DE2843295A1 - Verfahren zur herstellung stabiler avirulenter und hochimmunogener bakterienmutanten fuer lebendimpfstoffe - Google Patents

Description

• Titel der Erfindung Verfahren zur Herstellung stabiler, avirulenter und hochimmunogener Bakterienmutanten für Lebendimpfstoffe Anwendung der Erfindung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung stabiler, avirulenter und hochimmunogener Bakterienmutanten für Lebendimpfstoffe, insbesondere für verschiedene Impfstämme gegen Salmonellose Oharakteristik der bekannten technischen Lösungen Eine unbedingte Voraussetzung für den Einsatz von Impfstoffen aus lebenden Bakterien ist die genetische Stabilität der für ihre Herstellung benutzten Mutanten, um epidemiologische und epizootiologische Risiken auszuschließen. Stabile Mutanten müssen gleichzeitig bestimmte Parameter zur Virulenz, Immunogenität, Kultivation und Denazität erfüllen, um Impfstoffeigenschaften zu erreichen.
• (Schöll, Grünert und Linde, Zschr.f.d.ges.Hyg.23, 678 (1977)).
• Bei Mutanten mit nur einem einzigen attenuierenden Marker reduziert sich notwendigerweise die Forderung nach Stabilität auf eine unter nichtselektiven Praxisbedingungen nicht nachweisbare Reversion zum Wildstamm. Eine optimale Lösung des Problems Stabilität für die Belange der Imfstoffherstellung und des Einsatzes ist durch die Kopplung von zwei unabhängig voneinander attenuierenden Markern zu erreichen.
• FEr eine wissenschaftlich exakte Impfstamm-Prüfung sind solche Mutantentypen besonders geeignet, wo die Art der attenuierenden Mutation bzw. Mutationen eine Einschätzung der Revrsionshäufigkeit mit hochselektiven in vitro Methoden zuläßt. Für die Überwachung von Impfstoffen gegen Zooantroponosen sind solche in-vitro-Methoden geradezu zu fördern.
• Beim Fehlen von in-vitro-Methoden geben indirekte Verfahren über die Größenordnung der Stabilität einer bestimmten Mutation ungefähre Anhaltspunkte. Solche indirekt -- z.B. über wiederholte Nährböden- und in-vivo-Passagen -- gewonnenen Schätzwerte: Reversionshäufigkeit < 10-x, täuschen jedoch evtl. eine zu hohe Stabilität vor, da bei Fehlen eines starken Selektionsdruckes einzelne Revertanten auf dem Populationsniveau eliminiert werden können.
• Diese Problematik in Abhängigkeit vom Mutantentyp und Anwendungsgebiet wird dadurch demonstriert, daß - einerseits Literaturhinweise existieren, wonach bei Attenuierung durch nur einen Marker (Reversionshäufigkeit #10-7) keine absolute Sicherheit vor Impfkomplikationen besteht. COLLINS, J. Infect. Dis. 126, 69-76 (1972). SMITH, US-PS 3.364.117; SCHMIDT und KIEFER, Zbl. Bakteriol. Abt. I Orig. 227, 257-262 (1974) -- andererseits jedoch umfangreiche Feliversuche die Stabilität ausgewählter Einmarkerstämme (Reversionshäufigkeit zur Virulenz #10) bewiesen haben, wie z.B. mit Streptojnycin-dependenten (Sm-d) Mutanten von Salmonella dublin bei Kälbern [MEYER und Mitarb., Arch.f.exp.Veterihärmedizin 27, 301-320 (1973); 31, 71-93, 95-113, 277-288 (1977) mit Sm-d Shigellen bei Kindern [DuPont und Mitarb., J. Infect.Dis.125, 5-11 sowie 12-16 (1972); MEL, Zschr.f.d.ges.Hygiene 19, 656-657 (1973); SERGEEV und Mitarb., Zechr.f.d.ges.Hyg.19, 657-658 (1973) Sm-d Salmonella typhi beiErwachsenen MEL, Zschr.f.d.
• ges.Hyg. 656-657 (1973) und Sm-d Enteritis-Coli bei Säuglingen [KÖDITZ und BÜRDEL, Zuchr.f.d.ges.Hyg.22, (1976) 1. Beiheftj Für die notwendige staatliche Prüfung von Impfstämmen stellt sich damit die Forderung, daß -- bei Einmarker-Mutanten, deren Einsatz in endemisch/ enzootisch durchseuchten Populationen vertretbar ist, die Reversionsäufigkeit des Attenuierungsmarkers mit direkten nochselektiven Labormethoden erfaßt werden kann und # 10-8 liegt -- bei Doppelmarker-Mutanten, als anzustrebende Optimallösung des Problems Stabilität und Sicherheit vor Impfkomplikationen, nach Möglichkeit einer der beiden attenuierenden Marker in seiner Reversionshäufigkeit zur Virulenz mittels direkten hochselektiven Labormethoden erfaßt werden kann und mitrl07 (siehe unten) festgelegt werden sollte.
• Als potentielle Salmonella-Impfstämme wurden beschireben: Mutanten mit vermehrtmgsbegrenzenden Marker, wie z.B.
• . Streptomycin-dependene Stämme (RELTMAN I. Infect.Dis.
• 117, 101-107 (1967); SHUSTER und Mitarb., Zh.Mikrobiol. (Moskau) 1970/1, 144-145 . Temperatur-sensible Mutanten [FAHEY und COOPER, Infect.Immun. 1, 263-270 (1970); 2 183-191 sowie 192-200 (1970).J welche in vivo ihre Vermehrung einstellen und deren Reversionshäufigkeit mit hochselektiven Labormethoden erfaßbar ist [LINDE und Mitarb., Zschr.f.d.ges.Hyg. 22, (1976) 1. Beihaft; LICHODED und SHUSTER, Zschr.f.d.
• ges.Hyg. 22, (1976) 1. Beiheft]. Nachteilig für diese Mutantentypen ist, daß, infolge der fehlenden Vermehrung im Wirtsorganismus, zur Erzeugung einer belastbaren Immunität mehrfache und hohe Impfstoffdosen notwendig sind.
• - Mutanten mit nichtvermehrungsbegrenzender Attenuierung, welche die Potenz zur Gewebepersistenz bzw. in-vivo Vermehrung unterhalb des klinischen Schwellenwertes besitzen, daher in der Regel bei einmaliger Immunisierung eine belastbare Immunität auslösen und deren Reversionshäufigkeit zur Virulenz in Abhängigkeit vom Mutantentyp entweder mit selektiven Labormethoden oder lediglich indirekt (siehe oben) erfaßt werden kann; wie z.B.
• . Raun-Form-Mutanten [SMITH, US-PS 3.364.117; MARTIN-KOV und Mitarb., Immunprophylaxis 1971/2, 12-17) . avirulente S-Form-Stämme [SMITH, J. Hyg. (London) 54, 419-432 (1956)] . Sekundärmutanten von Klonen mit defekter Galaktose-4-Epimerase [GERMANIER, DT-PS 2.169.626] . avirulente Coli-Hydriden mit Salm. typhimurium-O-Antigen von [SCHMIDT und KIEFER, Zbl. Bakter.Hyg. I Abt. Orig. A 227, 297-262 (1974>) . Salmonella-Hybride aus avirulenter (Donor) und virulenter (Recipient) Salmonella [KRISNAPILIAI und KARTHIGASU, J. Bacter. 97, 1343-1351 (1969)] . Auxotrophie-Phänotypen mit einer zur Attenuierung führenden (Mutagen-induzierten) Ko-Mutation in benachbarten Genen der Zellwandsynthese [BACON und Mitarb., Brit.J.exper.Pathol. 31, 714-724 (1950), 32, 85-96 (1951); GARBER, The American Naturalist XC, 183-194 (1856); [LINDE und Mitarb., Acta microbiol. Acad.Sci.
• Hung.21, 11-27 (1974)3 und . Mutanten mit defekter Glycerinkinase, [RAUDONIKAS, Zh. Mikrobiol. (Moskau) 1976/12, 29-32J.
• Nachteilig für die Mehrzahl obiger durch einen einzigen Marker attenuierten Mutantentypen ist, daß die genetische Stabilität nur über indirekte Parameter ermittelt werden kann, so daß für die Impfstoffprüfung und den Einsatz dieser Mutanten als Impfstoff ein gewisser Unsicherheitsfaktor besteht.
• Dieser Nachteil ist bekanntermaßen durch den Einbau eines zweiten Markers zu beheben, welcher unabhängig vom ersten Marker eine Attenuierung bedingt: Suppressormutanten sind stabile Stämme mit zwei unabhängig voneinander attenuierenden Merkmalen. Daher wurden aus Streptomycin-dependenten Salmonellen durch spontane Mutation entstandene Streptomycin-independente Suppressormutanten [LICHODED und SHUSTER, Z. ges. Hyg. 22, (1976) 1. Beiheft; SHUSTER und Mitarb., Zh. Mikrobiol.
• (Moskau) 1971/7, 29-333 sowie aus Temperatur-sensiblen Salmonellen durch spontane Mutation entstandene Temperaturresistente Suppressormutanten [LINDE und Mitarb., Z. ges. Hyg. 22, (1976) 1. Beihaft], beschrieben.
• Der Nachteil der Streptomycin-independenten Suppressormutanten besteht jedoch darin, daß diese Doppelmutanten a) sich von Wildstämmen nur durch aufwendige Transduktionsanalysen oder die umständliche Bestimmung der verlängerten Generationszeit abtrennen lassen, b) infolge offensichtlich nicht identischer Mutationen in den Genen von bestimmten Ribosomenproteinen in ein Spektrum von Klonen mit unterschiedlichen Virulenz- und Immunogenitätsverhalten zerfallen [BLATZ und KNOLL, Leipzig, Karl-Marx-Universität, Diss.
• (1974), 92 S.) e) am Mäusemodell in der Regel eine Immunogenität nur bei relativ hoher Restvirulenz aufweisen [BLATZ und ENOLL, siehe b)) Ziel der Erfindung Ziel der Ereindung ist die Einführung bzw. Verwendung eines definierten genetischen Markers, -- bei dem der Phänotyp mit der Attenuierung korreliert -- dessen Reversionshäufigkeit zur Virulenz mit direkten Labormethoden hochselektiv erfaßbar ist -- Welcher sich zur Herstellung von stabilen nichtvermehrungsbegrenzt attenuierten Bakterienmutanten für gut verträgliche Lebendimpfstoffe unter Berücksichtigung der großtechnischen Herstellung eignet -- bei dem der genetische Defekt eine zeitlich begrenzte Vermehrung im Nutztier bzw. spezifischen Wirt unterhalb des klinischen Schwellenwertes zuläßt, so daß bei Einmarker-Mutanten (siehe unten) durch eine einmalige bzw. bei Doppelmarker-Mutanten siehe unten) durch eine in der Regel einmalige Impfung die zur Erzeugung einer belastbaren Immunität notwendige Antigenmenge im Wirtsgewebe sowie eine ausreichende aber begrenzte Antigenpersistenz als Vonaussetzung für die Auslösung einer zellulären Immunität als Hauptfaktor des Schutzes vor zyklischen Infektionen: COLLINS, Bacteriol. Rev. 38, 371-402 (1974) erreicht wind.
• - der es erlaubt, die damit versehenen Impfstämme jederzeit mit minimalem Aufwand von endemisch/enzootisch oder epidemisch/epizootisch vorkommenden Wildstämmen sicher abzugrenzen.
• Darlegung des Wesens der Erfindung Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß - Bakterienmutanten für nichtvermehrungsbegrenzte attenuierte BakterieLmutanten, geeignet für die Herstellung von Lebendimpfstoffen, welche sich unter nichtselektiven Praxisbedingungen als stabil erweisen, dadurch zu erhalten sind, in dem man von Wildstämmen Purin-abhängige Mutanten mit einer Reversionshäufigkeit #10-8 al Einmarker-Stämme isoliert.
• - stabile, nichtvermehrungsbegrenzte attenuierte Bakterienmutanten mit zwei unabhängig voneinander attenuierenden Markern, geeignet für die Herstellung von Lebendimpfstoffen, dadurch zu erhalten sind, indem man die Purin-Abhängigkeit als nichtvermehrungsbegrenzenden Zweitmarker in eine aus anderen Ursachen nicht vermehrungsbegrenzt attenuierte hochimmunogene Bismarker-Mutante einbaut. Da bei solchen Doppelmarker-Mutanten eine gleichzeitige spontane Reversion in den zwei unabhängig voneinander attenuierten Merkmalen infolge der sich potenzierenden Rinzelhäufigkeiten (#10-7 x#10-7 = #10-14) ausscheidet, besitzen solche Imfstämme unter den nichtselektiven Feldbedingungen eine volle Stabilität.
• -- sich derartige Mutanten aufgrund ihrer Übereinstimmung von phänotypisch erkennbaren und genetisch attenuierenden Markern mittels Routineverfahren der Serologie, Biochemie und Lysotypie hinreichend sicher von virulenten Feldstämmen in vitro abgrenzen lassen.
• derartige Mutanten fermentiert anzüchtbar und mittels Lyophilisation ausreichend lange konservierbar sind.
• -- aus derartigen Mutanten hergestellte Lebendimpfstoffe in große Nutztierpopulationen ohne epidemiologisches und epizootiologisches Risiko einsetzbar und immunogen sind.
• Einmarker-Mutanten; Der Einbau einer Purin-Abhängigkeit mit nicht nachweisbaren bzw. 10-8 liegender Reversionshäufigkeit zur Prototrophie (Virulenz) in einen Wildstamm, führt beispielsweise zu nachfolgend aufgeführten erfindungsgemäßen Einmarker-Mutanten, welche infolge ihrer Attenuierung und hohen Immunogenität für Mäuse (siehe Tabellen 1 und 3) als potentielle Impfstämme geeignet sind und beim Zentral institut für Mikrobiologie und experimentalle Therapie in Jena, DDR (ZINMET) hinterlegt wurden.
• Laborbezeichung Stamm-Nr. ZIMET-NR.
• Salm. dublin pur ade-16 IB AF 24 23 24 B 421 S. typhi-murium pur ade-81 AF 22 10 54 B 422 S. cholera-suis pur ade-27 AF 23 20 19 B 423 Doppelmarker-Mutanten: Der Einbau einer Pur in-Abhängigkeit, deren Reversionshäufigkeit entsprechend dem Anliegen "Stabilität" mit 10-7 fetsgelegt werden sollte, in eine aus anderer Ursache nichtvermehrungsbegrenzt attenuierte hochimmunogene Einmarker-Mutante, führt beispielsweise zu nachfolgend aufgeführten erfindungsgemäßen Doppelmarker-Mutanten mit zwei unabhängig voneinander attenuierenden Markern, welche infolge ihrer stabilen Attenuierung und Immunogenität für mäuse und Nutztiere (siehe unten) als potentielle Impfstämme geeignet sind und beim ZIMET hinterlegt wurden . Salmonella dublin met-91 pun ade-23 AF 24 23 26 hergestellt durch Selektion eines Purin-abhängigen Klons aus der Einmarker-Mutante S.dtiblin S-Borm met 91; Attenuierung durch Ko-Mutation, i.p. LD50 Maus #10,6,5 Einmarker-Mutantenkeime, deversionshäufigkeit zur Virulenz #10-7 (s.u.) . Salmonella typhi-murium his-155 pur [ade J4 AF 22 10 52 (siehe Tabelle 7) hergestellt durch Selektion eines Purin-abhängigen Kons aus der Einmarker-Mutante S. typhi-murium S-Form his-155; Attenuierung durch Ko-Mutation' i.p. LD50 Maus #106,7 Einmarker-Mutantenkeime, Reversionshäufigkeit zur Virulenz #10-7 (s.u.) . Salmonella typhi-murim his- pur [ade-] 4 AF 22 10 52 (siehe Tabelle 7) hergestellt durch Selektion eines Purin-abhägigen Kons aus der Einmarker-Mutante S. typhi-murium S-Form his-155; Attenuierung durch Ko-Mutation, i.p. LD50 Maus#106,7 Einmarker-Muantenkeime, Reversionshäufigkeit zur Virulenz #10-7 (z.u.) . Salmonella cholerae-suis R-Dessau pur ade 4 AF 23 20 10 bzw. 431/261 hergestellt durch Selektion eines Pur inabhängigen klones aus der Einmarker-Mutante S. cholerae-suis R-Dessau 431/256; Attenuierung durch R-Form Antigen, i.p. LD50 Maus 105,2 R-Mutantenkeime, Reversionshäufigkeit zur Virulenten S-Form 10-10 Hochimmunogene Doppelmarker-Mutanten mit zwei unabhängig voneinander attenuierenden Markern können auch erhalten werden, wenn in eine Einmarker-Mutante mit Purin-Abhängigkeit ein zweiter aus anderer Ursache attenuierender und nichtvermehrungsbegrenzender Marker eingebaut wird.
• Als Beispiel sei angeführt: Salmonella dublin (81) [ade-]thia- AF 24 23 24 a hergestellt durch Selektion eines Thiamin-abhangigen Klons aus der Einmarker-Mutante Salmonella dublin (81) [ade-].
• i.p. LD50-Maus 101,2 Wildstammkeine i.p. LD50Maus 108,5 Einmarkermutantenkeime i.p. LD50-Maus 109,7 Dopellmarkermutantenkeime Laborbezeichnung Stamm-Nr. ZIMET-Nr.
• Salmonella dublin pur ade thia AF 24 23 24a Salmonella dublin met 91 pur ade 23 AF 24 23 26 B 424 Salmonella typhi-murium his-155 AF 22 10 52 B 427 pur ade- 4 S.cholerae-suis R-Dessau pur ade 4 AF 23 20 10 B 428 bzw. 431/261 Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. die oben näher bezeichneten Impfstämme besitzen bezogen auf den Purinmarker folgende Vorteile bzw. erfüllen folgende Forderungen: . Korrelation zwischen phänotypischen Erscheinungsbild und Attenierung.
• . Reversionshäufigkeit zur Virulenz mit direkten Labormethoden hochselektiv erfaßbar.
• . Potenz zur Vermehrung im spezifischen Wirt unterhalb des klinischen Schwellenwertes und zeitlich begrenzte Antigenpersistenz im Gewebe als Voraussetzung für die Auslösung einer belastbaren Immunität.
• . Eignung zur Herstellung von stabil attenuierten Mutanten für hochimmunogene Lebendimpfstoffe.
• Diese erfindungsgemäße Problemlösung ist überraschend, denn auf Grund eines seit 25 Jahren bestehenden wissenschaftlichen Vorteils wurde die Mutation zur Purin-Abhängigkeit als ein nur zu schwach immunogenen Impfstämmen führendes vermehrungabegrenzendes Attenuierungsmerkmal eingeschätzt z.B. bei S. typhi-murium und S.typhi von RAGON und Mitarb., Brit.J.exper. Path. 32, 85-96 (1951); BRAUN, bakteralni genetika p. 191, Academia Praha 1968; GARBER, The American Naturalist XC, 183-194 (1956); GOWEN und Mitarb., GEnatios 38, 531-549 (1953); MENDEL-HERZBERG, J. Tnfect. Dis. 110, 192-203 (1962); TKACHENKO, Zh. Mikrobiol. (Moskau) 1967/6, 21-25; 1967/10; 102-105; 1969/10, 80-86 und daher die potentiellen Möglichkeiten nicht erkannt ELKINA und Mitarb., Zh. Mikrobiol. (Moskau) 1971/11, 10-13; LITHODED und SHUSTER, Zschr. Ges. hyg.22, (1976) l. Beiheft, welche sich aus dem Einsatz dieser Marker für die Herstellung nichtvermehrungsbegrenzt attenuierter, hochimmunogener Mutanten für bakteriellen Lebendimpfstoffe ergeben.
• Im Gegensatz zu dieser aherkannten wiesenschaftlichen Zeinung bzw. irrtümlich interpretierten Literatur konnte die verbliebene Potenz dieses Mutantentyps zur in vivo-Vermehrung und in vivo-Persistenz nachgewiesen werden.
• -- Purin-abhängige Mutanten lassen auf mit 10 % Mäuseserum substituiertem Minimalmedium eine Spur von Wachstum erkennen.
• -- Die in Tabelle 1 zusammengestellten Daten über die Immunogenität von Purin-abhängigen Salmonella-Mutanten für Mäuse beweisen indirekt die in vivo-Vermehrung und in vivo-Persistenz.
• Tabelle 1 Attenuierung und Immunogenität von acht Purin-abhängigen Salmonella-Mutanten.
• Reversionhäufigkeit 1/108 Mutanten-Keime.
• Summe aus 6-8 Einzelversuchen am Mäusemodell.
• Salmonella Immunisierung Belastung am 10. Tag pur [ade-]Mutanten i.p. 105 Keiem i.p. 100 LD50 Wildst.
• #/N % # #/N 5 # S. doublin 16 14/100 14 20/86 23 S. typhi- A 13 5/70 7 24/65 37 murium A 14 0/70 0 7/70 10 81 1/60 2 2/59 4 307 3/90 4 17/87 20 S. cholerae- 1 0/50 0 16/50 32 suis 27 0/40 0 6/40 15 30 6/50 12 10/44 23 29/530 6 102/501 20 Aussage zur Attenuierung und Immunogenität: Aus den Daten der Tabelle 1 ist ersichtlich, daß bei einmaliger i.p.-Immunisierung mit 105 Mutantenkeimen der jeweiligen Salmonella-Spezies auf Grund der ausgeprägten Attenuierung Verendungen in der Größenordnugn von minimal 0 bis 14 % auftreten. )Vird als Kontrolle die gleiche Lebendkeimzahl nicht attenuierter Wildsammkeime der jeweiligen Salmonella-Spezies verabreicht, sterben über 90 % der Kontrollmäuse. Bei den Verauchsmäusen, welche die "Immunisierung" durch die attenuierten Mutanten überstanden haben, verursacht die Wildstamm-Belastung mit der etwa 100 fachen LD50, die in Abhängigkeit von der jeweiligen Mutante, Verendungen zwischen 4 und 37 .
• Von den NaCl-Kontrollen verenden in Beobachtungszeitraum 6 % der Tiere.
• Der direkte Nachweis einer in vivo-Vermehrung und Gewebepersistenz von Purin-abhängigen Salmonella-Mutanten in Mäusen, als Voraussetzung für die hohe Tmaunogenität dieses Mutantentype (siehe oben) wird durch den nachfolgenden Versuch mit dem potentiellen Impfstamm Salmonella dublin pur [ade-]16 erbracht: Von 18 - 20 Gramm schweren ICR-Mäusen, welche i.p. 105 Mutantenkeime erhielten, wurden sofort nach der Immunisierung sowie täglich über 10 Tage je 3 Mäuse getötet, Leber und Milz steril entnommen, zusammen im Mörser zerrieben und in 2 ml physiologischer Kochselzlösung auspendiert. Von diesen Stammsuspensionen wurden die log.-Verdünnungsreihen 10-1, 10-2, 10-3 mit physiol. Kochsalzlösung hergestellt und 0,1 ml der Suspension 10° bis 10-4 auf Nähragar gespatelt. Nach 24 Stunden 37°C Bebrütung wurde die Zahl der Salmonella-Kolonien bestimmt und der Mittelwert gebildet.
• Die nach dem Versuchstag aufgeschlüsselten interpolierten Keimzahlen aus Leber und Milz sind in Tabelle 2 festgehalten.
• Tabelle 2 Vermehrung und Persistenz der Minmarker-Mutante S. dublin pur [ade-] 16 in Leber und Milz von IOR-Mäusen: Immunisierung i.p. mit 105 Keimen, quantitative Keimzehlbestimmung bei je 3 Mäusen unmittelbar nach Immunisierung und im täglichen Abstand (siehe Zeichnung Blatt 1) Wie aus dem Kurvenverlauf ersichtlich ist, erfolgt in der Maus innerhalb der ersten 48 Stunden eine geringgradige Zunahme der Impfstamm-Keimzehlen, welche bis zum vierten Tag etwa konstante Werte zeigen. In den nachfolgenden Tagen kommt es dann zu einer langsamen Eliminierung der Salmonella-Mutante aus dem Gewebe. Diese Versuchsergebnisse entsprechen den Befunden, wie aie COLLINS, 3acteriol. Rev. 38, 371-402 (1974) für avirulente Serotypen angibt, welche infolge ihrer Gewebepersistenz die Versuchstiere gegen eine letale Infektion mit spezies-adaptierten hochvirulenten Salmonellen schützen.
• - Das angeführte Labortierergebnis wird durch prinzipiell gleiche Aussagen aus den vorklinischen und klinischen Erprobungen an Nutztieren erhärtet: So wurden von 35 im Alter von 3 Wochen oral mit je 5 x 108 Lebendkeimen des potentiellen Impfstammes Salmonella cholerae-suis R [ade-4] immunisierten Saugferkeln täglich Rektaltupferproben entnommen, welche nach Stellmacher-Schöll £Stellmacher, W. in Beer, J. "Infektionskrankheiten d. Hst.", Sischer-V. Jena (1972); Schöll, W.
• Fortschrittsber. f.d. Land- und Nahrungsgüterwirtschaft 16/3 Berlin (1978) aufgearbeitet wurden. Die Ausscheidung des Impfs'tammes konnte in unregelmäßiger Folge bis zum 35. Tag post immunisationem nachgewiesen werden. Mit der Methodik nach Schöll (1978) gelang der Nachweis des Impfstammes aus den Organen von 172 bis zu 26 Wochen post immunisationem untersucht er Schweine bis zu 38 Tagen nach der Immunisierung.
• Ausführungsbeispiele: Die Erfindung wird nachstehend anhand der angegebenen Versuchsparameter und Beispiele näber erläutert.
• A) Material und Methoden Wildstämme: -- Salmonella tyhi-murium 415 (Moskau), i.p. LD50Maus 10¹Keime - Salmonella dublin 81 (ITFJ), i.p. LD50 Maus 105 Keime - Salmonella cholerae-suis 431/031 (Dessau) i.p. LD50 Maus 10³ Keime Einmarker-Mutanten als Ausgangsstämme für die Herstellung von Doppelmarker-Impfstämmen: - Salmonella typhi-murium his-155 (Leipzig) i.p.LD50 Maus 106,7 Keime - Salmonella dublin met 91 (Leipzig) i.p. LD50 Maus 106,5 Keime - Salmonella cholerae-suis R 431/256 (Dessau) i.p. LD50 Maus 105,2 Keime Versuchstiere: 16 - 18 Gramm schwere IOR-Mäuse Nährböden für die Vermehrung der Wildstämme, der jeweiligen Einmarker- und Doppelmarker-Mutanten sowie zur Mutantenselektion.
• Voomedium: Nähragar und Nährbouillon (Trockenmedium) SIFIN Minimalmedium: Modifizierte FALKOW und Mitart., J. Bacteriol. 84, 1303-1312 (1962) M9-Salzlösung DAVIS und MINGIOLl, J. Bacteriol. 60, 1?-28 (1950) mit bzw. ohne 2,5 % gewässertem Agar und 0,5 % Dextrose.
• Das Minimalmedium wird als solches zur Vermehrung des Salmonella typhi-murium Wildstammes eingesetzt, für den Salmonella dublin Wildstamm ist eine Supplementierung mit 20 ug Nikotinsäureamid/ml bzw. für den Salmonella cholerae-suis Wildstamm mit 20 ug Thiamin/ml notwendig.
• Teilsubstituiertes Minimalmedium: Für den Ausgangs stamm spezifisch ergänztes Minimalmedium plus 20 ag Aminosäure/ml. D.h. für den Salmonella cholerae-suis R-Stamm Dessau 431/256 also ohne Aminosaure; für Salmonella dublin-Stamm met 91 also mit Methionin; für Salmonella typhi-murium Stamm his-155 also mit Histidin.
• Vollsubstituiertes Minimalmedium: Wie teilsubstituiertes Minimalmedium mit zusätzlich 20 ug/ml Purin bzw. ein anderes Purin-Derivat wie beispielsweise Guanin, Hypoxanthin, Xanthin, Inosin, etc.
• 3) Selektion der Purin-abhängigen Mutanten 5 ml einer 16 h Schüttelkultur in Nährbouillon werden mit 45 ml Nährbouillon verdünnt und weitere 5 h bei 37°C bebrütet. Nach Zentrifugieren sowie einmaligem Waschen mit gepufferter physiologischer Kochsalzlösung wird das Sediment in einer Konzentration von 108 Keimen/ml in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Hiervon werden 10 ml mittels 100 ug N-Methyl-N'-Nitrosoguanidin/ml bei 37°C bis zu einer Überlebensrate von 5 % behandelt. Nach der Mutagenese wird der Ansatz zweimal mit gepufferter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, mit Nährbouilon auf lo ml aufgefüllt und zur phänotypischen Expression über Nacht bei 3700 bebrütet. Die Kultur wird erneut zentrifugiert, mit gepufferter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in teilsubstituiertes Minimalmedium mit einer Keimzahl von 107 - 108 Stunden resuspendiert, 2 Stunden bei 37°C bebrütet und dann 400 lE Penicillin/ml zugesetzt und weitere 5-7 Stunden bei 370 a bebrütet.
• Nach Zentrifugieren und einmaligem Waschen mit gepufferter Physiologischer Kochsalzlösung auf das alte Volumen von 10 ml resuspendiert, eine Iogarithmische Verdünnungsreihe hergestellt und von den Konzentrationen 100, 10-1, 10-2 und 10 3 jeweils 0,1 ml auf Nähragarplatten egespatelt. Nach 24 Stunden Bebrütung bei 37°C werden die Kolonien von Nähragarplatten mit Koloniezahlen zwischen 20 und 100 mittels Stempeltechnik auf Nähragar, Minimalmedium bzw. teilsubstituiertes Minimalmedium bzw. teilsubstituiertes Minimalmedium und vollsubstituiertes Minimalmedium iLbertragen.
• Klone, welche auf dem vollsubstituierten Minimalmedium wachsen, jedoch kein Wachstum auf Minimalmedium bzw.
• teilsubstituiertem Minimalmedium zeigen, werden auf die Stabilität ihrer Purin-Abhängigkeit geprüft.
• Beispiel 1 Einmaker-Mutanten: Von Wildstämmen abgeleitete Purin-abhängige Klone.
• welche unter Laborbedingungen keine Revertanten abspalten bzw. deren Reversionshäufigkeit #10-8 liegt, können als stabile Einmarker-Impfstämme eingesetzt werden.
• Die theoretische Möglichkeit einer Abspaltung von 10° Wildstämmekeinen bei Impfstoff-Dosen#108 Keime ist ohne Praxisrelevanz, da -- solche Imfstämme in ohnedies mit Salmonella Wildstämmen verseuchten Tierbeständen eingesetzt werden - diese einzelnen Keime mit Sicherheit auf dem Populationsniveau eliminiert werden.
• Nach der angeführten Methode wurden die oben beschriebenen stabilen Einmarker-Imfstämme erhalten mit dem Merkmal Purin-Abhängigkeit als nichtvermehrungsbegrenzen de Mutation.
• Die speziellen Daten für die stabilen Einmarker-Impfstämme hinsichtlich Attenuierung und Immunogenität am Mäusemodell sind aus der nachfolgenden Tabelle 3 sowie den dazugehörigen Ausführungen ersichtlich.
• Tabelle 3 Attenuierung und Immunogenität der stabilen Purinabhängigen Einmarker-Mutanten. Reversionshäufigkeit des nichtvermehrangsbegrenzenden attenuierenden Merkmals zur Prototrophie (Virulenz) mit hochselektiven Labormethoden nicht nachweisbar bzw. Ei 10-8 Mutanten i.p. Immunisierung 10xKeime LD50 Belastung i.p.
• 30 Mäusen nach 20 Tagen 100 LD50 Wildstamm Salmonella 105 106 107 108 /N Mäusen dublin 0 0 3 15 107,9 3/102 pur ade 16 IB typhi-murium pur [ade-]81 0 0 9 11 107,5 3/89 chloreae-suis pur [ade-]27 0 0 4 16 107,8 4/100 Wie Tabelle 3 zeigt sterben bei dieser Versuchsanstellung an der i.S. Immunisierung mit den L - purin-abhägigen Mutanten (i.p. LD50#108 Keime) letztmalig einzelne Mäuse bei Keimzahlen von 10 und resultiert aus der i.p. Immunisierung mit den -Einmarker Purin-abhängigen Mutanten für #95 % der die Immunisierung überlebenden Mäusen eine volle Immunität gegen die N 100 LD Wildstamm-Infektion.
• Bemerkenswert erscheint, daß eine solide Immunität durch die Imfstämme von Keimzahlen induziert wird, welche das Versuchstier Maus voll toleriert und mindestens zwei log.-Stufen unter dem Vert der Toxoinfektion liegen.
• Die bei Einsatz eines Lebendimpfstoffes notwendige und in jedem bakteriologischen Labor leicht durch zuführbare Abtrennung des Impfstammes von homologen Wildstämmen erfolgt - wie aus Tabelle 4 ersichtlich -über den Nachweis des Purin-Markers: Tabelle 4 Abtrennung der lmpfstämme von homologen Wildstämmen Wachstum zu testender Salm. auf Minimalmedium Vollsubstit.
• Minimalmedium Impf stamm + Wildstamm + + Beispiel 2 Doppelmarker-Mutanten: Von nichtvermehrungsbegrenzt attenuierten Ausgangsstämmen (d.h. von Einmarker-Mutanten) abgeleitete Purin-abhängige Klone, welche bezogen auf die Purin-Abhängigkeit eine Reversionshäufigkeit bis 1 prototrophe Revertante auf 10 Purin-abhängige Keime besitzen, können als potentielle Impfstämme mit 2 unabhängig voneinander attenuierenden Markers eingesetzt werden: Die Kopplung von 2 Markern Marker 1: z.B.
• -- Methionin- oder Histidin-Auxotrophiemutanten mit durch Ko-Mutation bedingter Attenuierung. Reversion zur Virulenz # 10 7 nachgewiesen durch stabile Attenuierung>20 Näragarpassagen und den alleinigen Nachweis der attenuierten Mutante bei i.p. mit 105 und 107 Mutantenkeimen geimpften Mäusen, von denen einzelne Tiere intercurrent bzw. an der Belastung durch den Impfstamm sterben (Wildstamm i.p. LD50 106,5 Keime).
• - Rauhform-Mutanten mit einer Reversionshäufigkeit α10-8 Marker 2: - Purin-Abhängigkeit mit einer Reversionshäufigkeit bis #10-7 garantiert, infolge der unter Praxisbedingungen nicht realisierbaren Gesamtreversionshäufigkeit von #10-14, eine volle Stabilität (siehe Seite 7).
• Die lediglich theoretisch zur Diskussion stehenden Revertanten der Impfstämme in einem der attenuierenden Marker werden mit Sicherheit auf den Populationsniveau eliminiert, zumal diese Revertanten infolge des anderen Markers immer noch attenuiert sind.
• Nach der angeführten Methode wurden die oben beschriebenen Salmonella Doppelmarker-Impfstämme erhalten mit dem Merkmal (Marker) Purin-Abhängigkeit als zweiten nichtvermahrungsbegrenzend attenuierten Marker.
• Möglich ist auch,. daß von attenuierten Purin-abhängigen Einmarker-Mutanten als Ausgangsstämme andersartig auxotrophe (z.B. Thiamin-auxotrophe> Klone mit einer Keversionshäufigkeit dieses Zweitmarkers #10-7 abgeleitet und als potentielle Impfstämme mit zwei unabhängig voneinander attenuierenden Markern verwendet werden können.
• In diesem Ball wäre: Marker 1: Purin-Abhängigkeit mit einer Reversionshäufigkeit #10-7 Marker 2: z.3. Thiamin-Auxotrophie, verbunden mit Attenuierung und Reversion zur Prototrophie #10-7 Die speziellen Marker für die Doppelmarker-Impfstämme sind den nachfolgenden ausgeführten drei Beispielen zu entnehmen: Beispiel 2a: Salmonella dublin (81) pur [ade]thia-Marker: 1: pur [ade-] mit einer Reversion zur Prototrophie 10-8 i.p. LD5o Maus 108,5 Keime Marker 2: this mit einer Reversion zur Prototrophie #1/108 this Keime Doppelmutante S. dublin (81) pur [ade-]thia i.p.
• LD50Maus 109,7 Keime [Wildstamm S. dublin (81) i.p. LD50 Maus 101,2 Keimel Die gleichzeitige Rückmutantenhäufigkeit beider Marker des Impfstammes 5. dublin (81) pur [ade-] thia liegt theoretisch somit in der Größenordnung von #10-16.
• Die in-vivo-Stabilität und Persistenz der Doppelmarker-Mutante Salmonella dublin (81) pur ade thia wurde ebenso wie die LD50 und die Prüfung der Immunogenität an NMRI-Mäusen getestet. Die Organe wurden einzeln in Porzellanmörsern homogenisiert und anschließend in ein jeweils dafür bestimmtes Reagenzglas mit 10 ml Nährbouillon (SIFIN-Berlin-Weißensee) gegeben. Nach 24-stündiger Bebrüstung bei 37°O wurden die Bouillon-Kulturen auf modifizierte Gassnernärböden abgeimpft und diese wiederum 24 Stunden bei 37°C bebrütet. Von bewachsenen Kulturen wurden mehrere Einzelkolonien auf Kligler-Schrägagar-Röhrchen isoliert, 24 Stunden bei 37°C bebrütet und als Salmonella verdächtige Kulturen anschließend serologisch typisiert. Um evtl. isolierte Revertanten zu erkennen, wurden die Kliglerkulturen auf teil- bzw. volisubstituiertes Minimalmedium gebracht, um die vorhandenen Marker zu charakterisieren.
• Alle geprüften Kulturen besaßen beide Marker und somit wurde eine in vivo-Reversion der Marker nicht beobachtet.
• Hinsichtlich Organpersistenz gelang der Bakteriennachweis in den parenchymatösen Organen wesentlich häufiger und die Persistenz hielt auch länger an als im Darm (siehe Fig.#). Die Isolierung aus dem Derm gelang letztmalig am 23. Tag nach der Belastung (siehe Fig. 2 a), in den parenchymatösen Organen am 55. Tag nach der Belastung (siehe Fig. 2 b). Diese zeitliche begrenzte Organpersistenz der avirulenten Doppelmutante stellt einen erwünschten Faktor der zur Erzielung einer hohen Immunität. Immunogenität der Doppelmarker-Mutante Salmonella dublin (81) pur ade thia für labortiere l§Bt Tabelle 5 erkennen, Der Impfstamm wird oral sehr gut ertragen, während der Immunisierungszeit überlebten alls Tiere. Nach 2maliger Antigengabe ist bereits mit Dosen von 1010 Keimen und nach 4malizer Antigengabe bereits mit Dosen von 107 Keimen ein sehr guter Impfschutz bei den mäusen erzielbar. (Siehe 2) Tabelle 6 Mäuseschutzverauch nach oraler Immunisierung mit der Doppelmarker-Mutante S. dublin (81) pur ade- thia-. Antigengaben bei zweimaliger Immunisierung am 1. und 14., bei 4maliger Immunisierung am 1., 2., 3. und 14. Versuchstag. Orale Belastung mit 1 x 105 Keimen des Bildstammes S. dublin (81) 14 Tage nach letzter Antigengabe. Berechnung der Signifikationsschwellen mit dem I²-Test.
• Imfstamm Immunisierungs- Zahl der Nährend der Zahl der Letalität Signifikanzdosis immun. Immunisierung infizierten d.infiz. schwellen im Mäuse verstorbene Mäuse Mäuse Vergleich mit Mäuse der Kontrollgruppe 2 mal 1 x 1010 25 0 25 6 = 24 % #<1,0 % 2 mal 1 x 109 25 0 25 10 = 40 % #>5,0 % 2 mal 1 x 108 25 0 25 7 = 28 % #<5,0 % 2 mal 1 x 107 25 0 25 11 = 44 % #>5,0 % S.dublin (81) 4 mal 1 x 1010 25 0 25 3 = 12 % #<0,1 % pur [ade-] 4 mal 1 x 109 25 0 25 5 = 20 % #<1,0 % thia 4 mal 1 x 108 25 0 25 6 = 24 % #<1,0 % 4 mal 1 x 107 25 0 25 6 = 24 % #<1,0 % Kontrolle 73 43 = 58,9 % Das Immunisationsergebnis der Doppelmarkermutante Salmonella dublin (81) pur [ade]- ]- thia am definitiven Impfling Kalb zeigt Tabelle 7.
• Tabelle 7: Ergebnis nach oraler Immunisierung von Kälbern bis zu 4 Wochen Lebensalter mit der Doppelmarker-Mutante S. dublin (81) pur [ade] thia und 2 bis 3 Wochen danach erfolgter oraler Belastung mit dem virulenten Stamm S. dublin (81) Immunisationsvarianten Kontrollen Mutante S.dublill (81) pur[ade] thia Stamm S. dublit (81) Zweimal 25 x 109 LK 1) einmal einmal 5 x 10LK im 3-d-Abstand oral 5 x 109 LK oral oral 2#/16 6#/27 11#/15 Abtrennung des Impfstammes von Wildstämmen: Die bei Einsatz eines Lebendimpfstofes notwendige Abtrennung des Impfstammes von Wildstämmen anderer Herkunst ist leicht durchführbar und zeigt Tabelle 8 Tabelle 8: Abtrennung des Impfstammes Salmonella dublin (81) pur [ade-] thia- von Wildstämmen sowie von Revertanten in einem der Erkennungsmarker Marker Impfstamm Wildstamm Rückmutante i. Marker Thiamin Purin Thiamin- + + Auxotrophie Adenin-Auxotrophie + - + 1) LK-Lebendkeime Wie das Schema der Tabelle 8 zeigt, ermöglicht die Erfassung der beiden Merkmale Thiamin-Auxotrophie plus Purin-Auxotrophie, bzw. die alleinige Erfassung eines der beiden genetischen Merkmale, eine Abtrennung des Impfstammes von Wildstämmep. Da der Impfstamm keine Geißeln ausbildet, ist seine Identifizierung zusätzlich noch durch die fehlende H-Agglutination in monospezifischer Hp-Serun möglich.
• Beispiel 2b: Salmonella typhi-murium S-Form bis 155 pur [ade]4 Marker 1: S-Form his- 155 (Atteinuierung durc Ko-Mutation) i.p. LD50 Maus 106,7 Keime, Reversionshäfigkeit zur VirulenZ (siehe oben) #10-7 (Reversion zur Prototrophie #10-8); Marker 2: purtadez (Attenuierung durch begrenztes Metabolitenangebot in vivo sowie pleiotropen Effekt) gekoppelte (S-Form bis-155 plus Furin-Abhägigkeit) i.p. LD50 Maus> 108Keime, Reversionshäufigkeit zur pur ade Prototrophie rv 1/108 pur [ade] Keime.
• Die gleichzeitige Reversionshäufigkeit beider Marker des Impfstemmes S.typhi-murium his-155 pur [ade-]4-liegt theoretisch in der Größenordnung #10-15: Die Immunogenität des Impfstammes sowie das Vorhandensein des Attenuierungsmerkers 1 im Iiupfstamm wurde -auf Grund der Schutzwirkung gegen die letale Wildstamm-Infektion bzw. des Virulenzverhaltens der Purin-prototropen Revertante von Marker 2 -- im Mäusemodell nach, gewiesen: siehe Tabelle 9 Tabelle 9: Attenuierung und Immunogenität von S. typhi-murium-Mutasten mit einem einzigen und zwei unabähngigevoneinander attenuierenden Markern sowie Virulenzverhalten der aus der Doppelumtante nach Reversion zur Purin-Prototrophie entstandenen Revertante S. typhi- i.p. Immunisierung 10x Keime Belastung i.p.
• murium #/N Mäusen nach 20 Tagen # 100 LD50 Mutanten 105 106 107 108 Widlstamm #/N Mäusen his 155 4/30 13/30 23/30 27/30 1/53 his 155 plus pur 0/20 0/20 0/20 8/20 3/72 [ade]4 Revertante his 177 pur 2/30 7/30 22/30 29/30 nicht geprüft [ade]4 Wildstammkontrolle 12/20 20/20 Wie die Tabelle zeigt sterben an der i.p. Immunisierung- mit der S-Form-Mutante his 155 (LD50#106,7 Keine) nur noch einzelne Tiere bei Keimzahlen von 10 Keimen.
• Doppelmutante his 155 pur ade 4 (LD50 >108 Keimen) letztmalig Mäuse der Keimzalhen von 108 Keimen) und resultiert aus der i.p. Immunisierung eine volle Immunität gegen die 100 LD50 Wildstamm-Infektion durch die - S-Form-Mutante his 1555 pu [ade]4 für ebenfalls #90% der bis zur Keimzahl von 10 Keimen immunisierten Tiere.
• Bemerkenswert erscheint, daß die solide Immunität durch den Impfstamm auch von Keimzahlen induziert wird, welche das Versuchstier Maus voll toleriert und mindestens 3 log.-Stufen unter dem Grenzwert der Toxoinfektion liegen. Die Revertante des Impfstammes zur Purin-Prototrophie (his 155 pur [ade] 4 -+ his 155 pur [ade]4) besitzt den LD50-Wert des S-Form his 155 Ausgangsstammes und beweist damit die Stabilität und das Vorhandensein des Markers 1 (S-Borm his 155; Attenuierung durch Ko-Mutation) im Impfatamm his 155 pur [ade]4.
• Abtennung des Imfstammes von Wildstammen: Die bei Einsatz eines Lebendimpfstoffes notwendige und in jedem bakteriologisch-serologischen Labor leicht durchführbare Abtrennung des Impfstammes von homologen Wildstämmen zeigt Tabelle 10.
• Tabelle 10 Impfstamm S. typhi-murium his 155 pur [ade]4: Abtrennung des Impfstammes von Widlstämmen anderer Herkunft sowie von Revertanten in einem der Erkennungsmarker Marker Impf- Wildstamm Impfstamm Revertante stamm anderer im Marker Herkunft Methionin Purin Histidin + + Auxotrophie Purin- + + Abhangigkeit ie das Schema in Tabelle 10 veranschaulicht, ermöglicht die Erfassung der beiden Merkmale Histidin-Auxotrophie plus Parin-Abhängigkeit, bzw. die alleinige Erfassung eines der beiden genetischen Merkmale, eine Abtrennung der Impfstämme von homologen Wildstämmen.
• Beispiel 20: Salmonella cholerae-suis-R-Dessau 431/256 pur ade 4 bzw. 431/261 Zu Marker 1: Das ist Mutation zur R-Form -- i.p. Maus 105,2 -- des somatischen Antigens mit einer Reversionshäufigkeit von 10-10 Die eingesetzte R-Matante besitzt die Potenz zur Gewebepersistenz beim Nutztier Schwein und zeichnet sich durch ausreichende Immunogenität und stark vermindertte Virulenz für Ferkel aus.
• Zu Marker 2: Da ist die Abhängigkeit gegenüber Purin mit einer Reversionhäufigkeit von # 1/108.
• Die gekoppelte (R-form plus Purin-Abhängigkeit) ip.
• LD50 Maus beträgt #109 Keime.
• Die gleichzeitige Reversionshäufigkeit beider Mark er des Impf stammes S. cholerae-suis R-Dessau 431/256 pur [ade] 4 bzw.431/261 liegt theoretisch in der Größenordnung von <10-18.
• Die Attenuierung und Immunogenität des Impfstammes sowie der R-Einmarker Ausgangsmutante am Mäusemodell ist in Tabelle 10 festgehalten.
• Tabelle 11 Attenuierung und Immunogenität der S.cholerae-suis Mutante mit einem Marker (R-Form 431/256) und der Impfstamm Doppelmutante mit 2 unabhängig voneinander attenuierenden Markarn: R-Form plus Purin-Abhängigkeit Salmonella i.p. Immunisierung 10x Keime Belastung chloerae-suis #/30 Min. nach 20 Tagen i.p. 105 Mutanten Wildst. Keime 104 105 106 107 108 109 #/N Mäusen nach 20 Tagen R-Stamm 431/256 11 15 15 24 30 22/55 R-Stamm plus 2 17 25/41 pur [ade]4 ./. ./. ./. 0 30/30 Wildstamm 30 i.p. LD50 #102,6 30/30 kontrolle Das in Tabelle 11 aufgeführte Material weist aus, daß -durch die Ausgangsmutante 431/256 mit einer LD50 #105,2 bei i.p. Keimzahlen von 104 noch einDrittel der Näuse verendet; und etwa 45 % der die Immunisierung überlebenden Mäuse gegen die 100 LD50 Wildstamm-Balastung geschützt ist -der Impfstamm 431/261 mit einer LD50 #109 letztmalig bei i.p. 108 Keimen einzelne Tiere durch Toxoinfektiuon tötete; un d die einmalige "Immunisierung im Grenzbereich zur Toxoinfektion" erwartungsgemäß über 50 % der überlebenden Mäuse gegen die letale itildstammbelastung schützt, während i.p. Immunisierung mit # 107 Keimen keine ausreichende Abwehr gegen den homologen S-Form-Wildstamm aufgebaut wird.
• Die für den S-cholerae-suis R-Dessau 431/256 pur ade 4 bzw. 431/261 Doppelmarker-Impfstamm am Mäusemodell nicht befriedigend nachweisbare Immunogenität bezieht sich allerdings auf die extrem hohe 100 LD50 Belastung.
• Im Falle einer LD5o-Belastung am definitiven Impfling - Schwein - ergibt sich eine sehr gute Schutzwirkung, wie Tabelle 12 ausweist.
• Tabelle 12: Ergebnis nach Immunisierung von Saugferkeln im 3-Wochen Alter mit der Doppelmarkermutante S. cholerae-suis 431/256 [ade] 4 bzw. 431/261 und 3 Wochen danach erfolgter oraler Belastung mit dem virulenten Stamm S.cholerae-suis 431/034 Immunisationsvarianten Inaktivierte Vakzine Ausgnagsstamm Mutante 431/261 Kontrollen zweimal parenteral 431/256 einaml einmal Stamm einmal parent. parent. oral 431/034 1-2 x 109 LK² 5 x 107 einmal 5 x 1010 GK1) 5 x 109 LK oral 5 x 1010 LK/k 6 /20 6 /25 8 /41 3 /97 62 /123 Abtrennung des Impfstammes von Wildstämmen: Die bei Einsatz eines Lebendimpfstoffes notwendige und in jedem bakteriologischen-serologischen Labor leicht durch führbare Abtrennung des Impfstammes von homologen Wildstämmen anderer Herkunft zeigt Tabelle 13.
• Tabelle 13.' Abtrennung des Impfstammes von Wildstämmen und R-Mutanten anderer Herkunft Marker Impfstamm Wildstamm R-Mutante Impfstamm-Revert.
• anderer Herkunft im R-Marker Purimark.
• Rauhform + + + Purin-Abhängig- + # # + # keit 1) GK-Gesamtkeime 2) LK-Lebendkeime Wie das Schema in Tabelle 13 veranschaulicht, ermöglicht die Erfassung beider Merkmale -- R-Form und Pur in-Abhängigkeit -- bzw. die alleinige Er-Passung d-s genetischen Merkmals Pur Abhängigkeit eine Abtrennung des Impfstammes von homologen Wildstämmen. Von den lediglich theoretisch zur Diskussion stehenden Revertanten des -Impfstammes in einem Marker läßt sich die R -- S Reversion erfassen. Die Revertanten zur Purin-Prototrophie lassen sich von der Mehrzahl spontan auftretender R-Bormen serologisch und durch ein differenziertes Lysisspektrum abtrennen. Nur in den seltenen Fällen einer Übereinstimmung der R-Struktur von Impfstamm und spontan auftretender R-Form ist keine Unterscheidung möglich.
• Beispiel 3 Bestimmung der Reversionshäufigkeit zur Purin-Prototrophie (Virulenz) und Nachweis der Purin-Abhängigkeit der oben beschriebenen Impfstämme: Durch Spateln von 108 und 107 Keimen der jeweils zu prüfenden Impfstämme auf Minimalmedium sowie einer Kontrollabimpfung auf vollsubstit uiertes Minimalmedium und anschließender 48stündiger Bebrütung bei 370C er folgt die Bestimmung der Reversionhäugihkeit -welche für Einmarker-Mutanten mit 10-8 festgelegt werden sollte (siehe oben) - welche für Doppelmarker-Mutanten mit 10 7 festgelegt werden sollte (siehe oben) und der Nachweis der Purin-Abhängigkeit.
• Zur Herstellung des Lebendimpistoffes werden die Stämme auf einem halbsynthetischen Nährmedium bei 370 C bis zum Ende der logarithmischen achstumsphase im Fermentor angezüchtet. Die Kultur wird lyophilisiert.
• Beispiel für die Herstellung des S, cholerae-suis Lebendimpfstoffes: Die Kultivierung des Stainnies S.cholerae-suis 431/261 erSolgt in einem Fermentor mit 70 1 Salmonellen-Nährmedium nach WP 115 919 mit 2% Laktalalbuminhydrolysat und 0,5 k Glucose. Das Medium wird vorgeklärt, steril filtriert und mit 7 1 Vorkultur, die als Standkultur durch 16 h-Behrütung bei 37°C gewonnen wurde sowie 35 ml Silikonentschäumer Antaphron NE 30 beimpft. Die Fermentation wird bei 3700, einer Rührgeschwindiceit von 200 U/min und einer Belüftung von 0,06 m3 Luft/h/l durchgeführt. Bei Erreichung der stationären Phase wird die Kultivierung abgebrochen und der pH-Wert mit 20 %iger Natro-nlauge auf den Wert 7,5 korrigiert. Zur Lyophilisation wird die Bakterienkultur mit Stabilisator versetzt.
• Nach Abfüllung des Impfstoffes werden die Falschen im shellfreezing-Verfahren eingefroren, in einer Byophilisationsanlage getrocknet und anschließend mit stickstoff geflutet.
• Die Lebendimpfstoffe werden in einer in der Regel einmaligen oralen oder parenteralen Gabe-von 1 x 108 bis 5 x 109 LK an die entsprechenden Nutztiere (definitiven Impflinge) verabreicht. Durch Einsatzprogramme, welche auf den jeweiligen immunologischen Voraussetzungen und epidemiologischen bzw. epizootiologischen Erforedernissen aufbauen, wird die Unterbrechung der natürlichen Infektionsketten der zu bekämpfenden Infektionskrankheiten maßgeblich unterstützt

Claims (3)

1. Patentansprüche: 1. Verfahren zur Herstellung stabiler hochimmunogener Bakterienmutanten für Lebendimpfstoffe dadurch gekennzeichnet, daß man aus Wildstämmen oder hochimmunogenen Einmarker-Stämmen (die aus anderer Ursache nichtrermehrungsbegrenzt attenuiert sind) stabile Klone mit aem nichtvermehrungsbegrenzt attenuierenden Marker Purinabhängigkeit selektioniert.
2. 2. Verfahren zur Herstellung stabiler hochimmunogener Bakerienmutanten für Lebendimpfstoffe gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, da13 man zur Mutantenselektion beispielsweise die verschiedensten Purinderivate wie Adenin, Guanin, Hypoxanthin, lanthin, Inosin verwendet.
3. 3. Verfahren zur Herstellung von stabilen hochimmunogenen Salmonella- Lebendimpfstoffen gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß man als Einmarker-Impfstämme folgende aus Wildstämmen selektionierte (purin-abhängige) Klone -- mit einer unter Laborbedingungen nicht nachweisbaren bzw. #10-8 liegenden Reversionshäufigkeit zur Prototrophie verwendet.

   Salmonella dublin pur ade-16 B ZIMET-Nr. B 421 Salmonella typhi-murium pur ade-81 " B 422 Salm.cholerae-suis pur ade-27 " B B 423 4. Verfahren zur Herstellung stabiler hochimmunogener Salmonella-Lebendimpfstoffe gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß man als Doppelmarker-Imfstämme folgende aus hochimmunogenen Einmarker-Mutanten (Attenuierung durch Ko-Mutation bzw. anderen Ursachen) selektionierte Purin-abhängige Klone verwendet.

   Salmonella dublin pur ade-thia AF 24 23 24a Salmonella dublin met 91 pur ade-23 ZIMET-Nr. B 424 Saleonella typhi-murium his-155 pur ade-4 Nr. 3 427 S.chloerae-suis R-Dessau pur ade-4 Nr. B 428