CN102746388A

CN102746388A - 一种链球菌保护性抗原C5a及其制备方法

Info

Publication number: CN102746388A
Application number: CN2012102252101A
Authority: CN
Inventors: 陈瑶生; 魏子贡; 付强; 刘小红; 莫德林
Original assignee: Ipig Management & Consulting Co Ltd; Sun Yat Sen University
Current assignee: Ipig Management & Consulting Co Ltd
Priority date: 2012-07-02
Filing date: 2012-07-02
Publication date: 2012-10-24
Anticipated expiration: 2032-07-02
Also published as: CN102746388B

Abstract

本发明涉及一种链球菌保护性抗原C5a及其制备方法，所述链球菌保护性抗原C5a为SEZC5a重组蛋白，由571个氨基酸组成，分子量为60.3kDa；正向引物有1个BamHI酶切位点，反向引物有1个EcoRI酶切位点。所述链球菌保护性抗原C5a的制备方法，通过克隆、表达、纯化SEZ C5a重组蛋白，应用一系列生物工程技术和小鼠实验对rSCPZ进行系统分析。rSCPZ免疫后可以提供较高的保护效力，anti-rSCPZ小鼠二免血清对小鼠有明显的被动免疫保护，rSCPZ免疫后的小鼠血清中表现高水平的抗体滴度。anti-rSCPZ抗体可以诱导高水平的杀菌能力，scpZ基因在SEZ感染的小鼠体内的转录水平高于体外培养的转录水平，rSCPZ可以Hep-2细胞，并且可以抑制SEZ侵染细胞的能力。

Description

一种链球菌保护性抗原C5a及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种链球菌保护性抗原C5a，还涉及该保护性抗原C5a的制备方法。

背景技术

链球菌是一种常见的致病菌，根据细胞壁多糖抗原不同，可分为A、B、C…、V（缺I和J）20个群，其中对人致病的主要为A群链球菌(Group A Streptococci，GAS),其他各群对动物致病。在家畜和家禽中发生的链球菌感染，主要为B链球菌(Group B Streptococci，GBS)和C群链球菌(Group C Streptococci，GCS)等群溶血性链球菌，如由B群引起的牛乳腺炎和猪脓疱症；由C群引起的马腺疫以及羊、猪败血型链球菌感染。目前对于GAS和GBS的研究较多，GAS和GBS的C5a蛋白(SCPA、SCPB)可以通过裂解C5a补体成分而抑制中性粒细胞趋化，从而有助于细菌逃避吞噬。近期的研究显示，C5a蛋白在粘附上皮细胞过程中扮演重要角色。SCPB可与人喉癌上皮细胞Hep-2细胞直接接触，兔anti-SCPB血清可以抑制对肺上皮A549细胞的入侵。SCPA也有同样的效果，小鼠鼻内接种SCPA后，可以阻止A群链球菌在小鼠咽部定植，这表明SCPA蛋白具有制备成疫苗的潜力，使人类可以预防A族链球菌的感染。

马链球菌兽疫亚种(Streptococcus zooepidemicus，SEZ)是GCS的一种，对于SEZ的研究较少。SEZ可以导致败血症、脑膜炎、化脓性关节炎、心内膜炎，还有马、猪、羊、牛等哺乳动物的乳房炎。SEZ还是一种传播人畜共患传染病病毒的重要介质，人们通过接触病患，挤牛奶或者其它日常工作而感染。由于对SEZ毒力因素和保护性抗原一直都缺乏全面了解，从而很难有效控制SEZ的感染。因此，预防这种病菌的传播依赖于严格的控制措施。因此提供一种保护性抗原对于防治SEZ的感染意义重大。

发明内容

有鉴于此，有必要针对SEZ难于防治的的问题，提供一种链球菌保护性抗原C5a。

一种链球菌保护性抗原C5a，为C5a重组蛋白，具有高度保守性。

所述C5a重组蛋白为SEZ C5a蛋重组白（rSCPZ），由scpZ基因编码，由571个氨基酸残基组成，分子量为60.3kDa，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述scpZ的正向引物和反向引物各有1个酶切位点。

一种链球菌保护性抗原C5a的制备方法，包含以下步骤：

PCR扩增：使用链球菌基因组为模板，与引物进行PCR扩增；

与载体连接：PCR产物经限制性酶酶切后与经相同的限制性酶酶切的pET-32a载体连接；所述的限制性酶为BamHI和EcoRI。

转化和诱导：将上述连接好的载体转化大肠杆菌后，孵育到指数生长期，加入IPTG后继续孵化3h；

纯化：收集细液，离心，来自上清液的目标蛋白经过Ni-NTA色谱进行纯化获得纯化的C5a重组蛋白。

所述引物为：正向引物(SEQ ID NO.3)：5’-CAGAGGGCGGATCCTTT-3’，划线部分为BamHI酶切位点；反向引物(SEQ ID NO.4)：5’-CTGCTGGAATTCTGAGATAT-3’，划线部分为EcoRI酶切位点；

链球菌保护性抗原C5a在制备链球菌疫苗中的应用。

应用所述链球菌保护性抗原C5a制备链球菌疫苗的方法为：将成功表达并纯化的重组蛋白分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化后作为疫苗，浓度为100μg/mL。

与现有技术相比，本发明通过克隆、表达、纯化C5a重组蛋白，应用一系列生物工程技术和小鼠实验对C5a重组蛋白进行系统分析。本发明首先通过PCR技术获得目的基因，使用大肠杆菌诱导表达C5a重组蛋白，经免疫印迹分析，该重组蛋白和SEZ康复猪血清表现良好的免疫反应。

C5a重组蛋白免疫后可以提供较高的保护效力，抗C5a重组蛋白小鼠二免血清对小鼠有明显的被动免疫保护，C5a重组蛋白免疫后的小鼠血清中表现高水平的抗体滴度。C5a重组蛋白抗体可以诱导高水平的杀菌能力，scpZ基因在SEZ感染的小鼠体内的转录水平高于体外培养的转录水平，rSCPZ可以Hep-2细胞，并且可以抑制SEZ侵染细胞的能力。

附图说明

图1.SEZ C55138菌株scpZ基因的琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道1为DNA标准DL2000Mark，泳道2为C5a扩增片段，泳道3为空白对照。

图2.（A）显示氨基酸序列结果。（B）是氨基酸对比图。三个假定活性氨基酸(Asp/His/Ser三联体)被框出来。（C）是rSCPZ的SDS-PAGE和免疫印迹分析结果图。泳道1-3分别是大肠杆菌非诱导、诱导表达的rSCPZ和Ni-NTA纯化的蛋白。泳道4是rSCPZ与SEZ康复猪血清的免疫印迹分析结果，最左边为分子Mark。

图3.表示rSCPZ在小鼠体内诱导产生的免疫反应。（A）免疫组的SCPZ/IgG水平显著高于阴性对照组的抗体水平。（B）SCPZ可以诱导一个起主导地位的的IgG1反应类型。

图4.（A）表示免疫组、阳性对照组和阴性对照组的小鼠，经SEZ攻毒后，小鼠的存活率。（B）SCPZ抗体和SEZ灭活疫苗（阳性对照）对小鼠表现显著的保护能力，而正常血清（阴性对照）不能保护小鼠。

图5.是小鼠全血杀菌能力分析，SEZ灭活疫苗血清（阳性对照）的杀菌能力最强，而rSCPZ血清的杀菌能力高于正常血清（阴性对照）。

图6.显示了定量PCR分析结果，结果显示，scpZ基因在小鼠体内有较高的转录水平，并且该转录水平量高于体外培养的转录水平。

图7.表示流式细胞分析rSCPZ粘附Hep-2细胞的结果。（A）表示未标记的细胞量。（B）使用rSCPZ处理后细胞的荧光信号强度。

图8.（A）rSCPZ对SEZ侵染Hep-2细胞的抑制作用。（B）小鼠anti-SCPZ抗体对SEZ侵染Hep-2细胞的抑制作用。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合实施例和附图做进一步说明。

实施例一、菌株与生长条件

菌株采用SEZ C55138菌株；培养基为TSB培养基中或者含5％胎牛血清的TSA培养基；在37℃振荡培养约8h，或OD600达到0.6-1.0。

载体为大肠杆菌pET-28a，感受态细胞为大肠杆菌BL21。

SEZ C55138菌株，大肠杆菌pET-28a载体和大肠杆菌BL21感受态细胞三者均为市购产品。

实施例二、制备方法

SCPZ蛋白由scpZ基因编码，所述gapdh基因正向引物有1个BamHI酶切位点，反向引物有1个EcoRI酶切位点。所述正向和反向游引物由SEZ MGCS10565基因组序列设计而来(NCBI Accession：CP001129.1)。

马链球菌兽疫亚种保护性抗原GAPDH的制备方法，包含以下步骤：

PCR扩增：使用C55138菌株的基因组为模板，使用下述引物进行PCR扩增；

正向引物(SEQ ID NO.3)：5’-CAGAGGGCGGATCCTTT-3’，划线部分为BamHI酶切位点，

反向引物(SEQ ID NO.4)：5’-CTGCTGGAATTCTGAGATAT-3’，划线部分为EcoRI酶切位点；

与载体连接：PCR产物使用限制性酶酶切后与经相同限制性内切酶酶切的pET-32a载体连接；

转化和诱导：将上述连接好的载体转化大肠杆菌感受态细胞BL21后，在37°C环境孵育到指数生长期，加入1mM IPTG诱导，在37°C环境孵化3h；同时做非诱导对照试验。

纯化：收集菌液，离心，上清液中的目标蛋白经过Ni-NTA色谱纯化后获得纯化的重组蛋白。

免疫印迹分析：纯化后的重组蛋白，使用感染过SEZ的康复猪血清作为一抗，羊抗猪IgG(H+L)-HRP作为二抗进行免疫印迹分析。

所述的C55138菌株的基因组由常规方法从C55138菌株中提取获得。

引物是由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。所述限制性内切酶为BamHI和EcoRI。

IPTG即异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质。基于这个特性，带有lacZ基因载体DNA以lacZ缺失细胞为宿主进行转化时，如果在平板培养基中加入X–Gal和IPTG，由于β–半乳糖苷酶的α–互补性，可以根据是否呈现白色菌落（或噬菌斑）而方便地挑选出基因重组体。此外，它还可以作为具有lac或tac等启动子的表达载体的表达诱导物使用。

实验结果1）PCR得到1716bp的碱基序列(SEQ ID NO.1)，琼脂糖凝胶电泳结果见图1。将其与SCPA与SCPB进行对比，比对结果显示SCPZ与SCPA(NCBI，gi：50915064)和SCPB(NCBI，gi：319744441)有序列同源性。推测结构为peptidases_S8_C5a_peptidase（见图2A），尤其是氨基酸活性位点具有高度保守性（见图2B）。序列的进一步生物信息学分析显示SCPZ的N末端有一个分泌信号，并定位于细胞壁上，这是许多链球菌表面毒力相关因素共有的特点。克隆与表达的571个氨基酸组成的混合蛋白(SEQ ID NO.2)，达到预测分子量为60.3kDa。

比较诱导和非诱导培养的细菌，可以证明蛋白表达成功，诱导蛋白的条带与预测的大小相一致。通过Ni-NTA亲和层析的方式获得纯化重组蛋白，该蛋白与感染SEZ的康复猪血清表现良好的免疫反应（见图2C）。

实施例三、小鼠免疫接种与攻毒试验

1、30只4周龄BALB/c雌鼠，随机分成3组，每组10只；

2、实验组：50μg纯化的重组SCPZ蛋白用弗氏完全佐剂乳化后，腹腔注射免疫第1组小鼠，14天后，以50μg弗氏不完全佐剂乳化的相同抗原，以同样的方式第二次注射免疫小鼠；

3、阳性对照组：向第2组小鼠注射SEZ灭活疫苗（使用弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化灭活的SEZ C55138菌株，细菌浓度为2×10⁸CFU/mL）；

4、阴性对照组：向第3组小鼠注射佐剂乳化的PBS，使用的佐剂与阳性对照组的佐剂相同；

5、所有小鼠免疫10天后（实验组为第二次免疫注射后10天），尾静脉取血获得血清，然后使用SEZ C55138菌株（2×10⁵CFU/mL）攻毒；

6、观察并记录所有小鼠的生长情况。

实验结果：1）阴性对照组的小鼠攻毒3天后，有5只小鼠死亡，存活的小鼠表现明显的临床症状，例如毛被零乱，反应迟钝，并在6天内死亡；

2）阳性对照组的小鼠表现轻微的临床症状，并在攻毒3天后恢复过来；

3）实验组的10小鼠，攻毒4天后有2只小鼠死亡，存活的小鼠表现轻微的临床症状，例如抑郁、消瘦，并在5天后恢复过来（见图4A）；

4）在攻毒实验完成14天后，存活的小鼠体内没有分离出细菌。

结果表明SCPZ可以局限性的保护小鼠，抵御SEZ的感染。

实施例四、被动保护试验分析

为了证实保护是归功于SCPZ特殊的刺激免疫反应，用anti-rSCPZ小鼠二免血清被动免疫小鼠，然后再实行攻毒试验。

1、30只6周龄BALB/c雌鼠，随机分成3组，每组10只；

2、实验组：用100μL anti-rSCPZ二免血清静脉注射免疫第1组小鼠；

3、阳性对照组：用SEZ灭活疫苗的二免血清静脉注射免疫第2组小鼠；

4、阴性对照组：用正常血清静脉注射免疫第3组小鼠；

5、免疫24h后，所有小鼠用SEZ C55138攻毒（2×10⁵CFU/mL）；

6、观察并记录所有小鼠的生长情况。

实验结果：1）阳性对照组小鼠在攻毒试验中存活下来；

2）实验组小鼠在攻毒后表现被毛粗乱、精神萎靡、对刺激反应迟缓等临床症状，但小鼠的存活率达90％。

3）阴性对照组小鼠，3天后全部死亡（见图4B）。

结果表明SCPZ对小鼠有明显的被动免疫保护能力。

实施例五、抗体滴度测定

血清IgG滴度用ELISA测定，将纯化的重组蛋白包被在酶联板上，将二免10天后的小鼠采血分离血清，连续倍比稀释后，各个稀释度取100μL加入酶联板，37°C反应后加入兔抗鼠IgG，用酶标仪读取OD值，取OD值大于对照血清平均OD值+3倍方差SD（标准差）的血清最大稀释倍数作为血清抗体。为了推断免疫类型，IgG1和IgG2a分别进一步作为对照用于测定Th2和Th1的免疫反应。

实验结果：免疫组的IgG滴度GAPDH抗体水平显著高于阴性对照组的抗体水平(p<0.001)（见图3A）。

结果表明GAPDH可以诱导显著的Th1-/Th2免疫反应，并且IgG1与IgG2在小鼠体内的反应，IgG1占主导地位（见图3B）。

实施例六、全血致死量分析

为了测定anti-rSCPZ抗体的杀菌活性，把小鼠血液肝素化后，使用anti-rSCPZ或对照血清与血液中存活的SEZ孵育后进行评估。

1、SEZ C55138菌株培养到指数生长中期，用PBS调整细菌浓度为10⁴CFU/mL；

2、实验组：900μL健康小鼠血液甘素化后，与100μLL小鼠anti-rSCPZ血清混合；

3、阳性对照组：900μL健康小鼠血液甘素化后，与100μL SEZ灭活疫苗免疫血清混合作为阳性对照；

4、阴性对照组：900μL健康小鼠血液甘素化后，与100μl SEZ灭活疫苗免疫前的血清混合作为阴性对照；

5、分别向各混合液中加入100μL SEZ菌液，37°C旋转培养90min；

6、每组取3份样品，每份100μL，并接种于TSA培养基中，计算孵化前和孵化后存活的细菌量；

7、存活率计算为剩下细菌量相对于开始时细菌量的百分比。

实验结果：阴性对照组SEZ存活率达96.0±2.967％；阳性对照组SEZ存活率仅为30.49±3.244％；实验组SEZ存活率为39.25±3.277％（见图5）。

结果表明：anti-rSCPZ抗体可以诱发高水平的杀菌能力。

实施例七、定量PCR检测体内诱导基因的表达水平

为了评估小鼠体内scpZ基因的表达水平，使用定量PCR技术相定量的测定scpZ基因的转录水平。

1、细菌从SEZ感染的小鼠体内重新获得，脾组织样品4°C，850×g，离心5min，取上清液4°C，15500×g，离心5min；

2、收获的SEZ用于提取总RNA；

3、逆转录获得cDNAs，以cDNA样品为模板做定量PCR（系统中显示绿色荧光），所有反应一式三份；

在Real-time PCR中，使用下述引物来定量分析scpZ基因：

正向引物(SEQ ID NO.5)：5’-CGGATTCCTTATCAGCGG-3’，

反向引物(SEQ ID NO.6)：5’-CTCCAGCAACCAACAAAA-3’；

Real-time PCR中，使用下述引物来定量分析16S rRNA基因：

正向引物(SEQ ID NO.7)：5’-ATCCGAACTGAGATTGGC-3’，

反向引物(SEQ ID NO.8)：5’-CCCTTATGACCTGGGCTA-3’；

实验结果：scpZ基因在SEZ感染的小鼠体内的表达水平比体外培养的表达水平高很多（见图6）。

结果表明scpZ基因在小鼠体内的转录水平得到提高，并且高于体外培养的转录水平。

实施例八、Hep-2细胞粘附试验分析

为了确定SCPZ是否与细菌粘附Hep-2细胞有关，我们运用细胞流式分析技术进行分析。105CFU/mL的SEZ与2μg重组蛋白SCPZ孵育，然后再与SCPZ免疫过的小鼠血清孵育，IgG-FITC染色后，使用流式细胞仪进行分析。

1、使用含1％BSA的PBS 200μL（PBS-BSA）重悬Hep-2细胞，加入2μg纯化rSCPZ，冰上孵育45min，同时用2μg的BSA代替rSCPZ作对照实验；

2、冰上预冷的PBS-BSA洗涤两次；

3、加入100μL小鼠SCPZ免疫血清，冰上孵育45min；

4、冰上预冷的PBS-BSA洗涤后，细胞与IgG-FITC冰上孵育45min；

5、冰上预冷的PBS-BSA洗涤一次，经流式细胞仪分析；

6、最后使用Beckton-Dickinson FACS-Calibur进行分析。

实验结果：rSCPZ孵育过的Hep-2细胞表面检测出显著的荧光信号，然而阴性对照没有检测出荧光信号（见图7）。

结果表明rSCPZ可以粘附Hep-2细胞。

实施例九、Hep-2细胞侵染抑制分析

为了判定rSCPZ在抑制SEZ侵染Hep-2细胞过程中扮演的角色，使用感染的单层细胞分析rSCPZ体内中和SEZ的能力，免疫前的血清作为阴性对照，10％抗原血清与细菌在室温孵育1h。侵染指数=（侵染的细菌数/粘附的细菌数）×100。同时，为了判断SCPZ涉及SEZ侵染Hep-2细胞的重要性，我们进行了抑制试验分析。

1、Hep-2细胞使用24孔板培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基，37℃培养；

2、单层细胞使用PBS洗涤3次后，与10μg/mL rSCPZ于37℃培养箱孵育2h，同样的细胞使用10μg/mL BSA处理后作对照组；

3、所有细胞使用PBS洗涤3次，使用DMEM溶解SEZ使得浓度为5×107CFU/mL，取1mL菌液分别加入到每孔板中，37℃，5％CO2条件下孵育2h；

然后，根据下面的方法对细菌的侵染能力进行评估：

4、前面孵育后的细胞，PBS冲洗多次，使未粘附的细菌尽量冲洗掉；

5、用含100μg庆大霉素和5μg青霉素的DMEM处理细胞，杀死未冲洗干净的细菌或粘附于细胞上的细菌，再用PBS冲洗细胞；

6、用0.2％Triton X-100的PBS降解细胞，琼脂糖铺板，细菌计数；

实验结果：1）与PBS相比，rSCPZ可以抑制87.3±2.193％的SEZ细菌量进入Hep-2细胞；

2）与正常血清相比，anti-SCPZ血清减少了78.2±2.427％(p<0.001)细菌进入细胞（见图8B）。

结果表明SCPZ能以特定的方式促进病菌入侵宿主细胞，同时SCPZ还可特异的结合抗体，阻止机体的特异性免疫反应。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。