CN114163536B - 一种基于乳酸菌LPxTG基序重组蛋白的构建及应用 - Google Patents

一种基于乳酸菌LPxTG基序重组蛋白的构建及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于乳酸菌LPxTG基序重组蛋白。该重组蛋白(LPxTG‑功能肽)对胃肠道环境的耐受性较好，从而可以保护功能肽，减少其在口服过程中被胃液、肠液破坏。本发明还公开一种基于乳酸菌LPxTG基序重组蛋白的构建方法、一种基于乳酸菌LPxTG基序重组蛋白的构建方法在增加功能肽抗氧化性方面的应用、一种基于乳酸菌LPxTG基序重组蛋白在口服制剂中的应用。

Description

一种基于乳酸菌LPxTG基序重组蛋白的构建及应用
技术领域
本发明涉及乳酸菌技术领域，具体涉及一种基于乳酸菌LPxTG基序重组蛋白的构建及应用。
背景技术
蛋白质作为生物体的重要组成部分，是生命体的重要物质基础。不少研究发现，蛋白质降解后的肽段具有许多生理和功能特性，如抗氧化、抗高血压、抗菌、抗癌等活性，简称为功能肽，其中，具有抗氧化性的功能肽，被称为抗氧化肽。和蛋白质相比，功能肽不仅具有与同源蛋白质相同的氨基酸组成，而且和蛋白质相比容易被肠道吸收，更有研究表明功能肽与肠道受体结合可能足以触发生物活性，诱导其抗氧化功能，因此它能起到维持和改善蛋白质营养状况的作用。同时，功能肽的低分子量和免疫原性也使得它们能够更深入地渗透到器官中发挥作用。目前功能肽已成为潜在的治疗剂，而口服途径因具有非侵入性和安全性，容易被肠道直接吸收，大大减轻肠胃负担，对消化系统的组织器官有很好的保护作用。但恶劣的胃肠环境，如消化酶、强酸条件等，容易对功能肽的胃肠道传递造成影响。
乳杆菌是乳酸菌中的其中一类。乳杆菌是定植在人体肠道中的益生菌，具有维持肠道菌群平衡促进消化吸收等功能。近年来研究发现乳杆菌的表面蛋白中含有LPxTG结构，发现其在增强乳杆菌的肠道黏附及耐受特性方面发挥着重要的协助作用。在乳杆菌的分选酶A的作用下，含有LPxTG结构的表面蛋白(简称为LPxTG表面结构蛋白)中苏氨酸(T)和甘氨酸(G)之间的肽键断裂，暴露的苏氨酸末端与肽聚糖肽桥结构中的氨基酸催化形成肽键，从而使其锚定在细胞壁肽聚糖上发挥黏附作用。另外，有研究发现乳杆菌中的表面蛋白能够提高对消化酶的抗性保护作用，能够在胃肠道中保护乳杆菌，并且在不同浓度的胆盐环境下培养乳杆菌，其表面蛋白的表达水平显著增加，表明表面蛋白对高浓度胆盐环境同样具有抵抗性。
但是，现有技术中关于乳酸菌LPxTG表面结构蛋白与功能肽的结合的研究较少，因此还可以进一步探究。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术的现状，提供一种基于乳酸菌LPxTG基序的重组蛋白。
本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术的现状，提供一种基于乳酸菌LPxTG基序重组蛋白的构建方法。
本发明所要解决的第三个技术问题是针对现有技术的现状，提供一种基于乳酸菌LPxTG基序重组蛋白的构建方法在增加功能肽抗氧化性方面的应用。
本发明所要解决的第四个技术问题是针对现有技术的现状，提供一种基于乳酸菌LPxTG基序的重组蛋白在口服制剂中的应用。
本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种基于乳酸菌LPxTG基序的重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白的氨基酸序列为：
Ile-Thr-Thr-Pro-Glu-Gly-Lys-Val-Pro-Asp-Ala-Ser-Asp-Gly-Thr-Lys-Asn-Lys-Thr-Asp-Leu-Pro-Asn-Asp-Thr-Lys-Tyr-Thr-Trp-Thr-Asp-Pro-Asp-Gln-Val-Ala-Gln-Asp-Val-Lys-Lys-Pro-Gly-Ser-His-Thr-Glu-Thr-Ile-Thr-Val-Arg-Tyr-Pro-Asp-Gly-Ser-Glu-Asp-Thr-Val-Thr-Val-Thr-Val-Asn-Val-Pro-Ala-Pro-Glu-Gly-Gln-Asn-Ile-Thr-Thr-Asp-Gln-Gly-Lys-Leu-Pro-Asn-Pro-Ala-Asp-Ala-Ile-Lys-Asn-Lys-Asp-Gln-Met-Pro-Asp-Gly-Thr-Thr-Tyr-Thr-Trp-Lys-Gln-Glu-Pro-Asp-Val-Ser-Thr-Pro-Gly-Asp-His-Thr-Gly-Val-Val-Glu-Val-His-Phe-Pro-Asp-Gly-Thr-Thr-Tyr-Glu-Val-Thr-Val-Asp-Val-His-Val-Asp-Ala-Val-Thr-Pro-Asp-Asn-Gly-Gly-Asn-Met-Asn-Ser-Gly-Asn-Gly-Ser-Ile-Asp-His-Gln-Asn-Gly-Thr-Glu-Ile-Asn-Asn-Gly-Thr-Ala-Thr-Lys-Thr-Asp-Asn-Gly-Ser-Val-Ile-Glu-Asn-Val-Thr-Glu-Asn-Ser-Val-Thr-Asn-Ser-Thr-Ser-Gln-Gln-Pro-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Gln-Thr-Gly-Tyr-Leu-Glu-Gln。
本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：一种基于乳酸菌LPxTG基序重组蛋白的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1、根据罗伊氏乳杆菌中含LPxTG序列的表面结构蛋白的基因序列，设计用于扩增的引物F1、R1，在引物F1的上游增加功能肽的序列后得到引物F1’，以提取的罗伊氏乳杆菌的全基因组为模板，使用引物F1’、R1进行PCR扩增，得到LPxTG-功能肽的基因片段；
所述功能肽以甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸中的任一种开头；
步骤S2、使用CE Design在引物F1’,R1两端增加同源臂F3,R3后得到F2、R2，对从步骤S1中得到的LPxTG-功能肽的基因片段为模板，采用引物F2、R2进行扩增，得到LPxTG-功能肽的基因片段增加同源臂后的产物；
步骤S3、根据步骤S2中LPxTG-功能肽的基因片段增加同源臂后的产物，构建LPxTG-功能肽重组表达载体；
步骤S4、将从步骤S3中得到的重组表达载体倒入宿主细胞，并在宿主细胞中进行诱导表达，获得表达产物；
步骤S5、分离纯化从步骤S4中所得的表达产物，获得重组蛋白，即LPxTG-功能肽。
优选地，所述步骤S1中，
所述引物F1为AGTTTGTGGCAATGTCTT；
所述引物F1’为CTGCTCCAGGTAGCCAGTTTGTGGCAATGTCTT；
所述引物R1为ATTACTACTCCAGAAGGTAAGGTTCCA；
所述功能肽为ggctacctggagcag。
优选地，所述步骤S2中，
所述引物F2为：gtggtggtggtggtgctcgagTTACTGCTCCAGGTAGCCAGTTT；
所述引物R2为cagcaaatgggtcgcggatccATTACTACTCCAGAAGGTAAGGTTCCA；
同源臂F3为gtggtggtggtggtgctcgag；
同源臂R3为cagcaaatgggtcgcggatcc。
优选地，所述步骤S3中，表达载体采用pET-28a。
优选地，所述步骤S4中，宿主细胞为BL-21(DE3)。
本发明解决上述第三个技术问题所采用的技术方案为：一种如上述的基于乳酸菌LPxTG基序重组蛋白的构建方法在增加功能肽抗氧化性方面的应用。
优选地，包括增加功能肽抗氧化性的方法，具体包括以下步骤：
步骤(a)、根据所述的基于乳酸菌LPxTG基序重组蛋白的构建方法制备LPxTG-功能肽，其中功能肽具有抗氧化性；
步骤(b)、将植物乳杆菌与步骤(a)制备的LPxTG-功能肽进行共培养。
优选地，所述步骤(b)具体包括：活化植物乳杆菌后，将其接种至LB肉汤培养基中扩大培养，得到植物乳杆菌菌液，在植物乳杆菌菌液中加入步骤(a)制备的LPxTG-功能肽的水溶液，该水溶液的浓度为5～15μg/ml，该水溶液与植物乳杆菌菌液等体积，于37℃培养4h后离心取上清液。
本发明解决上述第四个技术问题所采用的技术方案为：一种如上述的基于乳酸菌LPxTG基序的重组蛋白在口服制剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：得到的重组蛋白(即LPxTG-功能肽)对胃肠道环境的耐受性较好，从而可以保护功能肽，减少功能肽在口服过程中被胃液、肠液破坏。
基于乳酸菌LPxTG基序重组蛋白的构建方法，能够较为方便地得到LPxTG-功能肽。
基于乳酸菌LPxTG基序重组蛋白的构建方法在增加功能肽抗氧化性方面的应用，功能肽为抗氧化肽，在植物乳杆菌的作用下，LPxTG-功能肽中的功能肽可以被释放，并且释放后的功能肽的抗氧化能力得以增强。
基于乳酸菌LPxTG基序的重组蛋白在口服制剂中的应用，当LPxTG-功能肽用于口服制剂时，口服LPxTG-功能肽后，在肠道内的植物乳杆菌的作用下，实现功能肽在宿主体内的定向释放，有助于小肠定向吸收功能肽；
另外，肠道作为人体内外环境的交界，是关键的防御屏障，而肠道黏膜容易因膳食的氧化剂、诱变剂、致癌物等影响而受到自由基的侵害，但被释放后的功能肽清除自由基的能力得以增强，这样可以减少肠道中的自由基，从而减少肠道粘膜受到的来自自由基的氧化损伤，以及减少自由基对肠道中益生性菌群的干扰，有利于肠道中益生性菌群维持稳态。
附图说明
图1为本发明实施例通过引物F1’、R1扩增后的PCR扩增产物电泳图；
图2为本发明实施例通过引物F2、R2扩增后的PCR扩增产物电泳图；
图3为本发明实施例中重组表达质粒Pet28a-LPxTG-抗氧化肽构建图谱；
图4为本发明实施例中构建的LPxTG-抗氧化肽的蛋白诱导表达情况；
图5为本发明实施例中构建的LPxTG-抗氧化肽蛋白钴柱纯化后电泳图；
图6为本发明实施例中LPxTG-抗氧化肽和抗氧化肽的羟基自由基清除率；
图7为本发明实施例中LPxTG-抗氧化肽和抗氧化肽的ABTS自由基清除率；
图8为本发明实施例中LPxTG-抗氧化肽和抗氧化肽的DPPH自由基清除率；
图9为本发明实施例中LPxTG-抗氧化肽与抗氧化肽经人工胃液、人工肠液处理后的羟基自由基清除率；
图10为本发明实施例中LPxTG-抗氧化肽与抗氧化肽经人工胃液、人工肠液处理后的ABTS自由基清除率；
图11为本发明实施例中LPxTG-抗氧化肽与抗氧化肽经人工胃液、人工肠液处理后的DPPH自由基清除率。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1：基于乳酸菌LPxTG基序重组蛋白的构建方法
1.1得到LPxTG-功能肽的基因片段(步骤S1)
根据NCBI上公布的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)中含LPxTG序列的表面结构蛋白的基因序列：
ATTACTACTCCAGAAGGTAAGGTTCCAGACGCATCAGATGGTATTAAGAACAAGACTGATCTCCCTAACGACACGAAGTACACTTGGACTGATCCAGATCAAGTTGCACAAGATGTCAAGAAGCCTGGTTCACATACTGAAACGATTACTGTTCGTTATCCAGACGGTTCAGAAGATACGGTTACAGTAACTGTTAATGTTCCCGCACCTGAGGGACAAAATATTACAACTGATCAAGGTAAACTCCCTAACCCTGCAGATGCAATTAAGAACAAAGATCAGATGCCGGATGGAACAACTTACACTTGGAAGCAAGAACCTGATGTTTCTACTCCTGGTGATCACACTGGTGTAGTTGAAGTCCACTTCCCAGACGGAACTACCTATGAAGTAACCGTTGATGTTCATGTAGATGCTGTAACCCCTGATAATGGCGGAAACATGAACTCCGGTAATGGTTCAATTGATCATCAAAACGGCACTGAAATTAATAATGGAACTGCAACCAAGACTGATAACGGTTCAGTAATCGAAAATGTAACTGAAAATAGTGTAACTAACAGTACTAGCCAGCAACCAGCGAAGACATTGCCACAAACTGGTAATGATTCTTCTAAGTTCAGTGCATTAGCTGGCTTGAGTCTTGCCGCTTTCGCAAGTCTCTTCGGTTTTGCAGGCCACGATAAGAAACGCAAAGCTGATAAATAA(如SEQ ID NO.1所示)，用CE Design设计引物，得到引物F1、R1，在引物F1中增加功能肽的序列(本实施例中，功能肽为抗氧化肽，其氨基酸序列参见表1，由上海生工生物有限公司合成功能肽)后，对应得到引物的F1’，见表1，将设计好的引物序列送至上海生工生物有限公司进行合成。采用全式金的Easy Pure BacteriaGenomic DNA Kit提取罗伊氏乳杆菌SH23的全基因组，并用超微量分光光度计验证DNA浓度。以提取的罗伊氏乳杆菌的全基因组为模板，使用引物F1’、R1进行PCR扩增，反应体系如下：50μL反应体系，模板2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，2×Taq PCR MasterMix 25μL，ddH2O 1μL，按上述反应体系加样后进行扩增，扩增条件为95℃预变性3min，95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸2min，72℃再延伸5min，重复30个循环，扩增得到LPxTG-功能肽的基因片段，对该基因片段进行纯化，见图1，由图1可知LPxTG-功能肽的基因片段大小为600bp左右，符合预期。
1.2给LPxTG-功能肽的基因片段增加同源臂(步骤S2)
使用CE Design软件在引物F1’,引物R1的两端增加同源臂F3,R3后，得到F2,R2。以上述1.1中纯化的LPxTG-功能肽的基因片段为模板，采用引物F2、R2进行扩增，这样给LPxTG-功能肽的基因片段增加了同源臂，并进行纯化。由图2可知，LPxTG-功能肽的基因片段在增加同源臂F3和R3后的产物大小约600bp。
表1引物设计
Figure BDA0003399634970000061
1.3重组表达菌株的构建(步骤S3)
使用质粒提取试剂盒从含有pET-28a质粒的大肠杆菌中提取pET-28a质粒，对pET-28a质粒进行酶切得到线性质粒，将上述1.2中得到的LPxTG-功能肽在增加同源臂后的产物，与线性表达载体pET-28a进行连接，连接反应体系为20μL，线性化质粒载体与LPxTG-功能肽增加同源臂后的产物的摩尔比为1：2，5×CEⅡBuffer 4μL，ExnaseⅡ2μL，ddH2O增加至20μL。连接条件为37℃反应30min，表达载体pET28a(+)的启动子为T7启动子，得到重组质粒，重组质粒的构建图谱如图3所示，并将重组质粒加入到克隆感受态细胞BL-21(DE3)中，在冰上静置孵育30min后快速放入54℃的水浴锅中孵育45s，移至冰盒中静置2min后加入500μL LB培养基吹打均匀，在摇床上震荡培养1h(37℃，200rpm)，吸取菌液在LB琼脂平板中涂布均匀过夜培养，挑取单菌落至LB培养基中培养后菌液PCR鉴定并送至上海生工测序，确定成功导入重组质粒的大肠杆菌，命名为E-LPxTG-功能肽菌株。
1.4蛋白体外诱导表达(步骤S4)
过夜活化上述1.3得到的E-LPxTG-功能肽菌株，接种至LB培养基，当菌液OD600≈0.5时，使用0.4Mm IPTG 25℃进行诱导4h后使用PBS清洗诱导后的菌体三次，然后超声破碎菌体(300W，工作3s，间隔8s，工作110次)，8000×g离心30min后取上清液，并取一部分进行SDS-PAGE电泳。采用上述的IPTG浓度以及诱导时间，不容易形成包涵体，并且使最后得到的LPxTG-功能肽含量较高，选择上述超声破碎菌体的时间和功率，以降低超声对LPxTG-功能肽浓度的影响。
电泳结果如图4所示，E-LPxTG-功能肽菌株过表达了LPxTG-功能肽(即重组蛋白)，条带大小约为37KDa，且LPxTG-功能肽分布在上清液中，属于可溶性蛋白。LPxTG-功能肽的氨基酸序列为(如SEQ ID NO.10所示)：
Ile-Thr-Thr-Pro-Glu-Gly-Lys-Val-Pro-Asp-Ala-Ser-Asp-Gly-Thr-Lys-Asn-Lys-Thr-Asp-Leu-Pro-Asn-Asp-Thr-Lys-Tyr-Thr-Trp-Thr-Asp-Pro-Asp-Gln-Val-Ala-Gln-Asp-Val-Lys-Lys-Pro-Gly-Ser-His-Thr-Glu-Thr-Ile-Thr-Val-Arg-Tyr-Pro-Asp-Gly-Ser-Glu-Asp-Thr-Val-Thr-Val-Thr-Val-Asn-Val-Pro-Ala-Pro-Glu-Gly-Gln-Asn-Ile-Thr-Thr-Asp-Gln-Gly-Lys-Leu-Pro-Asn-Pro-Ala-Asp-Ala-Ile-Lys-Asn-Lys-Asp-Gln-Met-Pro-Asp-Gly-Thr-Thr-Tyr-Thr-Trp-Lys-Gln-Glu-Pro-Asp-Val-Ser-Thr-Pro-Gly-Asp-His-Thr-Gly-Val-Val-Glu-Val-His-Phe-Pro-Asp-Gly-Thr-Thr-Tyr-Glu-Val-Thr-Val-Asp-Val-His-Val-Asp-Ala-Val-Thr-Pro-Asp-Asn-Gly-Gly-Asn-Met-Asn-Ser-Gly-Asn-Gly-Ser-Ile-Asp-His-Gln-Asn-Gly-Thr-Glu-Ile-Asn-Asn-Gly-Thr-Ala-Thr-Lys-Thr-Asp-Asn-Gly-Ser-Val-Ile-Glu-Asn-Val-Thr-Glu-Asn-Ser-Val-Thr-Asn-Ser-Thr-Ser-Gln-Gln-Pro-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Gln-Thr-Gly-Tyr-Leu-Glu-Gln。
1.5蛋白纯化(步骤S5)
预平衡钴离子树脂后700×g低速离心5min去上清，加入5倍体积平衡缓冲液再次平衡树脂，700×g低速离心5min去上清，然后加入菌体超声后的粗裂解物，在冰上轻轻振荡孵育20min，700×g低速离心5min去上清，再次加入5倍体积平衡缓冲液清洗树脂后加入5倍体积洗脱缓冲液洗脱蛋白，收集洗脱液得到纯化的LPxTG-功能肽(即重组蛋白)，如图5所示。
在其它实施例中，功能肽也可以是以甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸开头的其它寡肽。
实施例2：LPxTG-功能肽与功能肽的功能特性比较研究
本实施例2中，为了体现功能肽的抗氧化能力，将功能肽命名为抗氧化肽。即，实施例1中的LPxTG-功能肽即本实施例2中的LPxTG-抗氧化肽；实施例1中的功能肽即为本实施例2中的抗氧化肽。
为了分别比较LPxTG-抗氧化肽和抗氧化肽对羟基自由基、ABTS自由基及DPPH自由基的清除活性，进行以下实验。
2.1羟基自由基清除活性
分为8组。其中，第1组是只有抗氧化肽(即peptide)，浓度为5μg/ml，即每毫升蒸馏水溶解5μg抗氧化肽；第2组是只有LPxTG-抗氧化肽(即LPxTG-peptide)，浓度为5μg/ml，即每毫升蒸馏水溶解5μg LPxTG-抗氧化肽；第3组是只有LPxTG表面结构蛋白，浓度为5μg/ml，即每毫升蒸馏水溶解5μg LPxTG表面结构蛋白。第4～8组分别是活化植物乳杆菌后接种至LB肉汤培养基中扩大培养(该植物乳杆菌选自植物乳杆菌ST-III，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号cgmccno.0847)，得到植物乳杆菌菌液，在植物乳杆菌菌液中梯度加入不同浓度的实施例1在1.4中得到的LPxTG-抗氧化肽0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml(即每毫升蒸馏水中分别溶解0μg、10μg、20μg、40μg、80μg LPxTG-抗氧化肽)后分别得到混合液，在混合液中，植物乳杆菌菌液的体积是混合液体积的1/2。接着，第4～8组的混合液均于37℃培养4h(也就是植物乳杆菌与LPxTG-抗氧化肽共培养4h)，离心取上清液，上清液与硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸，按顺序混合，即样品A1，空白组用蒸馏水代替样品，记为A0。第1～8组其它条件相同，均室温下孵育30min，在510nm处测定其吸光度。根据公式计算其羟基自由基清除活性。羟基自由基清除率(％)＝(1-A1/A0)×100，A1:样品；A0：空白。植物乳杆菌与LPxTG-抗氧化肽共培养的时间如果太短，两者的相互作用不够充分，羟基自由基清除率较低；共培养的时间如果太长，可能会影响LPxTG-抗氧化肽的活力，且不太符合实际LPxTG-抗氧化肽在胃肠道中的时间。
由图6可知，在同浓度的情况下，LPxTG-抗氧化肽的羟基自由基清除率高于抗氧化肽和LPxTG表面结构蛋白的自由基清除率，故LPxTG-抗氧化肽的抗氧化能力优于抗氧化肽的抗氧化能力和LPxTG表面结构蛋白的抗氧化能力。
表明：在植物乳杆菌的作用下，抗氧化肽可以从LPxTG-抗氧化肽中分离出来，LPxTG-抗氧化肽与植物乳杆菌的共表达体系对抗氧化肽的抗氧化能力起促进作用，且随着LPxTG-抗氧化肽浓度的增加，其抗氧化能力呈上升趋势，出现剂量依赖关系。
2.2 ABTS自由基清除活性
取ABTS和过硫酸钾以相同的体积混合均匀后室温下避光保存12h，使用前用磷酸盐缓冲液(PH＝7.4)稀释，使其在734nm处的吸光度为0.7±0.02。类似上述2.1，分为8组。其中，第1组是只有抗氧化肽(即peptide)，浓度为10μg/ml；第2组是只有LPxTG-抗氧化肽(即LPxTG-peptide)，浓度为10μg/ml；第3组是只有LPxTG表面结构蛋白，浓度为10μg/ml。第4～8组分别是活化植物乳杆菌后接种至LB肉汤培养基中扩大培养，得到植物乳杆菌菌液，在植物乳杆菌菌液中梯度加入不同浓度的实施例1在1.4中得到的LPxTG-抗氧化肽0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml后分别得到混合液，在混合液中，植物乳杆菌菌液的体积是混合液体积的1/2。接着，各混合液均于37℃培养4h，离心取上清液，即样品A1。向样品中加入等体积的ABTS自由基溶液，室温下孵育10min，空白组用蒸馏水代替样品，记为A0，其它条件相同，在734nm处检测其吸光度。根据公式计算其ABTS自由基清除活性。ABTS自由基清除率(％)＝(A0-A1)/A0×100，A1:样品；A0：空白。
图7的结果同样表明LPxTG-抗氧化蛋白与植物乳杆菌共培养后，对抗氧化肽的抗氧化功能具有促进作用。
2.3 DPPH自由基清除活性
类似上述2.1，分为8组。其中，第1组是只有抗氧化肽(即peptide)，浓度为5μg/ml；第2组是只有LPxTG-抗氧化肽(即LPxTG-peptide)，浓度为5μg/ml；第3组是只有LPxTG表面结构蛋白，浓度为5μg/ml。第4～8组分别是活化植物乳杆菌后接种至LB肉汤培养基中扩大培养，在植物乳杆菌中梯度加入不同浓度的实施例1在1.4中得到的LPxTG-抗氧化肽0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml后分别得到混合液，在混合液中，植物乳杆菌菌液的体积是混合液体积的1/2。接着，各混合液均于37℃培养4h后离心取上清液，即样品A1。将样品A1与DPPH自由基工作液以1:1混合，并在25℃阴凉处下孵育30min。空白组中将95％乙醇与DPPH自由基工作液以1:1混合，对照组将95％乙醇和样品按1：1配制，其它条件相同。将孵育好的样品于517nm处检测其吸光度，并根据公式计算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100，Ai:样品；A0：空白；Aj：对照组。
图8的结果同样表明LPxTG-抗氧化肽对抗氧化肽抗氧化功能的促进作用，但LPxTG表面结构蛋白与LPxTG-抗氧化肽对DPPH自由基的清除效果相近。
如表2所示，LPxTG表面结构蛋白与抗氧化肽的共表达体系构建(即LPxTG-抗氧化肽)显著增加了抗氧化肽的抗氧化活性，植物乳杆菌的加入可引起LPxTG-抗氧化肽自由基清除活性的显著变化(p<0.05)，这表明LPxTG表面结构蛋白与抗氧化肽具有协同作用，对抗氧化肽的抗氧化能力具有促进作用。
表2 抗氧化能力显著性差异分析
Figure BDA0003399634970000091
Peptide:抗氧化肽；LPxTG:LPxTG表面结构蛋白；LPxTG-peptide(即LPxTG-抗氧化肽):LPxTG表面结构蛋白与抗氧化肽结合的共表达体系；(+、-)表示是否加入植物乳杆菌。
注：相同列不同字母表示显著性差异(p<0.05)
实施例3：LPxTG-功能肽的胃肠耐受特性测试方法
本实施例3中，为了体现功能肽的抗氧化能力，将功能肽命名为抗氧化肽。即，实施例1中的LPxTG-功能肽即本实施例3中的LPxTG-抗氧化肽；实施例1中的功能肽即为本实施例3中的抗氧化肽。
为了测试LPxTG-抗氧化肽的胃肠耐受特性，做如下实验。分别配制人工胃液(下文简称为胃液)和人工肠液(下文简称为肠液)。人工胃液的配制方法为加入0.5gNaCl，0.3g胃蛋白酶用超纯水定容至100ML，pH＝2。人工肠液的配制方法为加入0.5gNaCl，0.5g牛胆汁盐，0.3g胰蛋白酶超纯水定容至100ML，pH＝8。加入等体积的浓度为10μg/ml的LPxTG-抗氧化肽、LPxTG表面结构蛋白和抗氧化肽，分别于37℃与胃液混合在一起处理2h、于37℃与肠液混合在一起处理3h。活化植物乳杆菌后接种至LB肉汤培养基中扩大培养，分别加入经胃液、肠液处理后的LPxTG-抗氧化肽、LPxTG表面结构蛋白于37℃培养4h后离心取上清液，测定其对羟基自由基、ABTS自由基与DPPH自由基的清除效果。对照组分别加入抗氧化肽、LPxTG-抗氧化肽，使用超纯水代替植物乳杆菌，其余条件相同。
实验结果参见表3～表4、图9～图11，结果表明，经胃液、肠液处理后，与抗氧化组(即只有抗氧化肽的组)相比，经过植物乳杆菌共培养后的LPxTG-抗氧化肽的抗氧化活性明显较高(p<0.01)。均经植物乳杆菌共培养后的LPxTG表面结构蛋白与LPxTG-抗氧化肽以及未经植物乳杆菌共培养的LPxTG-抗氧化肽的抗氧化活性也具有显著差异。
表明LPxTG-抗氧化肽对胃肠环境有一定的耐受性，对抗氧化肽起到一定的保护作用。且实验结果显示LPxTG-抗氧化肽与植物乳杆菌一起共培养后，LPxTG结构中甘氨酸与苏氨酸之间肽链可以被植物乳杆菌中的分选酶A降解断裂，抗氧化肽能够顺利被释放。
表3 胃液处理后抗氧化能力显著性差异分析
Figure BDA0003399634970000101
Peptide:抗氧化肽；LPxTG:LPxTG表面结构蛋白；LPxTG-peptide(即LPxTG-抗氧化肽):LPxTG表面结构蛋白与抗氧化肽结合的共表达体系；(+、-)表示是否加入植物乳杆菌。
注：相同列不同字母表示显著性差异(p<0.01)
表4 肠液处理后抗氧化能力显著性差异分析
Figure BDA0003399634970000111
Peptide:抗氧化肽；LPxTG:LPxTG表面结构蛋白；LPxTG-peptide(LPxTG-抗氧化肽):LPxTG表面结构蛋白与抗氧化肽结合的共表达体系；(+、-)表示是否加入植物乳杆菌。
注：相同列不同字母表示显著性差异(p<0.01)。
实施例4：基于乳酸菌LPxTG基序的重组蛋白在口服制剂中的应用
当将基于乳酸菌LPxTG基序的重组蛋白(即实施例1.4中得到的LPxTG-功能肽)用于口服制剂时，口服LPxTG-功能肽后，在肠道内的植物乳杆菌的作用下，实现功能肽在宿主体内的定向释放，有助于小肠定向吸收功能肽；
另外，被释放后的功能肽清除自由基的能力得以增强，这样可以减少肠道中的自由基，从而减少肠道粘膜受到的来自自由基的氧化损伤，以及减少自由基对肠道中益生性菌群的干扰，有利于肠道中益生性菌群维持稳态。
序列表
<110> 宁波大学
<120> 一种基于乳酸菌LPxTG基序重组蛋白的构建及应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 708
<212> DNA
<213> Lactobacillus reuteri
<400> 1
attactactc cagaaggtaa ggttccagac gcatcagatg gtattaagaa caagactgat 60
ctccctaacg acacgaagta cacttggact gatccagatc aagttgcaca agatgtcaag 120
aagcctggtt cacatactga aacgattact gttcgttatc cagacggttc agaagatacg 180
gttacagtaa ctgttaatgt tcccgcacct gagggacaaa atattacaac tgatcaaggt 240
aaactcccta accctgcaga tgcaattaag aacaaagatc agatgccgga tggaacaact 300
tacacttgga agcaagaacc tgatgtttct actcctggtg atcacactgg tgtagttgaa 360
gtccacttcc cagacggaac tacctatgaa gtaaccgttg atgttcatgt agatgctgta 420
acccctgata atggcggaaa catgaactcc ggtaatggtt caattgatca tcaaaacggc 480
actgaaatta ataatggaac tgcaaccaag actgataacg gttcagtaat cgaaaatgta 540
actgaaaata gtgtaactaa cagtactagc cagcaaccag cgaagacatt gccacaaact 600
ggtaatgatt cttctaagtt cagtgcatta gctggcttga gtcttgccgc tttcgcaagt 660
ctcttcggtt ttgcaggcca cgataagaaa cgcaaagctg ataaataa 708
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
agtttgtggc aatgtctt 18
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ctgctccagg tagccagttt gtggcaatgt ctt 33
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
attactactc cagaaggtaa ggttcca 27
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gtggtggtgg tggtgctcga gttactgctc caggtagcca gttt 44
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
cagcaaatgg gtcgcggatc cattactact ccagaaggta aggttcca 48
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ggctacctgg agcag 15
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gtggtggtgg tggtgctcga g 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
cagcaaatgg gtcgcggatc c 21
<210> 10
<211> 205
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 10
Ile Thr Thr Pro Gly Gly Leu Val Pro Ala Ala Ser Ala Gly Thr Leu
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ala Leu Pro Ala Ala Thr Leu Thr Thr Thr Thr Ala Pro
20 25 30
Ala Gly Val Ala Gly Ala Val Leu Leu Pro Gly Ser His Thr Gly Thr
35 40 45
Ile Thr Val Ala Thr Pro Ala Gly Ser Gly Ala Thr Val Thr Val Thr
50 55 60
Val Ala Val Pro Ala Pro Gly Gly Gly Ala Ile Thr Thr Ala Gly Gly
65 70 75 80
Leu Leu Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ile Leu Ala Leu Ala Gly Met Pro
85 90 95
Ala Gly Thr Thr Thr Thr Thr Leu Gly Gly Pro Ala Val Ser Thr Pro
100 105 110
Gly Ala His Thr Gly Val Val Gly Val His Pro Pro Ala Gly Thr Thr
115 120 125
Thr Gly Val Thr Val Ala Val His Val Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala
130 135 140
Gly Gly Ala Met Ala Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ala His Gly Ala Gly
145 150 155 160
Thr Gly Ile Ala Ala Gly Thr Ala Thr Leu Thr Ala Ala Gly Ser Val
165 170 175
Ile Gly Ala Val Thr Gly Ala Ser Val Thr Ala Ser Thr Ser Gly Gly
180 185 190
Pro Ala Leu Thr Leu Pro Gly Thr Gly Thr Leu Gly Gly
195 200 205

Claims (8)

1.一种基于乳酸菌LPxTG基序的重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白的氨基酸序列为：
Ile-Thr-Thr-Pro-Glu-Gly-Lys-Val-Pro-Asp-Ala-Ser-Asp-Gly-Thr-Lys-Asn-Lys-Thr-Asp-Leu-Pro-Asn-Asp-Thr-Lys-Tyr-Thr-Trp-Thr-Asp-Pro-Asp-Gln-Val-Ala-Gln-Asp-Val-Lys-Lys-Pro-Gly-Ser-His-Thr-Glu-Thr-Ile-Thr-Val-Arg-Tyr-Pro-Asp-Gly-Ser-Glu-Asp-Thr-Val-Thr-Val-Thr-Val-Asn-Val-Pro-Ala-Pro-Glu-Gly-Gln-Asn-Ile-Thr-Thr-Asp-Gln-Gly-Lys-Leu-Pro-Asn-Pro-Ala-Asp-Ala-Ile-Lys-Asn-Lys-Asp-Gln-Met-Pro-Asp-Gly-Thr-Thr-Tyr-Thr-Trp-Lys-Gln-Glu-Pro-Asp-Val-Ser-Thr-Pro-Gly-Asp-His-Thr-Gly-Val-Val-Glu-Val-His-Phe-Pro-Asp-Gly-Thr-Thr-Tyr-Glu-Val-Thr-Val-Asp-Val-His-Val-Asp-Ala-Val-Thr-Pro-Asp-Asn-Gly-Gly-Asn-Met-Asn-Ser-Gly-Asn-Gly-Ser-Ile-Asp-His-Gln-Asn-Gly-Thr-Glu-Ile-Asn-Asn-Gly-Thr-Ala-Thr-Lys-Thr-Asp-Asn-Gly-Ser-Val-Ile-Glu-Asn-Val-Thr-Glu-Asn-Ser-Val-Thr-Asn-Ser-Thr-Ser-Gln-Gln-Pro-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Gln-Thr-Gly-Tyr-Leu-Glu-Gln。
2.一种基于乳酸菌LPxTG基序重组蛋白的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1、根据罗伊氏乳杆菌中含LPxTG序列的表面结构蛋白的基因序列，设计用于扩增的引物F1、R1，在引物F1的上游增加功能肽的序列后得到引物F1’，以提取的罗伊氏乳杆菌的全基因组为模板，使用引物F1’、R1进行PCR扩增，得到LPxTG-功能肽的基因片段；
所述功能肽以甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸中的任一种开头；
所述引物F1为AGTTTGTGGCAATGTCTT；
所述引物F1’为CTGCTCCAGGTAGCCAGTTTGTGGCAATGTCTT；
所述引物R1为ATTACTACTCCAGAAGGTAAGGTTCCA；
所述功能肽为ggctacctggagcag；
步骤S2、使用CE Design在引物F1’,R1两端增加同源臂F3,R3后得到F2、R2，对从步骤S1中得到的LPxTG-功能肽的基因片段为模板，采用引物F2、R2进行扩增，得到LPxTG -功能肽的基因片段增加同源臂后的产物；
所述引物F2为：gtggtggtggtggtgctcgagTTACTGCTCCAGGTAGCCAGTTT；
所述引物R2为cagcaaatgggtcgcggatccATTACTACTCCAGAAGGTAAGGTTCCA；
同源臂F3为gtggtggtggtggtgctcgag；
同源臂R3为cagcaaatgggtcgcggatcc；
步骤S3、根据步骤S2中LPxTG-功能肽的基因片段增加同源臂后的产物，构建LPxTG-功能肽重组表达载体；
步骤S4、将从步骤S3中得到的重组表达载体倒入宿主细胞，并在宿主细胞中进行诱导表达，获得表达产物；
步骤S5、分离纯化从步骤S4中所得的表达产物，获得重组蛋白，即LPxTG -功能肽。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤S3中，表达载体采用pET-28a。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤S4中，宿主细胞为BL-21 (DE3)。
5.一种如权利要求2~4中任一项所述的基于乳酸菌LPxTG基序重组蛋白的构建方法在增加功能肽抗氧化性方面的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括增加功能肽抗氧化性的方法，具体包括以下步骤：
步骤(a)、根据所述的基于乳酸菌LPxTG基序重组蛋白的构建方法制备LPxTG-功能肽，其中功能肽具有抗氧化性；
步骤(b)、将植物乳杆菌与步骤(a)制备的LPxTG-功能肽进行共培养。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述步骤(b)具体包括：活化植物乳杆菌后，将其接种至LB肉汤培养基中扩大培养，得到植物乳杆菌菌液，在植物乳杆菌菌液中加入步骤(a)制备的 LPxTG-功能肽的水溶液，该水溶液的浓度为5~15μg/ml，该水溶液与植物乳杆菌菌液等体积，于37℃培养4h后离心取上清液。
8.一种如权利要求1所述的基于乳酸菌LPxTG基序的重组蛋白在制备口服制剂中的应用。
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