JPH02502785A - ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ワクチン 本発明は、遺伝子的に弱毒化された生きた微生物に基づく経口ワクチン及び該微 生物自体に関する。Ｉ特に、本発明はＳａ１ｍｏｎｅｌユａの弱毒化株に関−す る。

１９５０年代にＢａｃｏｎらは、Ｓ、　ｔｙｐｈｉのある種の汞化されているこ とを証明している（Ｂｒ、　Ｊ、　ＥＸＩ）、　ｐａｔｈ。

３１　ニア１４−７２４）。これらの株のうちのある種の株では、芳香環合成経 路及びプリン合成経路において変異が起きている。ｔｈｙＡなどの他の変異によ ってもバクテリアが弱毒化されることが知られている。

１９８０年代にｌ○５ｉｅｔｈと５ｔｏｃｋｅｒは、Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｘｉｕ ｍａｒｏ　Ａ変異株の構築を報告している（　Ｎａ　ｔｕγθ２４１：２３８− ３９）。ｌＬｒ０　Ａ　′に異は、トランスボデ７　’ｌ”ｎ１０突然変異誘発 を用いてａｒｏ　Ａ遺伝子に非可逆領域を保持するｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ ｍ株を構築することにより達成される。このａｒｏ　Ａ遺伝子は、哨乳動物中に は存在しない芳香環合成経路のキーエンディムである５−エノールビルビルクキ メート−３−ホスフェートシンターゼをコーｒする。従ってａｒｏ　Ａ変異株は 、成長のための芳香族アミノ酸、ｐ−アミノ安息香酸、２，４−ジヒＶロキシ安 息香酸などの外因性芳香族化合物に依存性のものである。　Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍ ｕｒｉｕ！ｌ１ａｒｏ　Ａ変異株を弱毒化し、これをマウスに経口もしくは非経 口的に投与した場合にムリンサルモネラ菌感染症に対する有効な生ワクチンとな ることが同系交配マウスで証明されている。

微生物を生きた形態でワクチン製剤に使用する場合には、安全性の面から、少な くとも２つの変異、好ましくはデノムの別々の部分での少なくとも２つの変異に より微生物な弱毒化することが必要となる。このような微生物は有毒な親株に戻 らないことが重要である。

凰−変異の弱毒株が親株に戻る可能性は少ないと考えられる。しかしながら、ゲ ノム中の異なる位置の２つの別々の遺伝子において変異を有する弱毒株の場合に は、親株に戻る危険性はほとんどないと言える。従って、２重変異株が安全なワ クチン用として候補に挙げることができる。

欧州特許出願Ｊａ　ｉ　８４０８６　（ＴＭ　Ｂｏａｒｄ　ｏｆＴｒｕｓｔｅｅ ＊　ｏｆ　ｔｈｅ　１ｅｌａｎｄ　Ｂｔａｎｆｏｒｄ　Ｊｏｎｉｏｒ　Ｕｎｉｖ ｅｒｓｉｔｙ；発明者：　Ｂｒｕｃｅ　５ｔｏｃｋｅｒ　）には、ａｒｏ　Ａ及 びｐｕｒ　Ａ非可逆変異を有するＳ、　ｔｙｐｈｉ非可逆株の構築について記載 されている。非可逆変異とは、１つのステップでは修復できない変異を言う。こ の種の遺伝子的変異には、遺伝子の１部を構成するＤＮＡ配列の介在及び欠失な どがある。

本発明者の実験により、Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの＆ｒＯＡｐｕｔＡ非可 逆変異株を静脈内投与した場合には、ＢＡＬＢ１０マウスを静脈内チャレンジか ら保護することがほとんどできないことが明らかにされた。これらの変異株を経 口投与した場合にもＢＡＬＢ／Ｃマウスの保護効果はないことも明らかにされて いる（　０’　Ｃ！ａｌ’ｌａｇｈａｎｅｔａＬ、１９８８−　工ｎｆ　ｅ　ｃ 　ｔ、工ｍｍｕｎ、　５６．４１９−４２３）。

ａｒｏ　Ａ及びｐｕｒ　Ａ変異はトランスボ・戸ンを用いることによって達成す ることができる。トランスポゾンは、７５０塩基対ないし数千ヌクレオチド対の ＤＮＡ配列であって、遺伝子物質をバクテリアクロモシーム内の他の位置に組み 込むことのできるものである。いくつかのトランスボデンは、そのトランスボゾ ンを保持する生物に対して抗生物質耐性を付与する遺伝子をコードしている。ト ランスボゾンが遺伝子座内に挿入されると、遺伝子の連続性がしばしば損なわれ 、その結果、遺伝子の機能が失なわれる。トランスボ・ｔンは、約１０−８／セ ル／世代の頻度で遺伝子から正確に除去される。このために遺伝子の機能が回復 する。しかしながら、しばしば不正確なトランスポゾンの除去が起こる−このた めに遺伝子機能は回復されず、またしばしば、このために非可逆変異がもたらさ れることになる。

本出願のために実施した研究のいくつかは、ヒトの腸チフスの原因である９、ｔ ｙｐｈｉを中心として実施した。

８、　ｔ７ｐｈｉは本質的にはヒトの病原体であるため、はとんどの動物実験に は不適当である。モデルマウスとＳ、ｔ７ｐｈｉｍｕｒｉｕｍを用いて動物研究 を実施した。

Ｓ、　ｔ７ｐｈｉｍｕｒ　ｉｕ！ｎは、マウス及びウシにおいて腸チフス様の病 気を引き起こす関連性の深い生物である。このモデルマウスニツイては、Ｃｏ１ １１ｎｓ、　１９７４　。

ｎａｃｔｅｒｉｏＩＲ６１７，３８，３７１に記載されている。

微生物をワクチンとして使用するためには、微生物は次の特性を有する必要があ る。

（Ｉ）、その微生物に関連した感染症を実質的に引き起こさないように十分に弱 毒化されている；ＣＩＩλ有毒株に実質的に戻ることができない；皿λ　それを 接ｌした動物に免疫応答を誘導することができ、従ってその有毒株にチャレンジ された時に保護作用を発揮することができる。

先行文献に記載されたワクチンとして使用される生きた微生物は、上記の必要な 特性を全て具備していないと考えられる。しかしながら、生きたバクテリアの方 が死んだバクテリアよりもより有効な免疫効果を引き起こすことが明らかにされ ており（０ｏｌｌｉｎｓ。

ＢａｃｔｅｒｉｏＩＲｅｖ、　１９７４　）、従って、先行技術の欠点を克服し た生ワクチンを開発することが依然として望まれている。

木発明者は、バクテリアの芳香環合成経路に関連した遺伝子の２つの部分のそれ ぞれに非可逆変異を導入することにより、生ワクチン製剤用に好適な生物が得ら れることを見出した。

従って、本発明の第１の局面によれば、芳香環合成経路の遺伝子の区別された２ つの部分のそれぞれに非可逆変異を保持した弱毒化微生物が提供される。この微 生物はバクテリアが好ましい。

芳香族アミノ酸生合成経路における経路分岐点の化合物であるコリスメートの合 成に関与した遺伝子は少なくとも１０個存在する。バクテリアのゲノム中に広く 分布しているこれらの遺伝子のいくつかとして、ａｒｏ　Ａ　（５−エノールぎ ルビルシキメートー３−ホスフェートシンターぞ）、ａｒｏｃ（コリスメートシ ンターゼ）、ａｒｏ　Ｄ　（３−ジヒドロキネート　デヒｐラターゼ）　、ａｒ ｏＥ　（シキメート　デヒドロゲナーゼ）などがある。

しかして、本発明の好ましい態様は、変異の１つが、ａｒｏ　Ａ、　ａｒｏ　Ｃ ，＆ｒＯＤまたはａｒｏ　Ｋ遺伝子中に起こっている態様である。３つの好まし い態様として、本発明によれば、ａｒｏ　Ａ　ａｒｏ　Ｅバクテリア変異株、ａ ｒｏ　Ａａｒｏ　Ｄバクテリア変異株が提供される。勿論、他のａｒｏ　２重変 異株も本発明の範囲内のものである。

特に、本発明の研究は、バクテリア病原体の全範囲に広げることができ、特に真 核細胞内に侵入して生育するバクテリアまたは粘膜表面で増殖するバクテリアに 広げることができる。これらの例としては、Ｓ　ａｌ、ｍｏｎｅ　：Ｌｌａ、　 ＢＯｒｄｅ　ｔ　ｅｌｌａ、　Ｈａｅｍｏ　ｐｈｉ　１ｕ　ｓ、　Ｌ’ｅ　ｐｔ ｏ　ｓｐｉ　ｒ＆。

５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕａ属のバクテリアが挙げらる。具体的には、ヒトの腸 チフスの原因である５−ｔｙｐｈｉ　；いくっかの動物種でサルモネラ症の原因 となる８、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ＝ｎ；ヒトの食物毒の原因であるＳ、ｅｈｔ ｅｒｉｔｉｄｉθ；ブタのサルモネラ症の原因であるＳ、　ｃｈｏｌｅｒａｓｔ ｚｉａ　；百日ぜきの原因であるＢＯｒｄ　＠　ｔ＠　Ｎ１ａ　ｐ＠　ｒ　ｔｕ 　８　Ｂ　１８−　ｐ髄膜炎の原因であるＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆ’１ ｕｅｎｚａｅ　；結核の原因であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃ ｕｌｏｓｉｓ　；淋疾の原因であるＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｚｏｒｒｈｏｅａ ｅ　；腺ペストの原因であるＹｅｒｌｉｉｎｉａｐｅｓｔａｓなどが挙げられる 。

本発明の好ましい態様においては、ａｒＯＡａｒＯＣ。

ａｒｏ　Ａ　ａｒｏＥまたはａ：ｒｏ　Ａ　ａｒｏ　Ｄ非可逆変異を保持するＳ 、　ｔｙｐｈｉ株Ｔ７２が提供される。

Ｓ、　ｔｙｐｈｉ　Ｔ７２　ａｒｏ　Ａの構築についてはＭＧＧ　２　Ｑ　７　 。

４０２　（Ｄｏｕｇａｎ　ｅｔ　ａｍ　）に記載されている。非可逆変異は、Ｓ 、　ｔｙｐｈｉ　’ｒｙ　２株にＬＴ２　ａｒｏ　Ａ　：　：Ｔｎ　ｉ　Ｑｗ− カーを形質導入することによって誘導することができる。　Ｔｎ　）ランスポ・ 戸ンはテトラサイクリン耐性をコードする遺伝子を有している。テトラサイクリ ン耐性の形質導入体を、適当な培地上でコロニーを生育することにより選択する ことができる。更に、テトラサイクリン耐性遺伝子を欠失し芳香環化合物依存性 のものをスクリーニングすることによって選択することができる。

Ｓ、　ｔ７ｐｈｉ　ａｒｏ　Ａ遺伝子または他のＳ、　ｔｙｐｈｉ　ａｒｏ遺伝 子に欠損を導入する他の方法は、クローン化Ｂ、ｔｙｐｈｉａｒｏ　Ａ遺伝子を トランスボデン突然変異誘発し、得られる変異遺伝子を、野性型遺伝子を変異体 で１換したＳ、ｔ７ｐｈｉクロモシームＩＣ組換えにより導入し、トランスボゾ ンが正確に除去されたものを選択する方法である。この方？Ｆ、ＶＣよれば、非 ｓ、ｔｙｐｈｉ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ヲ”）　りｆ７株に導入する必要がない。

２つの非可逆的変異のうちの２番目の非可逆的変異を２番目の遺伝子に導入する 方法は原理的にはいくつかある。その１つの方法は、交換可能なエレメントを２ 番目の遺伝子に挿入し、第１番目の非可逆変異構築の場合と同様に上記したと同 じようにしてバクテリアによる正確なぞの又換可能なエレメントの除去を行なう 方法である。２番目のａｒｏ遺伝子に変異を導入することによって２重変異を誘 導することができる。このミｒにより生物中に導入され、適当な選択培地を用い て芳香ｆｆ１ｆヒ合物依存性についてチェックする。

他の方法は、２番目の遺伝子をプラスミｆやコスミドなどのベクターにクローニ ングし、次いでクローン化された２番目の遺伝子に選択マーカーを導入し同時に 該遺伝子を不活性化する方法である。不活性化遺伝子及び異なる選択マーカーを 有するプラスミドは、公知の技術によって生物中に導入することができる。次い で適当な選択を行なうことによって、不活性化遺伝子が生物自身のクロモ・戸− ムに組み込まれ該生物自身の遺伝子コぎ−が失なわれた変異株を同定することが できる。特に、使用されるベクターは生物中で不安定なベクターであり、生物中 にて自然に失なわれる。シラスミド上の変異遺伝子及びクロモ・戸−ム上の生物 自身の遺伝子コピーは、遺伝子的クロスオーバーにより交換される。このような 方法により、ワクチン株の変異部位に外来ＤＮＡを導入する必要がなくなる。

本発明のａｒｏ　Ａ　ａｒｏ　Ｑ変異株、ａｒｏ　Ａ　ａｒｏ　Ｅ変異株及びａ ｒｏ　Ａ　ａｒｏ　Ｄ変異株は、十分に弱毒化されておりワクチン用に使用する には実質的に安全であり、また患者の免疫応答を引き起こすのに十分に免疫原性 であり、患者が有毒株に合一された時に保護効果を発揮することができる。

本発明の株は、１つもしくはそれ以上の異なる病原体の抗原を発現するように遺 伝子的に改良することができる。このような病原体としては、ウィルス、バクテ リア、ゾロトＪア、あるいはより高等な寄生性生物が挙げられる。病原体はヒト 及び他の哺乳動物の両者に感染するものでもよ＜、糧選択的なものでもよく、ま た種特異的なものでもよい。このような株を構築することによって、２価もしく は多価ワクチンを得ることができる。有用な抗原の例としては、例えば、Ｆ、　 Ｃ０１１熱不安定毒累Ｂサデユニツト（ＬＴ−Ｂ）、Ｆｌ、ｃｏｌｉ　Ｋ　Ｆ３ ８抗原、ＦＭＤＶ（足踏）へ７’？）’、インフルエンデウイルスｌｌｘ　白、 Ｂ、　ｐｅｒｔｕθｓ１声の６９　Ｋｄ蛋白などが挙げられる。発現させるため に用いる有用な他の抗原としては、クラミジア、フルーク、マイコシ２ズマ、線 虫、サナダムシ、狂犬病ウィルス及びロタウィルスの抗原などが挙げられる。

これらの抗原は、これら抗原をコーＶする遺伝子を発現カセットに導入すること により産生ずることができる。発現カセット中には、構造遺伝子に加えて、更に 転写開始領域、翻訳開始領域及び終止領域が含まれる。発現カセット中には調節 領域も含まれていてもよい。このような発現カセットは当業界においては周知で あり、その構築法も当業者に周知である。発現カセットは構築物であってもまた 天然のシラスミドであってもよい。具種抗原を発現することのできる遺伝子工学 的に弱毒化されたサルモネラの１例は欧州特許出願１０１２７１５３Ａ（ＳＳＶ 工／ウエルカＡ）Ｉｃ記載されている。発現カセットは、外因性遺伝子をバクテ リアクロモデームに導入できるようにそれを改良することができる。

弱毒化Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉからなり、Ｌ　Ｃ０１１熱不安定性エ ンテロトキシンサブユニツトＢを発現することのできる２価ワクチンが、ｅｌｅ ｍｅｎｔｓ　ｅｔ　ａＬ。

Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎ（１１ｍｍｕｎｉｔｙ、　４６　ｓ　Ａ　２　、　Ｎ ＯＶ　１９８　Ｃｐ５６４−５６９に記載されている。また、Ｔ７２１＆が、Ｓ ｈｉｇｅｌｌａ　５ｏｂｎｅｉ型工抗原などの他の抗原を発現するために使用さ れている（　Ｆｏｒ＝ａ１ｅｔ　ａｍ、。

工ｎｆｅｃｔｉｏ″１ａｎｄ　工ｍｍｕｎｉｔｙ　３４　＋　７４６−７５０　 ）　ａ本発明の第２の局面によれば、病原体の抗原なコーＶする発現カセットで 形質転換された弱毒化バクテリアであって該バクテリアにおいて該抗原が発現さ れる本明細書において記載する弱毒化バクテリアが提供される。

本発明の第３の局面によれば、薬学的に許容し得る担体とともに本明細書で記載 する弱毒化バクテリアを含む薬学的組成物が提供される。好ましくは、この薬学 的製剤はワクチン製剤である。

ワクチンは、例えば経口投与用のカプセルに凍結乾燥された形態で存在するのが 有利である。このようなカプセルは、例えば、オイド？イツｒＳ１オイｒ？ギツ ）Ｌなどのセルロースアセテート、セルロースフタレート、ヒドロキシゾロぎル メチルセルロースＴｔ　トラ含む腸溶性被覆を有していてもよい。これらのカプ セルはそのまま用いるものでもよく、あるいは投与前にサスペンションなどとし て再調製して用いる凍結乾燥型であってもよい。このような再調製（：、生物の 生存性を確保するために、適当な−のバッファーで行なうのが有利である。弱毒 化バクテリア及びワクチンを胃液の酸から保護するために、ワクチンを投与する 前に重炭酸ナトリウム製剤を投与するのが有利である。あるいは、非経口、経鼻 、または乳房投与用にワクチンを調製してもよい。

また、本発明によれば、上記したワクチンの有効投与量を患者に投与することか らなるバクテリア感染の予防的治療法が提供される。このような治療法に用いる 投与量は、患者の大きさ、体重、ワクチンのタイプなどの各種の臨床的要素によ って変動する。しかしながら、弱毒化Ｓ、　ｔｙｐｈｉの場合には、７０ゆの成 人患者に対しては１回の投与当り１０ｇ−１０１１個のｓ、ｔｙ角１を投与する のが一般的である。

以下に、本発明による詳細な実験例を示す。しかしながら、これらの例は本発明 を限定するものではない。

スタート株として上に詳述したＳ、　ｔ７ｐｈｉ　Ｔｙ　２　ａｒＯＡ及びＤｏ ′：Ｌｇａｎ　ａｔ　ａｍ、、　ＭＯｌ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、（１９８７）２ ０７：４０２−４０５に記載されたものを用いて全ての株を構築した。

Ｃａ１ｇａｒ７のＳａ１ｍｏｎｓ’ユａ　５ｔｏｃｋ　ＣｅｎｔｒｅからＳ。

ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　ＬＴ２Ｋ　：　：　Ｔｎ　１０株を得た。これはＪ。

Ｒｏｔｈ　Ｋよって最初に単離されたものである。７アージＰ２２をＬＴ２　ａ ｒｏ　Ｋ　：　：　Ｔｎ　１０上テ生育セシメテ溶解物を調製した。Ｐ２２ファ ージ溶解物を用いてｓ、　ｔｙｐｈｉ　Ｔｙ　２　ａｒＯＡを形質導入し、テト ラサイクリン耐性に基づいて選択した。この時点で、ａｒｏ　Ａ変異を補足する ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　ｃ　５のクローン化ａｒｏ　Ａ遺伝子をコー２ するプラスミドを、Ｓ−ｆ；７１）ｈｉ　ａｒｏ　Ａ株に導入した。クローン化 ａｒｏ　Ａ遺伝子を保持するＳ。

ｔｙｐｈｉ　ａｒｏ　Ａ　ａｒｏ　Ｅ　：　：　ｒｎ　１０は芳香環化合物（通 常はａｒｏ変異株が要求する）依存性の表現型を示す。公知技術（Ｂｏｃｈｎｅ ｒ　ｓｔ　ａｌ、、Ｔ、ｌ３ａｃｔｓｒｉｏｌ、　１４３　、９２９−９３３） であるテトラサイクリン感受性変異株をＢｏｃｈｎｅｒ培地で選択する方法によ り、ａｒｏ　Ｅ遺伝子からＴｎ１０エレメントを除去した。クローン化ａｒｏ　 Ａ遺伝子を有するＳ、　ｔｙｐｈｉ　ａｒｏ　Ａａｒｏ　Ｅ変異株について、最 少培地を用いて芳香環依存性をチェックした。１０１１個の生物を芳香環化合物 欠損最少培地にプレートし、３７℃でインキュベートし、５日間に亘って復帰細 胞コロニーをチェックすることにより、芳香環依存性コロニーを選択し、ａｒｏ 　１変異復帰について十分なチェックを行なった。徹底したスクリーニングを実 施したにもかかわらず安定なａｒｏ　Ｅのコロニーを増殖せしめて、クローン化 ａｒｏ　Ａ遺伝子を自然に欠失した変異株を選択した。１つのＳ、ｔｙｐｈｉ　 ａｒＯＡ　ａｒｏ　Ｂ変異株が選択された。これを、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１ １ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　’ｒ７ｐｅＣｕｌｔｕｒｅｓ　（１５１−Ｃｏ１１ｎｄ ａｌｅ　Ａｖｅｎｕｅ、　）ｏｎｄｏｎ　ＭＷ　９５ＥＴ　）に１９８７年１１ 月２５日にブダペスト条約に基づき寄託し、受託番号ｋＬ１２１６４が付与され た。

スタート株としてＳ、　ｔｙｐｈｉ　ＴＴ　２ａｒｏ　Ａ株を用いた。

Ｈｏｈｎとｃｏｌｌｌｎｓ　（Ｇｅｎｅ　１１　：　２９１−２９８（１９７８ ））の方法を用いてＬ　ｃｏｌｉ　ａｒｏ　Ｃを補足するために、コスミドを使 用してｓ、　ｔｙｐｈｉ　ＴＴ　２のａｒｏ　Ｃ遺伝子をクローン化した。ａｒ ｏ　ｃコスミｒをトランスボゾン７ｎ　５突然変異誘発に付し、サブクローン化 して、クローン化ａｒｏ　Ｃ遺伝子なコーｒするＤＮＡ小断片を設けた。水銀耐 性遺伝子をａｒｏ　ｃをコードする領域にクローニングすることによりクローン 化ａｒ。

Ｃ遺伝子を不活性化した。不活性化ａｒｏ　Ｃ遺伝子を保持するシラスミＶをＳ 、　ｔｙｐｈｉ　ａｒｏ　Ａに導入した。このシラスミドはアンピシリン耐性遺 伝子も含んでいる。

水銀耐性及びアンピシリン耐性に基いて選択することにより、不活性化ａｒｏ　 Ｃ遺伝子がＳ、　ｔｙｐｈｉクロモシー１−に組み込まれＳ、　ｔｙｐｈｉ　ａ ｒｏ　Ａ　ａｒｏ　Ｃ変異が誘導された変異株を同定することができた。

水銀耐性遺伝子の代わりにカナマイシン耐性遺伝子（Ｋｌｌ）−Ｒ）を用いて構 築体を得ることもできる。

Ｓ、　ｔ７ｐｈｉ　Ｔｙ　２ａｒｏ　Ａ　ａｒｏ　Ｃ’Ｋｒ＝−Ｒを、１９８７ 年１１月２５日Ｋ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔ７ｐｅＣ ｕｌｔｕｒｅａ　（６１Ｃｏｌｉｎｄａ１ｅ　Ａｖｅｎｕｅ、１ｏｎｄｏｎ　Ｎ ａ９５ＨＴ）にブダペスト条約に基いて寄託し、受託番号罵１２１６５が付与さ れた。

スタート株としてＳ、　ｔｙｐｈｉ　ａｒｏ　Ａ株を用いた。Ｓ。

ｔｙｐｈｉ　ａｒｏ　Ａ　ａｒｏ　］）の構築は、Ｖナー株ＬＴ２　ａｒ。

Ｄ５５３：：ＴｎｌＯを用いて調製したＰ２２７７−ジ溶解物でＳ、　ｔ７ｐｈ ｉ　ａｒｏ　Ａ株を形質導入し、ナト２サイタリン耐性で選択することにより達 成される。１つの単離体を精製し、これを用いて、Ｂｏｃｈｎｅｒ培地で選択す ることによりテトラサイクリン耐性株を調製した。

これらのいくつかを、ａｒＯＡ欠失を補足するためにゾｙｘ　ミドＰＡＢ　５１ 　（ａｒ’　Ａ“）で形質転換した。このシラスミＡＰを保持している時に安定 な芳香環化合物依存法のテトラサイクリン感受性単離体の１つを８．ｔ７ｐｈｉ Ｔｙ　２　ａｒｏ　Ａ　ａｒｏ　Ｄとした。

異なるａｒｏ遺伝子において変異を有する構築された全てのＳ、ｔｙｐｈｉ株は ｖ１抗原を依然として産生じ、ボイル後においては０凝集不能でありまたｏ９凝 集不能であり、ペン電型Ｈａであった。このような株ａｒｏ　Ａａｒｏ　Ｄ株の １つをブダペスト条約に基づきＮａｔｉｏｎａＩＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　 Ｔｙｐｅ　Ｃｕ’１ｔｕｒｅｓ　（６１Ｃｏ１１ｎｄａｌｅＡｖｅｎｕｅ、　Ｌ ｏｎｄｏｎ）に寄託した。

ＭｃＦａｒｌａｎｄと５ｔｏｃｋｅｒの方法を用いてｓ、　ｔｙｐｂｊｍ訊ｏｍ ＳＬ　１３４４　、　Ｓ、ｄｕｂｌｉｎ及びＳ、　ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ　Ｉ ｃ　ａｒｏ　Ａ欠失を導入した。ＴＴ　４７２株から調製されるファージ溶解物 を用いて全てのＳａ１ｍｏｎｅｌｌａ株を形質導入し、テトラサイクリン耐性株 を選択した。ＴＴ４７２株は、上流のｓｓｒ　Ｃ内であってａｒｏ　Ａと同じオ ペロン内に挿入されたＴｎｌＯを有している。テトラサイクリン耐性形質導入体 （・；、芳香環化合物並びにセリン及びぎりｒキシン耐性である。第２のＰ２２ 溶解物を調製し８Ｌ５２５４で生育せしめた。これはａｒｏ　Ａ内に公知の欠失 を有している。これを用いて、５ｅｒｅ：：Ｔｎｌｏのテトラサイクリン耐性株 を形質導入し、セリンとビリレキシンを含んでいないが芳香環化合物は含んでい る最少培地で形質導入体を選択した。芳香環化合物を添加したがセリンとぎすｒ キシンを含まない最少培地で生育するコロニーは、テトラサイクリン感受性であ って芳香環化合物依存性である。

無毒性ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　Ｓ　Ａ　２０１８株の安定なａｒ。

Ｃ変異を、一連の形質導入によりマウス−有毒Ｓ。

ｔ７ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　ｓＩＪ　１３４４株に導入することによつ８、ｔｙｐ ｈｉｍｕｒｉｕｍ　ａｒｏ　Ａ　ａｒｏ　Ｃを構築した。Ｂ、苛釦ユ員＝ＢＧＳ Ｃ５９２ｚｓｉ　６０８　：　：　Ｔｎ　１Ｑ株を用いて調製したアク２形質導 入溶解物により、Ｔｎ　１０　ｆｔ５Ａ２０１８株に導入した。５ＧＳＣ！　５ ９２株中のＴｎｌＯはその４０％が野性型ａｒｏ　Ｃ遺伝子に連結しており、他 方、５ａ２０１８株は安定はａｒｏ　Ｃ変異を有している。テトラサイクリン耐 性形質導入体を最少培地でピックアップし、いくつかのコロニーは芳香環依存性 であることが見出された。これらの単離体の１つを精製し、第２のＰ２２ファー ジ溶解物の調製に用いた。この溶解物を用いてｓ、　ｔ７ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　 ｓ　ｐ　１３４４を形質導入し、再びいくつかのテト２サイクリン酎注であって 芳香環化合物依存性の形質導入体を同定した。１つの単離体を用いて、ＢｏＣｈ ｎｅｒ培地での選択によりテトラサイクリン感受性誘導体株を調製した。１つの テトラサイクリン感受性で芳香環化合物依存性の単離体を精製し、前記したＭＯ Ｐａｒｌａｎｄと９ｔｏｃｋｅｒの方法を用いてａｒｏ　Ａ欠失をそれに導入し た。この単離体がａｒｏ　Ａ　ａｒｏ　Ｑであることを確認するために、シラス ミドｐＡＢ５１　（ａｒｏ　Ａ”）または：９ＴＭＣ！１２Ｂ（ａｒｏ　ｃ＋） −ｃ−形質転ａＬ、ソレカコレらのシラスミーを保持している時に芳香環化合物 依存性であることを調べた。

例４ｂ Ｓ＋ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　ａｒｏ　Ａａｒｏ　Ｄの構築５Ｌ１３４４ａｒｏ Ａ株にａｒｏ　］）欠失を導入することによりＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　 ａｒｏ　Ａ　ａｒｏ　Ｄを構築した。これは、Ｖナー株ＬＴ２ａｒｏＤ５５３　 ：：Ｔｎｉ　Ｑを用いて調製したＰ２２ファーゾ溶解物でｓＬ１３４４ａｒＯＡ 株を形質導入しテトラサイクリン耐性に基いて選択することにより達成される。

１つの単離体を精製し、これを用いて、ＢＯＣｈθｒ培地で選択することにより テトラサイクリン感受性誘導体株を調製した。これらのいくつかを精製し、ａｒ ｏ　Ａ欠失を補足するためにシラスミ？　　ｐＡＢ５ｉ　（ａｒｏ　Ａ”）で形 質転換した。このシラスミｒを保持する時に安定な芳香環化合物依存性であるテ トラサイクリン感受性態離体の１つを５ｂ１３４４ａｒｏ　Ａ　ａｒｏ　Ｄとし た。

Ｓｌ　ｊ　３４４　ａｒｏ　ｈａ−ＫａｒＯＥ欠失を４人−ｊる。：、？−によ りＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　ａｒｏ　Ａ　ａｒｏ　Ｅを構築した。これは 、Ｖナー株ＬＴ２ａｒＯＥ：：ＴｎｉＱを用いて調製したＰ２２７アージ溶解物 でＳＬ　１３４４　ａｒｏ　Ａ株を形質導入しテトラサイクリン耐性に基づき選 択することにより達成される。１つの単離体を精製し、これを用いて、ＢＯＣｈ ｎｅｒ培地で選択することによりテトラサイクリン感受性誘導体株を調製した。

これらのいくつかを精製し、ａｒｏ　Ａ欠失を補足するためにプラスミド１）Ａ Ｂ　５１　（ａｒｏ　Ａ”）で形質転換した。このシラスミｒを保持している時 に安定な芳香環化合物依存性のテトラサイクリン感受性単離体の１つを５Ｌ１３ ４４ａｒｏＡａｒｏ　Ｅとした。

例４ｂに示したＳＬ　１３４４　ａｒｏ　Ａ　ａｒｏ　Ｄ誘導体株と同様にして 、Ｓ、　（ｉｕｂ’ｌｉｎ及びＳ、　ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ　ａｒｏ　Ａａｒ ｏ　Ｄ誘導体株を構築した。

弱毒化Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株のｉｎ　ｖｉｖｏ　特性本研究に用いた Ｂ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株の詳細は表１に示ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの ｉｌ、ｎｔｉ、ｖ、接種後の各種器官での生物の数を測定するために、Ｈｏｒｍ ａｅｃｈｅ、　ＣＥ、　Ｉ−ｎｏｌｏｇｙ。

３７．３１１〜３１８に記載されたと同様の方法により肝臓と牌朦をホモジナイ ズした。生育培地としてＬ−アが−を用いてこれらのホモジエネートについて生 存生物数を測定し、１つの場所当りの４匹のマウスについての相乗平均上平均の ２つのスタンダードエラーで図面に表わした。

例６，７及び８では、８−１０週令のＳａ１ｍｏｎｅｌｌａ感染が疑われるＢＡ ＬＢ／Ｃマウスを用いた。一連）１０倍希釈液で１群５匹のマウスに注射するこ とにより有毒株について静注（１，Ｖ、）　ＬＤ５．を得た。この希釈液は、遠 心により採取した１晩Ｌ−ブロース培養液をＰＢＳに再懸濁して濃度１０９．− １０１１個バクテリア／−としたものであってリン酸バッファー生理食塩水ｐＨ ７，２（ＰＢＳ）溶液として調製されたものである。これはＰＢＳに１０倍で希 釈された一連の希釈液であり、その最高Ｖ−ズはニートサスペンション０．２　 ｍｇ　テアリ、１群８−１０匹のマウスに１．ｖ、または経口により投与された 。４週間後の死亡数を記録し、ＲｅｅｄとＭｕｅｎｃｈの方法（Ａｍ、Ｊ、Ｈｙ ｇ、２７：４９３−４９７（１９８３））によりＬＤ５ｏを算出した。１．ｖ、 接種の場合には、バクテリアサスにンジョン０．２−を尾静脈からマウスに投与 した。経口接種の場合には、Ｍｉｃｒｏｂｉａ’ｉ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ２：２１１−２２１に記載されたようにしてギャペジによりエーテルでわずかに 麻酔したマウスに０．２−のバクテリアを投与した。

例６ 安定なａｒｏ　ｆ異及び他の栄養要求性変異を導入することによる有毒な１；４ ．　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株の弱毒ｆヒＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　ＨＷ ＳＨと５Ｌ１３４４とは、ＢＡＬＢ／ｃマウスに１．ｖ、チャレンジした場合に １０生物より小さいＬＤｓｏ値を有するマウス有毒株である。静注ＬＤｙ、０値 は、これらの株の特定の栄養要求性変異株をＢＡＬＢ／Ｃマウスに投与した場合 について求めたものである（表２）。全てのａｒｏ　Ａ及びｐｕｒ　Ａ変異株は 、親株に比べてよく弱毒化されていた。Ｈ’ＷＳＨａｒｏ　Ａと５Ｌ３２６１　 （ＳＬｌ　３４４ａｒｏＡ）はそれぞれ１０ｇ７．４．１ｏｇ　７．１のＬつｂ Ｏ値を有しており、報告データとよく一致していた。ｐｕｒ　Ａ及びａｒｏ　Ａ 　ｐｕｒ　Ａ誘導体株は更に弱毒化されていた。ＨＷＳＨｐｕｒ　Ｅ株の測定Ｌ Ｄ５０値は実験によりかなり変動したが、あまり弱毒化されていなかった。例え ば、ある場合には１００個というわずかの生物を与えた時でもマウスは死亡し、 他方、他の場合にはｉ　ｏ’−ｉ　ｏ’ａの生物を与えてもマウスは生存し続げ た。ａｒｏ　Ｃａｒｏ　Ａ変異株は、６．５のＬＤ５０値を有するａｒｏ　Ａ　 ｐｕｒ　Ａ　ｆ異株よりも弱毒化されていなかった。これは単−ａｒｏｃｉ異株 の場合と同様であった。芳香環化合物変異株またはプリン変異株を経口投与した 場合には、１０１０個の生物という高投与量を与えた時でもマウスは死亡しなか った。

全ての８．　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株は非常に似た持続性パターンを示し、５ ６日目まで牌朦中でＳａ’１ｍｏｎｅｌｌａは検出されなかった（第１図ン。

経口投与ワクチンとしての弱雰化Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株例８ 有毒Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｑｒｉｕｍ　（Ｓ　Ｌ　１３４４　）をＢＡＬＢｌｏ　 マウスに経口チャレンジした場合における栄養要求性Ｓ、　ｔ７ｐｈｉｍｕｒｉ ｕｍ株を経口投与した時の保護効果を調べた。１０’−１０”個の栄養要求性変 異株を経口的にマウスに感染させ、次いで４週間後にこの免疫化マウスに有毒な 親株を経口的にチャ外した。

表３の結果から、：Ｄｕｒ　Ａ変異株とａｒｏ　Ａ　ｐｕｒ　Ａ変異株のいずれ も経口チャレンジに対して有意な保護効果を示さず、他方、ａｒＯＡ、１ＬｒＱ 及びａｒｏ　Ａ　ａｒｏ　Ｃｆ異株の場合には、免疫後２８日目及び７０日目の 両方で経口チャレンジに対して有意な保護効果を示したことが判る。

本発明の弱毒化Ｓ、　ｔｙｐｈｉ生物は経口投与用錠剤の形、　　態で好ましく 提供される。

［１１１０９−１０１０個のＳａｌｍｏｎｓｌｌａ　ｔｙｐｈｉを含有する凍結 乾燥賦形剤担体　　　　７゜（２）シリカシオキサイＶ（エアロジル２００）　 　　　Ｑ、５（３）シバツク（９７％シュクロース）　　　　２３５．０（４ン 架橋化ボビＶン（コリトンＣ！Ｉ、）　　　　　　　　７．０（５）微結晶セＡ Ｏ−ス（アビーｔルｐＨ１０２）　　　　３５．０（７）オパげ２イ腸溶性０Ｙ −Ｐ−７１５６（ポリビニルアセテート７タレート 十ゾエチルフタレート）　　　　　　　　３．５０水性溶媒中に５％シュクロー ス、１％ナトリウムグルタメー）及び１チバクトカ・ント７　（ｂａｅｔｏ　Ｃ ａ５ｔＯｎ８）を含む担体を調製する。この担体にＳ、ｔｙｐｈｉ生物を懸濁せ しめ、次いで凍結乾燥した。

凍結乾燥物をエアロジル２００とプレンｒし、得うれるプレンｒ混合物をスクリ ーンに通してふるい分げした。ふるい分けして得た粉末をシバツク、コリトンＣ Ｌ、アビセルＰＨ１０２及びステアリン酸マグネシウムとプレングー中で混合し た。このプレンＶ物を圧縮してタブレットとし次いで腸溶性被覆を付した。

この製剤中の多くの成分は、機能的に等価の薬学的に許容し得る他の賦形剤と置 換し得ることは当業者には理解されよう。

表１ ＳＬ１３４４　　　　　　　　　胚旦 ＨＷＳＨ”　　　　　　　　　　光栄養性骨：マウス有毒及びウシ有毒株はサル モネラ症で死にかかったウシから単離した。

表２ ２つの高度に有毒なり、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株２の各種栄養要求性誘導体 株をＢＡＬＢ／ｃマウスにｉ、ｖ、感染させることによってＬｏｇ　ＬＤ５ｏを 得た。

Ｌｏｇ　ＬＤ５ｏ　　　　　　　　　　　　Ｉｊ）ｇ　ＩＤ５ＱｓＬ１３４４　 　　　　　　　＜１Ｈ’ＷＳＥ　　　　　　　　＜１ＳＬ３２６１　　　　　　 　　６．９　　　　ＨＷＳＨａｒｏ　Ａ　　　　　７．４ＳＬｉ３４４　ｐｕｒ 　Ａ　　　　　６．７　　　　ＨＷＳＨｐｕｒ　Ａ　　　　　８．６ＳＬ３２６ １　　ｐｕｒ　Ａ　　　　　８．７　　　　ＨＷＳＨａｒｏ　ｐ、　ｐｕｒＡ８ ．９ＳＬ１３４４　”’　旦６．７　　　　ＨＷＳＨｐａｒ　Ｋ　　　　　　ｚ 、、Ｂそれ以外の全てのＬＤ、ｏは２８日後に計算した。

５Ｌ３２６１　　　　　　　＞　１０・１９°１非免疫化　　　　　　　７．４ 　　　　　６．７ノート：　５Ｌ３２６１はａｒｏ　Ａ株である。

手続補正書（自発） 平成１年１１月６日

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）芳香環合成経路に関与した２の別々の遺伝子のそれぞれにおいで非可逆変 異を有する弱毒化微生物。
2. （２）微生物がバクテリア病原体である請求の範囲第１項記載の弱毒化微生物。
3. （３）バクテリア病原体が侵入性生物である請求の範囲第２項記載の弱毒化微生 物。
4. （４）非可逆変異の１つがａｒｏＡ遺伝子において起こつている請求の範囲第１ 項−第３項のいずれか１項記載の弱毒化微生物。
5. （５）２番目の非可逆変異がａｒｏＣ、ａｒｏＤまたはａｒｏＥ遺伝子の１つに おいて起こつている請求の範囲第１項−第４項のいずれか１項記載の弱毒化微生 物。
6. （６）微生物が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｈａｅｍｏｐ ｈｉｌｕｓ、Ｌｅｐｔｏｓｉｐａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅ ｒｉａ及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ属から選ばれる請求の範囲第１項−第５項 のいずれか１項記載の弱毒化微生物。
7. （７）微生物が、Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓ．ｄｕｂｌ ｉｎ及びＳ．ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓから選ばれる請求の範囲第１項−第６項の いずれか１項記載の弱毒化徴生物。
8. （８）ａｒｏ　Ａ　ａｒｏ　Ｃ、ａｒｏ　Ａ　ａｒｏ　Ｅまたはａｒｏ　Ａ　ａ ｒｏＤ非可逆変異のいずれかを有するＳ．ｔｙｐｈｉ株Ｔｙ２。
9. （９）受託番号Ｎｏ１２１６４または１２１６５として寄託さてているＳ．ｔｙ ｐｈｉの弱毒株。
10. （１０）異種抗原を発現することのできる請求の範囲第１項−第１０項のいずれ か１項に記載の弱毒化徴生物。
11. （１１）異種抗原の構造遺伝子をコードするＤＮＡ配列を有する発現カセットを 含む請求の範囲第１項−第１０項のいずれか１項に記載の弱毒化徴生物。
12. （１２）哺乳動物の治療または予防的治療に用いるための請求の範囲第１項−第 １０項のいずれか１項に記載の弱毒化微生物。
13. （１３）ヒトの腸チフスの予防的治療に用いるための請求の範囲第８項または第 ９項記載の弱毒化Ｓ．ｔｙｐｈｉ生物。
14. （１４）薬学的に許容し得る賦形剤とともに請求の範囲第１項−第１０項のいず れか１項記載の弱毒化バクテリアを含む薬学的組成物。
15. （１５）第１のａｒｏ遺伝子に第１の非可逆変異を有する微生物の第２のａｒｏ 遺伝子に第２の非可逆変異を導入することからなる弱毒化微生物の製造方法。
16. （１６）第２の変異がトランスポゾン突然変異誘発により導入される請求の範囲 第１３項記載の方法。
17. （１７）第２のａｒｏ遺伝子の非可逆変異を組み込んだベクターで微生物を形質 転換し、第２のａｒｏ遺伝子の変異が微生物自身のクロモゾーム内に組み込まれ た生物を選択するためにスクリーニングすることからなる請求の範囲第１３項記 載の方法。