HU216449B - Eljárás legyengített baktérium előállítására - Google Patents
Eljárás legyengített baktérium előállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU216449B HU216449B HU89702A HU70289A HU216449B HU 216449 B HU216449 B HU 216449B HU 89702 A HU89702 A HU 89702A HU 70289 A HU70289 A HU 70289A HU 216449 B HU216449 B HU 216449B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- aro
- gene
- strain
- typhi
- mutation
- Prior art date
Links
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 34
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 claims 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 18
- 230000009194 climbing Effects 0.000 abstract 2
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 38
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 25
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 21
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 21
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 21
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 21
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 21
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 20
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 18
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 14
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 9
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 9
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 9
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 7
- -1 aromatic amino acid Chemical class 0.000 description 6
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 6
- 241000701835 Salmonella virus P22 Species 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LQIAZOCLNBBZQK-UHFFFAOYSA-N 1-(1,2-Diphosphanylethyl)pyrrolidin-2-one Chemical compound PCC(P)N1CCCC1=O LQIAZOCLNBBZQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 241000392514 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Dublin Species 0.000 description 3
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 3
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910002016 Aerosil® 200 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920003084 Avicel® PH-102 Polymers 0.000 description 2
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 description 2
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 2
- 229920003085 Kollidon® CL Polymers 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 206010048685 Oral infection Diseases 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- FLKPEMZONWLCSK-UHFFFAOYSA-N diethyl phthalate Chemical compound CCOC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)OCC FLKPEMZONWLCSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000002702 enteric coating Substances 0.000 description 2
- 238000009505 enteric coating Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229940008718 metallic mercury Drugs 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 description 2
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 description 2
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 2
- WTFXTQVDAKGDEY-UHFFFAOYSA-N (-)-chorismic acid Natural products OC1C=CC(C(O)=O)=CC1OC(=C)C(O)=O WTFXTQVDAKGDEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIAFKZKHHVMJGS-UHFFFAOYSA-M 2-carboxy-5-hydroxyphenolate Chemical compound OC1=CC=C(C([O-])=O)C(O)=C1 UIAFKZKHHVMJGS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000242722 Cestoda Species 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 108010033478 E coli K88 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 1
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 description 1
- 206010018612 Gonorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 241000245165 Rhododendron ponticum Species 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 1
- 241000405383 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. LT2 Species 0.000 description 1
- 241001607429 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. SL1344 Species 0.000 description 1
- 241000607760 Shigella sonnei Species 0.000 description 1
- 108050008280 Shikimate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 101150009163 Tada3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710182223 Toxin B Proteins 0.000 description 1
- 241001467018 Typhis Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229960004050 aminobenzoic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229940031416 bivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 208000001786 gonorrhea Diseases 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 108700010900 influenza virus proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007935 oral tablet Substances 0.000 description 1
- 229940096978 oral tablet Drugs 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 229940100467 polyvinyl acetate phthalate Drugs 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229940069328 povidone Drugs 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229940115939 shigella sonnei Drugs 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
- A61K39/092—Streptococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/0225—Spirochetes, e.g. Treponema, Leptospira, Borrelia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
- A61K39/0275—Salmonella
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/095—Neisseria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K2039/10—Brucella; Bordetella, e.g. Bordetella pertussis; Not used, see subgroups
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
A találmány szerinti legyengített mikrőőrganizműst állítanak elő őlymódőn, hőgy egy első arő génben egy első nem revertáló műtációthőrdőzó mikrőőrganizműsban egy másődik nem revertáló műtá iót hőznaklétre egy másődik arő génben. ŕ
Description
A találmány tárgya eljárás legyengített baktérium, előnyösen Salmonella törzsek előállítására.
1950-ben Bacon és munkatársai (Br. J. Exp. Path. 31, 714-724) kimutatták, hogy az S. typhi bizonyos auxotrof mutánsai az eredeti törzshöz képest egerekben legyengített hatást váltanak ki. A törzsek néhány képviselője az aromás aminosavak és a purin bioszintézis-útban lévő mutációt hordoz. Ismert továbbá, hogy egyéb mutációk, így a thy A, baktériumot gyengítenek le.
1981-ben Hosieth és Stocker (Natúré 241, 238-39)
S. typhimurium aro A mutáns előállításáról számol be. Az aro A mutáns előállításához transzpozon TnlO segítségével mutagenezissel S. typhimurium törzseket képeznek, amelyek az aro A génben megfordíthatatlan sérülést (nem revertáló léziót) hordoznak. Ez a gén kódolja az 5-enol-piruvil-sikimát-3-foszfát szintetáz-enzimet, a szervezet aromás bioszintézisének kulcsenzimét, amely emlősökben nem fordul elő. Az aro A mutánsok ezért exogén aromás vegyületektől függnek, beleértve az aromás aminosavakat, a p-amino-benzoesavat és a
2,4-dihidroxi-benzoátot. Beltenyésztett egereken kimutatták, hogy az S. typhimurium aro A mutánsok legyengített hatást váltanak ki, és hatékony élő vakcinaként alkalmazhatók az egérfélékre jellemző Salmonellosis ellen, ha orálisan vagy parenterálisan adagolják.
Ha egy mikroorganizmust élő formában alkalmaznak a vakcinakészítményben, akkor biztonsági okokból a mikroorganizmust legalább két mutációval, előnyösen a genom különböző részein le kell gyengíteni. Nagyon fontos, hogy az ilyen mikroorganizmus ne revertálódjon az eredeti virulens szülővé. Ennek lehetősége egyetlen mutációval viszonylag kicsi. Azonban elhanyagolható annak a veszélye, hogy a genom különböző helyein elhelyezkedő két diszkrét génben mutációt hordozó törzs visszaalakuljon. Az ilyen típusú kettős mutáns tehát a vakcinában viszonylag nagy biztonsággal alkalmazható.
A 0184086 számú európai közrebocsátási irat aro A és pur A irreverzibilis mutációkat hordozó, nem revertáló S. typhi törzs megszerkesztését írja le. Irreverzibilis mutációnak nevezzük azt a mutációt, amely egyetlen lépéssel nem javítható ki. Az ilyen típusú genetikus mutáció lehet a gén részét képező DNS-szekvencia inverziója (beépítés) vagy deléciója (kiiktatás).
Kísérleteink szerint az S. typhimurium irreverzibilis aro A és pur A mutációt hordozó mutánsai intravénásán adagolva BALB/C egereknél nem biztosítanak kielégítő védelmet intravénás fertőzés ellen. Ezek a mutánsok a BALB/C egerekben orálisan adagolva is hatástalanok (O’Callaghan és munkatársai: Infect. Immun. 56, 419-423, 1988).
Az aro A és pur A mutációk transzpozonok segítségével állíthatók elő. Ezek 750 bázispár és több ezer nukleotidpár közötti hosszúságú DNS-szekvenciák, amelyek genetikai anyagukat a bakteriális kromoszóma különböző helyeire beépítik. Néhány transzpozon olyan gént kódol, amely antibiotikum rezisztenciát kölcsönöz a transzpozont hordozó szervezetnek. Ha a beépülés hiányhelyen következik be, a gén folytonossága gyakran megszakad és ez a génfunkció elvesztésével jár. Mintegy x/sejt/generáció gyakoriságnál a transzpozon precízen kivágható a génből. Ez megőrzi a génfunkciót. Gyakrabban előfordul azonban, hogy pontatlan kimetszés következik be, ami a génfunkció elvesztésével jár és gyakran irreverzibilis mutációhoz vezet.
A találmányhoz kapcsolódó kísérletek során gyakran alkalmazzuk az S. typhi törzset, amely embereknél tífuszt okoz. Az S. typhi humán patogén törzs és ezért állatkísérletekben nem alkalmazható. Az állatkísérleteket egy egérmodell segítségével S. typhimurium törzzsel végzik, amely közeli rokona a fenti törzsnek és tífuszhoz hasonló betegséget okoz egerekben és szarvasmarhákban. Ezt a egérmodellt Collins ismerteti (Bacteriol. Rév. 38,371,1974).
A vakcinában felhasználásra kerülő mikroorganizmusnak a következő tulajdonságokkal kell rendelkezni:
(I) hatékony legyengítés, ami lényegében kizárja a legyengítetlen mikroorganizmuséval azonos fertőzés kiváltását, (II) minimális hajlam a virulens állapotra történő visszaalakulásra, (III) képes legyen immunitás kiváltására a szervezettel inokulált állatban és így megvédje azt egy esetleges virulens törzs által kiváltott fertőzéstől.
A technika állása szerint a vakcinákhoz alkalmazott élő mikroorganizmusok nem elégítik ki a fenti kritériumokat. Ezért szükség van olyan élő vakcina kifejlesztésére, amely kiküszöböli a technika állása szerinti megoldások hátrányait, mivel kimutatták, hogy az élő baktériumok általában nagyobb immunizáló hatással rendelkeznek, mint az elölt baktériumok (Collins: Bacteriol. Rév. 1974).
Azt találtuk, hogy élő vakcinában alkalmazható baktériumokat kapunk akkor, ha irreverzibilis mutációt építünk be a baktérium aromás aminosavszintézisében résztvevő két külön génbe.
A találmány feladata tehát legyengített mikroorganizmus kifejlesztése, amely az aromás bioszintézis két külön génjében irreverzibilis mutációt hordoz. Mikroorganizmusként előnyösen baktériumot alkalmazunk.
Az aromás aminosav bioszintézis elágazási pontját képező korizmát (transz-3-[(karboxi-etenil)-oxi]-4hidroxi-1,5-ciklohexadién-1 -karbonsav) szintézisében legalább tíz gén vesz részt. Ezek többnyire egymástól távol helyezkednek el a bakteriális genomban, így például az aro A (5-enol-piruvil-sikimát-3-foszfát-szintetáz), aro C (korizmát-szintetáz), aro D (3-dihidrokinátdehidratáz) és aro E (sikimát-dehidrogenáz).
A mutációk egyike előnyösen az aro A, míg a másik az aro C, aro D vagy aro E génben jelenik meg. Három előnyös kombináció például az aro A aro E mutáns baktérium, az aro A aro C mutáns baktérium és az aro A aro D mutáns baktérium, bár a többi kettős aro mutáns is az oltalmi körbe tartozik.
A találmány szerinti eljárás kiteljed a patogén baktériumok teljes körére (elsősorban az eukarióta sejtekben fejlődő vagy a nyálkahártyán telepeket képző baktériumokra). Példaként említhetők a Salmonella (a továbbiakban S.), Bordetella, Haemophílus, Leptospira és
HU 216 449 Β
Streptococcus baktériumok, így az emberi tífuszt okozó
S. typhi, több állatban szalmonellát okozó S. typhimurium, embereknél életmérgezést okozó S. enteritidis, sertéseknél szalmonellát okozó S. cholerasuis, szamárköhögést okozó Bordetella pertussis, meningitiszt okozó Haemophilus influensae, tuberkulózist okozó Mycobacterium tuberculosis, gonorrhoea-t okozó Neisseria gonorrhoeae és bubópestist okozó Yersinia pestas.
Különösen előnyösen alkalmazhatók az S. typhi Ty2 törzs azon mutánsai, amelyek irreverzibilis aro A aro C vagy aro A aro E vagy aro A aro D mutációkat hordoznak.
Az S. typhi Ty2 aro A törzset Dougan és munkatársai ismertetik (Mól. Gén. Génét. 207, 402 (1987)). Az irreverzibilis mutáció kiváltásához az S. typhi Ty2 törzsben LT2 aro A: TnlO markert viszünk be. A TnlO transzpozon tetraciklin rezisztenciát kódoló gént hordoz. A mikroorganizmusokat megfelelő közegen telepeket fejlesztve tetraciklin rezisztencia alapján válogatjuk ki. A további kiválogatáshoz azokat a mikroorganizmusokat vizsgáljuk, amelyek elveszítették a tetraciklin rezisztencia gént, és amelyek aromás aminosav függőséget szereztek.
Az S. typhi aro A génből (vagy más S. typhi aro génből) történő kiiktatás megvalósítható úgy is, hogy klónozott S. typhi aro A génen transzpozon mutagenizist hajtunk végre, a mutált gént S. typhi kromoszómába rekombináljuk, és így a vad típusú gént a mutáns génnel helyettesítjük, majd a pontatlan kimetszésű transzpozon alapján szelektálunk. Ez a módszer lehetővé teszi annak elkerülését, hogy S. typhi DNS-től idegen DNS-t vigyünk be a vakcinatörzsbe.
Elvben több módszer is alkalmas arra, hogy a második génben végrehajtsuk a második mutációt. Az egyik ilyen módszer szerint a második génbe átvihető elemet építünk be, majd az első mutációnál leírt módon baktérium felhasználásával pontatlan kimetszést hajtunk végre. A második aro génen végrehajtott mutációval kettős aro mutánst kapunk. Ez fenotípusosan megkülönböztethetetlen az egyes aro mutánstól. Ezért az első aro gén mutáns kiegészítéséhez az egyik gén nem mutáns másolatát plazmidba klónozva bejuttatjuk a szervezetbe, és a szervezetet megfelelő szelekciós közeg felhasználásával aromás vegyülettől történő függőségre vizsgáljuk.
A másik eljárás szerint a második gént egy vektorba, például plazmidba vagy kozmidba klónozzuk és a klónozott második génre szelektálható marker gént viszünk be és ezzel egyidejűleg inaktiváljuk a gént. Az inaktivált gént az ettől eltérő szelektálható markert hordozó plazmid a szokásos módszerekkel bevihető a mikroorganizmusba. Ezután lehetővé válik, hogy megfelelő szelekcióval azonosítsuk azt a mutánst, ahol az inaktivált gén rekombinálódott a szervezet saját kromoszómájában és a szervezet elvesztette a gén saját másolatát. Ez azt jelenti, hogy olyan vektort alkalmazunk, amely a szervezetben instabil és spontán elvész. A plazmidon lévő mutált gén és a szervezetnek a kromoszómában található saját génmásolata genetikus keresztezéssel kicserélhető. A további módszerekben kiküszöböljük idegen DNS-nek a mutáció helyén a vakcinatörzsbe történő bevitelét.
A találmány szerinti aro A aro C, aro A aro E és aro A aro D mutánsok legyengített hatást váltanak ki és ezért vakcinaként kellő biztonsággal felhasználhatók, emellett elég immunogének ahhoz, hogy immunválaszt váltsanak ki, ami védelmet biztosít egy ezt követő virulens törzs által kiváltott fertőzés ellen.
A találmány szerinti törzseket genetikailag manipuláljuk úgy is, hogy egy vagy több különböző patogénnek megfelelő antigént fejezzenek ki. A patogén lehet vírus, baktérium, protozoa vagy magasabb rendű parazita szervezet. A patogén megfertőzhet embereket vagy emlősállatokat, emellett lehet fajszelektív vagy akár fajspecifikus is. Az ilyen törzs bi- vagy multivalens vakcina alapját képezheti. A hasznos antigénekre példaként említhető az E. coli hőre érzékeny toxin B alegység (LT-B) E. coli K88 antigén, FMDV (száj- és körömfájás) víruspeptidek, influenzavírus-fehérjék, B. pertussis 69Kd fehéije. További példaként említhető a Chlamydia, métely, mikoplazma, orsógiliszta, galandféreg, veszettségvírus és rotavírus antigén.
Az antigének előállításához az antigént kódoló gént vagy géneket kifejező rendszerbe visszük. A kifejezőrendszer lehet DNS-szekvencia, amely az átírás és a lefordítás kezdetét és befejezését szabályozó szerkezeti gént kódoló DNS-szekvenciához kapcsolódik. A kifejezőrendszer lehet továbbá valamely szabályozószakasz is. Az ilyen kifejezőrendszerek szakember számára ismertek, és könnyen előállíthatok. A kifejezőrendszer lehet valamely mesterséges vagy természetes plazmid. Idegen antigént kifejező és genetikailag legyengített Salmonella egyik példáját ismerteti a 0127153 számú európai közrebocsátási irat. A kifejezőrendszert módosíthatjuk abból a szempontból is, hogy lehetővé tegye a heterológ génnek a bakteriális kromoszómába történő beépülését.
E. coli hőre érzékeny enterotoxin B alegységet kifejező legyengített Salmonella typhi törzset tartalmazó bivalens vakcinát ismertetnek Clemens és munkatársai (Infection and Immunity, 46, /2/, 564-569, 1984). A Ty21a-t más antigének, így Shigella sonnei I antigén kifejezésére is alkalmazzák (Formai és munkatársai: Infection and Immunity 34, 746-750).
A találmány tárgya továbbá eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, amely a fenti legyengített baktériumot tartalmazza gyógyszerészeti hordozóanyagokkal elkeverve. A gyógyszerkészítményt előnyösen vakcina formájában alkalmazzuk.
A vakcinát előnyösen liofilizált állapotban, például kapszulázva alkalmazzuk orális adagolásra alkalmas módon. A kapszula előnyösen enterális bevonattal van ellátva, amelynek komponense lehet például Eudragate S, Eudragate L, cellulóz-acetát, cellulóz-italát vagy hidroxi-propil-metil-cellulóz. A kapszulát felhasználhatjuk önmagában vagy a liofilizált anyagot felhasználás előtt például szuszpenzióvá alakítjuk. Ezt az átalakítást előnyösen puffer jelenlétében olyan pH-η végezzük, amely biztosítja a mikroorganizmus életképességét. A legyengített baktérium és a vakcina gyomorsavakkal szembeni védettsége érdekében a vakcina ada3
HU 216 449 Β golása előtt minden esetben előnyösen nátrium-hidrogén-karbonát készítményt adagolunk. A vakcina parenterális, intranazális vagy emlőn keresztül történő adagolásra alkalmas készítménnyé is alakítható.
A találmány szerinti vakcina hatékony dózisban adagolva felhasználható bakteriális fertőzés megelőzésére. Az alkalmazott dózis a különböző klinikai faktoroktól, így a beteg korától és testtömegétől, valamint a vakcina kiszerelési formájától függ. A legyengített S. typhi dózisa általában 109-10'1 S. typhi mikroorganizmus dózisegységenként, amely alkalmas 70 kg-os felnőtt beteg kezelésére.
A találmány tárgyát közelebbről az alábbi példákkal világítjuk meg anélkül, hogy az oltalmi kört a példákra korlátoznánk.
Az S. typhi aro A aro E és aro A aro C és aro A aro D vakcinatörzsek előállításához starter törzsként S. typhi Ty2 aro A törzset alkalmazunk (Dougan és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 207, 402-405 (1987)).
1. példa
S. typhi Ty2 aro A aro E kettős mutáns előállítása
A Salmonella Stock Centre in Calgary gyűjteményben található S. typhimurium LT2 aro E: :Tnl0 törzset alkalmazzuk, amelyet eredetileg J. Roth izolált. A P22 fágot LT2 aro E: :Tnl0-en tenyésztve lizátumot állítunk elő. A kapott P22 fág bomlásterméket S. typhi Ty2 aro A-ba visszük be és tetraciklinrezisztenciára szelektáljuk. Aro A mutációt pótló és S. typhimurium C5ből származó klónozott aro A gént kódoló plazmidot viszünk be az S. typhi aro A törzsbe. A klónozott aro A gént hordozó S. typhi aro A aro E: :Tnl0 törzs fenotípusosan aromás vegyületektől függ (az aro mutáció következménye). A TnlO plazmidot eltávolítjuk az aro E génből úgy, hogy Bochner-közegen tetraciklinérzékeny variánsokat szelektálunk (Bochner és munkatársai: J. Bacteriol. 143, 929-933). A klónozott aro A gént hordozó S. typhi aro A aro E mutánst minimál tápközegen aromás függőségre vizsgáljuk. Az aromás vegyületektől függő telepeket kiválogatjuk, és vizsgáljuk az aro E reverziót. Ebből a célból 1011 mikroorganizmust aromás vegyületeket nem tartalmazó minimál tápközegre helyezünk és 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Öt napon keresztül vizsgáljuk a revertáló telepeket. A stabil aro E mutációt tartalmazó telepek közül kiválogatjuk azt a variánst, amelyből spontán elveszett a klónozott aro A gén. így S. typhi aro A aro E mutánst szelektálunk. Ezt a Budapesti Szerződés előírásai szerint deponáltuk a National Collection of Type Cultures, 61 Colindale Avenue, London gyűjteményben 1987. november 25-én a 12164 szám alatt.
2. példa
S. typhi Ty2 aro A aro C kettős mutáns előállítása
Starter törzsként S. typhi Ty2 aro A törzset alkalmazunk. Az S. typhi Ty2 aro C génjét az E. coli aro C-t kiegészítő kozmiddal klónozzuk (Hohn és Collins: Gene 11, 291-298 (1978)). Az aro C kozmidot transzpozon Tn5 mutációhoz használjuk és szubklónozással klónozott aro C gént kódoló kis DNS-fragmenst lokalizálunk.
A klónozott aro C gént inaktiváljuk úgy, hogy fémhiganyrezisztencia-gént klónozunk az aro C kódolószakaszába. Inaktivált aro C-t hordozó plazmidot viszünk be az S. typhi aro A törzsbe. Ez a plazmid ampicillinrezisztenciagént tartalmaz. Fémhigany-rezisztencia és ampicillinérzékenység alapján kiválogatva azonosítjuk azokat a mutánsokat, amelyekben inaktivált aro C rekombinálódott az S. typhi kromoszómájába és így S. typhi aro A aro C mutánst képez.
A mutáns előállítása során eljárhatunk úgy is, hogy a fémhiganyrezisztencia-gén helyett kanamicinrezisztencia-gént (Km-R) alkalmazunk.
Az S. typhi Ty2 aro A aro C Km-R törzset a Budapesti Szerződés előírásai szerint a National Collection of Type Cultures, 61 Colindale Avenue, London gyűjteményben 1987. november 25-én a 12 165 szám alatt deponáltuk.
3. példa
Salmonella typhi aro A aro D kettős mutáns előállítása
S. typhi aro A törzset LT2 aro D553: :Tnl0 donortörzs segítségével előállított P22 fág bomlástermékkel kezelve S. typhi aro A aro D törzset állítunk elő. Tisztítás után Bochner-közegen szelektálva tetraciklinérzékeny származékot képzünk. Ezeket tisztítjuk és az aro A kiiktatásához pAB51 (aro A+) plazmiddal transzformáljuk. A tetraciklinérzékeny izolátumok egyikét, amely a plazmidot hordozva stabil aromás függőséget mutat, S. typhi Ty2 aro A aro D törzsnek nevezzük.
Az így előállított és különböző arogén-mutációkat hordozó S. typhi törzsek továbbra is termelik a Vi antigént, forralás után 0 összeragaszthatatlan, 09 összeragasztható és valamennyi ostoros Hd típusú. Az egyik aro A aro D törzset a Budapesti Szerződés előírásai szerint a National Collection of Type Cultures, 61 Colindale Avenue, London gyűjteményben deponáltuk a 12209 szám alatt 1988. december 15-én.
4. példa
5. typhimurium, S. dublin és S. cholerasuis kettős mutánsainak előállítása
S. typhimurium SL1344, S. dublin és S. cholerasuis törzsekbe McFarland és Stocker módszerével aro A kiiktatást végzünk. TT472 törzsből előállított fág bomlásterméket viszünk be a Salmonella törzsekbe és a tetraciklinrezisztens telepeket kiválogatjuk. A TT472 törzs a ser Cbe beépülve az aro A operontól felfelé és azon belül TnlO-et tartalmaz. A tetraciklinrezisztens származékok aromás vegyületektől, szerintői és piridoxintól függnek. Egy második P22 bomlásterméket állítunk elő SL5254en, amelyről ismert, hogy az aro A-n belül kiiktatást tartalmaz. Ezt bevisszük a ser C:: TnlO tetraciklinrezisztens törzsekbe és minimálközegen kiválogatjuk a szerintői és piridoxintól mentes, de aromás vegyületeket tartalmazó származékokat.
Az aromás vegyületeket tartalmazó, de szerintői és piridoxintól mentes minimál tápközegen fejlődő telepek tetraciklinérzékenyek és aromás vegyületektől függnek.
HU 216 449 Β
4a példa
S. typhimurium aro A aro C előállítása
Stabil aro C mutációt távolítunk el a virulens S. typhimurium SA2018 törzsből és az alábbi eljárással egérben virulens S. typhimurium SL1344 törzsbe visszük be. S. typhimurium SGSC592 zei 608: :TnlO törzs felhasználásával előállított P22 bomlásterméket alkalmazva TnlO-et viszünk be az SA2018 törzsbe. A TnlO az SGSC592 törzsben 40%ban a vad típusú aro C génhez kapcsolódik, amelynek következtében az SA2018 törzs stabil aro C mutációt hordoz. A tetraciklinrezisztens változatot minimál tápközegen vizsgálva több aromás függő telepet találunk. Ezek egyikét izoláljuk, tisztítjuk és felhasználjuk a második P22 fág bomlástermék előállításához. Ezt a bomlásterméket felhasználva S. typhimurium SL1344 törzset kezelünk és ismét több tetraciklinrezisztens és aromás vegyülettől függő származékot azonosítunk. Az egyiket izoláljuk és felhasználjuk a tetraciklinérzékeny származék előállításához, amelynek során a szelektálást Bochner-közegen végezzük. Az egyik tetraciklinérzékeny és aromás vegyülettől függő származékot izoláljuk, tisztítjuk és McFarland és Stocker módszerével aro A kiiktatást hajtunk végre. Annak igazolására, hogy a kapott izolátum aro A aro C változat, ezt pAB51 (aro A+) vagy pTMCI2H (aro C+) plazmiddal transzformáljuk, ahol a kapott transzformánsok mindkét plazmid esetében aromás vegyülettől függnek.
4b példa
S. typhimurium aro A aro D előállítása
SL1344 aro A törzsben aro D kiiktatást hajtunk végre. Ehhez a törzset LT2 aro D 553: :TnlO donortörzzsel előállított P22 fág bomlástermékkel kezeljük és kiválogatjuk a tetraciklinrezisztens változatot. Az egyiket izoláljuk és tisztítjuk, majd Bochner-közegen tetraciklinérzékeny származékká alakítjuk. Ezeket tisztítjuk és az aro A kiiktatáshoz pAB51 (aro A+) plazmiddal transzformáljuk. Az egyik tetraciklinérzékeny és stabilan aromás vegyülettől függő izolátum az SL1344 aro A aro D jelet kapta.
4c példa
S. typhimurium aro A aro E előállítása
SL1344 aro A törzsben aro E kiiktatást hajtunk végre. Ehhez a törzset LT2 aro E: :TnlO donor törzzsel előállított P22 fág bomlástermékkel kezeljük és kiválogatjuk a tetraciklin érzékeny változatot. Ezek egyikét izoláljuk, tisztítjuk és Bochner-közeg felhasználásával tetraciklinérzékeny származékká alakítjuk. Ezeket tisztítjuk és az aro A kiiktatáshoz pAB51 (aro A+) plazmiddal transzformáljuk. Az egyik tetraciklinérzékeny és stabilan aromás vegyületektől függő származék az SL1344 aro A aro E jelet kapta.
5. példa
A 4b példában az SL1344 aro A aro D változattal kapcsolatban ismertetett módon S. dublin és S. cholerasuis aro A aro D származékot állítunk elő.
Legyengített S. typhimurium törzsek in vivő tulajdonságai
Az alkalmazott S. typhimurium törzsek leírását az 1. táblázat tartalmazza.
Egerek fertőzése és a baktériumok egérfélék szervezetében történő szaporítása
Különböző szervezeteket S. typhimuriummal tnt i.v. inokulálunk, majd a mikroorganizmusok számának meghatározásához a májat és a lépet homogenizáljuk (Hormaeche CE, Immunology, 37, 311-318). Életképességi számítást végzünk a homogenizátumon L-agar közeg alkalmazásával és az eredményt geometriai átlag ±két standard hiba ábrázolásával fejezzük ki pontonként négy egérre felvéve.
A 6., 7. és 8. példában veleszületett Salmonella érzékenységgel rendelkező 8-10 hetes BALB/C egereket alkalmazunk. A virulens törzs intravénás LD50 értékének meghatározozásához öt egérből álló csoportokat tízszeres hígítási sorral kezelünk, ahol a hígítási sor előállításához az L-közegen egy éjszakán keresztül tenyésztett mikroorganizmusokat centrifugáljuk és foszfátpufferolt sóoldatban (pH=7,2) 109-10n baktérium/ml koncentrációig szuszpendáljuk. Ezt foszfáttal pufferolt sóoldatban tízszeresére hígítjuk, és a tiszta szuszpenziót legfeljebb 0,2 ml dózisban orálisan vagy intravénásán 8-10 egérből álló csoportnak adagoljuk. A pusztulást négy héten keresztül vizsgáljuk és az LD^ értéket Reed és Muench módszerével (Am. J. Hyg. 27,493-497,1983) számoljuk. Az intravénás kezeléshez az egereknek 0,2 ml baktérium szuszpenziót fecskendezünk be a farki vénába. Az orális adagoláshoz 0,2 ml baktérium szuszpenziót adunk az éterrel enyhén elaltatott egereknek gyomorszonda segítségével (Microbial. Pathogenesis, 2,211-221).
6. példa
Virulens S. typhimurium törzsek legyengitése stabil aro mutációval és más auxotrof mutációval
Az S. typhimurium HWSH és SL1344 egerekben virulens törzs, amelyek LD50 értéke BALB/C egereknek intravénásán adagolva 10 alatt marad. Az intravénás LD50 értéket a törzsek szelektált auxotrof származékain határozták meg BALB/C egerekben (2. táblázat). Mind az aro A, mind a pur A mutánsokat jelentős mértékben legyengítettük az eredeti törzsekhez viszonyítva. A HWSH aro A és SL3261 (SL1344 aro A) LD50 értéke lóg 7,4 és lóg 7,1, ami jó összhangban van a publikált adatokkal. A pur A és az aro A pur A származékok még jobban le vannak gyengítve. A HWSH pur E törzs legyengitése kisebb, mivel az LD50 érték a kísérletek során erősen szór. Például egyes mérések szerint legfeljebb 100 mikroorganizmus pusztult el, míg más mérések során ΙΟ4—105 túlélő organizmust mértek. Az aro C aro A mutáns kevésbé legyengített, mint az aro A pur A mutáns, az LD50 érték 6,5. Hasonló képet kapunk az egyes aro C mutánsra is. Orális adagolás esetén az aromás vagy purin mutánsok nem pusztítják el az egereket még 1010 mikroorganizmus adagolása esetén sem.
HU 216 449 Β
Zn
7. példa
S. typhimurium egyes és kettős aro mutánsok állandósága BALB/C egereknek i.v. adagolva Az állandóság vizsgálata során valamennyi S.
typhimurium törzs egymáshoz nagyon hasonló eredményt ad, amelynek során 56 nap alatt a lépben Salmonella nem mutatható ki (1. ábra).
8. példa
Legyengített S. typhimurium törzs orálisan adagolható vakcina formájában
Vizsgáltuk az orálisan adagolt auxotrof S. typhimurium törzsek BALB/C egerekben orálisan fertőző virulens S. typhimurium (SL1344) törzzsel szembeni védelmét. Az egereket orálisan fertőzzük ΙΟ9- 10ιθ auxotrof mutánssal és az immunizált egereket négy hét elteltével orálisan fertőzzük a virulens szülőtörzzsel.
A 3. táblázatban megadott eredmények egyértelmű-
| en mutatják, hogy sem a pur A, sem az aro A pur A mutáns nem vált ki megfelelő védelmet az orális fertőzés | 20 | SL1344 | Lóg LD <1 |
| ellen, míg az aro A, aro C és aro A aro C mutánsok | SL3261 | 6,9 | |
| megfelelő védelmet mutatnak az orális fertőzéssel | SL1344purA | 6,7 | |
| szemben az immunizálást követő 28 és 70 napon. | SL3261 pur A | 8,7 | |
| 9. példa | 25 | SL1344aroC SL1344 aro A aro C | 6,7 |
| Az előző példák bármelyike szerint előállított S. | (a találmány szerinti) | 6,5 | |
| typhi mikroorganizmust előnyösen orális tabletta formá- | SL1344 aro A | 6,75 | |
| jában szereljük ki. A tabletta összetétele a következő: | HWSH | <1 | |
| Tablettamag | HWSH aro A | 7,4 | |
| 1. fagyasztva szárított ΙΟ9- 10Ιθ | 30 | HWSH pur A | 8,6 |
| Salmonella typhi tartalmú hordozó 70,0 mg | HWSH aro A pur A | 8,9 | |
| 2. szilícium-dioxid (Aerosil 200) 0,5 mg | HWSH pur E | 3,8 |
a=az LD50 értéket 28 nap után mértük, kivéve a HWSH pur E törzset, ahol az 56. napon végeztük a mérést.
35
3. táblázat
3. Dipac (97 tömeg% szacharóz) 235,0 mg
4. keresztbe kapcsolt povidon (Kollidon CL) 7,0 mg
5. mikrokristályos cellulóz (Avicel pH 102) 35,0 mg
6. magnézium-sztearát 2,5 mg
350,0 mg
Bevonat
7. Opadry Enteric OY-P-7156 (polivinil-acetát-ftalát + dietil-ftalát) 35,0 mg
385,0 mg tömeg% szacharózt, 1 tömeg% nátrium-glutamátot és 1 tömeg% bacto kazitont tartalmazó vizes oldatot állítunk elő. Az S. typhi mikroorganizmust ebben a hordozóban szuszpendáljuk, majd fagyasztva szárítjuk.
A fagyasztva szárított anyagot Aerosil 200-zal keverjük és a keveréket szitáljuk. A kapott port a Dipac, Kollidon CL, Avicel pH 102 és magnézium-sztearátkomponensekkel keverjük. Ezt a keveréket tablettává préseljük és ellátjuk a bélben oldódó bevonattal. A fenti összetételben megadott komponensek a gyógyszerészeiben alkalmazható egyéb segédanyagokkal helyettesíthetők.
1. táblázat
A vizsgálatban alkalmazott S. typhimurium törzsek Törzs Auxotrofia
SL1344 his
SL3261 aro A his
Törzs
SL1344purA SL3261 pur A SL1344 SL1344 SL1344 HWSH^ HWSHaroA HWSH pur A
HWSHaroA pur A HWSH pur E
Auxotrofia pur A his pur A aro A his aro C aro A aro A aro C (találmány szerinti)
Prototroph aro A pur A aro A pur A pur E
C5 Prototroph x=egérben és borjúban virulens törzs, Salmonellosisban elpusztult borjúból izolálva.
2. táblázat
Két erősen virulens S. typhimurium törzs auxotrof származékainak i.v. fertőzött BALB/C egerekben mért lóg LDyí értéke*
Immunizáló törzs Fertőzés
| SL1344purA | 28 nap 6,7 | 70 nap | |
| 40 | SL3261 pur A | 5,6 | - |
| immunizálatlan | 6,2 | - | |
| SL3261 | >10,1 | 9,1 | |
| SL 1344 aro C | >10,1 | >9,9 | |
| 45 | SL 1344 aro A aro C (a találmány szerinti) | >10,1 | >9,9 |
| immunizálatlan | 7,4 | 6,7 |
Megjegyzés: az SL3261 azonos az aro A-val.
Claims (4)
- 50 SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás legyengített baktérium előállítására, azzal jellemezve, hogy első aro génjében nem revertáló mutációt hordozó baktérium másik aro génjében nem55 revertáló mutációt alakítunk ki.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a második nem revertáló mutációt transzpozon mutációval alakítjuk ki.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 60 hogy a másik aro gént egy vektorba klónozzuk, a kló6HU 216 449 Β nozott génbe egy szelektálható markert beépítve inaktiváljuk a klónozott gént, a baktériumba az inaktivált gént és egy másik, szelektálható markert hordozó plazmidot viszünk be, és szelektáljuk a baktérium saját kromoszómájába rekombinálódott inaktivált gént tartalmazó mutáns baktériumot.
- 4. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, 1. igénypont szerint előállított legyengített baktériumot gyógyszerészeti hordozóanyaggal és adott esetben egyéb gyógyszerészeti se5 gédanyaggal keverünk, és a keveréket adagolásra alkalmas készítménnyé alakítjuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB878730037A GB8730037D0 (en) | 1987-12-23 | 1987-12-23 | Vaccines |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU216449B true HU216449B (hu) | 1999-06-28 |
Family
ID=10628973
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU89702A HUT55242A (en) | 1987-12-23 | 1988-12-22 | Vaccine and process for producing them |
| HU89702A HU216449B (hu) | 1987-12-23 | 1988-12-22 | Eljárás legyengített baktérium előállítására |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU89702A HUT55242A (en) | 1987-12-23 | 1988-12-22 | Vaccine and process for producing them |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0322237B1 (hu) |
| JP (1) | JP2602970B2 (hu) |
| KR (1) | KR970010759B1 (hu) |
| AT (1) | ATE103331T1 (hu) |
| AU (1) | AU619519B2 (hu) |
| BR (1) | BR8807376A (hu) |
| CA (1) | CA1327331C (hu) |
| DE (1) | DE3888652T2 (hu) |
| DK (1) | DK174952B1 (hu) |
| ES (1) | ES2061700T3 (hu) |
| GB (1) | GB8730037D0 (hu) |
| HK (1) | HK1000469A1 (hu) |
| HU (2) | HUT55242A (hu) |
| IE (1) | IE65176B1 (hu) |
| IL (1) | IL88766A (hu) |
| MY (1) | MY104367A (hu) |
| NZ (1) | NZ227472A (hu) |
| PH (1) | PH31428A (hu) |
| RU (1) | RU2114172C1 (hu) |
| WO (1) | WO1989005856A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA889605B (hu) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU626139B2 (en) * | 1989-01-12 | 1992-07-23 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Avirulent salmonella vaccine |
| IE61635B1 (en) * | 1990-03-13 | 1994-11-16 | Trinity College Dublin | Improvements in vaccines |
| GB9007194D0 (en) * | 1990-03-30 | 1990-05-30 | Wellcome Found | Live vaccines |
| KR100240182B1 (ko) * | 1991-03-05 | 2000-01-15 | 레슬리 제인 에드워즈 | 재조합 단백질을 발헨하는 약독해진 박테리아를 함유하는 백신 |
| TW201794B (hu) * | 1991-05-03 | 1993-03-11 | American Cyanamid Co | |
| ATE359370T1 (de) * | 1993-02-22 | 2007-05-15 | Gen Hospital Corp | Heterologe antigene in stämmen zur impfung mit lebendzellen |
| US6036953A (en) * | 1996-11-29 | 2000-03-14 | The General Hospital Corporation | Heterologous antigens in live cell V. cholerae strains |
| GB9711964D0 (en) * | 1997-06-09 | 1997-08-06 | Medical Res Council | Live attenuated vaccines |
| CN1253551C (zh) | 1997-09-10 | 2006-04-26 | 维昂药品公司 | 减毒的遗传修饰肿瘤靶向细菌 |
| US6080849A (en) | 1997-09-10 | 2000-06-27 | Vion Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence |
| EP0913480A3 (en) * | 1997-11-03 | 2001-07-11 | Smithkline Beecham Corporation | Chorismate synthase |
| US6905691B1 (en) | 1997-12-11 | 2005-06-14 | Celltech Pharma Europe Limited | Vaccines containing attenuated bacteria |
| GB9806449D0 (en) | 1998-03-25 | 1998-05-27 | Peptide Therapeutics Ltd | Attenuated bacteria useful in vaccines |
| US6962696B1 (en) | 1999-10-04 | 2005-11-08 | Vion Pharmaceuticals Inc. | Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules |
| GB0121998D0 (en) | 2001-09-11 | 2001-10-31 | Acambis Res Ltd | Attenuated bacteria useful in vaccines |
| JP4623625B2 (ja) | 2003-07-24 | 2011-02-02 | 株式会社ＡＭＢｉＳ | ヘテロ型５量体組換えワクチン |
| FR2898276B1 (fr) * | 2006-03-08 | 2008-07-25 | Univ Claude Bernard Lyon | Nouveaux vaccins destines au traitement ou a la prevention des infections par parasites de la famille des taenidae et en particulier du genre echinococcus |
| US8821852B2 (en) * | 2010-12-22 | 2014-09-02 | Intervet Inc. | Vaccines with live bacterial isolates for systemic administration |
| WO2012123269A1 (en) | 2011-03-11 | 2012-09-20 | Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. | Immunogenic compositions and methods for their use |
| US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4337314A (en) * | 1979-05-23 | 1982-06-29 | Research Corporation | Genetically attenuated bacterial vaccines with multiple mutations of the same phenotype |
| US4735801A (en) * | 1982-09-07 | 1988-04-05 | Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University | Novel non-reverting salmonella live vaccines |
-
1987
- 1987-12-23 GB GB878730037A patent/GB8730037D0/en active Pending
-
1988
- 1988-12-22 HU HU89702A patent/HUT55242A/hu unknown
- 1988-12-22 BR BR888807376A patent/BR8807376A/pt not_active Application Discontinuation
- 1988-12-22 HU HU89702A patent/HU216449B/hu unknown
- 1988-12-22 AT AT88312203T patent/ATE103331T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-12-22 AU AU29193/89A patent/AU619519B2/en not_active Expired
- 1988-12-22 CA CA000586868A patent/CA1327331C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-22 NZ NZ227472A patent/NZ227472A/en unknown
- 1988-12-22 ZA ZA889605A patent/ZA889605B/xx unknown
- 1988-12-22 KR KR1019880017199A patent/KR970010759B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-12-22 IL IL8876688A patent/IL88766A/en unknown
- 1988-12-22 MY MYPI88001526A patent/MY104367A/en unknown
- 1988-12-22 ES ES88312203T patent/ES2061700T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-22 DE DE3888652T patent/DE3888652T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-22 EP EP88312203A patent/EP0322237B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-22 WO PCT/GB1988/001143 patent/WO1989005856A1/en unknown
- 1988-12-22 PH PH37971A patent/PH31428A/en unknown
- 1988-12-22 JP JP1501160A patent/JP2602970B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-22 RU SU4742131A patent/RU2114172C1/ru active
- 1988-12-22 IE IE383988A patent/IE65176B1/en not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-08-22 DK DK198904126A patent/DK174952B1/da not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-10-15 HK HK97101924A patent/HK1000469A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IE65176B1 (en) | 1995-10-04 |
| ZA889605B (en) | 1990-08-29 |
| DK412689D0 (da) | 1989-08-22 |
| HUT55242A (en) | 1991-05-28 |
| HK1000469A1 (en) | 1998-03-27 |
| IL88766A (en) | 1995-07-31 |
| DE3888652D1 (de) | 1994-04-28 |
| WO1989005856A1 (en) | 1989-06-29 |
| RU2114172C1 (ru) | 1998-06-27 |
| MY104367A (en) | 1994-03-31 |
| DK412689A (da) | 1989-08-22 |
| EP0322237B1 (en) | 1994-03-23 |
| PH31428A (en) | 1998-11-03 |
| DE3888652T2 (de) | 1994-07-07 |
| JP2602970B2 (ja) | 1997-04-23 |
| KR970010759B1 (ko) | 1997-06-30 |
| BR8807376A (pt) | 1990-03-20 |
| AU2919389A (en) | 1989-07-19 |
| ATE103331T1 (de) | 1994-04-15 |
| EP0322237A1 (en) | 1989-06-28 |
| CA1327331C (en) | 1994-03-01 |
| AU619519B2 (en) | 1992-01-30 |
| NZ227472A (en) | 1992-07-28 |
| KR890010200A (ko) | 1989-08-07 |
| GB8730037D0 (en) | 1988-02-03 |
| ES2061700T3 (es) | 1994-12-16 |
| HU890702D0 (en) | 1991-01-28 |
| DK174952B1 (da) | 2004-03-22 |
| JPH02502785A (ja) | 1990-09-06 |
| IE883839L (en) | 1989-06-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5077044A (en) | Novel non-reverting shigella live vaccines | |
| US5210035A (en) | Non-reventing live vaccines | |
| AU584963B2 (en) | Non-reverting double mutant salmonella live vaccines | |
| US4837151A (en) | Live vaccines comprising two mutations and foreign antigen | |
| AU623599B2 (en) | Avirulent microbes, incapable of producing functional adenylate cyclase and cyclic amp | |
| EP0400958B1 (en) | Live vaccines | |
| EP0524205B1 (en) | Live vaccines | |
| US5468485A (en) | Avirulent microbes and uses therefor | |
| HU216449B (hu) | Eljárás legyengített baktérium előállítására | |
| US4550081A (en) | Non-reverting salmonella | |
| US5643771A (en) | Non-reverting live bacterial vaccines | |
| EP0500699B1 (en) | Cross-protective salmonella vaccines | |
| PT512260E (pt) | Vectores "pur a" estaveis e suas utilizacoes | |
| US5811105A (en) | Vaccines containing bacteria attenuated by mutations in two genes of the aromatic amino acid biosynthetic pathway | |
| AU659995C (en) | Live vaccines |