JP2017048175A

JP2017048175A - アシネトバクター・バウマニのファージに由来する抗菌ペプチドおよびその使用

Info

Publication number: JP2017048175A
Application number: JP2016167434A
Authority: JP
Inventors: 立光陳; Li-Kuang Chen; 凱誌張; Kai-Chih Chang; 文瑞呉; Wen-Jui Wu
Original assignee: Hualien Tzu Chi Hospital
Current assignee: Hualien Tzu Chi Hospital
Priority date: 2015-09-04
Filing date: 2016-08-30
Publication date: 2017-03-09
Also published as: TW201710282A; EP3138572A1; US20170064965A1; AU2016222438A1; CN106497899A

Abstract

【課題】抗菌ペプチドを提供する。【解決手段】本発明の抗菌ペプチドは、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎｎｉｉ）のファージのリゾチームに由来する。本発明は、前記抗菌ペプチドを含む殺菌組成物、および前記抗菌ペプチドを用いる生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）殺菌方法にも関する。【選択図】なし

Description

本発明は、抗菌ペプチドに関し、特に、アシネトバクター・バウマニのファージに由来する抗菌ペプチドに関する。

１．アシネトバクター・バウマニ
アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎｎｉｉ、以下、ＡＢとも称す）は、土壌、水、食物などの自然環境の中に広く存在しており、正常人の皮膚の表面にも発見される。アシネトバクター・バウマニは、グラム染色した後に光学顕微鏡で観察したところ、赤色の球桿菌状（ｃｏｃｃｏｂａｃｉｌｌｉ）であり、莢膜の構造を有することがわかった。また、生化学的特性では非発酵性グラム陰性の球桿菌に属し、好気性であり、運動性を有せず、カタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）が陽性であり、４２℃の環境下で生長でき、１０％の乳糖を酸化する能力を有し、適切な生長温度は２０℃〜３０℃の間にある。生長条件が厳しくないため、アシネトバクター・バウマニは、様々な物体の表面および無生物環境に広く存在することができ、乾燥環境では、１３日以上、ひいては２週間まで生存することができる。これらの優位性により、アシネトバクター・バウマニは、病院において乾燥または湿潤な環境に長期間存在することができ、日和見的な院内病原菌（ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｐａｔｈｏｇｅｎ）となり、正常人に対しては、重度の感染を起こすことは少ないが、長期間入院および免疫力の低下した患者に対しては、日和見感染を起こしやすい。１９９８年で、台湾大学医学院附属病院は、ほとんど全ての抗生物質に対して薬剤耐性を有するアシネトバクター・バウマニ（ｐａｎｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔＡ. ｂａｕｍａｎｎｉｉ、以下、ＰＤＲＡＢとも称す）をはじめて分離した。台湾以外の世界各地でも、様々な抗生物質、例えば、β−ラクタム（ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍｓ）系抗生物質、アミノグリコシド（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）系抗生物質、フルオロキノロン（ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ）系抗生物質およびカルバペネム（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍｓ）系抗生物質などに対して薬剤耐性が生じるアシネトバクター・バウマニは、次々と現れてきている。このため、台湾国内外にかかわらず、多剤耐性のアシネトバクター・バウマニは、無視できない問題となっている。

２．ファージ
ファージ（ｐｈａｇｅまたはバクテリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ））は、細菌に感染するウイルスである。他のウイルスと同様に、ファージの遺伝物質は、核酸とタンパク質とから構成される。ファージが細菌に感染するとき、ファージは、遺伝物質を注入して、宿主の酵素により複製を行う。生存環境が悪い場合、ファージは、関連するタンパク質を組み立て、菌を破壊して出て行き、次の宿主を探す。ファージが菌を破壊して出て行く際に、生じた関連するタンパク質は、リゾチームを含む。リゾチームは、細菌の細胞壁を破壊して、細菌内の浸透圧のアンバランスを引き起こし、破裂させることができる。

３．抗菌能力を有するペプチド
イギリスの科学者であるフレミングがペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）を発見して以来、多くの抗生物質が発見されており、その化学構造を修飾または変更することにより、治療効果を増加させてきた。近年、抗生物質の乱用により、薬剤耐性を有する菌株に対する医療が段々難しくなり、薬剤耐性を有する細菌に対して、細菌を死滅させるための新規の抗生物質を探す必要があるため、新型の抗菌薬物の研究は非常に必要とされている。

大自然においては、多くの種類の生物が、外来病原菌に対して先天的に免疫・対抗する第一防衛線として、抗菌能力を有するペプチドを製造することができる。抗菌能力を有するペプチドは、通常、以下の（１）〜（３）の特性を有する：（１）長さが約１２〜約１００個のアミノ酸で構成されること、（２）＋２〜＋９価の静電荷を有すること、および（３）両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ）を有する構造（疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）および親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）領域を有する）。このようなカチオンと両親媒性とを兼有する特性により、ペプチドを、アニオンを有する細胞膜または微生物のリン脂質膜とより交互に作用させやすく、ひいては膜中に入り込む。抗菌能力を有するペプチドは、多くの生物体に広く分布されており、例えば、ミツバチの針における毒液に発見されたメリチン（ｍｅｌｉｔｔｉｎｓ）、カレイのような脊椎動物に発見された抗菌ペプチドであるプルロシジン（ｐｌｅｕｒｏｃｉｄｉｎ）、および小麦種子のような植物に発見されたプロチオニン（ｐｕｒｏｔｈｉｏｎｉｎｓ）、さらに、ヒトの好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ）、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）およびＴリンパ球（Ｔｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）にも抗菌能力を有するペプチドの存在が発見されている。

しかしながら、病原性微生物（例えば、アシネトバクター・バウマニ）の薬剤耐性が速やかに増加するのに対して、現在自然界に発見されおよび人為的に改良された抗菌能力を有するペプチドのいずれも、抗菌能力および抗菌範囲が抗生物質よりはるかに弱い。抗生物質を用いて病原性微生物の薬剤耐性を増加させるリスクを回避するために、有効に殺菌することができ、かつ、微生物の薬剤耐性を生じない殺菌方法が求められている。

本発明は、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎｎｉｉ）のファージのリゾチームに由来する抗菌ペプチドであって、前記ファージが、アシネトバクター・バウマニのファージ２号であり、寄託番号ＤＳＭ２３６００としてドイツ微生物細胞培養機関（ＤＳＭＺ）に寄託されていることを特徴とする抗菌ペプチドを提供する。

本発明の一つの具体的な実施態様によれば、前記抗菌ペプチドが、ＳＥＱＩＤＮｏ：１のアミノ酸配列に由来する。もう一つの具体的な実施態様においては、前記抗菌ペプチドが、ＳＥＱＩＤＮｏ：１と少なくとも７２％の類似度を有するアミノ酸配列を含む。

本発明の一つの具体的な実施態様によれば、前記抗菌ペプチドの疎水性が−０.３４〜−１.２６であり、両親媒性が０.２９〜０.４７であり、静電荷が＋４〜＋６である。

本発明の一つの具体的な実施態様によれば、前記抗菌ペプチドが、ＳＥＱＩＤＮｏ：２、ＳＥＱＩＤＮｏ：３、ＳＥＱＩＤＮｏ：４またはＳＥＱＩＤＮｏ：５と同じアミノ酸配列を有する。

本発明の一つの態様においては、抗菌ペプチドおよび担体を含む殺菌組成物であって、前記抗菌ペプチドが、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎｎｉｉ）のファージのリゾチームに由来し、寄託番号ＢＣＲＣ９７００４７として台湾の食品工業発展研究所に寄託されていることを特徴とする殺菌組成物を提供する。

本発明のもう一つの態様においては、前記抗菌ペプチドを細菌と接触させることを含む、生体外殺菌方法。一つの具体的な実施態様によれば、前記細菌がアシネトバクター・バウマニであり、また、前記抗菌ペプチドがアシネトバクター・バウマニに対して殺菌能力を有する。

本発明で提供する抗菌ペプチドは、アシネトバクター・バウマニの標準菌株に対して抗菌効果を有するのみならず、多剤耐性のアシネトバクター・バウマニおよび臨床的多剤耐性のアシネトバクター・バウマニ菌株に対しても良好な抗菌能力を有する。

図１は、細菌の電子顕微鏡画像であり、ＬｙｓＡＢ２−１１３−１４５で処理される前後の細菌の破壊状況を示す図である。そのうち、図１Ａは、処理される前の状況を示す図であり、図１Ｂは、ＬｙｓＡＢ２−１１３−１４５で処理された後の状況を示す図である。図２は、細菌の電子顕微鏡画像であり、ＬｙｓＡＢ２１１３−１４５Ｇ４で処理される前後の細菌の破壊状況を示す図である。そのうち、図２Ａは、処理される前の状況を示す図であり、図２Ｂは、ＬｙｓＡＢ２１１３−１４５Ｇ４で処理された後の状況を示す図であり、図２Ｃは、図２Ａの部分拡大図であり、図２Ｄは、図２Ｂの部分拡大図である。図３は、細菌の明視野および蛍光下での顕微鏡画像であり、ＬｙｓＡＢ２１１３−１４５Ｇ１で殺菌した後、ＦＩＴＣが細菌に入る状況を示す図である。そのうち、図３Ａおよび図３Ｂは、リン酸緩衝液処理のみを加えた陰性対照群の明視野および蛍光下での顕微鏡画像であり、図３Ｃおよび図３Ｄは、ＬｙｓＡＢ２１１３−１４５Ｇ１を１時間加えた明視野および蛍光下での顕微鏡画像である。図４は、細菌の明視野および蛍光下での顕微鏡画像であり、ＬｙｓＡＢ２１１３−１４５Ｇ４で殺菌した後、ＦＩＴＣが細菌に入る状況を示す図である。そのうち、図４Ａおよび図４Ｂは、リン酸緩衝液処理のみを加えた陰性対照群の明視野および蛍光下での顕微鏡画像であり、図４Ｃおよび図４Ｄは、ＬｙｓＡＢ２１１３−１４５Ｇ４を１時間加えた明視野および蛍光下での顕微鏡画像である。

以下、特定の具体的な実施態様に基づいて、本発明の実施形態を説明する。本発明の技術分野を熟知する者は、本明細書の開示内容より、本発明の他の利点および効果を理解できる。

本発明は、抗菌能力を有するペプチドを提供し、前記ペプチドが、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎｎｉｉ）のファージのリゾチームに由来する。本発明の一つの具体的な実施態様によれば、前記ファージが、アシネトバクター・バウマニのファージ２号（ＢＣＲＣ９７００４７）である。

本願で述べた「ペプチド」とは、１個より多いアミノ酸モノマーを含む短鎖を示し、そのうち、前記１個より多いアミノ酸モノマーの間は、アミド結合で連結する。ただし、本願で使用されたペプチドのアミノ酸モノマーは、天然アミノ酸に制限されておらず、前記ペプチドのアミノ酸配列は、非天然アミノ酸、類似構造の化合物、またはアミノ酸の欠失を含んでもよい。

本願で述べた「抗菌能力」とは、細菌阻止活性および殺菌活性を含み、最小細菌阻止濃度実験および最小殺菌実験の結果を利用して評価を行う。

本願で述べた「構造パラメータ」とは、抗菌ペプチドの抗菌活性および選択性に影響する性質であり、例えば、両親媒性、配座（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（例えば、αヘリックスおよびβシート）、帯電性（ｃｈａｒｇｅ）、極性角度（ｐｏｌａｒａｎｇｌｅ）、疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｖｉｔｙ）および疎水性モーメント（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｍｏｍｅｎｔ）などが挙げられる。構造パラメータは、互いに影響し合うものであり、通常、そのうちの一つの構造パラメータを変更することにより、他のパラメータの変更を引き起こす。

本願で述べた「両親媒性」とは、ペプチドの一方の末端が疎水性であり、もう一方の末端が親水性であることを示す。本願で述べた「疎水性モーメント」とは、ペプチドの両親媒性の程度を測定する方法であり、ペプチドにおける各アミノ酸の疎水性ベクトルの総和で表示できる。

また、本発明は、前記抗菌ペプチドを含む殺菌組成物を提供し、当該組成物がさらに担体を含んでもよい。前記担体の実例としては、賦形剤、希釈剤、増粘剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、油脂または非油脂の基剤、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０）、懸濁化剤、ゲル化剤、補助剤、防腐剤、酸化防止剤、安定剤、着色剤および香料が挙げられる。

以下、さらに、特定の具体的な実施例により、本発明の特徴による効果を説明するが、本発明の範囲を限定していない。

実施例１抗菌ペプチドの設計およびアミノ酸配列の分析
この実施例は、アシネトバクター・バウマニのファージ２号（寄託番号ＢＣＲＣ９７００４７として台湾の食品工業発展研究所に寄託されており、寄託番号ＤＳＭ２３６００としてドイツ微生物細胞培養機関（ＤＳＭＺ）に寄託されている）のリゾチーム（以下、ＬｙｓＡＢ２とも称す）のカルボキシル末端を、新規の抗菌ペプチドを設計する鋳型として利用した。ＬｙｓＡＢ２のカルボキシル末端の領域は、１１３番目のアミノ酸〜１４５番目のアミノ酸（以下、ＬｙｓＡＢ２１１３−１４５とも称す）であり、その配列がＳＥＱＩＤＮｏ：１で示される。

ＬｙｓＡＢ２のカルボキシル末端の構造を、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔ（ｃｌｕｓｔａｌｗ_３ＤｐｒｏｇｒａｍｉｎＳＴＲＡＰ）（ＧｉｌｌｅＣ, ＦｒｏｍｍｅｌＣ（２００１）ＳＴＲＡＰ：ｅｄｉｔｏｒｆｏｒＳＴＲｕｃｔｕｒａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ. １７：３７７−３７８をご参照）分析ソフトウェアで分析した結果、ＬｙｓＡＢ２のカルボキシル末端は、二極性のらせん構造を有し、静電荷が＋４であり、殺菌活性を有する可能性があると予測されることを示した。

次に、ペプチドの長さ、分子量、疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）、疎水性モーメント、両親媒性（ｒｅｌａｔｉｖｅＨ. ｍｏｍｅｎｔ）および静電荷（charge）を含む、ＬｙｓＡＢ２１１３−１４５ペプチドの構造パラメータを変更させた。前記構造パラメータを変更させることにより、新規の抗菌能力を有するペプチドを合成した。前記造パラメータを変更させるとき、本発明の技術分野において従来知られている生物情報ソフトウエア（一次構造の分析ソフトウエアおよび二次構造の分析ソフトウエアを含む）を利用して、構造パラメータに対して予測を行った。

そのうち、一次構造の分析ソフトウエアは、ペプチドの分子量を予測するためのＰｒｏｔＰａｒａｍ（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）、およびペプチドの静電荷分布を分析するためのＰｅｐｓｔａｔｓ（http：//www.ebi.ac.uk/emboss/）を含むが、限定されていない。また、二次構造の分析ソフトウエアは、Ｊｐｒｅｄ３（http：//www.compbio.dundee.ac.uk/www−jpred/）、ＰＳＩＰＲＥＤＰｒｏｔｅｉｎＰｒｅｄｉｃｔｏｒ（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）、およびペプチドの疎水性と疎水性モーメントを分析するためのｃｏｎｓｅｎｓｕｓｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙｓｃａｌｅ（ＣＣＳ）を含むが、限定されていない。それらの分析ソフトウエアは、ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＰｅｐｔｉｄｅＤａｔａｂａｓｅ（ＡＰＤ）から提供されてもよい。

続いて、上記の構造パラメータが変更されたペプチドに対して、スクリーニングを行うことにより、抗菌活性を有する抗菌ペプチドを得た。変更された配列は、明新生物科技社によってペプチドを合成し、得られた４つのアシネトバクター・バウマニのファージのリゾチームに由来する抗菌ペプチドは、それぞれ、ＬｙｓＡＢ２１１３−１４５Ｇ１、ＬｙｓＡＢ２１１３−１４５Ｇ２、ＬｙｓＡＢ２１１３−１４５Ｇ３およびＬｙｓＡＢ２１１３−１４５Ｇ４と称され、それらのアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱＩＤＮｏ：２〜５で示される。

ＬｙｓＡＢ２１１３−１４５とそれに由来する抗菌ペプチドの配列および構造パラメータは、表１に示される。

実施例２抗菌ペプチドの細菌阻止・殺菌の効果
最小細菌阻止濃度の測定（ＭｉｎｉｍａｌＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、すなわち、ＭＩＣ）
本発明の抗菌ペプチドの細菌阻止効果を試験するために、微量液体希釈法（ｂｒｏｔｈｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎｔｅｓｔ）により、細菌発育を完全に阻止できる最小の抗菌能力を有するペプチド濃度として、抗菌ペプチドの細菌に対する最小細菌阻止濃度（ＭｉｎｉｍａｌＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、すなわち、ＭＩＣ）を測定した。

微量液体希釈法の操作プロセスは、以下のように示される。すなわち、単一のコロニーの菌を取り、３ｍＬのＭｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ液体培地（Ｍ−Ｈｂｒｏｔｈ、米国のＢＢＬ社製、成分は1Ｌあたり２gの牛肉抽出物粉末、１７.５gのカゼイン酸加水分解物、１.５gの可溶性デンプンを含む）に接種し、３７℃で２〜６時間培養し、さらに、Ｍ−Ｈ液体培地で光学密度（ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ）ＯＤ_６００が１（１×１０^９ＣＦＵ／ｍＬ）になるように菌液濃度を調整し、菌液を５×１０^５ＣＦＵ／ｍＬまでに１０倍段階希釈して、７５μＬを９６穴プレートに入れた後、２５６μＭの抗菌能力を有するペプチドを７５μＬを加え、数十回混合した後、培地を３７℃に置く、インキュベーターで２０〜２４時間培養し、ＭＩＣの結果を観察した。

最小殺菌濃度の測定（Ｍｉｎｉｍｕｍｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、すなわち、ＭＢＣ）
本発明の抗菌ペプチドの細菌に対する最小殺菌濃度を知るために、上記で得られた最小細菌阻止濃度の抗菌ペプチドを１００μＬ取り、ガラスビーズで適切な培地の表面に塗布し、培地を３７℃で２４時間培養した後、三日間観察し続けた。コロニーが生じないなら、細菌を死滅させたことを示し、この場合、細菌発育を完全に阻止できる最小細菌阻止濃度が、最小殺菌濃度になる。

この実施例において、最小細菌阻止濃度および最小殺菌濃度の実験に用いられたアシネトバクター・バウマニ菌株は、表２で示される。

本発明のいくつかの具体的な実施例で提供された、抗菌能力を有するペプチドの最小細菌阻止濃度および最小殺菌濃度の結果は、表３で示される。

実験結果は、本発明で提供された抗菌ペプチドは、アシネトバクター・バウマニの標準菌株および多剤耐性を有するアシネトバクター・バウマニ菌株のいずれにも対して、細菌阻止効果および殺菌効果が良好に生じることを示す。

また、表３に示されるように、ＬｙｓＡＢ２１１３−１４５は、最小細菌阻止濃度が６４μＭであり、最小殺菌濃度が６４μＭであった。これに比べて、構造パラメータ（例えば、静電荷、疎水性および両親媒性）を変更してＬｙｓＡＢ２１１３−１４５に由来する抗菌ペプチドは、低い濃度であっても、アシネトバクター・バウマニに対して細菌阻止作用および殺菌作用が生じた。そのうち、ＬｙｓＡＢ２１１３−１４５Ｇ４のアシネトバクター・バウマニに対する細菌阻止・殺菌の効果は最も好ましく、その最小細菌阻止濃度が４μＭであり、最小殺菌濃度が４μＭであって、臨床的多剤耐性アシネトバクター・バウマニに対しても同様の細菌阻止・殺菌の効果（最小細菌阻止濃度が４μＭであり、最小殺菌濃度が４μＭである）を表した。

実施例３走査型電子顕微鏡
本発明の抗菌ペプチドが細菌の外観に対して影響を与えるか否かを観察するために、Ｍａｎｇｏｎｉ, Ｍ. Ｌ.らのＥｆｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｅｐｔｉｄｅｔｅｍｐｏｒｉｎＬｏｎｃｅｌｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ, ｍｅｍｂｒａｎｅｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙａｎｄｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ.（ＢｉｏｃｈｅｍＪ（２００４）３８０：８５９−６５）に記載された実験を参照して、８０μＭの抗菌ペプチドを１×１０^９ＣＦＵの菌液に添加し、３７℃で１時間培養した後、走査型電子顕微鏡を利用して、菌体が破壊される状況を観察した。

その結果は、図1および図２に示されるように、図１Ａは、処理されていない陰性対照群であり、図１Ｂは、ＬｙｓＡＢ２１１３−１４５ペプチドで処理されたものであった。図面からわかるように、抗菌ペプチドで処理されていない陰性対照群は、アシネトバクター・バウマニの外観が完全であり、表面が平滑であって、一般的にいわゆるアシネトバクター・バウマニが球桿菌であるという描写にあてはまった。しかし、抗菌能力を有するペプチドで処理されたアシネトバクター・バウマニを添加することにより、図１Ｂに示されるように、菌体の表面が不完全となり、孔があって、ひいては割れが生じ、また、アシネトバクター・バウマニが球桿状から円球状となり、周りに細菌の破砕による多くのくずが観察された。これにより、抗菌ペプチドが、アシネトバクター・バウマニに対して、その菌体の外部構造を不完全にさせ、その外観での変更を生じさせ、さらに、その菌体を破壊することを証明した。

図２Ａは、ＬｙｓＡＢ２１１３−１４５Ｇ４で処理されていない陰性対照群であり、図２Ｂは、ＬｙｓＡＢ２１１３−１４５Ｇ４ペプチドで処理されたものであった。図２Ｃは、図２Ａの部分拡大図であり、図２Ｄは、図２Ｂの部分拡大図であった。図面からわかるように、抗菌ペプチドで処理されていない陰性対照群に比べて、抗菌能力を有するＬｙｓＡＢ２１１３−１４５Ｇ４ペプチドで処理されたアシネトバクター・バウマニを添加することにより、表面が不完全となり、孔があって、周りに多くのくずが観察された。さらに、ＬｙｓＡＢ２１１３−１４５Ｇ４のアシネトバクター・バウマニ菌体外観に対する影響は、ＬｙｓＡＢ２１１３−１４５に比べて、更に広く明らかになった。

実施例４抗菌ペプチドの細菌細胞膜に対する透過性試験
本発明の抗菌ペプチドが細菌細胞膜の透過性を変更するか否かを知るために、ＭａｎｇｏｎｉＭ. Ｌ. ｅｔａｌ.（２００４）の方法を参照して、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ、すなわち、ＦＩＴＣ）で細胞を染色し、抗菌ペプチドが細菌の細胞膜上で透過性の変更を引き起こすか否かを観察し、ＦＩＴＣを細菌内部に入れさせ、緑色蛍光を示した。

操作プロセスは以下のように。すなわち、アシネトバクター・バウマニを３７℃のＬＢ液体培地（カナダのＢｉｏＳｈｏｐＣａｎａｄａ社から取得し、成分は１Ｌあたり５gのＮａＣｌ、１０gのトリプトン、５gの酵母抽出物を含む）で培養し、ＯＤ_６００がおおよそ１に等しいとき、遠心分離してリン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ、すなわち、ＰＢＳ）で洗浄し、再溶解した。次に、段階希釈を利用して、菌量を２×１０^９ＣＦＵ／ｍＬまでに希釈し、５０μＬの菌液を取り、５０μＬのＬｙｓＡＢ２１１３−１４５Ｇ１と３７℃で１時間培養し、処理群とした。また、５０μＬの菌液を取り、等量のＰＢＳを加えて混合して、陰性対照群とした。続いて、１ｍＬのＦＩＴＣ溶液（リン酸ナトリウム緩衝液において６μg／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）を、それぞれ処理群および対照群と均一に混合し、スライドガラスに滴下し、３７℃の温度で１時間静置し、蛍光顕微鏡（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で結果を観察した。

図３は、抗菌ペプチドで処理された細菌の明視野および蛍光下での顕微鏡画像であり、そのうち、図３Ａおよび図３Ｂは、それぞれ、陰性対照群の明視野および蛍光下での顕微鏡による観察結果であった。図３Ａに示されるように、明視野下では、菌体の存在位置を直接観察することができ、図３Ｂは、蛍光顕微鏡で観察したものであり、明らかな緑色（すなわち、ＦＩＴＣで示された色）が見られないため、ＰＢＳでアシネトバクター・バウマニを処理しても、その細胞膜に影響を与えないことがわかった。また、図３Ｃおよび図３Ｄは、ＬｙｓＡＢ２１１３−１４５Ｇ１を加えた処理群のそれぞれ明視野および蛍光での顕微鏡による観察結果であり、図３Ｃは、明視野下では菌体の存在位置を直接観察することができることを示し、図３Ｄは、蛍光顕微鏡で観察したものであり、緑色蛍光の菌体が多く見られた。これにより、本発明の抗菌能力を有するペプチドが、アシネトバクター・バウマニの細胞膜に影響を与え、その透過性を変更させることにより、ＦＩＴＣ染色剤を菌体内に入れさせ、菌体に緑色蛍光を生じさせることがわかった。

図４は、ＬｙｓＡＢ２１１３−１４５Ｇ４で処理された細菌の明視野および蛍光下での顕微鏡画像であり、そのうち、図４Ａおよび図４Ｂは陰性対照群であり、それぞれ明視野および蛍光下での顕微鏡による観察結果を示す。図４Ａは、明視野下では菌体の存在位置を直接観察することができることを示し、図４Ｂは、蛍光顕微鏡で観察したものであり、明らかな緑色（すなわち、ＦＩＴＣで示された色）が見られないため、ＰＢＳでアシネトバクター・バウマニを処理しても、その細胞膜に影響を与えないことがわかった。また、図４Ｃおよび図４Ｄは、ＬｙｓＡＢ２１１３−１４５Ｇ４を加えた処理群のそれぞれ明視野および蛍光での顕微鏡による観察結果であり、図４Ｃは、明視野下では菌体の存在位置を直接観察できることを示し、図４Ｄは、蛍光顕微鏡で観察したものであり、緑色蛍光の菌体が多く見られた。これにより、本発明の抗菌能力を有するペプチドが、アシネトバクター・バウマニの細胞膜に影響を与え、その透過性を変更させることにより、ＦＩＴＣ染色剤を菌体内に入れさせ、菌体に緑色蛍光を生じさせることがわかった。

上記の内容をまとめると、本発明に基づいて、アシネトバクター・バウマニのファージ２号のリゾチームのペプチド配列を鋳型として利用して、その構造パラメータを変更させることにより生じた抗菌ペプチドは、細菌阻止・殺菌の活性を有し、その効果が、鋳型としてもアシネトバクター・バウマニのファージ２号のリゾチームペプチドより優れる。また、上記結果も、本発明で提供する抗菌ペプチドは、アシネトバクター・バウマニの標準菌株に対して抗菌効果を有するのみならず、多剤耐性のアシネトバクター・バウマニおよび臨床的多剤耐性のアシネトバクター・バウマニ菌株に対しても良好な抗菌能力を有することを証明する。

上記の実施例は、例示的に本発明の原理とその効果を述べるものに過ぎず、本発明を限定するものではない。本技術分野に習熟した者は、本発明の趣旨および範囲から逸脱しない限り、上記の実施例に修正と変更を施すことができる。したがって、本発明の主張する権利範囲は、特許請求の範囲に記載される通りである。

Claims

アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎｎｉｉ）のファージのリゾチームに由来する抗菌ペプチドであって、
前記ファージが、アシネトバクター・バウマニのファージ２号であり、寄託番号ＤＳＭ２３６００としてドイツ微生物細胞培養機関（ＤＳＭＺ）に寄託されていることを特徴とする抗菌ペプチド。
ＳＥＱＩＤＮｏ：１のアミノ酸配列に由来する請求項１に記載の抗菌ペプチド。
ＳＥＱＩＤＮｏ：１と少なくとも７２％の類似度を有するアミノ酸配列を含む請求項２に記載の抗菌ペプチド。
ＳＥＱＩＤＮｏ：２、ＳＥＱＩＤＮｏ：３、ＳＥＱＩＤＮｏ：４またはＳＥＱＩＤＮｏ：５と同じアミノ酸配列を有する請求項１に記載の抗菌ペプチド。
アシネトバクター・バウマニに対して殺菌能力を有する請求項１〜４のいずれかに記載の抗菌ペプチド。
請求項１に記載の抗菌ペプチドおよび担体を含む殺菌組成物。
前記担体が、賦形剤、希釈剤、増粘剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、油脂または非油脂の基剤、界面活性剤、懸濁化剤、ゲル化剤、補助剤、防腐剤、酸化防止剤、安定剤、着色剤または香料である請求項６に記載の組成物。
請求項１に記載の抗菌ペプチドを細菌と接触させることを含む、生体外殺菌方法。
前記細菌がアシネトバクター・バウマニである、請求項８に記載の方法。