CN111499702A - 一种马链球菌兽疫亚种的检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种马链球菌兽疫亚种的检测试剂盒及检测方法，该检测试剂盒包括包被有重组SzP蛋白的酶标板，SzP蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，终止液，含有检测用抗体的液相，所述的检测用抗体包括用于检测抗体的酶标二抗。本发明还公开了一种马链球菌兽疫亚种重组SzP蛋白的制备方法，该重组蛋白回收率、纯度和活性均较高。本发明提供的一种马链球菌兽疫亚种的检测试剂盒及检测方法具有制备成本低，且检测特异性、灵敏性及可重复性均较好的优点。

Description

一种马链球菌兽疫亚种的检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种马链球菌兽疫亚种的检测试剂盒及检测方法。
背景技术
马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp.zooepidemicus)是动物链球菌病的主要病原之一。马链球菌兽疫亚种可感染马属动物、猪、牛、犬和猫等多种动物，人类食用该菌污染的食品或与患病动物接触均有可能被感染。马链球菌兽疫亚种在我国主要感染马、驴和猪，临床表现为关节炎、败血症、肺炎和脑膜炎，一般呈地方流行性。类M蛋白具有多种生物学功能，能介导兽疫亚种和宿主细胞的粘附作用，具体而言，体内的H因子是血浆内一种重要的调节蛋白，与类M蛋白结合能抑制补体C3b对链球菌的吸附，从而起到抑制机体吞噬细胞对链球菌吞噬的作用。类M蛋白N末端带有负电荷，可排斥表面带负电荷的吞噬细胞，如单核巨噬细胞、嗜中性粒细胞等，从而抑制以上吞噬细胞对其的吞噬作用据此可知类M蛋白是兽疫亚种重要的毒力因子。
酶联免疫吸附试验是常用免疫学诊断方法，是根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应的高敏感性而建立起来的免疫检测技术。其基本过程是将抗原或抗体吸附于固相载体，并在载体上进行免疫酶反应，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。具体方法包括间接法、夹心法、双夹心法和竞争法。其中间接法较为常用，用于测定未知抗体，原理是用抗原将固相载体致敏，然后加入含有特异性抗体的血清，经过一段时间的孵育，固相载体表面的抗原抗体形成复合物，洗漆除去其他成分，再加上用酶标记的二抗，加入底物，底物在酶催化作用下发生反应，产生有色物质。
现有技术如授权公告号为CN 102565392 B的中国发明专利，公开了一种快速检测马链球菌兽疫亚种的ELISA快速检测试剂盒及方法。具体而言，该发明所述试剂盒包括重组马链球菌兽疫亚种类M蛋白抗原和酶标二抗。该发明还公开了一种检测马链球菌兽疫亚种的间接ELISA方法，该方法快速简便，可直接对待检血清进行检测。该发明所述检测试剂盒和检测方法的敏感度高，特异性强。
发明内容
本发明的目的在于一种制备成本低，且检测特异性、灵敏性及可重复性均较好的马链球菌兽疫亚种的检测试剂盒及检测方法。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
提供一种马链球菌兽疫亚种重组SzP蛋白的制备方法，包括以下步骤：
S1、SzP蛋白原核表达系统的构建；
S2、重组SzP蛋白的诱导表达；
S3、重组SzP蛋白的分离纯化；
上述SzP蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；上述步骤S2中SzP重组蛋白的表达形式为可溶性蛋白，上述步骤S3具体包含：将诱导好的菌液离心收集沉淀，用磷酸盐缓冲液悬浮菌体，超声破碎，离心取上清，经0.45μm滤膜过滤后，加入终浓度为0.3-0.53mg/mL的鞣花酸和终浓度为0.16-0.24mg/mL的白桦脂醇，得到粗重组SzP蛋白；使用Ni-NTA His·Bind树脂的蛋白纯化层析柱纯化重组蛋白SzP，得到纯化的重组SzP蛋白。重组蛋白中含有His Tag标签，重组蛋白溶液中加入鞣花酸和白桦脂醇，有利于His Tag标签的暴露，促进His Tag序列的组氨酸的咪唑基与Ni2+的结合，抑制溶解缓冲液中咪唑的竞争性结合，有利于目的蛋白与树脂的结合，在提高重组蛋白回收率的同时，能够保证纯化后重组蛋白的纯度和特异性，进而在降低试剂盒的制备成本的同时保证检测的特异性。
优选地，上述步骤S1具体包括：以SEZ基因组为模板，对SEZ szp基因进行扩增，利用NdeⅠ和XhoⅠ对得到的PCR产物与表达载体pET-28a(+)进行双酶切后，酶切产物回收后进行连接反应，再将连接产物导入大肠杆菌BL21感受态细胞中。
优选地，上述步骤S3中使用Ni-NTA His·Bind树脂的蛋白纯化层析柱纯化重组蛋白SzP所需溶液及其成分包括：
溶解缓冲液：20-30mM Na3PO4·12H2O、450-500mM NaCl、20-30mM咪唑；
洗脱缓冲液：20-30mM Na3PO4·12H2O、450-500mM NaCl、400-500mM咪唑。
优选地，上述溶解缓冲液和/或洗脱缓冲液中还包括京尼平苷酸。在蛋白质分子折叠时，由线性氨基酸序列的相隔离的氨基酸残基而形成的空间构象，成为构象决定簇，蛋白质的抗原决定簇依赖于其一级结构和空间结构，京尼平苷酸能够保护重组蛋白在纯化过程中加入的溶解液和洗脱液中的盐离子对重组蛋白的结构的破坏，有利于与血清中的特异性IgG抗体发生结合，提高重组蛋白的活性，提高P/N值，从而提高检测的灵敏性和可重复性。
优选地，上述溶解缓冲液和/或洗脱缓冲液中京尼平苷酸的浓度为8.7-11.4mM。
提供一种马链球菌兽疫亚种的检测试剂盒，包括：
——包被有重组SzP蛋白的酶标板，上述SzP蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQID NO.1；
——终止液；
——含有检测用抗体的液相，上述的检测用抗体包括用于检测抗体的酶标二抗。
优选地，上述重组SzP蛋白采用上述的制备方法进行制备。
提供一种马链球菌兽疫亚种的酶联免疫检测方法，采用上述的检测试剂盒进行检测。
本发明由于采用了在纯化前在重组蛋白溶液中添加鞣花酸和白桦脂醇、在纯化所需的溶解缓冲液和/或洗脱缓冲液中添加京尼平苷酸，因而具有如下有益效果：
1)有利于重组蛋白中His Tag标签的暴露，促进His Tag序列的组氨酸的咪唑基与Ni2+的结合，抑制溶解缓冲液中咪唑的竞争性结合，有利于目的蛋白与树脂的结合，在提高重组蛋白回收率的同时，能够保证纯化后重组蛋白的纯度和特异性，进而在降低试剂盒的制备成本的同时保证检测的特异性；
2)能够保护重组蛋白在纯化过程中加入的溶解液和洗脱液中的盐离子对重组蛋白的结构的破坏，有利于与血清中的特异性IgG抗体发生结合，提高重组蛋白的活性，提高P/N值，从而提高检测的灵敏性和可重复性。
因此，本发明是一种制备成本低，且检测特异性、灵敏性及可重复性均较好的马链球菌兽疫亚种的检测试剂盒及检测方法。
附图说明
图1为本发明试验例1中纯化后重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；
图2为本发明试验例1中纯化后重组蛋白浓度的测定结果；
图3为本发明试验例1中Western-blot检测结果；
图4为本发明试验例2中OD450值的测定结果；
图5为本发明试验例3中阳性率的测定结果；
图6为本发明试验例3中批内变异系数的测定结果；
图7为本发明试验例3中批间变异系数的测定结果。
具体实施方式
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：
实施例1：
本发明的技术路线是，首先，提取马链球菌兽疫亚种的全基因组DNA，通过PCR扩增出SzP蛋白的基因。然后构建pETSEZ-SzP重组质粒。再转化质粒得到SzP蛋白的原核表达系统，通过诱导表达、分离纯化得到重组SzP蛋白。最后组装成马链球菌兽疫亚种的检测试剂盒。
菌株及试剂采用：马链球菌兽疫亚种ATCC35246菌株，大肠杆菌BL21菌株，表达载体pET-28a(+)。
基因组DNA小量提取试剂盒购自百奥莱博公司。TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶及内切酶均购自NEB公司。DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自Geneaid公司。
1.马链球菌兽疫亚种重组SzP蛋白的制备
1.1SzP蛋白原核表达系统的构建
1.1.1基因组DNA的提取：
将菌株接种至THB平板上活化，挑取单菌落接种至THB液体培养基，37℃培养24h，取1mL菌液离心，按基因组DNA小量提取试剂盒的操作程序提取基因组DNA。
1.1.2SzP蛋白基因的PCR扩增：
以提取的基因组DNA为模板，SF为上游引物、SR为下游引物，PCR扩增SzP蛋白基因。SF及SR引物序列如下：
SF：GTCAGCATATGGCGCTCAGGGTCGTTGAGTCATCTG
SR：GGACTCTCGAGGATGTCCCTTTGTCTGGTTGAGATTGC
反应体系(25μL)如下：
Figure BDA0002481031930000041
混匀，置PCR扩增仪中，95℃预变性5min，再按如下程序循环：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，经30个循环后，72℃延伸5min。
经1％琼脂糖凝胶电泳后，按照DNA胶回收试剂盒使用说明书回收纯化的目的片段。
1.1.3pETSEZ-SzP重组质粒的构建：
将纯化的SzP蛋白基因的PCR产物分别用NdeⅠ和XhoⅠ对目的片段、pET-28a(+)载体进行双酶切，将酶切后的目的片段和pET-28a(+)载体进行连接。酶切体系如下：
Figure BDA0002481031930000051
混合均匀后放入37℃水浴锅中，反应4h，1％琼脂糖凝胶电泳，切取目的条带，用DNA胶回收试剂盒纯化酶切产物。连接体系如下：
Figure BDA0002481031930000052
放于PCR仪中，16℃反应12h，反应结束后，将EP管置于冰盒中。
对SEZ szp基因进行扩增，利用NdeⅠ和XhoⅠ对得到的PCR产物与表达载体pET-28a(+)进行双酶切后，酶切产物回收后进行连接反应，再将连接产物导入大肠杆菌BL21感受态细胞中。
将连接产物10μL加至100μL E.coli BL21感受态细胞中，冰上放置30min；42℃热激90s，立即置于冰上2min；加入500μL LB液体培养基，37℃、150r/min震荡培养1h；10000rpm离心收集沉淀，重悬细胞，取200μL均匀地涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，25℃下静置30min，倒置于37℃培养箱中培养过夜。小量法提取质粒并进行酶切和PCR分析、鉴定，阳性表达质粒再次转化于BL21(DE3)感受态细胞中，涂板、提质粒、经PCR、酶切鉴定，阳性克隆送上海博亚测序。得到的基因为1140bp，测得序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
ATGGCAAAAAAAGAAATGAAGTTTTACCTTCGTAAATCAGCCTTTGGGCTAGCTTCAGTATCAGCAGCCCTCTTGGTTGGTGTGGCAGCTGTATCAGCAGATTCTGTTGAGTCAGCTAAGCCTGTAGCAGTTGCTGTTACAGATAGTTTAGATAGTGAAGCCGCAGCTACAAAGGCAGAAGCTGATCTAGTTGCTGCAAAAGCAGACCTAGCAGCAGCAGAAGCAGCAATCACAGCTGCAAAAGCTGAATTTGACACCGCTCAAGCAGACTTAGCTACCGCTGAAGCTACTATCGCAGAGCTTGAGCAAAAAATGGCTGAGTTAGAAAGCAAAATTCAAGAAAAGCAAAAAGAGCTAGAGGACATCATTCGTAAACAAGGCCCTGCTCATGCAGCTATCGGTGGTCGTAATGGAGACGCTGACGCAGAACAATTAGATGAGCTAGCTGGTGAGGTTAGCCGAGCAAAAGCAGCTCTTAAGGTTGAACTTCAAAAGGTCAAAGAAGAGTTAGAAGTAGCTAAAAAAGCTTATGCTGGTATCGAAGAAAGAAAACAAGTAGCAGCAGCTAAGCTAGATGCAGCTAACAAGGCTTTTGCTGGAGTTGAAGAAAAGCATGCTCAAGCAATGGCTGCATTTGAAGCAGCATTCGCAGCATACAAGGAAGCTGTTAAGGCTGAATTGAAGGCAGCAGGTGCTAGCGACTTCTACACCAAAAAGATTGACTCTGCCAACACAGTTGACGGTGTTAAGACACTCAGAGAAATGATCTTAGACTCAATTGCTAAGCCAGAGGTTGAACCAGAGGCTAAGCCTGAACCTAAGCCAGAACCAAAACCTGAGCCAAAACCAGAACCTAAACCAGAACCTAAACCAGAACCTAAGCCAGAGCCAAAACCAGAACCTAAGCCTGAGCCTAAGCCAGAACCAAAACCAGAACCTAAGCCAAAACCTCAACCTAAACCAGCTCCAGCTCCAAAACCTGAAGCTAAGAAGGAAGAGAAGAAAGCAGCGCCTAAGCAAGACGCCAACAAATTGCCATCAACAGGTGAAGCTACAAATCCATTCTTCACCGCGGCAGCTCTTGCAGTTATGGCAGGTGCAGGCGTGGCTGCAGTGTCAACAAGACGCAAAGAAAACTAA。
1.2重组SzP蛋白的诱导表达：
挑取含质粒pETSEZ-SzP的单菌落接种于含50μL/mL卡那霉素的5mL LB培养液中，37℃，180rpm摇床培养过夜，次日以1/100(V/V)的比例转接到20mL含卡那霉素的LB培养液中，37℃培养至OD600达0.6左右，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，18℃180rpm摇床诱导培养3h。
1.3重组SzP蛋白的分离纯化；
将1L诱导好的菌液10000rpm离心5min，收集沉淀，用20mL PBS缓冲液(135mmol/LNaCl,2.7mmol/L KCl,4.3mmol/L Na2HPO4,1.4mmol/L KH2PO4,pH7.2)悬浮菌体，超声破碎5min，10000rpm离心5min取上清，经0.45μm滤膜过滤后，加入终浓度为0.42mg/mL的鞣花酸和终浓度为0.19mg/mL的白桦脂醇；5倍于柱体积的超纯水清洗亲和层析柱，控制流速为1mL/min，以避免空气进入柱中，用10倍于柱体积的溶解缓冲液(30mM Na3PO4·12H2O、500mMNaCl、20mM咪唑，pH7.4)对Ni-NTA His·Bind树脂洗涤，再用平衡缓冲液重悬后装入层析柱，自然沉降，将滤过的上清缓慢上柱过柱；用洗脱缓冲液(30mM Na3PO4·12H2O、500mMNaCl、500mM咪唑，pH8.0)洗下目标蛋白，离心取上清。经SDS-PEG电泳检测得到57kDa左右的蛋白特征带，为预期分子量的目的蛋白。
2.组装马链球菌兽疫亚种的检测试剂盒
ELISA筛选出合适重组SzP蛋白抗原后，组装马链球菌兽疫亚种的检测试剂盒。该试剂盒包括抗原包被条、阴性对照血清、阳性对照血清、稀释液、酶标二抗、10×浓缩洗涤液、显色剂、终止液。
抗原包被条的制备包括以下步骤：用包被液(0.05M，pH9.6的碳酸盐缓冲液)稀释重组SzP蛋白至浓度为0.25μg/mL，混合均匀，按照每孔100μL的量加入96孔酶标板，37℃包被1h，4℃过夜，用PBST洗涤液(含有0.5％体积分数Tween-20的磷酸盐缓冲液)洗涤3次；按照每孔100μL的量将封闭液(含5％(W/V)脱脂乳的磷酸盐缓冲液)加入酶标板，37℃封闭2h，用PBST洗涤3次。
阴性对照血清为未感染马链球菌兽疫亚种的猪的阴性血清。阳性对照血清为感染马链球菌兽疫亚种的猪的阳性血清。稀释液为pH值为7.2、BSA为1％(W/V)的磷酸盐缓冲液。以上所述的酶标二抗为HRP-兔抗猪IgG抗体。浓缩洗涤液为10×PBST、pH7.2。显色剂是四甲基联苯胺。终止液为1N硫酸溶液。
利用本发明的试剂盒进行马链球菌兽疫亚种的检测，采用间接ELISA抗体检测法。重组SzP蛋白抗原包被于酶标板上，分别加入待检血清、阴性对照血清和阳性对照血清，37℃孵育80min，洗涤后加入酶标二抗，待检血清、阳性对照血清中的马链球菌兽疫亚种抗体会与包被于酶标板上的重组SzP蛋白抗原结合，形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入辣根过氧化物酶标记的二抗，与马链球菌兽疫亚种抗体特异性结合，游离的成分被洗去。加入显色剂，若反应孔中有马链球菌兽疫亚种抗体，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂变蓝，加终止液变黄。在450nm处测OD值。具体包括以下步骤：
1)从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内封存于4℃；
2)留空白孔(若使用双波长读板，空白孔可以不设)；
3)提前准备好样本、阳性对照血清、阴性对照血清，分别按照1:80倍比进行稀释；
4)先将阳性对照血清、阴性对照血清分别加入相应孔中(100μL/孔)；在每个样本孔中加入50μL样本稀释液和50μL样本，用封板胶纸封住反应孔；
5)37℃孵育80min；
6)提前15分钟制备酶标二抗工作液，酶标二抗工作液：按当次试验所需用量，用试剂稀释液稀释酶标二抗(1:5000)配置成生物素化抗体工作液，使用前30分钟准备，仅供当日使用，室温避光放置；
7)洗板5次；
8)除空白孔外，加入酶标二抗工作液(100μL/孔)，用封板胶纸封住反应孔；
9)37℃孵育60min；
10)洗板5次；
11)加入显色底物(包括空白孔)100μL/孔，25℃避光孵育15分钟；
12)加入终止液(包括空白孔)100μL/孔，混匀后即刻测量OD450值(10分钟内)。
结果判断：
根据已建立的最佳反应条件，用重组类蛋白对20份阴性血清进行检测，计算标准差(SD)，根据经验公式：阴阳性临界值＝阴性血清OD值的平均值(X)+3×标准差(SD)，计算出阴阳性临界值。
样本的OD450≧阴阳临界值0.324，可以在99.9％的水平上判定为阳性。
实施例2：
纯化前重组蛋白溶液中未加入鞣花酸和白桦脂醇。结果判断：样本的OD450≧阴阳临界值0.336，可以在99.9％的水平上判定为阳性。其余部分和实施例1完全一致。
实施例3：
纯化前重组蛋白溶液中未加入鞣花酸。结果判断：样本的OD450≧阴阳临界值0.327，可以在99.9％的水平上判定为阳性。其余部分和实施例1完全一致。
实施例4：
纯化前重组蛋白溶液中未加入白桦脂醇。结果判断：样本的OD450≧阴阳临界值0.330，可以在99.9％的水平上判定为阳性。其余部分和实施例1完全一致。
实施例5：
溶解缓冲液的成分包括30mM Na3PO4·12H2O、500mM NaCl、20mM咪唑、9.6mM京尼平苷酸，pH7.4，洗脱缓冲液成分包括30mM Na3PO4·12H2O、500mM NaCl、500mM咪唑、9.6mM京尼平苷酸，pH8.0。结果判断：样本的OD450≧阴阳临界值0.267，可以在99.9％的水平上判定为阳性。其余部分和实施例1完全一致。
实施例6：
洗脱缓冲液成分包括30mM Na3PO4·12H2O、500mM NaCl、500mM咪唑、9.6mM京尼平苷酸，pH8.0。结果判断：样本的OD450≧阴阳临界值0.281，可以在99.9％的水平上判定为阳性。其余部分和实施例1完全一致。
实施例7：
溶解缓冲液的成分包括30mM Na3PO4·12H2O、500mM NaCl、20mM咪唑、9.6mM京尼平苷酸，pH7.4。结果判断：样本的OD450≧阴阳临界值0.277，可以在99.9％的水平上判定为阳性。其余部分和实施例1完全一致。
实施例8：
溶解缓冲液的成分包括30mM Na3PO4·12H2O、500mM NaCl、20mM咪唑、9.6mM京尼平苷酸，pH7.4，洗脱缓冲液成分包括30mM Na3PO4·12H2O、500mM NaCl、500mM咪唑、9.6mM京尼平苷酸，pH8.0。结果判断：样本的OD450≧阴阳临界值0.273，可以在99.9％的水平上判定为阳性。其余部分和实施例2完全一致。
实施例9：
洗脱缓冲液成分包括30mM Na3PO4·12H2O、500mM NaCl、500mM咪唑、9.6mM京尼平苷酸，pH8.0。结果判断：样本的OD450≧阴阳临界值0.282，可以在99.9％的水平上判定为阳性。其余部分和实施例2完全一致。
实施例10：
溶解缓冲液的成分包括30mM Na3PO4·12H2O、500mM NaCl、20mM咪唑、9.6mM京尼平苷酸，pH7.4。结果判断：样本的OD450≧阴阳临界值0.279，可以在99.9％的水平上判定为阳性。其余部分和实施例2完全一致。
试验例1：
重组蛋白纯度的检测：将纯化后的重组蛋白使用SDS-PAGE电泳进行检测。
重组蛋白浓度的检测：用Thermo公司的BCA蛋白浓度试剂盒对纯化后的蛋白进行浓度检测，按照说明书步骤进行。纯化后重组蛋白的SDS-PAGE电泳图见图1。纯化后重组蛋白浓度的测定结果见图2。
重组蛋白的特异性鉴定
Western-blot检测：将1μg/mL纯化的重组蛋白电转印至硝酸纤维素膜上，电转条件为18V电压30min，转印后的硝酸纤维素膜放入含5％(W/V)脱脂乳的磷酸盐缓冲液中4℃封闭过夜。将封闭好的硝酸纤维素膜放入经稀释液1：100倍稀释的马链球菌兽疫亚种的抗体中，室温作用80min，用PBST洗涤3次，再与经PBS 1:5000倍稀释的HRP标记兔抗猪IgG 37℃作用1h，用PBST洗涤3次，TMB显色试剂盒显色，扫描记录。Western-blot检测结果见图3。
由图1可以看出，实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、实施例9、实施例10均出现单一明显的条带，分子量约为57kD，与预期结果相符，且实施例1的条带与实施例2、实施例3、实施例4相比更为清楚，实施例5与实施例8相比、实施例6与实施例9相比、实施例7与实施例10相比也更为清楚。
由图2可以看出，实施例1纯化后的重组蛋白浓度明显高于实施例2、实施例3、实施例4，实施例5明显高于实施例8，实施例6明显高于实施例9，实施例7明显高于实施例10。
由图3可以看出，实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、实施例9、实施例10中纯化后的重组蛋白均能够与马链球菌兽疫亚种的抗体发生特异性反应，且实施例1与实施例2、实施例3、实施例4的条带深浅无明显区别，实施例5与实施例8的条带深浅无明显区别、实施例6与实施例9的条带深浅无明显区别、实施例7与实施例10的条带深浅无明显区别。
综上，图1、图2、图3的结果说明重组蛋白溶液中加入鞣花酸和白桦脂醇，有利于His Tag标签的暴露，促进His Tag序列的组氨酸的咪唑基与Ni2+的结合，抑制溶解缓冲液中咪唑的竞争性结合，有利于目的蛋白与树脂的特异性结合，在提高回收率的同时，能够保证纯化后重组蛋白的纯度和特异性。
此外，由图3还可以看出，与实施例1相比，实施例5、实施例6、实施例7的条带较深，与实施例2相比，实施例8、实施例9、实施例10的条带较深，且实施例5的条带比实施例6、实施例7深，实施例8的条带比实施例9、实施例10深，这说明，京尼平苷酸能够保护重组蛋白在纯化过程中加入的溶解液和洗脱液中的盐离子对重组蛋白的结构的破坏，有利于与血清中的特异性IgG抗体发生结合。
试验例2：
重组蛋白的活性检测：将重组蛋白按作0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.075μg/mL、0.05μg/mL、0.025μg/mL倍比稀释，阳性血清按1:100稀释后，按间接ELISA方法测定抗原抗体反应，按ELISA试验测定其OD450值，以1:100稀释的阴性血清作为空白对照。OD450值的测定结果见图4。
抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的测定：采用双方阵试验，取酶标板，用包被液将纯化后的抗原作8μg/mL、4μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL倍比稀释，每孔100μL，37℃包被1h，4℃过夜，用PBST洗涤液(含有0.5％体积分数Tween-20的磷酸盐缓冲液)洗涤3次；按照每孔100μL的量将封闭液(含5％(W/V)脱脂乳的磷酸盐缓冲液)加入酶标板，37℃封闭2h，用PBST洗涤3次。用稀释液(pH值为7.2、BSA为1％(W/V)的磷酸盐缓冲液)将马链球菌兽疫亚种的阳性血清和阴性血清在酶标板进行1:50、1:100、1:200、1:300、1:500倍比稀释后，进行ELISA检测。取阳性血清孔中OD值接近1.00左右的血清浓度，相应的阴性血清OD值较低的的血清稀释度为最佳稀释度，相应的抗原稀释度为抗原的最佳包被浓度。抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度见表1。
表1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度
Figure BDA0002481031930000101
Figure BDA0002481031930000111
由图4可以看出，实施例5、实施例6、实施例7的OD450均明显大于实施例1，且实施例5的OD450均明显大于实施例6、实施例7，实施例8、实施例9、实施例10的OD450均明显大于实施例2，且实施例8的OD450均明显大于实施例9、实施例10。
由表1可以看出，实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、实施例9、实施例10的最佳抗原包被浓度均为0.5μg/mL、最佳血清稀释度均为1:100，实施例5、实施例6、实施例7的P/N值均大于实施例1，且实施例5的P/N值均大于实施例6、实施例7，实施例8、实施例9、实施例10的P/N值均大于实施例2，且实施例8的P/N值均大于实施例9、实施例10。
综上，图4和表1的结果说明京尼平苷酸能够保护重组蛋白在纯化过程中加入的溶解液和洗脱液中的盐离子对重组蛋白的结构的破坏，有利于与血清中的特异性IgG抗体发生结合，提高重组蛋白的活性，提高P/N值。
试验例3：
特异性试验
按照确定的间接ELISA操作程序，对无乳链球菌、副猪嗜血杆菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒的阳性血清进行检测。
表2特异性试验结果
Figure BDA0002481031930000112
Figure BDA0002481031930000121
由表2可以看出，实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、实施例9、实施例10对无乳链球菌、副猪嗜血杆菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒的阳性血清的检测结果均为阴性，这说明，重组蛋白溶液中加入鞣花酸和白桦脂醇后再进行纯化，在提高回收率的同时，能够保证纯化后重组蛋白的纯度和特异性，进而在降低试剂盒的制备成本的同时保证检测的特异性。
敏感性试验
用建立的间接ELISA方法检测临床上100份阳性血清样品，通过分析阳性检出率，来客观地反应间接ELISA检测方法的敏感性。阳性率的测定结果见图5。
重复性试验
使用同一批次包被的96孔酶标板，分别对5份不同的马链球菌兽疫亚种阳性血清进行间接ELISA检测，每份血清做6个重复，以验证该ELISA的批内稳定性。使用4块不同批次制备的96孔酶标板，对5份不同的马链球菌兽疫亚种血清进行间接ELISA检测，以验证该ELISA的批间稳定性。变异系数计算方法：标准差/平均数。批内变异系数的测定结果见图6。批间变异系数的测定结果见图7。
由图5可以看出，实施例5、实施例6、实施例7的阳性率均明显大于实施例1，且实施例5的阳性率均明显大于实施例6、实施例7，实施例8、实施例9、实施例10的阳性率均明显大于实施例2，且实施例8的阳性率均明显大于实施例9、实施例10。
由图6、图7可以看出，实施例5、实施例6、实施例7的批内和批间变异系数均明显小于实施例1，且实施例5的批内和批间变异系数均明显小于实施例6、实施例7，实施例8、实施例9、实施例10的批内和批间变异系数均明显小于实施例2，且实施例8的批内和批间变异系数均明显小于实施例9、实施例10。
综上，图5、图6、图7的结果说明京尼平苷酸能够保护重组蛋白在纯化过程中加入的溶解液和洗脱液中的盐离子对重组蛋白的结构的破坏，有利于与血清中的特异性IgG抗体发生结合，提高重组蛋白的活性，提高P/N值，从而提高检测的灵敏性和可重复性。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<110> 山东畜牧兽医职业学院
<120> 一种马链球菌兽疫亚种的检测试剂盒及检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1140
<212> DNA
<213> 马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp. zooepidemicus)
<400> 1
atggcaaaaa aagaaatgaa gttttacctt cgtaaatcag cctttgggct agcttcagta 60
tcagcagccc tcttggttgg tgtggcagct gtatcagcag attctgttga gtcagctaag 120
cctgtagcag ttgctgttac agatagttta gatagtgaag ccgcagctac aaaggcagaa 180
gctgatctag ttgctgcaaa agcagaccta gcagcagcag aagcagcaat cacagctgca 240
aaagctgaat ttgacaccgc tcaagcagac ttagctaccg ctgaagctac tatcgcagag 300
cttgagcaaa aaatggctga gttagaaagc aaaattcaag aaaagcaaaa agagctagag 360
gacatcattc gtaaacaagg ccctgctcat gcagctatcg gtggtcgtaa tggagacgct 420
gacgcagaac aattagatga gctagctggt gaggttagcc gagcaaaagc agctcttaag 480
gttgaacttc aaaaggtcaa agaagagtta gaagtagcta aaaaagctta tgctggtatc 540
gaagaaagaa aacaagtagc agcagctaag ctagatgcag ctaacaaggc ttttgctgga 600
gttgaagaaa agcatgctca agcaatggct gcatttgaag cagcattcgc agcatacaag 660
gaagctgtta aggctgaatt gaaggcagca ggtgctagcg acttctacac caaaaagatt 720
gactctgcca acacagttga cggtgttaag acactcagag aaatgatctt agactcaatt 780
gctaagccag aggttgaacc agaggctaag cctgaaccta agccagaacc aaaacctgag 840
ccaaaaccag aacctaaacc agaacctaaa ccagaaccta agccagagcc aaaaccagaa 900
cctaagcctg agcctaagcc agaaccaaaa ccagaaccta agccaaaacc tcaacctaaa 960
ccagctccag ctccaaaacc tgaagctaag aaggaagaga agaaagcagc gcctaagcaa 1020
gacgccaaca aattgccatc aacaggtgaa gctacaaatc cattcttcac cgcggcagct 1080
cttgcagtta tggcaggtgc aggcgtggct gcagtgtcaa caagacgcaa agaaaactaa 1140
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcagcatat ggcgctcagg gtcgttgagt catctg 36
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggactctcga ggatgtccct ttgtctggtt gagattgc 38

Claims (7)

1.一种马链球菌兽疫亚种重组SzP蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、SzP蛋白原核表达系统的构建；
S2、重组SzP蛋白的诱导表达；
S3、重组SzP蛋白的分离纯化；
所述SzP蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；所述步骤S2中SzP重组蛋白的表达形式为可溶性蛋白，所述步骤S3具体包含：将诱导好的菌液离心收集沉淀，用磷酸盐缓冲液悬浮菌体，超声破碎，离心取上清，经0.45μm滤膜过滤后，加入终浓度为0.3-0.53mg/mL的鞣花酸和终浓度为0.16-0.24mg/mL的白桦脂醇，得到粗重组SzP蛋白；使用Ni-NTA His·Bind树脂的蛋白纯化层析柱纯化重组蛋白SzP，得到纯化的重组SzP蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S1具体包括：以SEZ基因组为模板，对SEZ szp基因进行扩增，利用Nde Ⅰ和Xho Ⅰ对得到的PCR产物与表达载体pET-28a(+)进行双酶切后，酶切产物回收后进行连接反应，再将连接产物导入大肠杆菌BL21感受态细胞中。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中使用Ni-NTA His·Bind树脂的蛋白纯化层析柱纯化重组蛋白SzP所需溶液及其成分包括：
溶解缓冲液：20-30mM Na3PO4·12H2O、450-500mM NaCl、20-30mM咪唑；
洗脱缓冲液：20-30mM Na3PO4·12H2O、450-500mM NaCl、400-500mM咪唑，优选30mMNa3PO4·12H2O、500mM NaCl、500mM咪唑。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述溶解缓冲液和/或洗脱缓冲液中还包括京尼平苷酸。
5.一种马链球菌兽疫亚种的检测试剂盒，其特征在于，包括：
——包被有重组SzP蛋白的酶标板，所述SzP蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.1；
——终止液；
——含有检测用抗体的液相，所述的检测用抗体包括用于检测抗体的酶标二抗。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于：所述重组SzP蛋白采用权利要求1-4任一项中所述的制备方法进行制备。
7.一种马链球菌兽疫亚种的酶联免疫检测方法，其特征在于：采用权利要求5或6所述的检测试剂盒进行检测。
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