CN103316371A - 制备卵囊的改进方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制备卵囊的改进方法。具体地说，本发明提供改进的制备卵囊的方法和组合物。根据本发明制备的卵囊用于制备疫苗。在优选实施方案中，本发明提供制备艾美虫卵囊的方法和组合物。根据本发明制备的含有艾美虫卵囊、孢子囊和/或子孢子的疫苗用于卵内或孵化后的鸟类抗球虫免疫。
Description
本申请是申请日为2002年8月29日，申请号为200810149286.4，发明名称为“制备卵囊的改进方法”的发明专利申请的分案申请。
相关申请资料
本申请要求2001年8月30日提出的美国临时申请号60/316310的权益，其全部内容通过引用结合到本说明书中。
技术领域
本发明提供制备来源于原生动物的卵囊的方法和组合物；特别地，本发明提供制备艾美虫(Eimeria)卵囊的方法和组合物。
背景技术
家禽球虫病是艾美虫属原生动物寄生虫所致的疾病。艾美虫类的卵囊普遍存在于环境并且在家禽垃圾中持续存活多个月。食入卵囊能以种特异性方式导致消化道多个部位的感染。这些生物体在消化道内的增殖超过数日，结果使其下一代卵囊排泄于粪便中。重复周期感染导致免疫，并且当家禽接受早期感染且家禽之间的剂量均一，经过几个周期接触后可以形成相当巩固的免疫力。
相反，当禽类未以均一的方式接受感染，可能引起从未感染过的禽类受到突然、严重感染的情形，导致饮食转化能力以及体重增加的降低，以及较高的二次感染的危险。目前，家禽工业中用于控制球虫病的最常见方法不是疫苗接种，而是在食物中给予抗球虫药。接种率低常常是由于通过操作便利的饮食或饮水或通过孵化场喷洒接种的给药均一性不可靠，这些是传统的给药途径和时间。对改善孵化场给药期间的给药均一性的关注正在逐渐增加。
近来，已建立的卵内接种技术适用于以活卵为基础的球虫疫苗给药(WO96/40234和WO96/40233；Pfizer，Inc.)。这种卵内给药途径提供了一种对仍在禽卵中的各个胚胎给予均一剂量的疫苗的便捷方法。卵内给予禽疫苗现在应用于美国每年生产的90亿只童子鸡中的约85％，以及百分比渐增的在美国之外每年生产210亿童子鸡(例见，美国专利号4458630)。因此，活的、卵内给药的球虫疫苗的潜在市场显著大于孵化后给予球虫疫苗的当今市场。
采用于球虫活疫苗的卵囊来源于原先严重富含污染微生物的鸡粪。通常，管理单位要求卵内给药疫苗应当表明基本不存在污染微生物。为最彻底地保证终产品中的生物负荷水平最小，在卵囊制备过程的各步骤中采用有效控制微生物污染水平的组合物和方法是有益的，包括收集和孢子形成步骤以及灭菌步骤。
目前疫苗制备中制备卵囊的方法的缺陷在于经常使用对设备有害或腐蚀的材料。
因此，本领域内需要一种改进的由原生动物制备卵囊的方法，尤其是用于制备疫苗。
发明内容
本发明涉及改进的制备原生动物卵囊(例如，艾美虫)的方法和组合物，例如用于制备疫苗。尤其在家禽疫苗方面，本发明适合于制备孵化后或卵内使用的疫苗。同样，该疫苗可以用于童子鸡、蛋鸡、种鸡、火鸡、小马和/或家禽产业。
相应地，第一个方面，本发明提供一种用于制备卵囊的组合物，其包括过氧化合物和有机酸，所述组合物具酸性pH值。该组合物可以用于原生动物卵囊的收集、孢子形成和/或灭菌。
由此，另一方面，本发明提供一种收集动物粪便中的原生动物卵囊的方法，其包括步骤：(a)提供原生动物感染的动物，其中动物在其粪便中排泄源自原生动物的卵囊，和(b)使来源于感染动物的含卵囊的粪便与包括过氧化合物和有机酸的组合物接触。
在特定的上述实施方案中，从组合物中撤除或者过氧化合物或者有机酸，特别是当被用作收集介质的时候。
另一方面，本发明提供一种使原生动物卵囊形成孢子的方法，其包括步骤：(a)提供一种包括原生动物卵囊的组合物，和(b)在适合孢子形成的条件下使卵囊在包括过氧化合物和有机酸的组合物中持续一定时间形成孢子。
再一方面，本发明提供一种使原生动物卵囊消毒的方法，其包括：(a)提供一种包括原生动物卵囊的制品，和(b)在足以达到对所述制品的需要消毒水平的条件下在包括过氧化合物和有机酸的组合物中使卵囊消毒一定时间。
又一方面，本发明提供一种用于纯化原生动物卵囊的浮选介质，其包括高密度、非离子溶液和聚阳离子。在另一种实施方案中，本发明提供一种用于纯化原生动物卵囊的浮选介质，其包括高密度、非离子溶液和油。
本发明也提供一种通过浮选而纯化原生动物卵囊的方法，其步骤包括：(a)在上述浮选介质和大量原生动物卵囊之间形成悬浮液，(b)让悬浮液分层，和(c)从分层的悬浮液中收获原生动物卵囊。
本发明上述方面的一种特定实施方案中，原生动物包括艾美虫属的物种并且动物对象为禽类。
再一方面，本发明提供一种由禽类制备原生动物卵囊的方法，其步骤包括：(a)用原生动物感染禽类足够时间，使原生动物卵囊在感染禽类对象粪便中排出，(b)从感染禽类对象收集含卵囊的粪便，以及(c)在所述收集步骤之前至少约1天以及在所述收集步骤的至少部分阶段以平均大粒径的食物喂饲感染的禽类对象。在特定实施方案中，原生动物包括艾美虫属物种。
在以下说明书中更加详细地阐述本发明的上述和其它方面。
具体实施方式
现参照本发明之优选实施方案描述本发明。然而，本发明可以以不同的形式实现并且不表明受本说明书所提出的实施方案限制。此外，提供这些实施方案是使本公开充分彻底，并向本领域内技术人员完整表达本发明之范围。
除另有说明外，本发明中所采用的所有技术和科学术语与本发明所属领域内的一般技术人员的常规理解具有相同的意思。在本发明说明书中所采用的术语的目的仅仅是描述特定实施方案而无意于限制本发明。
本说明书提及的全部出版物、专利申请、专利、以及其它参考文献均以其全部内容通过引用结合到本说明书中。
本发明说明书中所采用的术语的目的是仅仅是描述特定实施方案而无意于限制本发明。本发明说明书及所附权利要求中使用的单数形式“一”、“一种”和“该(所述)”意思也包括复数形式，除非正文另有明确说明。
本发明适用于药用和兽用。术语“动物”和“动物对象”包括但不限于哺乳动物和禽类对象，优选是禽类对象。
合适的哺乳动物对象包括但不限于人、猿、猪、牛、山羊、马、猫、绵羊、犬、小鼠和兔类(lagamorph)对象。
本说明书所用术语“禽类”和“禽类对象”或“鸟类”和“鸟类对象”包括雄性和雌性任何禽类或鸟类，但主要是包括目的是获得禽卵、禽肉或作为宠物的商业饲养的家禽。因此，术语“禽类”和“禽类对象”或“鸟类”和“鸟类对象”优选包括鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉鸡、长尾鹦鹉、鹦鹉、美冠鹦鹉、澳洲鹦鹉、鸵鸟、鸸鹋等。鸡和火鸡为优选的禽类或鸟类对象，以鸡为最优选。
本发明总体涉及制备原生动物卵囊的方法和组合物。已发现这些方法和组合物可用作例如制备疫苗的方法。许多原生动物具有被称作为“卵囊”的生活阶段。本发明应用于从任何原生动物物种制备卵囊，包括但不限于艾美虫属、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、弓形体属、疟原虫和等孢子球虫属。在本发明的实施方案中，本发明用于制备艾美虫卵囊。
术语“原生动物”、“卵囊”、“孢子囊”、“子孢子”和“裂殖子”具有它们在本领域内公认的意思。除另有说明外，这些术语的意思指活的原生动物、卵囊、孢子囊、子孢子和裂殖子，尽管本领域内技术人员能够理解可以采用灭活的(或减毒的)原生动物、卵囊、孢子囊、子孢子和裂殖子制备疫苗。
术语“艾美虫”是指艾美虫属的一个或一个以上的物种。这些艾美虫物种包括那些存在于鸡的种类，包括禽艾美虫(E.tenella)，堆形艾美虫(E.acervulina)，巨型艾美虫(E.maxiam)，尼氏艾美虫(E.necatrix，)和缓艾美虫(E.mitis)，塞前艾美虫(E.praecox)，E.mivati和波氏艾美虫(E.brunetti)，以及那些存在于火鸡的种类，其包括E.meleagrimitis，E.adenoeides，E.gallopavonis，E.dispersa，E.innocua和E.subrotunda。术语“艾美虫”还包括感染其它鸟类或哺乳动物物种的艾美虫属的品系或物种。此外，术语“艾美虫”包括上述艾美虫属物种的所有品系，包括但不限于野生型品系、早熟型或其它选育品系、减毒品系以及已经减毒的卵囊，例如通过辐照、化学处理等减毒。而且，术语“艾美虫”还包括任何新发现的艾美虫品系或物种。最后，术语“艾美虫”包括活的和灭活的艾美虫，尽管除另有说明外是指活的艾美虫。
包括艾美虫卵囊的组合物发现可应用于抗球虫病的鸟类免疫方法。抗球虫病的鸟类接种方法在本领域内是已知的，包括卵内(例如，国际专利公开WO96/40234和WO9640233；Pizer Inc.)和孵化后(例如，Edgar的美国专利号3147186；McDonald等的美国专利号5055292；以及Shirley等的美国专利号4438097)的接种方法。
本领域内技术人员能够理解卵囊可以进一步处理以给予其它生命阶段(例如子孢子或孢子囊)以用于最终疫苗组合物，或制备符合接种目的原生动物蛋白。
此外，术语“原生动物”包括野生型品系、早熟型或其它选育品系、减毒品系、以及已经减毒的卵囊，例如经过辐照、化学处理等。而且，术语“原生动物”还包括任何新发现的原生动物品系或物种。最后，术语“原生动物”涵盖活的和灭活的原生动物，尽管除另有说明外是指活的原生动物。
术语卵囊的“制备”包括感染动物(例如鸟)和收集含有卵囊的粪便、形成孢子、纯化和/或消毒卵囊等步骤。因此，术语“制备”是指从动物中收获卵囊以及从粪便材料中纯化卵囊的全过程或指该过程中的单个步骤(或一个从属步骤)。
除另有说明外，用于本说明书的卵囊制备方面的术语“纯化”是指从含有卵囊的制品中分离或去除碎屑或其它不需要的物质。这些术语意思是指提高从存在于粪便的其它物质中提取或分离卵囊的程度，并非从卵囊制品中绝对去除所有其他物质。类似地，卵囊制品可以含有一定程度的污染微生物，只要其最终制品适合其预定用途(例如，作为疫苗)。在疫苗拟用于卵内给予鸟类的情况下，在特定实施方案中，其制品应当完全没有可检测到的微生物污染，尤其是对胚胎有致病作用(即，导致显著的疾病或死亡)的微生物。
根据情况，“纯化”过程可以是指从粪便中纯化卵囊以制备适合疫苗接种目的的制品的全过程。或者，“纯化”过程可以是指全部纯化流程中的任何从属步骤甚或单一步骤。
本发明提供制备卵囊(例如，艾美虫卵囊)的方法和组合物。所制备的卵囊一般具有充分的感染性、活性和纯度以生产用于免疫接种的免疫原性组合物。本发明的方法和组合物可以与本领域内已知的其它方法结合使用。类似地，本发明之各种方法和组合物可以单独或相互结合使用。
卵囊例如艾美虫卵囊的制备方法是本领域内已知的(例见，Edgar的美国专利号3147186；Davis等的美国专利号4544548和4863731；国际专利公开WO00/50072(Pizer Inc.)，以及国际专利公开WO02/37961(Novus International，Inc.)；Hammond等，(1994)Amer.J.Vet.Res.5：70；Hill等，(1961)J.Parasit.47：357；Jackson，(1964)Parasitology54：87，Lotze等，(1961)J.Parasit.47：588；Schmatz等，(1984)，J.Protozool.31：181；Whitlock，(1959)Aust.Vet.J.35：310)。一般地，这些方法涉及以相应的原生动物感染动物，收集含有卵囊的感染动物粪便，通过一系列分离步骤纯化卵囊例如过筛、离心、过滤和/或密度浮选从粪便性材料纯化卵囊，使卵囊形成孢子，任选添加分离步骤，以及任选对形成孢子的卵囊进行消毒以灭活污染微生物(包括细菌、霉菌、真菌、酵母和病毒)。不同卵囊制品(例如，来源于不同种类或品系)可以联合组成最终产品，例如，抗多种原生动物(例如，艾美虫)的疫苗。
术语“微生物污染”或“被微生物污染”是指存在可检测的有害的活体微生物，其包括但不限于细菌、霉菌、真菌、酵母和病毒。在特定实施方案中，其卵囊制品基本没有可检测的污染微生物，即在制品中检测不到显著水平的污染微生物。
缩略词“v/v”是指“体积/体积”。类似地，缩略词“w/v”是指“重量/体积”。
下文更详细地描述本发明的各个方面。
免疫原性组合物
采用本发明方法制备的免疫原性组合物可以给予动物对象以免疫接种抗原生动物病。可以给予含有采用本发明方法制备的卵囊的免疫原性组合物(例如，疫苗)以引起免疫反应。典型地，该免疫原性组合物包括与药学上可接受的载体相结合的本说明书公开的免疫剂量的卵囊。“免疫剂量”是卵囊的剂量足以引起或激发免疫原性组合物给药对象的免疫反应。如本领域内技术人员所理解的，免疫原性组合物可以用活的、减毒的和/或灭活的生物体配制。在卵内给予活的球虫疫苗情况下，其卵囊剂量一般足以产生相对低水平的初始感染，其后继以多轮再感染，通过反复多次感染导致免疫。上述讨论针对卵囊，但也适用于其它生命体，例如，子孢子或孢子囊。
以“药学上可接受的”表示一种并非生物学或其他方面不希望的物质，即，该物质可以给予对象而不产生任何不希望的生物学作用。因此，这种药用组合物可以用于例如制备免疫用组合物。生理学和药学上可接受的载体可以包括其它化合物，包括但不限于本领域内已知的稳定剂、盐、缓冲剂、佐剂和/或防腐剂(例如，抗菌、抗真菌和抗病毒剂)。药学上可接受的载体并非必须无菌，尽管其通常被卵内给予禽类胚胎。
可以采用本领域内已知的免疫原性组合物的任何给药途径，只要能激发抗原生动物的活性免疫反应(优选保护性免疫反应)。当对象为鸟类时，该免疫原性组合物可以卵内或孵化后给予。实例性给药途径有孵化后口服给药或卵内注射到羊膜中。在特定的本发明实施方案中，用自动注射装置卵内给药。
术语“接种”或“免疫”是本领域内所熟知的。例如术语接种或免疫可以理解为一种增强对象对抗原的免疫反应的过程，并由此增强其对抗或克服感染的能力。对抗艾美虫的鸟类卵内免疫方法在本领域内是已知的(例如，国际专利公开WO96/40234和WO9640233；Pfizer，Inc.)。
本说明书中使用的术语“保护性免疫”或“保护性免疫反应”是指寄主动物建立起针对疫苗的免疫反应，由此在其后接触或被攻击时，该动物能够抗击感染。因此，在处理动物中保护性免疫反应将减少以后接触病原体时的发病和死亡事件。本领域内技术人员能够理解在商业性动物饲养体系中，评价所产生的保护性免疫反应是评价疫苗接种在全体禽或兽群中的作用，例如，在极少数免役接种动物中可能仍然有疾病或发病以及死亡的现象。
“活性免疫反应”其意思是在以后接触原生动物或原生动物抗原后对对象群体具有一定益处的任何水平的保护作用，无论其形式是降低发病、减少病变、改善食物转化率、或减少疾病的任何其它有害作用等等，无论其预防作用是部分的还是完全的。“活性免疫反应”或“活性免疫力”的特征是“参与接触免疫原后的寄主组织和细胞。其涉及淋巴网状系统中的免疫活性细胞的分化和增殖，其导致抗体合成或促进细胞介导的反应活性或两者兼有”。Herbert B.Herscowitz，Immunophysiology：Cell Function and Cellular Interaction in AntibodyFormation(免疫生理学：抗体形成中的细胞功能与细胞间相互作用)，见IMMUNOLOGY：BASIC PROCESSES(免疫学：基本过程)117(Joseph A.Bellanti主编，1985)。换句话说，活性免疫反应是通过感染，或如本发明情况下，通过接种使寄主接触免疫原之后建立起来的。活性免疫力可以与被动免疫力相区别，后者通过“从已被主动免疫的寄主把预先形成的物质(抗体、转移因子、胸腺移植物、白介素-2)到未免疫寄主”获得的。
卵囊收集与孢子形成
卵囊典型地收集于感染动物的粪便，然后在获得感染力之前在氧气存在下形成孢子。根据多种常规方法，卵囊在含有2.5％重铬酸钾的溶液中收集并形成孢子。重铬酸钾充当抗菌溶液并作为卵囊孢子形成的氧气来源。然而，重铬酸钾是有害物质并且作为有害废物需要特殊处理。根据常规方法，从卵囊制品中去除重铬酸钾以制备基本不含这种有害化合物的最终产品。
根据先有技术方法，含有卵囊的粪便在各个物种的产出高峰期期间以含有重铬酸钾的干燥或液体介质收集(例如，在接种艾美虫后约三、四或五天至约六至九天)。在收集阶段之后，然后采用例如过筛或密度浮选技术将卵囊从粪便杂物中初步分离，然后置于新鲜的重铬酸钾介质中，搅拌，并通气48至72小时以促进孢子形成过程。
在Edgar的美国专利号3147186中，描述的艾美虫卵囊孢子形成是采用1％至4％重铬酸钾作为孢子形成介质。该专利申明“该化合物满足作为抗细菌、抗真菌、和抗病毒剂并且还在孢子形成期间及其后为卵囊提供氧气以保持其活力的多重目的(Col.11，47-50行)”。
Ryley等(1976)Parisitology73(3)：311-326，描述了采用2.5％的重铬酸钾溶液作为收集、孢子形成、和长期贮藏介质。
Cost89/820，生物技术，球虫病研究技术指南，Eckert，J.，R.Braun，M.W.Shirly，及P.Coudert，编著，1995，欧洲委员会，董事会总则XII，科学、研究和发展，农业生物技术，卢森堡，第8页，也描述了在卵囊制备中采用2.5％的重铬酸钾。
本发明提供一种收集卵囊的介质，该收集介质包括过氧化合物和有机酸。该收集介质优选具有控制有害微生物生长的酸性pH值(例如，低于约pH7、6、5、4或3)并且还可以含有其它抗微生物化合物。在特定实施方案，收集介质的pH值在约pH1至约pH3范围内。
卵囊可以从感染动物的粪便、盲肠核、肠内层等之中收集。然而，由于商业目的，其卵囊典型地收集于粪便。这些粪便与收集介质接触，后者可以达到一种或一种以上的目的，例如，其可能具有抗微生物(例如，抗细菌、抗真菌、抗病毒等)特性和/或提供氧气以保持卵囊活力。收集介质中的氧气还可以在收集期间诱导孢子形成并且可能缩短或甚至取消独立的孢子形成步骤。
粪便或卵囊“收集”于本发明收集介质中，其并非必须将粪便/卵囊直接收集于收集介质。可以收集“干的”粪便/卵囊然后转移到本发明之收集介质中。在本发明实施方案中，在粪便产生后约0.25、0.5、1、2、4、12、24、36或48小时之内将粪便/卵囊转移到本发明之收集介质中。在描述性实施方案中，以传送带或倾斜表面接受含有卵囊的粪便然后转移到含有本发明之收集介质的收集容器中。在转移(即在传送带或倾斜表面上)到收集容器期间可以用收集介质喷洒粪便。
粪便与收集介质的比率没有限定，只要其足以控制微生物生长并且，如果需要的话，引起孢子形成过程。粪便与收集介质的实例性比率是约1∶0.25、约1∶0.5、约1∶1、约1∶2、约1∶3、约1∶4、约1∶5、或约1∶10(v/v)。
本领域内已知的任何过氧化合物均可用于收集介质。实例性化合物包括过氧化氢、过硼酸钠(例如，一水或四水化物形式)、过碳酸钠、过氧化镁、过氧化钙、过氧化锌、过氧化脲、以及它们的组合。所用的过氧化合物可以含有或不含激活剂如四乙酰基乙二胺(TAED)。TAED典型地采用约1-3％的浓度。
存在于收集介质中的过氧化合物浓度足以达到预计作用(例如，抗微生物作用和/或形成孢子)，但不足以导致卵囊过分损伤。这些过氧化合物的浓度可以低至约0.05、0.1、0.25、0.5或1％(v/v)或(w/v)以及高至约0.5％、1％、3％、5％、10％、15％(v/v)或(w/v)或更高。当过氧化合物为过氧化氢时，其典型的介质浓度从约0.1％、0.25％或0.5％(v/v)至约1％、3％或5％(v/v)。
其有机酸可以是本领域内已知的的任何有机酸，包括柠檬酸、乙酸、丙酸、或其它任何单-或多聚-乙酸、或它们的组合。介质中的有机酸浓度可以是约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、5％、8％、或10％(v/v)或(w/v)，或更高。有机酸的浓度可以进一步低于约25％、20％、15％、12％、10％(v/v)或(w/v)，或更低。在特定实施方案中，所含有机酸的浓度是约1-15％或约3-10％(v/v)或(w/v)。
在其它特定实施方案中，除过氧化合物外，所述组合物含有从约1％至约20％或从约2.5％至约10％或15％柠檬酸以及从约0.05％至约1％或从约0.1％至约0.5％的丙酸。
该收集介质可以另含其它组分，包括缓冲剂、盐、抗微生物剂等。在本发明特定实施方案中，包括消泡剂。采用消泡剂可以有益于减少起沫和卵囊团聚。
正如本领域内可以理解的，有机酸可能相对昂贵。因此，在某些实施方案中可以省去收集介质中的有机酸。
类似地，在收集阶段存在某些可能需要避免采用过氧化合物的情况。因此，在特定的本发明实施方案中，收集介质中省去了过氧化合物。
在特定实施方案中，过氧化合物和/或有机酸可以与更常规的含有重铬酸钾的收集或孢子形成介质结合使用。在其它特定实施方案中，本发明之收集和孢子形成介质不含重铬酸钾并且比使用含有重铬酸钾的介质更安全和更容易处理。
本发明含有过氧化合物和有机酸(分别如上文所述)的过氧介质可以选择，或另外，用作孢子形成介质。本发明人已发现当该过氧介质被用作收集介质时，在收集期间有显著百分比的艾美虫卵囊形成孢子。在特定实施方案中，至少有约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或更多的卵囊在收集期间(即，在任何纯化步骤之前)形成孢子。
在某些实施方案中，该过氧介质在独立的孢子形成步骤中用作孢子形成介质以完成孢子形成过程。此外，如果不采用本发明收集介质(例如，如果采用重铬酸钾收集介质)，其可能将进行特定的孢子形成步骤以实现卵囊制品孢子的充分形成。
相应地，在特定实施方案中，本发明提供卵囊(例如，艾美虫卵囊)孢子形成的方法，其步骤包括提供含有卵囊的组合物，以及在适合孢子形成条件下使卵囊在本发明的孢子形成介质中一定时间形成孢子。
在收集阶段之后实现孢子形成时，其粪便典型地收集于动物，并且再任选经过纯化步骤例如过筛、过滤等。然后将该卵囊转移至孢子形成介质，并且通常允许孢子形成在适当的条件下进行约24-96小时，例如，约48-72小时。例如，在孢子形成过程中其溶液可以搅动或搅拌和通气。
当收集和孢子形成步骤之间不需要更换过氧介质时，为了商业制造之目的，其间一般有一个或一个以上的纯化步骤并且在孢子形成步骤之前需添加新鲜的孢子形成介质。
在其它实施方案中，其孢子形成过程与收集和/或消毒(下文所述)步骤同时进行。
固体与收集介质的比率没有严格限定，只要其足以达到所需孢子形成水平和控制微生物生长。粪便与收集介质的实例性比率为约1∶0.25，约1∶0.5，约1∶1，约1∶2，约1∶3，约1∶4，约1∶5，或约1∶10(v/v)。
例如，在一个说明性的实施方案中，将含卵囊的粪便收集于本发明收集/孢子形成介质中。采用过筛、密度浮选和/或过滤技术从粪便原料中纯化卵囊。然后通过离心使卵囊聚集并且重新悬浮于新鲜的收集/孢子形成介质中，并且孢子形成是在合适的条件(例如，搅拌和/或通气)下继续48-72小时。
然后形成孢子的原生动物可以任选经过其它纯化步骤和/或消毒(下文所述)。
采用本发明介质作为收集和/或孢子形成介质的优点是可以防止卵囊变干，减少从收集阶段开始的生物负荷，提供较高的孢子形成率，以及可以比含有重铬酸钾的常规介质更容易处理。
孢子形成之后，可以进行除去过氧化合物的步骤，例如，采用酶解处理、透析和/或过滤。例如，可以采用催化降解(例如，酶解处理或化学处理例如用二氧化锰)、透析和/或过滤除去过氧化合物。在使用过氧化氢的情况下，可以采用过氧化氢酶减少或清除残留的过氧化氢。
卵囊消毒
消毒步骤作为一个任选步骤而典型地采用于作为卵内疫苗以及在某些时候也用作孵化后疫苗的卵囊制备方法中。如本领域内所已知，用于疫苗制品的卵囊通常采用次氯酸钠溶液消毒，其可以导致卵囊壁的损伤，损害卵囊结构并且可能降低无菌卵囊在贮存期间的长时程活力。
Vettering，J.M.((1969)J.Parasitology55(2)：412-417)描述了采用次氯酸介质的无菌卵囊制备方法。
Jackson，A.R.B.((1964)Parasitology54：87-93)也描述了采用次氯酸盐作为消毒介质的活球虫子孢子的分离方法。
Nyberg和Knnap((1970)Proceeding of the Helminthology Societyof Washington37：32-36)描述了电子显微镜显示的次氯酸钠对禽艾美虫卵囊壁的影响。
本发明者已经发现上述包括过氧化合物和有机酸的收集/孢子形成介质也可以用作消毒(灭菌)介质。在特定实施方案中，消毒介质将进一步包括次氯酸盐(例如，漂白剂)或本领域内已知的其它消毒剂。
孢子形成(上文所述)之后，其卵囊制品可以经过其它纯化步骤(例如，密度过滤、浮选等)，继而消毒。另外，消毒步骤可以在孢子形成步骤之前或同时使用。然而，一般来说，接近纯化步骤结束时的消毒有优势，因为消毒之后的步骤是采用灭菌步骤或试剂来进行的。
“消毒”的意思是减少卵囊制品中的污染微生物负荷(例如，活的污染微生物，如上文定义)。卵囊制品绝对没有微生物污染是没有必要的，只要最终制品符合其预计用途(例如，作为疫苗)。对于拟用于卵内给予鸟类的疫苗，其制品一般应当基本没有可检测的微生物污染(即，检测不到显著水平的污染微生物)。在另一种实施方案中，与未消毒时相比，可检测的污染微生物水平至少减少约50％、60％、75％、85％、90％、95％、99％或更多。
检测微生物的方在本领域内是已知的并且以被检测的微生物类型为基础。
相应地，本发明提供一种卵囊消毒的方法，其步骤包括提供含有卵囊的组合物，以及在足以达到该组合物所需消毒水平的条件下使卵囊在本发明之消毒介质(如上文所述)中消毒一定时间。在本发明实施方案中，消毒处理产生适合给予动物对象(例如，卵内接种方法)的微生物污染水平的制品。该消毒步骤可以进行任何合适的时间长度，其典型地为约1小时至约12、24或48小时。
在其它特定实施方案中，孢子形成和消毒处理同时进行。
消毒处理的温度没有严格限定并且通常在从约4℃至约40℃的温度下进行。卵囊优选不经过冷冻或长时间暴露于高温(例如，暴露于40℃下通常应当少于数小时或甚至少于1小时)。在一种实例性实施方案中，消毒是在约30℃下进行约24至72小时。
卵囊制品对消毒介质的比率没有严格限定，只要足以将微生物生长水平降低到所需水平。粪便对收集介质的实例性比率为约1∶0.25、约1∶0.5、约1∶1、约1∶2、约1∶3、约1∶4、约1∶5、或约1∶10(v/v)。
消毒之后，应当进行去除过氧化合物的步骤，例如，采用催化降解(例如，酶解处理或化学处理例如以二氧化锰)、稀释、透析和/或过滤。例如，在过氧化氢情况下，可以采用过氧化氢酶减少或去除残留的过氧化氢。
作为另一个任选步骤，其卵囊制品可以接触(例如，喷洒、漂洗或混合)一种降低卵囊间聚集的组合物，例如含有蛋白质、肽、蛋白水解物和/或氨基酸的溶液(例如，水溶液)。示例性化合物包括但不限于大豆蛋白、大豆水解物、酪蛋白、酪蛋白水解物、溶解酵素、白蛋白、牛血清白蛋白、乳蛋白、氨基酸(例如，精氨酸、苯丙氨酸和/或天冬氨酸)、胎牛血清、鸡血清、全乳、等等。在一种特定实施方案中，抗聚集溶液包括带正电荷的氨基酸、带负电荷的氨基酸以及中性氨基酸。
典型地，溶液中各组分的浓度为约0.01M至10M、约0.05M至5M或约0.05M至约2M。
溶液pH值可以根据介质中采用的特定组分选择，并且可以在酸性、中性、或碱性范围中。在特定实施方案中，抗聚集溶液的pH在中性范围内。例如，该溶液可以用磷酸缓冲液(pH7)或Hank平衡盐溶液(pH7)缓冲。
还可以采用其它化合物减少聚集，例如，消泡剂(如，消泡净A)。
卵囊可以在纯化过程中的任何一个希望减少卵囊间聚集的点接触抗聚集介质。在消毒过程之后采用可能有优势。在特定实施方案中，没有消毒步骤(例如，在某些孵化后疫苗产品中)，此过程可以用于减少终产物的聚集。或者，该抗聚集溶液可以添加到最终制剂中以减少其中的卵囊聚集。
卵囊分离的浮选介质
一种用于从粪便物质及其它不需要的杂物中纯化卵囊的传统技术是依赖于通过高密度介质如饱和氯化钠或蔗糖溶液的卵囊密度浮选并回收含有卵囊的部分。浮选方法可以用于孢子形成之前和/或之后。离子溶液如氯化钠可能在长时暴露时损伤卵囊(Ryley和Ryley，(1978)Parasitology77：33-39)。非离子溶液，例如蔗糖浓溶液，也被用于浮选步骤。任何固体试剂例如氯化钠或蔗糖的缺点之一是它们在使用前必须溶解于一种水溶液中。
在Davis等的美国专利号4544548和4863731中，提出了一种控制禽类球虫病的方法。这些专利描述了盐浮选过程的用途，即，在浓盐溶液中采用离心浮选并且随后稀释并在二次离心步骤中回收卵囊。
Ryley等((1976)Parisitology73(3)：311-326)描述了采用蔗糖、氯化钠、和硫酸锌浮选从粪便中分离卵囊的方法。
Vetterling J.M.((1969)J.Parisitology55(2)：412-417)描述了连续流离心技术：在高密度蔗糖溶液中浮选、以水稀释、再次离心回收卵囊。
Marquardt W.C.((1961)J.Parisitology47：248-250)描述了通过梯度离心从粪便杂物中分离线虫卵的方法。Patnaik B.等((1966)Indian Vet.J.43：414-422)公开了通过修正的Marquardt法从鸡粪中获得纯化状态的球虫卵囊的技术。
Shama和Reid((1963)J.Parisitology49：159-160)公开了一种采用密度梯度沉降的球虫卵囊的净化方法。
国际专利公开WO00/50072(Pfizer，Inc.)描述了硫酸钠浮选处理的用途。
Dulski等(1988)Avian Diseases32：235，描述了胶体二氧化硅悬浮液(PercollTM)在卵囊密度浮选中用途。
本发明提供一种从不需要的物质中纯化卵囊的浮选介质，其包括高密度、非离子液体和聚阳离子分子或颗粒。该高密度、非离子液体可以是具有约1.08、1.1、1.12、1.14、1.16、1.18或1.2g/ml密度的任何含水液体。典型地，该密度不能更高，因为大多数商业离心设备不用于高密度溶液离心。在本发明的实施方案中，高密度、非离子溶液为甘油、山梨糖醇、蔗糖、高果糖玉米糖浆、羟甲基纤维素、或它们的联合。
本发明者发现聚阳离子分子或颗粒可以用于改善非离子浮选介质的杂物去除特性。本领域内已知的任何合适的聚阳离子均可包括于浮选介质。示例性聚阳离子包括精氨酸、组氨酸、赖氨酸、二乙基氨基乙基-纤维素(DEAE-纤维素)，以及多价金属离子(例如，铁或铝盐如硫酸铝和氯化铁)。聚阳离子的浓度没有严格限定，但优选足够高以促进杂物絮凝，但不足以过分损伤卵囊。介质中聚阳离子的实例性浓度是从约0.01M、0.05M或0.1M至约0.5M、1M、3M或更高。
浮选介质可以含有其它组分例如缓冲剂或抗微生物剂。在特定实施方案中，该浮选介质包括非离子去垢剂(例如，土温-20)和/或消泡剂(消泡净A)以降低卵囊形成凝块的可能性。
本发明还包括采用密度浮选步骤的卵囊纯化方法。在特定实施方案中，该方法包括：将含有卵囊的制品悬浮于包括高密度、非离子液体和聚阳离子的组合物中以在形成足以产生卵囊浮选的条件的悬浮液，以及从悬浮液中回收卵囊。一般地，使含有卵囊的物质与浮选溶液混合，并允许溶液分层，其卵囊保留在上清液部分而粪便杂物形成沉淀。可以采用离心以易化或促进分层。
本发明者进一步发现将油加到包括高密度非离子浮选介质(有或无聚阳离子)中可以改进浮选步骤。这种油可以是本领域内已知的任何合适的油，包括但不限于玉米油、红花油、花生油、双低油菜籽油、大豆油、等。油的加入可以改善杂物除去并且在无高速离心时达到更好的分离水平并且甚至可以不需要离心。
浮选步骤中的油的浓度没有特别限制。用于浮选介质的油的浓度一般为浮选溶液总体积的约1％至约10％或约3％至约7％。
此外，油浮选步骤可以在上文所述含有聚阳离子的高密度非离子溶液浮选之前或之后。
浮选步骤之后，含有卵囊的回收部分可以进一步通过本领域内已知的任何合适的方法进行加工。例如，这部分可以经过本领域内已知的或本说明书公开的其它纯化程序、和/或孢子形成和/或消毒。
可以通过本领域内已知的任何方法从卵囊中除去浮选介质，包括离心/洗涤步骤、透析和离心(例如，切向流动过滤)。
食物制备
特别考虑到以鸟类生产卵囊，本发明者已经发现在卵囊被排泄到粪便时或其前后时间里鸟类进食可以影响卵囊从粪便物质中的分离过程。按照传统方法，在卵囊(例如，艾美虫卵囊)被排泄到粪便的全部阶段通常禽类被喂以完全磨碎或粉碎的食物。在含有卵囊的粪便物质被收集后，其初始纯化步骤依赖于大量处理技术如筛分和/或过滤。常规的禽类食物含有非常精细的颗粒，其可能难以从卵囊中分离。据本发明者所知，本说明书所述研究首先定位于阐明食物对从动物粪便纯化卵囊过程的影响。
本发明者发现通过维持感染动物的大颗粒食物，即，食物具有较大的平均粒径可以促进(即，改善)从粪便物质中分离卵囊。该食物典型含有的主要组分的配料未经碾粉(即，完整颗粒)或仅部分碾粉或经过压制或提取。实例性配料包括碎裂玉米、压制大豆、完整燕麦，以及它们的组合。在部分实施方案中，颗粒经筛分而去掉细粉。在本发明特定实施方案中，该大颗粒食物中含有少于约40％(w/w)、少于约30％(w/w)、少于约20％(w/w)、少于约10％(w/w)、少于约5％(w/w)、或甚至更少的碾粉饲料或食物(例如碾粉的玉米、大豆、鱼或骨粉饲料等)。在另一种实施方案中，大颗粒食物基本不含碾粉的饲料组分。本领域内技术人员能够理解维生素、矿物质、氨基酸、和其它微量营养成分将典型地添加到食物的颗粒状预混配方中。
示例性的禽类食物含有至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高(w/w)的压制大豆、碎裂玉米、整粒燕麦、和/或其它未碾粉或仅部分碾碎、压制、榨取的本领域内已知的饲料组分，以及保持鸟类的营养健康的任何维生素、矿物质、氨基酸和盐。在一种特定实施方案中，喂饲鸡的食物基本上由45-55％(w/w)压制大豆、35-40％(w/w)碎裂玉米、和5-15％(w/w)的整粒燕麦、以及以及保持鸟类的营养健康的维生素、矿物质、氨基酸和盐组成。
大体上，在收集期间维持大颗粒食物的鸟类所产生的粪便中至少有约30％、35％、40％、50％、60％、70％(w/w)或更多能够留存于0.5mm筛。或者，至少有约40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％(w/w)或更多的粪便留存于0.075毫米筛。
鸟类可以从孵化后开始喂饲大颗粒食物。或者，鸟类开始喂饲常规禽类食物然后在收集阶段的某一时间或之前，例如收集前至少约七天、五天、三天、两天、一天或十二小时，或者，在收集开始时，转而喂饲大颗粒食物。一般在整个收集阶段维持鸟类的大颗粒食物。只要发现纯化过程有某些改善或改进，鸟类喂饲大颗粒食物可以少于完整的收集阶段。
含有排泄卵囊的粪便典型地收集于各物种的最高产出期间，根据其种属，典型地起始于感染后三、四或五天并且在其后连续收集约两至四天。在本发明的实施方案中，收集阶段发生在感染后约3-9或约4-8天的某一时间。
本发明的大颗粒食物制备可以导致杂物去除更容易、改善卵囊产率、和/或降低生产成本。
下列实施例的提出是对本发明的阐述，而不能被解释成是对它们的限制。
实施例1
制备卵囊的食物
该实施例描述一种由大颗粒和典型的食物添加剂(维生素、矿物质、微量营养素)联合组成的生产卵囊的食物。该大颗粒组分可以包括碎裂玉米、压制大豆、和/或整粒谷物如燕麦。在保持鸟类合理的营养的同时开发这种食物以改进卵囊的产量和产率并且易化卵囊的分离。其方案可以包括采用常规禽类食物直至收集阶段刚开始之前，在卵囊产出阶段期间转而以大颗粒食物喂饲鸟类。这种食物的优点是更容易地通过过筛和过滤去除杂物，其改善卵囊产率，以及其减少生产成本。
过筛处理常规采用于卵囊纯化中。通过采用高百分比的留存于筛的大颗粒而开发出来的食物配方能够使过筛处理更容易。以常规禽类食物作为对照研究四种实验性食物的卵囊产出。采用Cobb x Cobb童子鸡生产巨型艾美虫卵囊。每种处理各采用五个平行样本。此实施例中，大颗粒食物喂饲于整个实验期间，没有补充常规禽类食物。粪便样本收集于高峰产出阶段(管饲后5至8天)并且达到体积标准、充分混合并采集卵囊计数和测定杂物的子样本。然后各样本以35目筛(约0.5mm)过筛，使之达到标准体积，充分混合并采集卵囊计数和测定杂物的子样本。结果见表1所示。
表1
这些实验结果表明采用常规禽类食物时杂物初始水平最高。食物2-5(大颗粒食物)产生的起始杂物水平低于常规禽类食物，并且全部实验食物是类似的。过35目筛后对于大颗粒食物其卵囊回收率(91至99％)高于常规禽类食物(85％)。最后，采用大颗粒食物时35目筛去除高达46％的杂物，相比之下当采用常规禽类食物时过35目筛仅去除5％的杂物。
实施例2
生产卵囊的食物的小规模使用预试
采用笼养童子鸡(共计540只)生产巨型艾美虫卵囊。主要喂饲实施例1所述食物5(大颗粒食物)；在食物5喂饲期间也提供标准禽类食物的补充碟。经口管饲至嗉囊给予接种卵囊(每只鸡20000个形成孢子的卵囊)。接种后5至8天将粪便收集到10％柠檬酸、0.25％丙酸溶液中(每盆2升)。
收获后，每批均进行下列步骤：
●汇聚；测量汇聚样本体积；采集子样本。
●采用振荡筛过一组18目(1mm)和60目(～0.25mm)筛。
●采用振荡筛过200目(～0.25mm)筛。
●采用McMaster方法计数卵囊。
●通过离心少量样品测定杂物水平并测量沉淀固体体积与离心总体积的比率。
其结果总结于下列表2中：
表2
该结果表明食物5的卵囊回收率平均为86-88％而CVs(变异系数)＜15％。平均有72％的初始固体在过筛步骤中被除去。
实施例3
以过氧和有机酸为基础的介质用于卵囊收集和孢子形成
本实施例，以及其后的两个实施例，描述收集/孢子形成/消毒介质，其防止卵囊干化、减少收集阶段开始时的生物负荷、产生较高的孢子形成率、比重铬酸钾容易处理、以及是比次氯酸盐更温和的消毒剂。
开发可以用作卵囊收集和孢子形成介质的一种由0.75％过氧化氢、10％柠檬酸、0.25％丙酸和0.1％消泡净A组成的介质。该液体介质防止卵囊干化、在收集过程中充当抗微生物介质以杀灭病毒和防止细菌或霉菌积累、以及促进收集过程中的孢子形成。加入消泡净A是防止粪便悬浮液中的过量泡沫，并且用于减少卵囊聚集。然而，介质中的消泡净A是任选的。可以采用其它过氧化合物如过硼酸钠(其一水合物或四水合物形式)或替代或联用过氧化氢。
由鸡产生多种球虫物种的卵囊并在各物种之产出高峰阶段收集到介质中。以约2至3升的收集介质收集8至10只鸟的粪便。在收集阶段结束时，采用过筛和密度浮选技术纯化卵囊。然后将卵囊放入新配制的孢子形成介质中，搅拌并通气72小时。在收集之后以及再次在过筛、浮选、以及3天的孢子形成处理过程之后立即采用标准显微技术测定孢子形成率。结果见表3所示。
表3
当以新介质收集卵囊时，孢子形成过程主要见于处理之前，并且发现所有被检测的艾美虫种系的最终孢子形成率均很高。这些结果提示所提出的收集和孢子形成介质提供了一种在卵囊收集阶段，甚至在孢子形成过程之前平均48-72小时达到高水平的孢子形成率的有效方法。
实施例4
以过氧和有机酸为基础的消毒介质的抗真菌和杀真菌性质的证实
进行实验评价用于实施例3所述之收集和孢子形成介质的试剂的抗真菌和杀真菌性质。采用胰蛋白酶大豆肉汤培养基(TSB)进行初步无菌实验。通过Scopulariopsis brumptil培养菌刮出物悬浮在25mL PBS中建立真菌培养母液并且以粗Swinney滤器(～100μm)过滤该物质。将200μL真菌液接种于三份TSB培养瓶以备处理(处理组2-11)。
处理评价实施例3所述收集/孢子形成/消毒介质之各种组分，或单独或联合。除丙酸外还评价了丙酸钠。评价室温下28天的处理作用；然后，在孵育28天时，所有被处理培养瓶每份取1mL放入含有氯霉素(50μg/mL)和青霉素G(100U/mL)的麦芽精琼脂(MEA)培养皿中并在室温下培养14天。如果发现在28天的TSB培养瓶培养中没有生长(-)并且当培养瓶介质被转移到MEA培养皿时发现其生长则认为该试剂是抗真菌的。如果发现在TSB培养瓶(-)或在转移到MEA培养皿时均无生长则认为该试剂是杀真菌的。结果见于表4。
表4
与预期相同，在此实验中培养基对照组的真菌生长保持阴性而真菌对照组为阳性。在培养瓶和培养皿试验中，丙酸钠(0.25％和0.50％)均不能抑制真菌生长。丙酸处理(0.25％)培养基(处理组4)是抗真菌的；其抑制培养瓶中的真菌生长，但不影响MEA培养皿。其它处理组(除对照组外)显然是杀真菌的，其真菌未见生长于培养瓶也不生长于培养皿。这些结果表明用于推荐配方(处理组9)的试剂的强效抗真菌和杀真菌性质。
实施例5
以过氧和有机酸为基础的消毒介质在卵囊生产中的应用
进行该试验以评价实施例3所述孢子形成介质作为消毒剂的效用。以童子鸡生产巨型艾美虫卵囊并采用密度浮选技术纯化。采用10％柠檬酸、0.25％丙酸、0.75％过氧化氢、和1mL/L消泡净A使卵囊孢子形成72小时。孢子形成后，离心卵囊并重新悬浮于无菌过滤的孢子形成介质(10％柠檬酸、0.25％丙酸、0.75％过氧化氢、和1mL/L消泡净A)并在室温下搅拌培养过夜。消毒后，先后采用200mM磷酸钾(pH7)和没有防腐剂的PBS通过二次过滤进行缓冲液更换。其批量样品以约1/3的容量贮存于4℃下的玻璃瓶中。最终产品的子样本送到商业检测实验室根据美国农业部(USDA)指导原则检测其纯度。采用过氧基础介质消毒后的9CFR无菌检测结果见表5所示。
表5
所有试验结果表明无菌过滤的孢子形成介质可以用作卵囊消毒的次氯酸钠的有效替代物。
实施例6
以过氧和有机酸为基础的介质用于消毒卵囊
制备两批实验用巨型艾美虫卵囊(批次A和批次B)。每批均通过采用过筛和浮选步骤纯化。然后将每批分开并且试验两种消毒方法(次氯酸钠和过氧化氢与柠檬酸和丙酸)。对各试验样本进行多项纯度检测包括9CFR检测和两种病毒检测的PCR方法。其结果见表6所示：
表6
纯度检测结果表明全部消毒物质均没有污染微生物，并且过氧化氢消毒溶液与次氯酸盐一样有效。
实施例7
在以甘油为基础的溶液中浮选巨型艾美虫
以下两个实施例描述采用带多个正电荷的分子或颗粒(例如，0.1M精氨酸)分离卵囊的浮选介质。这些分子可以用于增强非离子浮选介质(例如，蔗糖、甘油、高果糖玉米糖浆)的杂物去除特性，并且可以采用添加剂如非离子去垢剂(例如，土温-20)或消泡剂(例如消泡净A)以减少卵囊聚集并因此优化浮选过程。这些浮选介质的优点包括促进杂物去除，非离子溶液对卵囊的损伤可能小于盐溶液，且正电荷可以充当辅助絮凝剂使小杂物颗粒结合到一起并在离心期间获得更有效的杂物颗粒沉淀。
采用五种不同介质处理含有巨型艾美虫卵囊的鸡粪。起始材料包括来源于约150只鸡的汇聚物。该汇聚物采用机械过筛设备既而以细目筛过筛。过筛样品在750mL水中离心使卵囊沉淀。弃上清液并且采用：1)20％硫酸钠，2)60％甘油，3)60％甘油+0.1M精氨酸，4)60％甘油+10g/L DEAE-纤维素，或5)60％甘油+0.1M精氨酸+10g/LDEAE-纤维素重新悬浮沉淀。采用5倍沉淀体积的各介质重新悬浮3份沉淀其代表约2250mL过筛样品。20％硫酸钠介质在10℃下以1000rpm离心10分钟，其它所有处理物在10℃下以3000rpm离心10分钟。浮选结果总结于表7中。
表7
在这些试验中，所有浮选介质均产生很好的卵囊回收率，其范围从78.4％至103.6％。所有以甘油为基础的介质均比硫酸钠介质更有效地去除杂物。硫酸钠介质减少固形物的百分比为63.8％，而甘油基础介质的范围为从79.6％至96.7％。添加带阳离子电荷分子(精氨酸)或颗粒(DEAE-纤维素)比单用甘油改进了杂物的去除。标准硫酸钠浮选方法中每mL固体中卵囊产率提高2.7倍，而采用60％甘油+0.1M精氨酸方法每mL固体中卵囊产率提高了28.8倍。
实施例8
在以甘油和蔗糖为基础的介质中浮选巨型艾美虫卵囊
采用童子鸡生产的含有巨型艾美虫的鸡粪检验其它浮选介质。鸡粪收集前采用36小时断食阶段。尽管甘油-精氨酸介质在卵囊回收和杂物去除方面非常有效，但更大规模下的昂贵的甘油可能是不能承受的。为利用精氨酸和鸡粪杂物之间的电荷相互作用，研究非离子密度促进剂的作用。在该试验中，比较了基于甘油或蔗糖非离子化合物的各种配方。
浮选前，鸡粪通过粗和细筛处理以去除大的杂物颗粒。过筛样品在700mL水中离心沉淀卵囊。去上清液并采用下文所述试验配方重悬沉淀。各试验介质采用近似相等的试样。各介质以5倍沉淀体积悬浮3份相当于约2100mL过筛样品的沉淀。混合的重悬沉淀通过粗筛以保证聚集物重新悬浮。以少量合适的浮选介质漂洗聚集物过筛。
浮选介质
A.60％甘油，0.1M精氨酸
B.60％甘油，0.1M精氨酸，0.2％土温-20，1mL/L消泡净A
C.1.5M蔗糖，0.1M精氨酸
D.1.5M蔗糖，0.1M精氨酸，0.2％土温-20，1mL/L消泡净A
E.1.5M蔗糖，0.1M精氨酸，0.2％土温-20，1mL/L消泡净A，0.1％黄原胶。
浮选处理的结果总结于表8中。
表8
有或没有添加剂的甘油-精氨酸均产生很好的卵囊回收率并改善了卵囊的纯化(每mL固体中的卵囊比前一步骤改善约19倍)。而单用蔗糖-精氨酸介质产生很好的卵囊回收率(90％)并且很好地去除杂物(比前一步骤改善约18倍)，添加0.2％土温-20和1mL/L消泡净使所进行的两项检测值均有轻微减少。以黄原胶增加蔗糖-精氨酸-土温-20-消泡净A介质的粘度对卵囊回收基本没有影响但对杂物清除有相反作用。
因此，当采用非离子浮选介质时正电荷分子(例如精氨酸)或正电荷颗粒(例如DEAE-纤维素)可以促进杂物的去除。非离子浮选介质包括如甘油水溶液、蔗糖水溶液、高果糖玉米糖浆水溶液、或其它类似溶液的配方。正电荷部分可能充当了浮选辅助剂，使负电荷杂物颗粒结合到一起，并因此在离心过程中使杂物更容易聚集成块。促进卵囊回收和杂物去除的作用可以通过采用其它添加剂如土温-20或消泡净A而优化。
实施例9
油促进的卵囊浮选技术
此实施例描述所设计的调查油在卵囊浮选处理中的作用试验。以油为基础的处理可以改善从固体中分离卵囊并且使该处理能够在1×g下进行因而避免采用更高离心力下的昂贵的离心设备。
所进行的试验是检验温和的连续浮选技术是否可以用于从粪便杂物中分离卵囊。完成分离工作可以利用不同的密度条件，采用连续搅拌处理使卵囊缓慢上升到介质上层，在此可以将它们撇取而从粪便杂物中回收。
在试验开始时采用部分纯化(过筛和浮选)的批量巨型艾美虫卵囊。采用数种联合的高果糖玉米糖浆(HFCS)，CornSweet55(ADM，Illinois)和氯化钠盐作为增加密度的试剂。将材料置于1L聚丙烯烧杯中并采用IKA Labortechnik Batch混合器使之与HFCS及NaCl缓慢混合。从悬浮液上层，然后从近容器底部取样。取样后加入添加的HFCS，进一步使材料缓慢混合，然后取出第二批样品。
采用25mL移液管或塑料药勺将上层样品(F-1，F-2)收集到50mL聚丙烯试管中(每个样品25mL)。采用25mL移液管移取底部样品(S-1，S-2)到50mL聚丙烯试管中(每个样品25mL)。所有样品均以蒸馏水稀释10倍并转移到250mL玻瓶中。从每个玻瓶中取两份子样本并以1×PBS缓冲液稀释10倍。采用McMaster方法计数这些稀释的次级样品中的卵囊。此试验结果见表9所示。
表9
数据表明尽管卵囊明显富集在悬浮液的上层，但在任何实验条件下卵囊都没能有效悬浮以及形成清晰的上层(即，在没有离心时)。研究中HFCS与NaCl比例或进一步稀释粪便悬浮液不影响浮选。试验发现试验的悬浮液的上层液取样是困难的。
在此实验之后，将原料显著稀释或引入漂浮促进剂显然有益于易化卵囊在粪便原料中的运动。进行实验检测利用植物油作为浮选促进剂的作用。
在1L聚丙烯烧杯中，采用IKA分次式混合器使500mL的卵囊悬浮原液与含有160g高果糖玉米糖浆+40g NaCl+50mL红花油的500mL水混合。混合器按下列次序操作：快-慢-停-慢-停。将上层液(50mL)舀至盛有200mL水的250mL玻瓶中。将玻瓶内所含物彻底混合。在几分钟内清楚地形成三层。从每一层中取两个小样并以McMaster室计数。其结果如表10所示。
表10
| 层 | 卵囊计数-子样本1 | 卵囊计数-子样本2 |
| 油上层 | 2 | 4 |
| 油层下薄层 | 110 | 121 |
| 大量的底层(～93％) | 0 | 0 |
这些结果表明油易化了浮选实质步骤。油辅助浮选处理的优点之一是无须离心，此即1×g下，快速形成卵囊层。典型地，卵囊浮选处理采用2000×g或更高的离心力以实现卵囊层与杂物的分离。
上述实施例是对本发明的说明，而不能被当作是对它们的限制。本发明通过下列权利要求进行说明，权利要求的等同实施方案包括在本发明中。
Claims (5)
1. 一种消毒原生动物卵囊的方法，其包括：
(a) 提供含有原生动物卵囊的制品；和
(b) 使卵囊在用于制备卵囊的组合物中消毒，消毒的时间和条件足以达到所希望的所述制品的消毒水平，所述组合物包含过氧化合物和有机酸，并且具有酸性pH值。
2. 权利要求1的方法，其中所述原生动物包括艾美虫属物种。
3. 权利要求2的方法，其中艾美虫属物种选自巨型艾美虫、和缓艾美虫、禽艾美虫、堆形艾美虫、波氏艾美虫、尼氏艾美虫、塞前艾美虫、E. mivati以及它们的组合。
4. 权利要求1的方法，其中所述消毒步骤之后所述制品基本不含可检测到的微生物污染。
5. 权利要求1的方法，其中所述消毒步骤进行约12至约48小时。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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