KR100834007B1 - 세균 및 이스트의 세포벽 용균 조성물 및 이를 제조하는방법 - Google Patents

세균 및 이스트의 세포벽 용균 조성물 및 이를 제조하는방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세균 또는 이스트로부터 얻어진 세포벽 용균 조성물 및 이를 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 그람음성균, 그람양성균 및 이스트를 생화학적 및 화학적으로 처리하여 얻어진 세균 또는 이스트의 세포벽 성분을 포함하며, 백신항원, 이종항원운반체, 면역증강제, 백신보좌제 및 복합사료 첨가제로서 사용될 수 있는 세균 및 이스트의 세포벽 용균 조성물 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 미생물 특이항원 및 면역증강물질이 풍부한 세균 및 이스트의 세포벽을 TNT (Tris-NaCl-Triton X-114)법, DMSO법 등과 같은 다양한 생화학적 및 화학적 방법으로 처리하여 다양한 형태의 투명세포외막, 세포벽 및 용균물질을 얻을 수 있으며, 본 발명의 방법으로 얻어진 투명세포외막은 백신항원 및 이종항원 운반체(delivery system)로 유용하게 사용될 수 있고, 상기 세포벽은 면역증강제 및 백신보좌제로서 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 상기 용균물질은 복합사료 첨가제로서 유용하게 사용될 수 있다.
그람음성균, 그람양성균, 이스트, 투명세포외막, 세포벽, 용균물질

Description

세균 및 이스트의 세포벽 용균 조성물 및 이를 제조하는 방법{CELL LYSIS COMPOSITION OF BACTERIAL AND YEAST CELL WALL AND METHOD FOR PREPARING THE SAME}
도 1은 투명세포외막 추출법을 이용하여 얻은 그람양성균인 포도상구균(Staphylococcus aureus Cowan I)의 투명 세포막의 사진이다.
도 2는 DMSO법을 이용하여 얻은 그람양성균인 돈단독균(Erysipelothrix rhusiopathiae T2)의 반투명 세포막의 사진이다.
도 3은 알칼리 용균법을 이용하여 얻은 그람음성균인 대장균(Escherichia coli O55)의 반투명 세포외막의 사진이다.
도 4는 TNT법을 이용하여 얻은 그람음성균인 보데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)의 투명 세포외막의 사진이다.
도 5는 Bacterial ghost법을 이용하여 얻은 이스트균인 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)의 투명 세포막의 사진이다.
도 6은 TNT법을 이용하여 얻은 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)의 투명 세포외막의 사진이다.
도 7은 TNT법을 이용하여 얻은 이스트균인 캔디다균(Candida albicans)의 세포외벽의 사진이다.
도 8은 NaOH법을 이용하여 얻은 대장균(Escherichia coli O55)의 세포벽의 사진이다.
도 9는 TNT법을 이용하여 얻은 대장균(Escherichia coli O55)의 세포벽의 사진이다.
도 10은 TMC법을 이용하여 얻은 대장균(Escherichia coli O55)의 세포벽의 사진이다.
도 11은 투명세포외막 추출법을 이용하여 얻은 보데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)의 세포벽의 사진이다.
도 12는 TMC법을 이용하여 얻은 그람양성균인 포도상구균(Staphylococcus aureus Cowan I)의 내용물이 없는 세포벽의 사진이다.
도 13은 TMC법을 이용하여 얻은 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)의 투명 세포외막의 사진이다.
도 14는 TNT법을 이용하여 얻은 포도상구균(Staphylococcus aureus Cowan I)의 과립구 형태의 세포벽의 사진이다.
도 15는 TNT법을 이용하여 얻은 돈단독균(Erysipelothrix rhusiopathiae T2)의 과립구 형태의 세포벽의 사진이다.
도 16은 TET법을 이용하여 얻은 대장균(Escherichia coli O55)의 과립구 형태의 세포벽의 사진이다.
도 17은 투명세포외막 추출법을 이용하여 얻은 대장균(Escherichia coli O55)의 과립구 형태의 세포벽의 사진이다.
도 18은 TET법을 이용하여 얻은 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)의 과립구 형태의 세포벽의 사진이다.
도 19는 TET법을 이용하여 얻은 캔디다균(Candida albicans)의 과립구 형태의 세포벽의 사진이다.
도 20은 NaOH-EDTA 추출법을 이용하여 얻은 대장균(Escherichia coli O55)의 용균물질의 사진이다.
도 21은 TET법을 이용하여 얻은 대장균(Escherichia coli O55)의 용균물질의 사진이다.
도 22는 TET법을 이용하여 얻은 돈단독균(Erysipelothrix rhusiopathiae T2)의 용균물질의 사진이다.
본 발명은 세균 또는 이스트로부터 얻어진 세포벽 용균 조성물 및 이를 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 미생물 특이항원 및 면역증강물질이 풍부한 그람음성균, 그람양성균, 이스트 등을 생화학적 또는 화학적으로 처리하여 얻어진 세포벽 성분을 포함하며, 백신항원, 이종항원운반체, 면역증강제, 백신보좌제 및 복합사료 첨가제로서 사용될 수 있는 세균 또는 이스트의 세포벽 용균 조성물 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
그람음성균, 그람양성균 또는 이스트의 세포벽에는 다양한 형태의 항원물질과 면역증강물질이 존재하는 것으로 알려져 있으며, 현재 항원물질과 면역증강물질을 포함하고 있는 세균 또는 이스트의 세포벽을 얻기 위해 균질화기(homogenizer) 또는 압력에 의한 세포 파괴기(cell pressure)를 이용하여 세포벽을 물리적으로 완전히 파괴한 후 추출하는 방법이 알려져 있으나, 상기 방법으로 수득되는 세포벽의 수율은 매우 소량으로 실험적인 생산만이 가능하며, 대량 생산에는 부적합할 뿐만 아니라, 세포벽의 완전한 파괴로 인해 세포벽에 존재하는 유용한 성분의 선별적인 이용이 어려운 것으로 알려져 있다. 또한, 박테리오파지(Bacteriophage)를 이용하는 용균법도 공지되어 있으나, 일부 그람음성균에만 국한되어 있어 대량 생산이 어렵고, 또한 미생물에 대한 박테리아파지의 높은 특이성 때문에 이를 실용화하기는 어렵다. 이 외에도, 알칼리 용균법이 사용되고 있으나, 이스트에는 적용하기 어려울 뿐만 아니라, 사용 용도에 따른 다양한 세포벽을 얻을 수 없다는 문제가 있다.
본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 예의 노력한 결과, 그람음성균, 그람양성균 또는 이스트로부터 용도에 맞는 다양한 세포벽을 추출하고 용균할 수 있는 생화학적 및 화학적 방법을 개발하였으며, 이를 이용하여 형태학적으로 유용한 투명세포외막, 세포벽 및 용균물질을 수득함으로써, 본 발명은 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 상술한 바와 같은 종래기술의 문제를 해결하기 위해 제안된 것으로, 본 발명은 미생물 특이항원 및 면역증강물질이 풍부한 그람음성균, 그람양성균 또는 이스트를 생화학적 및 화학적으로 처리하여 얻어진 세균 및 이스트의 세포벽 성분을 포함하며, 백신항원, 이종항원운반체, 면역증강제, 백신보좌제 또는 복합사료 첨가제로서 사용될 수 있는 세균 및 이스트의 세포벽 용균 조성물을 제공함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 제 1 양태는 미생물 특이항원 및 면역증강물질이 풍부한 그람음성균, 그람양성균 또는 이스트를 생화학적 또는 화학적으로 처리하여 얻어진 세포벽 성분을 유효성분으로서 포함하는 세균 또는 이스트로부터 얻어진 세포벽 용균 조성물로서, 상기 세포벽 용균 조성물은 백신항원, 이종항원운반체, 면역증강제, 백신보좌제 또는 복합사료 첨가제로서 사용되는 것을 특징으로 하는 세균 및 이스트의 세포벽 용균 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 그람음성균은 대장균(Escherichia coli O55), 보데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis) 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 상기 그람양성균은 포도상구균(Staphylococcus aureus Cowan I), 돈단독균(Erysipelothrix rhusiopathiae T2) 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 또한 본 발명에서 상기 이스트는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 캔디다균(Candida albicans) 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 조성물에 유효성분으로서 포함되는 상기 세포벽 성분은 투명세포외막, 세포벽 및 용균물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 세포벽 용균 조성물은 항원백신, 백신보좌제, 항원운반체, 면역증강제, 사료첨가제 또는 음수 제형의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물을 이용하여 통상적인 방법에 따라 다양한 형태의 제형을 제조할 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 유효 성분인 본 발명에 따른 세포벽 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 활성 성분에 대한 비히클, 부형제 또는 메디움으로 작용하는 고형, 반고형 또는 액상의 물질일 수 있다. 따라서, 제형은 정제, 환제, 분제, 새세이, 엘릭시르, 현탁제, 유제, 용액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 주사제, 멸균 분제 등의 형태일 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 용균 조성물은 투여된 후 유효 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 유효 성분으로서 본 발명의 세포벽 성분은 사람을 포함하는 동물에 대해 하루에 0.1 내지 1000 ㎎/㎏(체중), 바람직하게는 1 내지 100 ㎎/㎏(체중)의 양으로 1일 1회 또는 분할하여 경구 또는 비경구적 경로를 통해 투여할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 제 2 양태는 유효성분으로서 그람음성균, 그람양성균 또는 이스트로부터 얻어진 투명 세포벽, 반투명 세포벽, 또는 순수 세포벽 가운데 적어도 어느 하나를 포함하는 세포벽 용균 조성물을 제조하는 방법으로서, 그람음성균, 그람양성균 또는 이스트 가운데 적어도 어느 하나의 배양균을 배양하는 단계; 및 상기 배양균을 생화학적 또는 화학적으로 처리하여 투명 세포벽, 반투명 세포벽, 또는 순수 세포벽 가운데 적어도 어느 하나를 유효 성분으로 하는 세포벽 용균 조성물을 얻는 단계를 포함하는 세균 또는 이스트의 세포벽 용균 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 세포벽 용균 조성물의 제조방법에 있어서, 상기 배양균을 생화학적 또는 화학적으로 처리하는 단계에서는 투명세포외막 추출법, TNT(Tris-HCl, Sodium chloride, Triton X-114)법 또는 NaOH-EDTA(Sodium Hydroxide-(Ethylenedinitrilo)Tetraacetic Acid) 용균법 가운데 어느 하나의 방법이 이용되며, 이때 얻어진 세포벽 용균 조성물은 투명 세포벽 또는 반투명 세포벽인 것이 바람직하다. 또한, 상기 배양균을 생화학적 또는 화학적으로 처리하는 단계에서는 투명세포외막 추출법, TNT(Tris-HCl, Sodium chloride, Triton X-114)법, TMC(Tris-HCl, Magnesium chloride, Calcium chloride)법 또는 TET(Tris-HCl, EDTA, Triton X-100)법 가운데 어느 하나의 방법이 이용되며, 이때 얻어진 세포벽 용균 조성물은 세포 내용물이 없는 순수세포벽인 것이 바람직하며, NaOH-EDTA(Sodium Hydroxide-(Ethylenedinitrilo)Tetraacetic Acid) 용균법 또는 TET(Tris-HCl, EDTA, Triton X-100)법 가운데 어느 하나의 방법이 또한 이용되며, 이때 얻어진 세포벽 용균 조성물은 투명 세포벽 또는 반투명 세포벽인 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 세균 또는 이스트의 세포벽 용균 조성물은 미생물 특이항원 및 면역증강물질이 풍부하며, 이때 얻어진 상기 투명세포외막은 백신보좌제가 없는 백신항원 및 이종항원 운반체(delivery system)로 유용하게 사용될 수 있고, 상기 세포벽은 면역증강제 및 백신보좌제로서 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 상기 용균물질은 복합사료 첨가제로서 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 투명세포외막 추출법을 이용한 포도상구균의 세포막 분리
그람양성균인 포도상구균(Staphylococcus aureus Cowan I)을 500ml의 BHI(Brain Heart Infusion) 브로쓰에서 28℃에서 18시간 동안 배양한 후, 얻어진 배양균에 500ml의 10% 황산마그네슘을 가하고, 18시간 동안 추가로 배양하였다. 이어, 투명세포외막 추출법으로서, 2배 양의 증류수를 가하여 용균을 촉진시켜 투명 세포막을 수득하였다(도 1 참조).
실시예 2: DMSO법을 이용한 돈단독균의 세포막 분리
그람양성균인 돈단독균(Erysipelothrix rhusiopathiae T2)을 BHI(Brain Heart Infusion) 브로쓰에 0.1% 트윈(Tween) 80을 첨가하여 제조된 500ml의 배지에서 37℃에서 18시간 동안 배양한 후, 얻어진 배양균 10ml 당 1ml의 수산화나트륨 및 1ml의 DMSO를 가하여 7일 동안 배양하였다. 상기 배양액으로부터 반투명의 세포막을 수득하였다(도 2 참조).
실시예 3: 알칼리 용균법을 이용한 대장균의 세포외막 분리
그람음성균인 대장균(Escherichia coli O55)을 TSA(Tryptic Soy Agar) 브로쓰에서 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 멸균 증류수를 가하여 배양된 균을 수집하고, 수집한 균에 0.25M의 NaOH를 가한 후, 실온에서 7일 동안 배양하여 투명 세포막을 수득하였다(도 3 참조).
실시예 4: 알칼리 용균법을 이용한 대장균의 세포외막 분리
그람음성균인 보데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)를 실시예 3과 동일한 방법으로 배양하고 수집한 후, 수집한 균에 50mM Tris-HCl, 0.15M 염화나트륨 및 Triton X-114를 가한 후, 실온에서 7일 동안 배양하여 투명 세포막을 수득하였다(도 4 참조).
실시예 5: 사카로마이세스의 세포외막 분리
이스트균인 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)는 실시예 1의 투명세포외막 추출법 및 실시예 4의 알칼리 용균법인 TNT법과 동일한 방법으로 실시하여 투명 세포외막을 추출하였다(도 5 및 도 6 참조).
실시예 6: 캔디다균의 세포외막 분리
이스트균인 캔디다균(Candida albicans)은 실시예 5의 TNT법과 동일한 방법으로 실시하여 투명 세포외벽을 추출하였다(도 7 참조)
실시예 7: 세포 내용물이 없는 세포벽의 분리
그람음성균인 대장균(Escherichia coli O55)을 TSA(Tryptic Soy Agar) 브로쓰에서 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 멸균 증류수를 가하여 배양된 균을 수집하고, 수집한 균에 0.25M 내지 2M의 NaOH를 가한 후, 실온에서 7일 동안 배양하여 세포 내용물이 없는 세포벽을 수득하였으며(도 8 참조), 또한 상기 수집된 균을 TNT법 및 TMC(10mM Tris-HCl, 20mM 염화마그네슘 및 1mM 염화칼슘)법으로 처리하여 세포 내용물이 없는 세포벽을 각각 수득하였다(도 9 및 도 10 참조).
또한, 보데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)은 투명세포외막 추출법으로 처리하여 세포 내용물이 없는 세포벽을 수득하였고(도 11 참조), 그람양성균인 돈 단독균(Erysipelothrix rhusiopathiae T2)을 TMC법으로 처리하고 이스트균인 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)를 TNT법으로 처리하여 내용물이 없는 세포벽을 각각 수득하였다(도 12 및 도 13 참조).
실시예 8: 과립구 형태의 세포외벽의 분리
그람양성균인 포도상구균(Staphylococcus aureus Cowan I) 및 돈단독균(Erysipelothrix rhusiopathiae T2)을 TNT법으로 처리하여 과립구 형태의 세포외벽을 수득하였으며(도 14 및 도 15 참조), 그람음성균인 대장균(Escherichia coli O55)을 TET(50mM Tris-HCl, 25mM EDTA, 1% Triton X-100) 및 투명세포외막 추출법으로 처리하여 과립구 형태의 세포외벽을 각각 수득하였으며(도 16 및 도 17 참조), 또한 이스트균인 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 캔디다균(Candida albicans)을 TET법으로 처리하여 과립구 형태의 세포외벽을 각각 수득하였다(도 18 및 도 19 참조).
실시예 9: 용균처리에 의한 세포 용균물질의 분리
그람음성균인 대장균(Escherichia coli O55)을 1M NaOH-EDTA 추출법 및 TET 법으로 처리하여 용이하게 균체를 용균시킴으로써 세포 용균물질을 각각 수득하였으며(도 20 및 도 21 참조), 그람양성균인 돈단독균(Erysipelothrix rhusiopathiae T2)을 TET 법으로 처리하여 균체를 완전히 용균시킴으로써 세포 용균물질을 수득하였다(도 22 참조).
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 세균 및 이스트의 세포벽 용균 조성물은 미생물 특이항원 및 면역증강물질이 풍부한 세균 및 이스트의 세포벽을 TNT (Tris-NaCl-Triton X-114)법, DMSO법 등과 같은 다양한 생화학적 및 화학적 방법으로 처리하여 다양한 형태의 투명세포외막, 세포벽 및 용균물질을 대량으로 얻을 수 있으며, 본 발명의 방법으로 얻어진 투명세포외막은 백신보좌제가 없는 백신항원 및 이종항원 운반체(delivery system)로 유용하게 사용될 수 있고, 상기 세포벽은 면역증강제 및 백신보좌제로서 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 상기 용균물질은 복합사료 첨가제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (9)

  1. 미생물 특이항원 또는 면역증강물질이 풍부한 그람음성균, 그람양성균 또는 이스트 가운데 적어도 어느 하나를, 생화학적 또는 화학적으로 처리하여 얻어진 투명 세포벽, 반투명 세포벽, 또는 순수 세포벽 성분 가운데 적어도 어느 하나를 유효성분으로 하며,
    상기 그람음성균은 대장균(Escherichia coli O55), 보데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 그람양성균은 포도상구균(Staphylococcus aureus Cowan I), 돈단독균(Erysipelothrix rhusiopathiae T2)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하고,
    상기 이스트는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 캔디다균(Candida albicans)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세균 또는 이스트의 세포벽 용균 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포벽 용균 조성물은, 백신 항원, 이종항원 운반체, 면역 증강제, 백신보좌제, 또는 복합사료 첨가제 가운데 적어도 어느 하나로 이용되는 것을 특징으로 하는 세균 또는 이스트의 세포벽 용균 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 그람음성균, 그람양성균 또는 이스트 가운데 적어도 어느 하나의 배양균을 배양하는 단계; 및
    상기 배양된 배양균을 생화학적 또는 화학적으로 처리하여 투명 세포벽, 반투명 세포벽, 또는 순수 세포벽 가운데 적어도 어느 하나를 유효성분으로 하는 세포벽 용균 조성물을 얻는 단계;를 포함하고,
    상기 그람음성균은 대장균(Escherichia coli O55), 보데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 그람양성균은 포도상구균(Staphylococcus aureus Cowan I), 돈단독균(Erysipelothrix rhusiopathiae T2)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하고,
    상기 이스트는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 캔디다균(Candida albicans)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세균 또는 이스트의 세포벽 용균 조성물의 제조방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 배양균을 생화학적 또는 화학적 방법으로 처리하는 단계는 투명세포외막 추출법, TNT(Tris-HCl, Sodium chloride, Triton X-114)법 또는 NaOH-EDTA(Sodium Hydroxide-(Ethylenedinitrilo)Tetraacetic Acid) 용균법 가운데 어느 하나의 방법을 이용하고, 얻어진 세포벽 용균 조성물은 투명 세포벽 또는 반투명 세포벽을 포함하는 것을 특징으로 하는 세균 또는 이스트의 세포벽 용균 조성물의 제조방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 배양균을 생화학적 또는 화학적 방법으로 처리하는 단계는 투명세포외막 추출법, TNT(Tris-HCl, Sodium chloride, Triton X-114)법, TMC(Tris-HCl, Magnesium chloride, Calcium chloride)법 또는 TET(Tris-HCl, EDTA, Triton X-100)법 가운데 어느 하나의 방법을 이용하고, 얻어진 세포벽 용균 조성물은 세포 내용물이 없는 순수세포벽을 포함하는 것을 특징으로 하는 세균 또는 이스트의 세포벽 용균 조성물의 제조방법.
  9. 제 6 항에 있어서,
    상기 배양균을 생화학적 또는 화학적 방법으로 처리하는 단계는 NaOH-EDTA(Sodium Hydroxide-(Ethylenedinitrilo)Tetraacetic Acid) 용균법 또는 TET(Tris-HCl, EDTA, Triton X-100)법 가운데 어느 하나의 방법을 이용하되, 얻어진 세포벽 용균 조성물은 투명 세포벽 또는 반투명 세포벽을 포함하는 것을 특징으로 하는 세균 또는 이스트의 세포벽 용균 조성물의 제조방법.
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