BR112012026880B1

BR112012026880B1 - método para eliminação ou redução de um biofilme bacteriano, variante de endolisina ou variante de bacteriocina e seus usos

Info

Publication number: BR112012026880B1
Application number: BR112012026880-5A
Authority: BR
Inventors: Stefan Miller
Original assignee: Lysando Ag
Priority date: 2010-04-27
Filing date: 2011-04-27
Publication date: 2021-03-16
Also published as: IL222713A; JP2016208985A; IL222713A0; DK2563916T3; EP2563916B1; CN103119158A; US9534223B2; BR112012026880A2; US20170173121A1; AU2011247584A1; MX2012012345A; WO2011134998A8; EA201270774A1; TW201204262A; US20130052182A1; CA2794603C; JP2013532955A; CA2794603A1; AU2011247584B2; EA037276B1

Abstract

MÉTODO DE REDUÇÃO DE BIOFILMES A presente invenção refere-se a métodos de eliminação , redução ou prevenção de biofilmes bacterianos através de uma proteína de fusão que compreende uma endolisina, uma autolisina ou uma bacteriocina à qual um peptídeo com membrana ou LPS que interrompe a atividade é fundido. Ainda, a presente invenção refere- se a proteínas de fusão para uso como um medicamento , em particular para o tratamento ou para a prevenção de infecções causadas por bactérias Gram-positivas e/ou Gram-negativas associadas ao biofilme bacteriano, como um meio para diagnóstico, desinfetante ou como substância cosmética. A presente invenção refere-se ainda à remoção ou à redução ou à prevenção de contaminação por bactérias Gram-negativa e/ou Gram-positiva associadas ao biofilme bacteriano de matéria alimentícia, de equipamento para processamento de alimentos, de plantas de processamento de alimentos, de superfície que entram em contato com matéria alimentícia , de dispositivos médicos, de superfície em hospitais e cirurgia. Além disso, a presente invenção refere-se ao uso da dita proteína de fusão como um meio para diagnóstico em diagnósticos médicos, de alimentos ou produtos alimentícios ou ambientais associados ao biofilme bacteriano.

Description

[001]A presente invenção refere-se a métodos de eliminação, redução ou prevenção de biofilmes bacterianos através de uma proteína de fusão que compre-ende uma endolisina, uma autolisina ou uma bacteriocina à qual um peptídeo com atividade de ruptura de membrana ou de LPS é fundido. Ainda, a presente invenção refere-se a proteínas de fusão para uso como um medicamento, em particular para o tratamento ou para a prevenção de infecções causadas por bactérias Gram-positivas e/ou Gram-negativas associadas ao biofilme bacteriano, como um meio para diag-nóstico, desinfetante ou como substância cosmética. A presente invenção refere-se ainda à remoção ou à redução ou à prevenção de contaminação por bactérias Gram-negativa e/ou Gram-positiva associada ao biofilme bacteriano de matéria alimentícia, de equipamento para processamento de alimentos, de plantas de processamento de alimentos, de superfícies que entram em contato com a matéria alimentícia, de dispositivos médicos, de superfícies em hospitais e cirurgia. Além disso, a presente invenção refere-se ao uso da dita proteína de fusão como um meio de diagnóstico no diagnóstico medicinal, alimentar ou alimentício ou ambiental associado ao biofilme bacteriano.

[002]As endolisinas são peptideoglicana hidrolases codificadas por bacterió- fagos (ou vírus bacterianos). São sintetizadas durante a expressão gênica tardia no ciclo lítico da multiplicação de fagos e medeiam a liberação de virions de progênie partindo das células infectadas através da degradação da peptideoglicana bacteria- na. São β-(1,4)-glicosilases (lisozimas), transglicosilases, amidases ou endopeptida-ses. A aplicação antimicrobiana das endolisinas já foi sugerida em 1991 por Gasson (GB2243611). Embora a capacidade de matar das endolisinas seja conhecida há muito tempo, o uso destas enzimas como agentes antibacterianos foi ignorado devi- do ao sucesso e à dominância dos antibióticos. Apenas após o surgimento de bacté-rias resistentes a vários antibióticos este conceito simples de combater agentes pa-togênicos humanos com endolisinas recebeu interesse. Uma necessidade convin-cente de desenvolver classes totalmente novas de agentes antibacterianos emergiu e as endolisinas utilizadas como 'enzibióticos' - um termo híbrido de 'enzimas' e 'an-tibióticos' - satisfez perfeitamente esta necessidade. Em 2001, Fischetti e colabora-dores demonstraram pela primeira vez o potencial terapêutico da endolisina de bac- teriófago Cl para estreptococos do grupo A (Nelson e outros, 2001). Assim então várias publicações estabeleceram as endolisinas como uma alternativa atraente e complementar para controlar infecções bacterianas, particularmente por bactérias Gram-positivas. Subsequentemente endolisinas diferentes contra outros agentes patogênicos Gram-positivos tais como Streptococcus pneumoniae (Loeffler e outros, 2001), Bacillus anthracis (Schuch e outros, 2002), S. agalactiae (Cheng e outros, 2005) e Staphylococcus aureus (Rashel e outros, 2007) tiveram sua eficácia com-provada como enzibióticos. Atualmente, o desafio mais importante da terapia com endolisina se baseia na insensibilidade de bactérias Gram-negativas para a ação exógena de endolisinas, uma vez que a membrana externa protege o acesso das endolisinas da peptideoglicana. Isto geralmente previne a expansão da faixa de en-dolisinas eficientes para agentes patogênicos Gram-negativos importantes.

[003]As bactérias Gram-negativas possuem uma membrana externa, com sua bicamada assimétrica característica como uma característica distintiva. A bica- mada da membrana externa consiste de uma monocamada interna que contém fos- folipídeos (primariamente fosfatidil etanolamina) e uma monocamada externa que é principalmente composta de um único glicolipídeo, lipopolissacarídeo (LPS). Há uma diversidade imensa de estruturas de LPS no reino bacteriano e a estrutura de LPS pode ser modificada em resposta às condições ambientais prevalescentes. A estabi-lidade da camada de LPS e a interação entre moléculas de LPS diferentes são prin- cipalmente conseguidas através da interação eletrostática de íons divalentes (Mg2+, Ca2+) com os componentes aniônicos da molécula de LPS (grupos fosfato no lipídeo A e o núcleo interno e grupos carboxila de KDO). Portanto, os sítios de ligação a cá- tions são essenciais para a integridade da membrana externa (Vaara, 1992). Os agentes policatiônicos tais como polímeros de poli-L-lisina (de pelo menos 20 resí-duos) aumentam a permeabilidade da membrana externa através do deslocamento destes cátions divalentes estabilizadores. Em adição, exercem um assim chamado mecanismo de 'captação auto promovida' (Hancock e Wong, 1984). Devido ao seu volume, estes interrompem a função de barreira normal da membrana externa e criam rachaduras transitórias, promovendo sua própria captação (Vaara e Vaara, 1983). Além disso, o empacotamento denso e ordenado do grupamento hidrofóbico do lipídeo A, favorecido pela ausência de ácidos graxos insaturados, forma uma es-trutura rígida com alta viscosidade. Isto a deixa menos permeável para as moléculas lipofílicas e confere estabilidade adicional à membrana externa (OM).

[004]Em contraste às bactérias Gram-negativas, as bactérias Gram-positivas não possuem uma membrana externa. A membrana citoplasmática é circundada por uma camada de peptideoglicana de até 25 nm de espessura (que tem apenas até 5 nm nas bactérias Gram-negativas) que forma a parede celular. A finalidade principal da parede celular das Gram-positivas é manter o formato da bactéria e agir contra a pressão interna na célula bacteriana. A peptideoglicana, ou mureína, é um polímero que consiste de açúcares e aminoácidos. O componente de açúcar consiste de resí-duos alternados de N-acetilglucosamina ligada em β-(1,4) e os resíduos de ácido N- acetilmurâmyco compõem os componentes de açúcar. Uma cadeia peptídica de três até cinco aminoácidos é ligada ao ácido N-acetilmurâmyco. A cadeia peptídica pode ser reticulada com a cadeia peptídica de outro filamento formando uma camada si-milar a uma trama em 3D. A cadeia peptídica pode conter resíduos de aminoácidos D e L e a composição pode variar para bactérias diferentes.

[005]A maioria das bactérias Gram-negativas, bem como muitas bactérias Gram-positivas desenvolve um biofilme bacteriano. O biofilme é definido como um agregado ou uma associação de micro-organismos, que se adere à superfície. As bactérias aderentes são frequentemente circundadas e protegidas por uma substân-cia polimérica extracelular que é produzida pelas bactérias Gram-negativas e Gram- positivas. Por causa do biofilme as bactérias são muito mais resistentes às substân-cias antimicrobianas como antibióticos, desinfetantes e enzimas que degradam a parede celular. Em adição, o tratamento de biofilmes não é geralmente possível por-que a substância polimérica extracelular se protege contra a degradação por subs-tâncias antimicrobianas, desinfetantes ou substâncias que degradam biofilmes.

[006]Assim, há uma necessidade de métodos de eliminação, redução ou prevenção de biofilmes bacterianos.

[007]Este objetivo é resolvido pelo assunto de objetivo definido nas reivindi-cações.

[008]As figuras a seguir ilustram a presente invenção.

[009]A Figura 1 é uma visão esquemática que mostra a construção plasmi-deal para a produção recombinante de (POLI)n-gp144 ((POLI)n-KZ144). Previamente, pEXP5CT/POLI-gp144 (pEXP5CT/POLI-KZ144) foi construído por uma PCR de cauda (com o sítio de restrição BamHI e o primeiro cassete policátion no iniciador da cauda a 5’). O plasmídeo foi linearizado com BamHI, desfosforilado e ligado com um cassete que contém extremidades de BamHI projetadas. Este cassete se origina da hibridização de dois oligonucleotídeos complementares e codifica 9 resíduos carre-gados postivamente. Um resíduo de arginina positivo adicional é criado no sítio de junção entre o primeiro e o segundo cassete, junto com uma serina. Variantes mais longas de pEXP5CT/(POLI)n-gp144 (pEXP5CT/(POLI)n-KZ144) foram construídas similarmente através de ciclos repetidos.

[010]A Figura 2 mostra a expressão e a secreção de POLI-gp144 por Pichia pastoris. Uma quantidade de 30 μL de sobrenadante de uma cultura de expressão de P. pastoris X33 [após 1 dia (quadrado), 3 dias (triângulo) e 4 dias (círculo)] é adicionada a 270 μL de células P. aeruginosa PAO1p permeabilizadas com clorofórmio. As condições de tampão eram as condições enzimáticas ótimas de POLI-gp144 (KH2PO4/K2HPO4) I = 120 mM pH 6,2). Subsequentemente, a densidade óptica foi registrada de forma espectrofotométrica. Uma queda na densidade óptica indica a secreção de uma enzima muralítica por P. pastoris. Como um controle negativo, P. pastoris X33 sem plasmídeo de expressão é incluída (losango).

[011]A Figura 3 mostra em uma representação gráfica a atividade antibacte- riana do phiKZgp144 não modificado e ELgp188 endolisinas, dos variantes de endo-lisina modificadas POLI-gp144 e POLI-gp188 que compreendem um peptídeo que compreendem 9 resíduos de aminoácidos carregados postivamente e dos variantes modificados (POLI)2-gp144 e (POLI)2-gp188 que compreendem um peptídeo que compreende 18 resíduos de aminoácidos carregados postivamente em células de Pseudomonas aeruginosa PAO1p. As barras de erro produzem os desvios padrões da média.

[012]A Figura 4 mostra uma fotografia de um SDS-PAGE corado com Coo- massie que mostra os resultados da expressão e da purificação da endolisina PSP3gp10 não modificada e sua variante de endolisina modificada PKPSP3gp10. A faixa LMW refere-se a um marcador de tamanho (LMW ladder). As três faixas a seguir referem-se às frações de proteína da proteína purificada no Tampão de Eluição (20 mM de NaH2PO4-NaOH pH7,4; 0,5 M de NaCl; 500 mM de imidazol) após cro- matografia de afinidade com Ni2+. A faixa FT refere-se ao fluxo e a faixa W às frações de descarte. Apenas bandas secundárias menores são visíveis nas frações de proteína purificada, indicando a alta pureza das proteínas recombinantes (>90%).

[013]As Figuras 5 A até D mostram em uma representação gráfica as ativi-dades antibacterianas de PSP3gp10 não modificado e do PKPSP3gp10 modificado em composições diferentes sobre várias bactérias Gram-negativas em crescimento exponencial após uma incubação à temperatura ambiente e sem agitação. Cada es-pécie de bactérias Gram-negativas foi incubada durante 30 minutos com uma com-posição que compreende 0,5 mM de EDTA, mas sem endolisina, com uma composi-ção que compreende 1,315 μM de PSP3gp10 não modificado, mas sem EDTA, com uma composição que compreende 1,315 μM de PKPSP3gp10 modificado, mas sem EDTA, com uma composição que compreende 1,315 μM de PSP3gp10 não modifi-cado e 0,5 mM de EDTA e com uma composição que compreende 1,315 μM de PKPSP3gp10 modificado e 0,5 mM de EDTA. Na Figura 5 A é representada a ativi-dade antibacteriana sobre células de P. aeruginosa PAO1p, na Figura 5 B a atividade antibacteriana sobre células de P. aeruginosa Br667, na Figura 5 C a atividade antibacteriana sobre células de E.coli WK 6 e na Figura 5 D a atividade antibacteria- na sobre células de Salmonella typhimurium. “Δ” fornece a diferença de atividade entre as respectivas amostras de PSP3gp10 e PKPSP3gp10. As barras de erro pro-duzem os desvios padrões da média.

[014]A Figura 6 mostra uma fotografia de um SDS-PAGE corado com Coo- massie que mostra os resultados da expressão e da purificação da endolisina P2gPO9 não modificada e sua variante de endolisina modificada PKP2gPO9. A faixa LMW refere-se a um marcador de tamanho (LMW ladder). As três faixas a seguir referem-se às frações de proteína da proteína purificada em Tampão de Eluição (20 mM de NaH2PO4-NaOH pH7,4; 0,5 M de NaCl; 500 mM de imidazol) após cromato- grafia de afinidade com Ni2+. A faixa FT refere-se ao fluxo e a faixa W às frações de descarte. Apenas bandas secundárias menores são visíveis nas frações de proteína purificada, indicando a alta pureza da proteína recombinante (>95%).

[015]As Figuras 7 A até F mostram em uma representação gráfica as ativi-dades antibacterianas de P2gPO9 não modificado e o P2gPO9 modificado em com-posições diferentes sobre várias bactérias Gram-negativas em crescimento expo- nencial após uma incubação à temperatura ambiente e sem agitação. Cada espécie de bactérias Gram-negativas foi incubada durante 30 minutos com uma composição que compreende 0,5 mM de EDTA, mas sem endolisina, com uma composição que compreende 1,315 μM de P2gPO9 não modificado, mas sem EDTA, com uma com-posição que compreende 1,315 μM de P2gPO9 modificado, mas sem EDTA, com uma composição que compreende 1,315 μM de P2gPO9 não modificado e 0,5 mM de EDTA e com uma composição que compreende 1,315 μM de P2gPO9 modificado e 0,5 mM de EDTA. Na Figura 7 A é representada a atividade antibacteriana sobre células de P. aeruginosa PAO1p, na Figura 7 B a atividade antibacteriana sobre cé-lulas de P. aeruginosa Br667, na Figura 7 C a atividade antibacteriana sobre células de E.coli WK 6, na Figura 7 D a atividade antibacteriana sobre células de Burkholde- ria pseudomallei, na Figura 7 E a atividade antibacteriana sobre células de Pseudo-monas putida G1 e na Figura 7 F a atividade antibacteriana sobre células de Salmo-nella typhimurium LT2 (SGSC N° 2317). “Δ” fornece a diferença de atividade entre as respectivas amostras de P2gPO9 e PKP2gPO9. As barras de erro produzem os desvios padrões da média.

[016]A Figura 8 mostra uma fotografia de um SDS-PAGE corado com Coo- massie que mostra os resultados da expressão e da purificação da endolisina OB- PgpLYS não modificada e sua variante de endolisina modificada PKOBPgpLYS. A faixa LMW refere-se a um marcador de tamanho (LMW ladder). As três faixas a seguir referem-se às frações de proteína da proteína purificada em Tampão de Eluição (20 mM de NaH2PO4-NaOH pH7,4; 0,5 M de NaCl; 500 mM de imidazol) após cro- matografia de afinidade com Ni2+. A faixa FT refere-se ao fluxo e a faixa W às frações de descarte. Apenas bandas secundárias menores são visíveis nas frações de proteína purificada, indicando a alta pureza das proteínas recombinantes (>90%).

[017]As Figuras 9 A até F mostram em uma representação gráfica as ativi-dades antibacterianas de composições diferentes de OBPgpLYS não modificada e a PKOBPgpLYS modificada sobre várias bactérias Gram-negativas em crescimento exponencial após uma incubação à temperatura ambiente e sem agitação. Cada es-pécie de bactérias Gram-negativas foi incubada durante 30 minutos com uma com-posição que compreende 0,5 mM de EDTA, mas sem endolisina, com uma composi-ção que compreende 1,315 μM de OBPgpLYS não modificada, mas sem EDTA, com uma composição que compreende 1,315 μM de PKOBPgpLYS modificada, mas sem EDTA, com uma composição que compreende 1,315 μM de OBPgpLYS não modifi-cada e 0,5 mM de EDTA e com uma composição que compreende 1,315 μM de PKOBPgpLYS modificada e 0,5 mM de EDTA. Na Figura 9 A é representada a ativi-dade antibacteriana sobre células de Escherichia coli WK6, na Figura 9 B a atividade antibacteriana sobre células de Salmonella typhimurium LT2 (SGSC N° 2317), na Figura 9 C a atividade antibacteriana sobre células de Pseudomonas aeruginosa PAO1p, na Figura 9 D a atividade antibacteriana sobre células de Pseudomonas ae-ruginosa Br667, na Figura 9 E a atividade antibacteriana sobre células de Pseudo-monas putida G1 e na Figura 9 F a atividade antibacteriana sobre células de Burkholderia pseudomallei'. “Δ” fornece a diferença de atividade entre as respectivas amostras de OBPgpLYS e PKOBPgpLYS. As barras de erro produzem os desvios padrões da média.

[018]As Figuras 10 A e B mostram em uma representação gráfica as ativida-des de redução de biofilme de PoliKZ144 (Art-014) sobre um isolado clínico de cres-cimento mucóide de Pseudomonas aeruginosa 2573 (Source Uniklinikum Regens-burg, nicht nãher definiert). Pseudomonas aeruginosa 2573 foi crescida pelo menos 24 horas a 37°C em uma placa para microtitulação de poliestireno para permitir a formação de biofilme. Para visualizar o conteúdo do biofilme foi realizada uma colo-ração com cristal violeta. Na Figura 10 A, o biofilme foi então incubado com Alginato liase (10u/mL) ou PoliKZ144 (50μg/mL). O efeito de ambas as enzimas foi comparado com o biofilme não tratado ou o biofilme lavado e reincubado em meio LB como controles. Na Figura 10 B o efeito de PoliKZ144 foi comparado com o biofilme não tratado ou o biofilme lavado e reincubado em meio LB como controles e cepas de lab de E. coli de crescimento mucóide para indicar coloração de fundo inespecífica.

[019]As Figuras 11 A até G mostram em uma representação gráfica as ativi-dades de redução de biofilme de várias proteínas de fusão sobre cepas de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas diferentes. Staphylococcus aureus KS13 (A e B), Listeria monocytogenes Scott A (C), Acinetobacter baumannii DSMZ30007 (D), Pseudomonas aeruginosa 2572 (E, F) e Pseudomonas aeruginosa 2573 (G) foram crescidos pelo menos 24 horas a 37°C em uma placa para microtitulação de poliesti-reno para permitir a formação de biofilme. Para visualizar o conteúdo do biofilme foi realizada uma coloração com cristal violeta. Na Figura 11 A, o biofilme foi então in-cubado com peptídeo PK (1,25 μg/poço) ou a endolisina Ply2638 (25 μg/poço) ou a proteína de fusão Ply2638-PK (25 μg/poço). O efeito do peptídeo, da endolisina e da proteína de fusão foi comparado com o biofilme não tratado (uma parte de tampão de proteína para uma parte de 2x LB sem NaCl) indicado por LB. Na Figura 11 B, o biofilme foi então incubado com a bacteriocina Lisostafina (18 μg/poço) ou o variante de bacteriocina PK-Lisostafina (18 μg/poço). O efeito da bacteriocina e do variante de bacteriocina foi comparado com o biofilme não tratado (uma parte de tampão de proteína para uma parte de 2x LB sem NaCl) indicado por LB. Na Figura 11 C, o bio- filme foi então incubado com o variante de endolisina modificada Pentapeptídeo- Ply511 (25 μg/poço). O efeito do variante de endolisina modificada foi comparado com o biofilme não tratado (uma parte de tampão de proteína para uma parte de 2x LB sem NaCl) indicado por LB. Nas Figuras 11 D e E, o biofilme foi então incubado com peptídeo PK (1,25 μg/poço) ou a endolisina OBP (25 μg/poço) ou o variante de endolisina modificada PK-OBP (25 μg/poço). O efeito do peptídeo, da endolisina e do variante de endolisina modificada foi comparado com o biofilme não tratado (uma parte de tampão de proteína para uma parte de 2x LB sem NaCl) indicado por LB. Nas Figuras 11 F e G, o biofilme foi então incubado com a endolisina KZ144 (50 μg/poço) ou o variante de endolisina modificada SMAP29-KZ144 (50 μg/poço). O efeito do peptídeo, da endolisina e do variante de endolisina modificada foi compa-rado com o biofilme não tratado (uma parte de tampão de proteína para uma parte de 2x LB sem NaCl) indicado por LB.

[020]O termo “proteína” como utilizado aqui se refere sinonimicamente ao termo “polipeptídeo”. O termo “proteína” como utilizado aqui se refere a um polímero linear de resíduos de aminoácidos ligados por ligações peptídicas em uma sequência específica. Os resíduos de aminoácidos de uma proteína podem ser modificados, por exemplo, por ligações covalentes de vários grupos tais como carboidratos e fosfato. Outras substâncias podem ser mais frouxamente associadas com as cadeias polipeptídicas, tal como heme ou lipídeo, dando origem às proteínas conjugadas que também são compreendidas pelo termo “proteína” como utilizado aqui. São várias maneiras em que as cadeias polipeptídicas dobradas foram elucidadas, em particular em relação à presença de alfa hélices e folhas beta-pregueadas. O termo “proteína” como utilizado aqui se refere a todas as quatro classes de proteínas que são todas alfa, todas beta, alfa/beta e alfa plus beta. Além disso, o termo “proteína” refere-se a um complexo, em que o complexo refere-se a um homômero.

[021]O termo “proteína de fusão” como utilizado aqui se refere a um produto de expressão que resulta da fusão de duas sequências de ácidos nucléicos. Tal pro-teína pode ser produzida, por exemplo, em sistemas de expressão de DNA recombi- nante ou através de reticulação química. Além disso, o termo “proteína de fusão” como utilizado aqui se refere a uma fusão de uma primeira sequência de aminoáci- dos, em particular uma endolisina, uma autolisina ou uma bacteriocina e/ou outra peptideoglicana hidrolase, com uma segunda ou uma sequência de aminoácidos adicional. A segunda ou uma sequência de aminoácido adicional é preferencialmen-te um peptídeo, em particular um peptídeo catiônico, apolicatiônico, hidrofóbico, an- fipático e/ou antimicrobiano. Preferencialmente, a dita segunda e/ou uma sequência de aminoácidos adicional é estranha e não é substancialmente homóloga a qualquer domínio da primeira sequência de aminoácidos.

[022]O termo “variante de endolisina modificada” é utilizado aqui sinonimi- camente com o termo “variante de endolisina”. Ambos os termos referem-se a uma proteína de fusão que compreende uma endolisina e um peptídeo, em particular um peptídeo catiônico, policatiônicos, hidrofóbico, anfipático e/ou antimicrobiano.

[023]O termo “variante de bacteriocina modificada” é utilizado aqui sinonimi- camente com o termo “variante de bacteriocina”. Ambos os termos referem-se a uma proteína de fusão que compreende uma bacteriocina e um peptídeo, em particular um peptídeo catiônico, policatiônicos, hidrofóbico, anfipático e/ou antimicrobiano.

[024]O termo “variante de autolisina modificada” é utilizado aqui sinonimica- mente com o termo “variante de autolisina”. Ambos os termos referem-se a uma pro-teína de fusão que compreende uma autolisina e um peptídeo, em particular um peptídeo catiônico, policatiônicos, hidrofóbico, anfipático e/ou antimicrobiano.

[025]O termo “filamento peptídico” como utilizado aqui se refere a qualquer tipo de peptídeo ligado a uma proteína tal como uma endolisina, uma bacteriocina ou uma autolisina. Em particular o termo “filamento peptídico” como utilizado aqui se refere a um peptídeo catiônico, um peptídeo policatiônico, um peptídeo anfipático, um peptídeo hidrofóbico e/ou um peptídeo antimicrobiano. Entretanto, um filamento peptídico no significado da presente invenção não refere-se a His-tags, preferenci-almente His5-tags, His6-tags, His7-tags, His8-tags, His9-tags, His10-tags, His11-tags, His12-tags, His16-tags e His20-tags, Strep-tags, Avi-tags, Myc-tags, Gst-tags, JS-tags, cisteína-tags, FLAG-tags ou outros tags conhecidos na arte, tiorredoxina ou proteínas que se ligam à maltose (MBP). O termo “tag” em contraste ao termo “filamento peptídico” como utilizado aqui se refere a um peptídeo que pode ser útil para facilitar a expressão e/ou a purificação por afinidade de um polipeptídeo, para imobilizar um polipeptídeo a uma superfície ou servir como um marcador ou um grupamento rotu- lador para a detecção de um polipeptídeo, por exemplo, através da ligação com anti-corpo em formatos de ensaio de ELISA diferentes contanto que a função que torna o tag útil para uma das facilitações listadas anteriormente não seja causada pela carga postiva do dito peptídeo. Entretanto, o His6-tag pode, dependendo do respectivo pH, também ser positivamente carregado, mas é utilizado como ferramenta de purificação por afinidade uma vez que se liga aos cátions divalentes imobilizados e não é utilizado como um filamento peptídico de acordo com a presente invenção.

[026]O termo “peptídeo” como utilizado aqui se refere a peptídeos curtos que consistem de desde aproximadamente 2 até aproximadamente 100 resíduos de aminoácidos, mais preferencialmente desde aproximadamente 4 até aproximada-mente 50 resíduos de aminoácidos, mais preferencialmente até aproximadamente 5 até 30 resíduos de aminoácidos, em que o grupo amino de um resíduo de aminoáci- do está ligado ao grupo carboxila de outro resíduo de aminoácido por uma ligação peptídica. Um peptídeo pode ter uma função específica. Um peptídeo pode ser um peptídeo que ocorre naturalmente ou um peptídeo planejado e sintetizado de form sintética. O peptídeo pode ser, por exemplo, derivado ou removido de uma proteína nativa através de clivagem enzimática ou química ou pode ser preparado utilizando técnicas de síntese de peptídeos convencionais (por exemplo, síntese em fase sólida) ou técnicas de biologia molecular (ver Sambrook, J. e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Os peptídeos produzidos de sinteticamente preferidos são, por exemplo, peptídeos catiônicos, policatiônicos, anfipáticos ou hidrofóbicos. Os peptídeos que ocorrem naturalmente são, por exemplo, peptídeos antimicrobianos.

[027]Como utilizado aqui, o termo “peptídeo catiônico” refere-se a um peptí- deo que possui resíduos de aminoácidos carregados postivamente. Preferencial-mente um peptídeo catiônico possui um valor de pKa de 9,0 ou maior. Tipicamente, pelo menos quatro dos resíduos de aminoácidos do peptídeo catiônico podem ser positivamente carregados, por exemplo, lisina ou arginina. “Positivamente carrega-dos” refere-se às cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos que possuem uma carga positiva líquida em condições aproximadamente biológicas. O termo “peptídeo catiônico” como utilizado aqui se refere também a peptídeos policatiônicos.

[028]O termo “peptídeo policatiônico” como utilizado aqui se refere a um peptídeo planejado e produzido sinteticamente composto principalmente de resíduos de aminoácidos carregados postivamente, em particular resíduos de lisina, arginina e/ou histidina, mais preferencialmente resíduos de lisina e/ou arginina. Um peptídeo é composto principalmente de resíduos de aminoácidos carregados postivamente se pelo menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou aproxi-madamente 100 % dos resíduos de aminoácidos forem resíduos de aminoácidos carregados postivamente, em particular resíduos de lisina e/ou arginina. Os resíduos de aminoácidos que não são resíduos de aminoácidos carregados postivamente po-dem ser resíduos de aminoácidos carregados de forma neutra e/ou resíduos de aminoácidos carregados negativamente e/ou resíduos de aminoácidos hidrofóbicos. Preferencialmente os resíduos de aminoácidos que não são resíduos de aminoáci- dos carregados postivamente são resíduos de aminoácidos carregados de forma neutra, em particular serina e/ou glicina.

[029]O termo, “peptídeo antimicrobiano” (AMP) como utilizado aqui se refere a qualquer peptídeo que ocorre naturalmente que possui atividade microbicida e/ou microbistática, por exemplo, sobre bactérias, vírus, fungos, leveduras, mycoplasma e protozoário. Assim, o termo “peptídeo antimicrobiano” como utilizado aqui se refere em particular a qualquer peptídeo que possui propriedades antibacterianas, antifún- gicas, antimicóticas, antiparasíticas, antiprotozoários, antivirais, antiinfecciosas, anti- infecciosas e/ou germicidas, algicidas, amebicidas, microbicidas, bactericidas, fungi-cidas, parasicidas, protozoacidas, protozoicidas, em particular peptídeos sushi e de- fensina. O peptídeo antimicrobiano pode ser um membro da superfamília da RNAse A, uma defensina, uma catelicidina, granulisina, histatina, psoriasina, dermicidina ou hepcidina. O peptídeo antimicrobiano pode ser naturalmente ocorrente em insetos, peixes, plantas, aracnídeos, vertebrados ou mamíferos.

[030]Preferencialmente o peptídeo antimicrobiano pode ser naturalmente ocorrente em insetos, peixes, plantas, aracnídeos, vertebrados ou mamíferos. Prefe-rencialmente o peptídeo antimicrobiano pode ser naturalmente ocorrente em rabane-te, bicho-da-seda, licosa, sapo, preferencialmente em Xenopus laevis, sapos Rana, mais preferencialmente em Rana catesbeiana, sapo, preferencialmente o sapo asiá-tico Bufo bufo gargarizans, mosca, preferencialmente em Drosophila, mais preferen-cialmente em Drosophila melanogaster, em Aedes aegypti, em abelha, abelhão, pre-ferencialmente em Bombus pascuorum, mosca varejeira, preferencialmente em Sar- cophaga peregrine, escorpião, límulo, peixe-gato, preferencialmente em Parasilurus asotus, vaca, porco, ovino, suíno, bovino, macaco e ser humano.

[031]O termo “peptídeo sushi” como utilizado aqui se refere às proteínas de controle do complemento (CCP) que possuem repetições consensos curtas. O mó-dulo sushi dos peptídeos sushis funciona como um domínio de interação proteína- proteína em muitas proteínas diferentes. Foi mostrado que os peptídeos que contêm um domínio Sushi possuem atividades antimicrobianas. Preferencialmente, peptí- deos sushis são peptídeos antimicrobianos que ocorrem naturalmente.

[032]O termo “peptídeo anfipático” como utilizado aqui se refere a peptídeos sintéticos que possuem grupos funcionais tanto hidrofílicos quanto hidrofóbicos. Pre-ferencialmente, o termo “peptídeo anfipático” como utilizado aqui se refere a um pep- tídeo que possui uma disposição definida de grupos hidrofílicos e hidrofóbicos, por exemplo, os peptídeos anfipáticos podem ser, por exemplo, alfa hélice, que possuem predominantemente cadeias laterais não polares ao longo de um lado da hélice e resíduos polares ao longo do restante de sua superfície.

[033]O termo “grupo hidrofóbico” como utilizado aqui se refere a grupos quí- mycos tais como cadeias laterais de aminoácidos que são substancialmente insolú-veis em água, mas solúveis em uma fase oleosa, com a solubilidade na fase oleosa sendo maior que aquela em água ou em uma fase aquosa. Na água, os resíduos de aminoácidos que possuem uma cadeia lateral hidrofóbica interagem um com os ou-tros para gerar um ambiente não aquoso. Os exemplos de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais hidrofóbicas são resíduos de valina, isoleucina, leucina, metio- nina, fenilalanina, triptofano, cisteína, alanina, tirosina, histidina, treonina, serina, prolina e glicina.

[034]O termo “endolisina” como utilizado aqui se refere a uma enzima que é adequada para hidrolisar paredes celulares bacterianas. “Endolisinas” compreendem pelo menos um “domínio enzimaticamente ativo” (EAD) que possui pelo menos uma das atividades a seguir: endopeptidase, N-acetil-muramoil-L-alanina-amidase (ami-dase), N-acetil-muramidase, N-acetil-glucosaminidase (lisozima) ou transglicosila- ses. Em adição, as endolisinas podem conter também regiões que são enzimatica- mente inativas e se ligam à parede celular das bactérias hospedeiras, os assim chamados CBDs (domínios de ligação à parede celular). A endolisina pode conter um, dois ou mais CBDs. Entretanto, o termo “endolisina” como utilizado aqui se refere ainda às enzimas que possuem pelo menos um EAD, mas sem CBDs. Geralmente, o domínio que se liga à parede celular é capaz de se ligar a componentes diferentes sobre a superfície de bactérias. Preferencialmente, o domínio que se liga à parede celular é um domínio de ligação à peptideoglicana e se liga à peptideoglicana bacteriana.

[035]O termo “parede celular” como utilizado aqui se refere a todos os com-ponentes que formam o revestimento da parede celular das bactérias Gram- positivas e Gram-negativas e garantem assim sua integridade. Em particular, o termo “parede celular” como utilizado aqui se refere à peptideoglicana, à membrana externa das bactérias Gram-negativas com o lipopolissacarídeo, à membrana celular bacteriana, mas também às camadas adicionais depositadas sobre a peptideoglica- na como, por exemplo, cápsulas, camadas de proteína externas ou substâncias vis-cosas.

[036]O termo “autolisinas” como utilizado aqui se refere às enzimas relacio-nadas com as endolisinas, mas codificadas por bactérias e envolvidas, por exemplo, na divisão celular e no metabolismo da parede celular. Uma visão geral de autolisinas pode ser encontrada em “Bacterial peptidoglycan (murein) hydrolases. Vollmer W, Joris B, Charlier P, Foster S. FEMS Microbiol Rev. 2008 Mar;32(2):259-86”.

[037]O termo “bacteriocina” como utilizado aqui se refere a substâncias simi-lares a proteínas, similares a polipeptídeos ou similares a peptídeos que são capazes de inibir o crescimento de outras bactérias. Algumas bacteriocinas são capazes de degradar paredes celulares bacterianas como Lisostafina (que degrada paredes celulares de Staphylococcus), Mutanolisina (que degrada paredes celulares de Streptococcus) e Enterolisina (que degrada paredes celulares de Enterococcus). Preferencialmente a dita inibição ocorre especificamente através da absorção das ditas outras bactérias aos receptores específicos da bacteriocinaa. Em geral, as bac- teriocinas são produzidas por micro-organismos. Entretanto, o termo “bacteriocina” como utilizado aqui se refere a uma forma isolada produzida por um microorganismo ou a uma forma produzida sinteticamente e refere-se ainda a variantes que mantêm substancialmente as atividades de seuas bacteriocinas originais, mas cujas sequências foram alteradas através da inserção ou da deleção de um ou mais resíduos de aminoácidos.

[038]O termo “EAD” como utilizado aqui se refere ao domínio enzimatica- mente ativo de uma endolisina. O EAD é responsável pela hidrólise de peptideogli- canas bacterianas. Este exibe pelo menos uma atividade enzimática de uma endoli-sina. O EAD também pode ser composto de mais de um módulo enzimaticamente ativo. O termo “EAD” é utilizado aqui sinonimicamente com o termo “domínio catalíti-co”.

[039]O termo “deleção” como utilizado aqui se refere à remoção de 1, 2, 3, 4, 5 ou mais resíduos de aminoácidos da respectiva sequência de partida.

[040]O termo “inserção” ou “adição” como utilizado aqui se refere à inserção ou à adição de 1, 2, 3, 4, 5 ou mais resíduos de aminoácidos à respectiva sequência de partida.

[041]O termo “substituição” como utilizado aqui se refere à troca de um resí-duo de aminoácido localizado em um certa posição por um diferente.

[042]O termo “biofilme” como utilizado aqui se refere a um agregado de micro-organismos bacterianos em que as células bacterianas se aderem a cada outra e/ou a uma superfície. Estas células aderentes são frequentemente cobertas com uma matriz de substância polimérica extracelular (EPS), que é produzida pelas células. O biofilme EPS, é composto de DNA, proteínas e polissacarídeos extracelulares. Estes biofilmes podem se formar sobre quaisquer superfícies vivas ou não vivas, em particular tanto sobre superfícies sólidas na forma de colônias quanto sobre superfí-cies líquidas na forma de películas. As células microbianas que crescem em um bio- filme são fisiologicamente distintas de células planctônicas do mesmo organismo.

[043]A presente invenção refere-se a métodos de eliminação, redução ou prevenção de um biofilme bacteriano que compreendem as etapas de: a)fornecimento de uma proteína de fusão que compreende uma enzima que possui a atividade de degradar a parede celular de bactérias Gram-negativas e/ou Gram-positivas à qual um peptídeo com atividade de ruptura de membrana ou de LPS é fundido; e b)contato de um material, líquido, superfície ou material biológico com a dita proteína de fusão. Preferencialmente, a presente invenção refere-se a métodos de eliminação, redução ou prevenção de um biofilme bacteriano que compreendem as etapas de: c)fornecimento de uma proteína de fusão que compreende uma endolisina, uma autolisina ou uma bacteriocina à qual um peptídeo com atividade de ruptura de membrana ou de LPS é fundido; e d)contato de um material, líquido, superfície ou material biológico com a dita proteína de fusão.

[044]O termo “fornecimento” de uma proteína de fusão de acordo com a pre-sente invenção refere-se a simplesmente pegar e utilizar a proteína de fusão de acordo com a presente invenção ou a gerar e purificar tal proteína de fusão antes do uso de acordo com a presente invenção.

[045]Preferencialmente, o material é uma pedra, rocha, solo, sedimentos, alimento, ração ou cosméticos. Preferencialmente, o líquido é água, tal como água potável, água subterrânea ou água de esgoto, águas termais, mares, lagos, rios, qualquer tipo de sistema aquoso, soluções de limpeza e armazenamento de lentes de contato, dentaduras, implantes, próteses ou aparelhos dentários.

[046]Preferencialmente, o material biológico é qualquer substância derivada ou obtida de um organismo vivo, em particular plantas e mamíferos, preferencial-mente humanos, por exemplo, células, tecidos, órgãos, sangue, componentes do sangue e líquidos corporais. Preferencialmente, as células são, por exemplo, células nucleadas ou células anucleadas. As células podem ser derivadas de qualquer ór-gão, em particular, hepatócitos, células muculares lisas, células endoteliais, querati- nócitos, células de ilhota, células tronco (de adultos e neonatais, vários tecidos ou origem de espécies), células progenitoras de células tronco, células sanguíneas do cordão umbilical, gametas (masculino e feminino), células progenitoras de gametas, ertroblastos, leucoblastos e condroblastos. Os tecidos são, por exemplo, membranas mucosas, nervos, músculos, epitélios, tecidos conjuntivos e de suporte, tecidos moles orais e dentes. Os órgãos são, por exemplo, coração, válvulas do coração, olho, ouvido, trato urinário, pulmões, fígado, rim, trato biliar, próstata, nariz, trato digestivo, trato respiratório, trato gastrointestinal, cérebro e medula óssea. Os líquidos corporais preferidos são urina, fluido cerebrospinal e fluidos linfáticos.

[047]Preferencialmente, as superfícies são superfícies biológicas ou não bió- ticas sólidas. Os exemplos preferidos de superfícies são a superfície de dispositivos médicos, em particular implantes, próteses, catéteres, tais como implantes dentários, próteses do trato urinário, membrana peritoneal e catéteres de diálise peritoneal, catéteres internos para hemodiálise e para administração crônica de agentes quimio- terapêuticos (catéteres de Hickman), implantes cardíacos tal como marca-passos, válvulas cardíacas protéticas, dispositivos de auxílio ventricular, enxertos vasculares sintéticos e stents, dispositivos de fixação interna, suturas percutâneas e tubulação traqueal e ventiladora, bem como superfícies de tubulação de sistemas de águas industriais ou potáveis e de sistemas aquáticos naturais.

[048]Os biofilmes são formados por micro-organismos bacterianos em que as células bacterianas se aderem a cada outra e/ou a uma superfície. As substâncias poliméricas extracelulares (EPS) excretadas pelos micro-organismos bacteria- nos de um biofilme formam com a água hidrogéis, de forma que uma matriz similar a lodo é formada. Esta matriz também pode compreender bolhas de gás e partículas inorgânicas. A EPS do biofilme é composta de DNA extracelular, proteínas e polis- sacarídeos. Além dos micro-organismos bacterianos outros organismos unicelulares podem ser integrados no biofilme. Os biofilmes podem ocorrer através da deposição dos micro-organismos bacterianos nas interfaces. Principalmente, o biofilme é for-mado sobre superfícies de água ou on uma interface para uma fase sólida. Estes biofilmes podem se formar sobre quaisquer superfícies vivas ou não vivas. Em geral todas as interfaces podem ser depositadas pelos biofilmes. Os biofilmes são presen-tes quase em qualquer lugar, no solo e sedimentos, no água subterrânea, sobre ro-cha, em desertos, em águas termais, sobre e dentro de plantas e animais, em parti cular sobre membranas mucosas. Além disso, os biofilmes podem ocorrer sobre dis-positivos médicos, tais como implantes, catéteres, endoscópios, próteses, instrumen-tos e aparelhos, mas também em cosméticos, alimentos e rações. Os biofilmes tam-bém podem estar associados a infecções, porque na maioria dos casos os micro-organismos bacterianos formam biofilme para serem protegidos contra o sistema imunológico. A formação de um biofilme garante a sobrevivência em longo prazo dos micro-organismos bacterianos. Um exemplo de uma infecção aguda do trato respira-tório é a doença do legionário que é causada pela ingestão ou inalação de aglome-rados de biofilmes de legionella que se soltam dos canos de ar ou água de sistemas de aquecimento ou resfriamento. Ainda muitas bactérias de alimentos, como E. coli 0157:H7, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Salmonella spp. e Cam- phylobacter jejuni podem se formar sobre os alimentos e biofilmes de dispositivos que são então altamente resistentes a biocidas, seca, calor, antibióticos e reagentes de limpeza. Os micro-organismos responsáveis pelas infecções de implantes, catéte- res e outros dispositivos médicos podem ser estafilococos negativos para a coagulase, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Streptococcus spp., Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter spp., Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginsa e Candida spp. que também estão associados a um espectro amplo de infecções nosocomiais. As infecções bacterianas típicas associadas aos biofilmes em humanos são: infecções de ferimentos, em particular ferimentos associados com diabetes mellitus, amigdalite, osteomielite, endocardite bacteriana, sinusite, infecções da córnea, infecção do trato urinário, infecção do trato biliar, pedras renais in-fecciosas, uretrite, prostatite, infecções causadas por catéteres, infecções do ouvido médio, formação de placa dentária, gingivite, periodontite, fibrose cística e infecções causadas por dispositivos internos permanentes tais como protéses de articulações e válvulas cardíacas.

[049]A presença de biofilmes pode ser determinada através de vários testes, tal como através do Método em placas de cultura de tecidos (TCP) descrito em Christensen e outros, J Clin Microbiol 22:996-1006 (1985) ou através do Método em tubo (TM) como previamente descrito por Christensen e outros, Infect Immun 37:318-26 (1982) ou através do Método em Ágar em vermelho do Congo (CRA) descrito por Freeman e outros, J Clin Pathol 42:872-4 (1989). O biofilme pode ser quantificado através da utilização do ensaio de cristal violeta (Peeters e outros, J Microbiol Methods 72: 157-165 (2008)).

[050]A proteína de fusão de acordo com a presente invenção pode influenciar a interação das bactérias que formam um biofilme de forma que as células sejam transferidas em células planctônicas isoladas onde são então lisadas pela dita prote-ína de fusão, consequentemente o biofilme é então degradado em parte ou total-mente. A influência da proteína de fusão de acordo com a presente invenção sobre as bactérias também pode lisar diretamente as bactérias associadas em um biofilme e assim, o biofilme é degradado em parte ou totalmente. Além disso, a proteína de fusão de acordo com a presente invenção pode prevenir a formação de biofilmes bacterianos através da lise de bactérias que são capazes de formar um biofilme com outras bactérias.

[051]As proteínas de fusão de acordo com a presente invenção referem-se preferencialmente a variantes de endolisina, variantes de bacteriocina e variantes de autolisina.

[052]As proteínas de fusão preferidas de acordo com a presente invenção compreendem uma endolisina, uma autolisina ou uma bacteriocina fundida a um peptídeo com atividade de ruptura de lipopolissacarídeo (LPS) ou em geral de mem-brana. O LPS é um componente principal da membrana externa de bactérias Gram- negativas. Este aumenta a carga negativa da membrana celular e protege a mem-brana de certos tipos de ataque químyco. Até certo grau o dito LPS protege a mem-brana de bactérias Gram-negativas também das endolisinas adicionadas fora das bactérias. Entretanto, o LPS pode ser interrompido por peptídeos que possuem uma atividade de ruptura de LPS, por exemplo, como peptídeos carregados positivamente. Além disso, os ditos peptídeos podem estar envolvidos no mecanismo de transporte de proteína de membrana externa, na desestabilização de proteínas estruturais de membrana externa e/ou na desestabilização dependente de lipídeos. Os inventores da presente invenção descobriram de forma surpreendente que um peptí- deo que possui atividade de ruptura de LPS ou em geral de membrana promove a passagem de uma endolisina, uma autolisina ou uma bacteriocina fundida ao dito peptídeo através da membrana externa de bactérias Gram-negativas. Após a passagem promovida da endolisina, da autolisina ou da bacteriocina através da membrana externa de bactérias, a parede celular da bactéria pode ser mais facilmente rompida ou desintegrada pela endolisina devido à degradação da camada de pepti- deoglicana seguida pela lise osmótica quando a pressão celular interna da bactéria não pode se mais por muito tempo resistida. As bactérias Gram-positivas possuem uma camada de peptideoglicana mais espessa que as bactérias Gram-negativas. Aqui a membrana que interrompe a atividade da proteína de fusão sustenta a lise das bactérias, através da atuação sobre a membrana citoplasmática.

[053]Assim, a presente invenção refere-se a métodos de eliminação, redução ou prevenção de biofilmes bacterianos através de proteínas de fusão compostas de uma enzima, preferencialmente uma endolisina, uma autolisina ou uma bacterio- cina, que possui a atividade de degradar a parede celular de bactérias Gram- negativas e/ou Gram-positivas e um peptídeo com com atividade de ruptura de membrana, em que o dito peptídeo é fundido à enzima no N e/ou C-terminal. As ditas proteínas de fusão de acordo com a presente invenção são também chamadas de variantes de endolisina modificadas ou simplesmente variantes de endolisina ou de endolisinas modificadas, variantes de autolisina modificadas ou variantes de au-tolisina, bacteriocinas modificadas ou variantes de bacteriocina.

[054]A parte de endolisina da proteína de fusão é preferencialmente codifi-cada por bacteriófagos específicos para bactérias Gram-negativas tais como grupos de bactérias Gram-negativas de grupos, famílias, gêneros ou espécies bacterianas que compreendem cepas patogênicas para humanos ou animais como Enterobacte- riaceae (Escherichia, especialmente E. coli, Salmonella, Shigella, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, especialmente K. pneumoniae, Mor- ganella, Proteus, Providencia, Serratia, Yersinia), Pseudomonadaceae (Pseudomo-nas, especialmente P. aeruginosa, Burkholderia, Stenotrophomonas, Shewanella, Sphingomonas, Comamonas), Neisseria, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, Brucella, Francisella, Bordetella, Legionella, Bartonella, Coxiella, Haemophilus, Pasteurella, Mannheimia, Actinobacillus, Gardnerella, Spirochaetaceae (Treponema e Borrelia), Leptospiraceae, Campylobacter, Helicobacter, Spirillum, Streptobacillus, Bacteroida- ceae (Bacteroides, Fusobacteria, Prevotella, Porphyromonas), Acinetobacter, espe-cialmente A. baumannii.

[055]Em outra modalidade preferida, a endolisina da proteína de fusão é co-dificada por bacteriófagos específicos por bactérias Gram-positivas tais como bacté-rias Gram-positivas de grupos, famílias, gêneros ou espécies bacterianas que com-preendem cepas patogênicas para humanos ou animais, em particular do filo Acti-nobacteria, em particular da classe Actinobacteridae, em particular da ordem Acti- nomycetales, em particular das famílias Actinomycineae: Actinomycetaceae (Acti-nomyces, Mobiluncus), Corynebacterineae: Mycobacteriaceae (Mycobacteria), No- cardiaceae, Corynebacteriaceae, Frankineae: Frankiaceae, Micrococcineae: Brevi- bacteriaceae e Propionibacteriaceae (Propionibacterium) e da ordem Bifidobacteria- les, em particular das famílias Bifidobacteriaceae (Bifidobacterium, Falcivibrio, Gar-dnerella) e outras subclasses: Acidimicrobidae, Coriobacteridae, Rubrobacteridae, Sphaerobacteridae; e do filo Firmicutes, em particular da classe Bacilli, em particular da ordem Bacillales, em particular das famílias: Bacillaceae (Bacillus), Listeriaceae (Listeria), Staphylococcaceae (Staphylococcus, Gemella, Jeotgalicoccus) e da ordem Lactobacillales, em particular das famílias: Enterococcaceae (Enterococcus), Lactobacillaceae (Lactobacillus, Pediococcus), Leuconostocaceae (Leuconostoc), Streptococcaceae (Lactococcus, Streptococcus) e da classe Clostridia, em particular da ordem: Clostridiales (Clostridium, Peptostreptococcus, Selenomonas), Halanae- robiales e Thermoanaerobacterales e da classe Tenericutes/Mollicutes, em particular da ordem: Mycoplasmatales (Mycoplasma, Ureaplasma), Entomoplasmatales (Spi-roplasma), Anaeroplasmatales (Erysipelothrix), Acholeplasmatales (Acholeplasma), Haloplasmatales (Haloplasma).

[056]Em outra modalidade preferida, a autolisina ou a bacteriocina da proteí-na de fusão é codificada por bactérias Gram-negativas ou Gram-positivas tais como bactérias Gram-negativas ou Gram-positivas de grupos, famílias, gêneros ou espécies bacterianas que compreendem cepas patogênicas para humanos ou animais que são listadas anteriormente.

[057]Preferencialmente, a parte de endolisina deriva de um fago ou uma endolisina do tipo selvagem que é representado na tabela 1 a seguir:

[058]É também preferida a parte da endolisina que é derivada de endolisinas dos fagos ΦKZ e EL de Pseudomonas aeruginosa, do fago OBP de Pseudomonas putida, do fago LUZ24 ou da T4 lisozima, gp61 muramidase, PSP3 endolisina, do fago de Salmonella, do fago de Acinetobacter baumannii, do Fago P2 de E. coli, do fago N4 e K1F de E. coli e do fago de Salmonella typhimurium.

[059]As endolisinas preferidas adicionais da proteína de fusão são endolisinas de fagos de Listeria PlyA118, PlyA500, PlyPSA, PlyA511, PlyP35, PlyP40, fago de Staphylococcal Phi 11 endolisina, Phi MR11 endolisina, LysK, Ply 2638, Clostridium perfringens PlyS6, Ply3626, Clostridium difficile: CD27L endolisina, Streptococcus: B30 endolisina, fago Dp-1 Pal amidase, C1 endolisina, Cpl-1 endolisina, PlyGBS, Enterococccus: PlyV12, Bacillus anthracis: Fago gama endolisina PlyG, fago de Propionibacterium endolisina PA6-gp20.

[060]As autolisinas preferidas da proteína de fusão são descritas em: pepti- deoglicana (mureína) hidrolases Bacterianas. Vollmer W, Joris B, Charlier P, Foster S. FEMS Microbiol Rev. 2008 Mar;32(2):259-86. Epub 2008 Fev 11. Review. Um exemplo de uma autolisina preferida é a AtlA Autolisina.

[061]As bacteriocinas preferidas são Lisostafina (que degrada paredes celulares de Staphylococcus), Mutanolisina (que degrada paredes celulares de Streptococcus) e Enterolisina (que degrada paredes celulares de Enterococcus). Mais preferencialmente, a bacteriocina da proteína de fusão de acordo com a presente invenção compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 87.

[062]Os exemplos adicionais para a parte de endolisina da proteína de fusão são selecionados do grupo que consiste de Cpl-1 de acordo com a SEQ ID NO: 84, Ply511 de acordo com a SEQ ID NO: 85, LysK de acordo com a SEQ ID NO: 86, PA6-gp20 de acordo com a SEQ ID NO: 88, phiKZgp144 de acordo com a SEQ ID NO: 1, ELgp188 de acordo com a SEQ ID NO: 2, endolisina de Salmonella de acordo com a SEQ ID NO: 3, endolisina do fago T4 de Enterobactérias de acordo com a SEQ ID NO: 4, endolisina de Acinetobacter baumannii de acordo com a SEQ ID NO: 5, endolisina do Fago K1F de E.coli de acordo com a SEQ ID NO: 6, OBPgpLYS de acordo com a SEQ ID NO: 7, PSP3 Salmonella endolisina (PSP3gp10) de acordo com a SEQ ID NO: 8, endolisina do Fago P2 de E.coli (P2gPO9) de acordo com a SEQ ID NO: 9, fago de Salmonella typhimurium muramidase STM0016 de acordo com a SEQ ID NO: 89, Fago N4 de E. coli muramidase N4-gp61 de acordo com a SEQ ID NO: 90 , N4-gp61 trunc. de acordo com a SEQ ID NO:91 e Ply 2638 de acordo com a SEQ ID NO: 92.

[063]Em outra modalidade preferida da presente invenção os métodos de eliminação, redução ou prevenção de biofilmes bacterianos através da proteína de fusão de acordo com a presente invenção compreendem modificações e/ou alterações das sequências de aminoácidos. Tais alterações e/ou modificações podem compreender mutações tais como deleções, inserções e adições, substituições ou combinações das mesmas e/ou alterações químicas dos resíduos de aminoácidos, por exemplo, biotinilação, acetilação, PEGilação, alterações químicas dos grupos amino, SH- ou carboxila. As ditas endolisinas modificadas e/ou alteradas exibem a atividade lítica da respectiva endolisina do tipo selvagem. Entretanto, a dita atividade pode ser maior ou menor que a atividade da respectiva endolisina do tipo selvagem. A dita atividade pode ser aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou aproximadamente 200 % da atividade da respectiva endolisina do tipo selvagem ou ainda maior. A atividade pode ser medida através de ensaios bem conhecidos na arte por um perito na arte, por exemplo, como o ensaio de lise de placa ou o ensaio de lise líquida que são, por exemplo, descritos em Briers e outros, J. Biochem. Biophys Methods 70: 531-533, (2007).

[064]O peptídeo da proteína de fusão de acordo com a presente invenção pode ser ligado à enzima, preferencialmente à endolisina, à autolisina ou à bacterio- cina através de resíduos de aminoácidos adicionais, por exemplo, através de meios de clonagem. Preferencialmente, os ditos resíduos de aminoácidos adicionais podem não ser reconhecidos e/ou clivados por proteases. Preferencialmente o dito peptídeo pode ser ligado à enzima através de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos de aminoácidos adicionais. Preferencialmente, o peptídeo fundido no N- terminal da enzima, preferencialmente à endolisina, à autolisina ou à bacteriocina, da proteína de fusão de acordo com a invenção compreende ainda aminoácidos adicionais em seu N-terminal. Preferencialmente o peptídeo compreende o aminoácido metionina (Met) ou metionina, glicina e serina (Met-Gly-Ser) ou alanina, metionina e glicina (Ala-Met-Gly). Em outra modalidade preferida o peptídeo é ligado ao N- terminal da enzima, preferencialmente à endolisina, à autolisina ou à bacteriocina, através dos resíduos de aminoácidos adicionais, em particular glicina e serina (Gly- Ser). Em outra modalidade preferida o peptídeo é ligado ao C-terminal da enzima através dos resíduos de aminoácidos adicionais, em particular glicina e serina (Gly- Ser).

[065]Em um aspecto da presente invenção o peptídeo com atividade de ruptura de membrana e/ou de LPS compreende o peptídeo carregado positivamente, que compreende um ou mais dos aminoácidos carregados positivamente que são lisina, arginina e/ou histidina. Preferencialmente, mais de 80%, preferencialmente mais de 90%, preferencialmente 100% dos aminoácidos no dito peptídeo são ami- noácidos carregados positivamente. Vantajosamente, o peptídeo catiônico fica posicionado na extremidade N-terminal e/ou C-terminal da proteína de fusão, aumentando assim a cationicidade das últimas proteínas. Em outra modalidade da invenção, o peptídeo catiônico fundido à enzima, preferencialmente à endolisina, à autolisina ou à bacteriocina tem pelo menos 5, mais preferencialmente pelo menos 9 aminoácidos de comprimento.

[066]Em uma modalidade preferida o dito peptídeo compreende aproxima-damente 3 até aproximadamente 50, mais preferencialmente aproximadamente 5 até aproximadamente 20, por exemplo, aproximadamente 5 até aproximadamente 15 resíduos de aminoácidos e pelo menos 20, 30, 40, 50, 60 ou 70%, mais preferen-cialmente pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 90% dos ditos resíduos de aminoácidos são resíduos de arginina ou lisina. Em outra modalidade preferida o dito peptídeo compreende aproximadamente 3 até aproximadamente 50, mais prefe-rencialmente aproximadamente 5 até aproximadamente 20, por exemplo, aproxima-damente 5 até aproximadamente 15 resíduos de aminoácidos e os ditos resíduos de aminoácidos são resíduos de arginina ou lisina.

[067]Preferencialmente, o peptídeo da proteína de fusão é fundido ao N- terminal e/ou ao C-terminal da enzima, preferencialmente da endolisina, da autolisina ou da bacteriocina. Em uma modalidade particularmente preferida o dito peptídeo é fundido apenas ao N-terminal da enzima, preferencialmente a endolisina, a autolisina ou a bacteriocina. Entretanto, são ainda preferidas as proteínas de fusão que possuem um peptídeo tanto no N-terminal quanto no C-terminal. Os ditos peptídeos no N-terminal e no C-terminal podem ser os mesmos ou peptídeos distintos.

[068]O peptídeo da proteína de fusão é preferencialmente covalentemente ligado à enzima. Preferencialmente, o dito peptídeo consiste de pelo menos 5, mais preferencialmentepelomenos de 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15,16, 17,18,19,20, 21, 22,23, 24,25,26,27,28, 29, 30,31,32,33, 34,35,36,37,38, 39,40,41,42, 43, 44,45, 46,47,48,49,50, 51, 52,53,54,55, 56,57,58,59,60, 61,62,63,64, 65, 66,67, 68,69,70,71,72, 73, 74,75,76,77, 78,79,80,81,82, 83,84,85,86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou pelo menos 100 resíduos de aminoácidos. É especialmente preferido um peptídeo que compreende aproximada- mente 5 até aproximadamente 100 resíduos de aminoácidos, aproximadamente 5 até aproximadamente 50 ou aproximadamente 5 até aproximadamente 30 resíduos de aminoácidos. É mais preferido um peptídeo que compreende aproximadamente 6 até aproximadamente 42 resíduos de aminoácidos, aproximadamente 6 até aproxi-madamente 39 resíduos de aminoácidos, aproximadamente 6 até aproximadamente 38 resíduos de aminoácidos, aproximadamente 6 até aproximadamente 31 resíduos de aminoácidos, aproximadamente 6 até aproximadamente 25 resíduos de aminoá- cidos, aproximadamente 6 até aproximadamente 24 resíduos de aminoácidos, apro-ximadamente 6 até aproximadamente 22 resíduos de aminoácidos, aproximadamente 6 até aproximadamente 21 resíduos de aminoácidos, aproximadamente 6 até aproximadamente 20 resíduos de aminoácidos, aproximadamente 6 até aproxima-damente 19 resíduos de aminoácidos, aproximadamente 6 até aproximadamente 16 resíduos de aminoácidos, aproximadamente 6 até aproximadamente 14 resíduos de aminoácidos, aproximadamente 6 até aproximadamente 12 resíduos de aminoáci- dos, aproximadamente 6 até aproximadamente 10 resíduos de aminoácidos ou aproximadamente 6 até aproximadamente 9 resíduos de aminoácidos.

[069]Em um aspecto da presente invenção o peptídeo é selecionado do grupo de peptídeos catiônicos, peptídeos policatiônicos, peptídeos hidrofóbicos, peptí- deos antimicrobianos e peptídeos anfipáticos.

[070]Em um aspecto da presente invenção o peptídeo é um peptídeo catiô- nico e/ou policatiônico, que compreende um ou mais dos resíduos de aminoácidos carregados postivamente de lisina, arginina e/ou histidina, em particular de lisina e/ou arginina. Preferencialmente, mais de aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 99 % dos resíduos de aminoácidos no dito peptídeo são resíduos de aminoácidos carregados postivamente, em particular resíduos de lisina e/ou arginina. São especialmente preferidos os peptídeos que consistem de aproximadamente 100 % de resíduos de aminoácidos carregados postivamente, em particular resíduos de arginina e/ou lisina, em que preferencialmente aproximadamente 60 % até aproximadamente 70 % dos ditos resíduos de aminoácidos carregados postiva- mente são resíduos de lisina e aproximadamente 30% até aproximadamente 40 % dos ditos resíduos de aminoácidos carregados postivamente são resíduos de argini- na. É mais preferido um peptídeo que consiste de aproximadamente 100 % de resíduos de aminoácidos carregados postivamente, em particular resíduos de arginina e/ou lisina, em que preferencialmente aproximadamente 64 % até aproximadamente 68 % dos ditos resíduos de aminoácidos carregados postivamente são lisina e aproximadamente 32 % até aproximadamente 36 % dos ditos resíduos de aminoácidos carregados postivamente são arginina. Os peptídeos que consistem de apenas argi- nina ou apenas lisina são também preferidos.

[071]São especialmente preferidos os peptídeos catiônicos e/ou policatiôni- cos da proteína de fusão que compreendem pelo menos um motivo de acordo com a SEQ ID NO: 10 (KRKKRK). Em particular peptídeos catiônicos que compreendem pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17 motivos de acordo com a SEQ ID NO: 10 (KRKKRK) são preferidos. São mais preferidos os peptídeos catiônicos que compreendem pelo menos um motivo KRK (lys-arg-lys), preferivelmente pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 motivos de KRK.

[072]Em outra modalidade preferida da presente invenção o peptídeo é um peptídeo catiônico que compreende além dos resíduos de aminoácidos carregados postivamente, em particular resíduos de lisina e/ou arginina, resíduos de aminoáci- dos carregados de forma neutra, em particular resíduos de glicina e/ou serina. São preferidos os peptídeos catiônicos que consistem de aproximadamente 70 % até aproximadamente 100 % ou aproximadamente 80 % até aproximadamente 95 % ou aproximadamente 85 % até aproximadamente 90 % de resíduos de aminoácidos carregados postivamente, em particular resíduos de lisina, arginina e/ou histidina, mais preferencialmente resíduos de lisina e/ou arginina e de aproximadamente 0 % até aproximadamente 30 % ou aproximadamente 5 % até aproximadamente 20 % ou aproximadamente 10 % até aproximadamente 20 % de resíduos de aminoácidos carregados de forma neutra, em particular resíduos de glicina e/ou serina. São preferidos os peptídeos que consistem de aproximadamente 4 % até aproximadamente 8 % de resíduos de serina, de aproximadamente 33 % até aproximadamente 36 % de resíduos de ariginina e de aproximadamente 56 % até aproximadamente 63 % de resíduos de lisina. São especialmente preferidos os peptídeos que compreendem pelo menos um motivo de acordo com a SEQ ID NO: 32 (KRXKR), em que X é qualquer outro aminoácido sem ser lisina, arginina e histidina. São especialmente preferidos os peptídeos que compreendem pelo menos um motivo de acordo com a SEQ ID NO: 33 (KRSKR). São mais preferidos os peptídeos catiônicos que compreendem pelo menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou aproximadamente 20 motivos de acordo com a SEQ ID NO: 32 (KRXKR) ou SEQ ID NO: 33 (KRSKR).

[073]São ainda preferidos os peptídeos da proteína de fusão que consistem de aproximadamente 9 até aproximadamente 16 % de resíduos de glicina, de apro-ximadamente 4 até aproximadamente 11 % de resíduos de serina, de aproximadamente 26 até aproximadamente 32 % de resíduos de ariginina e de aproximadamente 47 até aproximadamente 55 % de resíduos de lisina. São especialmente preferidos os peptídeos que compreendem pelo menos um motivo de acordo com a SEQ ID NO: 34 (KRGSG). São mais preferidos os peptídeos catiônicos que compreendem pelo menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou aproximadamente 20 motivos de acordo com a SEQ ID NO: 34 (KRGSG).

[074]Em outra modalidade preferida da presente invenção o peptídeo catiô- nico compreende além dos resíduos de aminoácidos carregados postivamente, em particular resíduos de lisina e/ou arginina, resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, em particular resíduos de valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, cisteína, alanina, tirosina, histidina, treonina, serina, prolina e glicina, mais preferen-cialmente resíduos de alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina e/ou triptofano. São preferidos os peptídeos catiônicos da proteína de fusão que consistem de apro-ximadamente 70 % até aproximadamente 100 % ou aproximadamente 80 % até aproximadamente 95 % ou aproximadamente 85 % até aproximadamente 90 % de resíduos de aminoácidos carregados postivamente, em particular resíduos de lisina e/ou arginina e de aproximadamente 0 % até aproximadamente 30 % ou aproximadamente 5 % até aproximadamente 20 % ou aproximadamente 10 % até aproximadamente 20 % resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, resíduos de valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, cisteína, alanina, tirosina, histidina, treo- nina, serina, prolina e glicina, mais preferencialmente resíduos de alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina e/ou triptofano.

[075]São especialmente preferidos os peptídeos da proteína de fusão sele- cionados do grupo que consiste das sequências a seguir apresentadas na Tabela 2.Tabela 2:

[076]Preferencialmente, o peptídeo da proteína de fusão não é um tag tal como um His-tag, Strep-tag, Avi-tag, Myc-tag, Gst-tag, JS-tag, cisteína-tag, FLAGtag ou outros tags conhecidos na arte e não é tiorredoxina ou proteínas que se ligam à maltose (MBP). Entretanto, a proteína de fusão de acordo com a presente invenção pode compreender em adição tal tag ou tags.

[077]Preferencialmente, o peptídeo da proteína de fusão possui a função de conduzir a proteína de fusão de acordo com a presente invenção através da membrana externa de bactérias, mas não possui ou possui apenas baixa atividade quando administrado sem estar fundido à endolisina, à autolisina ou à bacteriocina. A função de conduzir a proteína de fusão através da membrana externa de bactérias Gram-negativas e/ou Gram-positivas é causada pelo potencial da membrana externa ou da atividade de interrupção ou permeabilização ou desestabilização de LPS do dito peptídeo. Tal membrana externa ou atividade de interrupção ou permeabilização ou desestabilização de LPS do peptídeo pode ser determinada em um método como a seguir: As células bacterianas que serão tratadas são cultivadas em meio líquido ou sobre placas de ágar. Então a concentração de células bacterianas no meio líquido é determinada fotometricamente em DO600nm ou as colônias sobre as placas de ágar são contadas, respectivamente. Agora, as células bacterianas em meio líquido ou sobre as placas são tratadas com uma proteína de fusão de acordo com a invenção. Após a incubação a concentração de células bacterianas no meio líquido é determinada fotometricamente em DO600nm ou as colônias sobre as placas de ágar são contadas novamente. Se a proteína de fusão exibir tal membrana externa ou atividade de interrupção ou permeabilização ou desestabilização de LPS, as células bacterianas são lisadas devido ao tratamento com a proteína de fusão e assim, a concentração de células bacterianas no meio líquido ou o número de colônias de bactérias sobre a placa de ágar é reduzido. Assim, a redução na concentração de células bacterianas ou no número de colônias de bactérias após o tratamento com a proteína de fusão é indicativa de uma membrana externa ou atividade de interrupção ou permeabilização ou desestabilização de LPS da proteína de fusão.

[078]Em uma modalidade adicional da presente invenção o peptídeo é um peptídeo antimicrobiano que compreende uma carga líquida positiva e aproximadamente 50% de aminoácidos hidrofóbicos. Os peptídeos antimicrobianos são anfipáti- cos, com um comprimento de aproximadamente 12 até aproximadamente 50 resíduos de aminoácidos. Os peptídeos antimicrobianos são naturalmente ocorrentes em insetos, peixes, plantas, aracnídeos, vertebrados ou mamíferos. Preferencialmente o peptídeo antimicrobiano pode ser naturalmente ocorrente em rabanete, bi- cho-da-seda, licosa, sapo, preferencialmente em Xenopus laevis, sapos Rana, mais preferencialmente em Rana catesbeiana, sapo, preferencialmente sapo asiático Bufo bufo gargarizans, mosca, preferencialmente em Drosophila, mais preferencialmente em Drosophila melanogaster, em Aedes aegypti, em abelha, abelhão, preferencialmente em Bombus pascuorum, mosca varejeira, preferencialmente em Sarcophaga peregrine, escorpião, límulo, peixe-gato, preferencialmente em Parasilurus asotus, vaca, porco, ovino, suíno, bovino, macaco e ser humano.

[079]Em outra modalidade preferida o peptídeo antimicrobiano da proteína de fusão consiste de aproximadamente 0 % até aproximadamente 5 % ou aproximadamente 0 % até aproximadamente 35 % ou aproximadamente 10 % até aproximadamente 35 % ou aproximadamente 15 % até aproximadamente 45 % ou aproximadamente 20 % até aproximadamente 45 % de resíduos de aminoácidos carregados postivamente, em particular resíduos de lisina e/ou arginina e de aproximadamente 50 % até aproximadamente 80 % ou aproximadamente 60 % até aproximadamente 80 % ou aproximadamente 55 % até aproximadamente 75 % ou aproximadamente 70 % até aproximadamente 90 % resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, resíduos de valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, cisteína, alanina, tirosi- na, histidina, treonina, serina, prolina e glicina, mais preferencialmente resíduos de alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina e/ou triptofano.

[080]Em outra modalidade preferida da presente invenção o peptídeo antimi- crobiano da proteína de fusão consiste de aproximadamente 4 % até aproximadamente 58 % de resíduos de aminoácidos carregados postivamente, em particular resíduos de lisina e/ou arginina e de aproximadamente 33 % até aproximadamente 89 % resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, resíduos de valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, cisteína, alanina, tirosina, histidina, treonina, serina, prolina e glicina, mais preferencialmente resíduos de alanina, valina, leucina, iso- leucina, fenilalanina e/ou triptofano.

[081]Os exemplos de peptídeos antimicrobianos da proteína de fusão de acordo com a presente invenção são listados na tabela a seguir.Tabela 3:

[082]Em uma modalidade adicional da presente invenção o peptídeo é um peptídeo sushi que é descrito por Ding JL, Li P, Ho B Cell Mol Life Sci. 2008 Abr;65(7-8):1202-19. Os peptídeos sushis: caracterização estrutural e modo de ação contra bactérias Gram-negativas. É especialmente preferido o peptídeo sushi 1 de acordo com a SEQ ID NO: 133.

[083]Os peptídeos sushi preferidos da proteína de fusão são peptídeos sushis S1 e S3 e múltiplos dos mesmos; FASEB J. 2000 Set;14(12):1801-13.

[084]Em uma modalidade adicional da presente invenção o peptídeo é um peptídeo hidrofóbico, que compreende pelo menos 90 % dos resíduos de aminoáci- dos hidrofóbicos de valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, cisteína, alanina, tirosina, histidina, treonina, serina, prolina e/ou glicina. Em outra modalidade preferida o peptídeo hidrofóbico da proteína de fusão consiste de apro-ximadamente 90 % até aproximadamente 95 % ou de aproximadamente 90 até aproximadamente 100% ou de aproximadamente 95 % até aproximadamente 100 % dos resíduos de aminoácidos hidrofóbicos de valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, cisteína, alanina, tirosina, histidina, treonina, serina, prolina e/ou glicina.

[085]Os peptídeos hidrofóbicos preferidos da proteína de fusão são Wal- magh1 que possui a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 134 e o peptídeo hidrofóbico da proteína de fusão que possui a sequência de aminoácidos Phe-Phe-Val-Ala-Pro (SEQ ID NO: 135).

[086]Em uma modalidade adicional da presente invenção o peptídeo é um peptídeo anfipático, que compreende um ou mais dos resíduos de aminoácidos car-regados postivamente de lisina, arginina e/ou histidina, combinado a um ou mais dos resíduos de aminoácidos hidrofóbicos de valina, isoleucina, leucina, metionina, feni- lalanina, triptofano, cisteína, alanina, tirosina, histidina, treonina, serina, prolina e/ou glicina. As cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos são orientadas com a fina-lidade de que as superfícies catiônicas e hidrofóbicas fiquem aglomeradas nos lados opostos do peptídeo. Preferencialmente, mais de aproximadamente 30, 40, 50, 60 ou 70% dos aminoácidos no dito peptídeo são aminoácidos carregados positivamente. Preferencialmente, mais de aproximadamente 30, 40, 50, 60 ou 70%, dos resíduos de aminoácidos no dito peptídeo são resíduos de aminoácidos hidrofóbicos. Vantajosamente, o peptídeo anfipático é fundido na extremidade N-terminal e/ou C- terminal da enzima com atividade de degradação da parede celular, aumentando assim a anfipacidade das últimas proteínas.

[087]Em outra modalidade da presente invenção o peptídeo é um peptídeo anfipático que consiste de pelo menos 5, mais preferencialmente pelo menos de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 resíduos de aminoácidos. Em uma modalidade preferida pelo menos aproximadamente 30, 40, 50, 60 ou 70% dos ditos resíduos de aminoácidos do peptídeo anfipático são resíduos de arginina ou lisina e/ou pelo menos aproximadamente 30, 40, 50, 60 ou 70% dos ditos resíduos de aminoácidos do peptídeo anfipático são dos aminoá- cidos hidrofóbicos valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, cis- teína, alanina, tirosina, histidina, treonina, serina, prolina e/ou glicina.

[088]Em outra modalidade preferida da presente invenção o peptídeo é um peptídeo anfipático que compreende além dos resíduos de aminoácidos carregados postivamente, em particular resíduos de lisina e/ou arginina, resíduos de aminoáci- dos hidrofóbicos, em particular resíduos de valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, cisteína, alanina, tirosina, histidina, treonina, serina, prolina e glicina, mais preferencialmente resíduos de alanina, valina, leucina, isoleucina, feni- lalanina e/ou triptofano. São preferidos os peptídeos anfipáticos que consistem de aproximadamente 10 % até aproximadamente 50 % ou aproximadamente 20 % até aproximadamente 50 % ou aproximadamente 30 % até aproximadamente 45 % ou aproximadamente 5 % até aproximadamente 30 % de resíduos de aminoácidos car-regados postivamente, em particular resíduos de lisina e/ou arginina e de aproxima-damente 50 % até aproximadamente 85 % ou aproximadamente 50 % até aproxi-madamente 90 % ou aproximadamente 55 % até aproximadamente 90 % ou apro-ximadamente 60 % até aproximadamente 90 % ou aproximadamente 65 % até apro-ximadamente 90 % resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, resíduos de valina, iso- leucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, cisteína, alanina, tirosina, histidi- na, treonina, serina, prolina e glicina, mais preferencialmente resíduos de alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina e/ou triptofano. Em outra modalidade preferida peptídeos anfipáticos que consistem de 12 % até aproximadamente 50 % de resíduos de aminoácidos carregados postivamente, em particular resíduos de lisina e/ou arginina e de aproximadamente 50 % até aproximadamente 85 % resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, resíduos de valina, isoleucina, leucina, metionina, fenila- lanina, triptofano, cisteína, alanina, tirosina, histidina, treonina, serina, prolina e glici- na, mais preferencialmente resíduos de alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilala- nina e/ou triptofano.

[089]Os peptídeos anfipáticos preferidos da proteína de fusão são, α4-helix de T4 lisozima de acordo com a SEQ ID NO: 136 e Variante WLBU2 que possui a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 137 e Walmagh 2 de acordo com a SEQ ID NO: 138.

[090]Em uma modalidade preferida da presente invenção a proteína de fusão consiste de um peptídeo de acordo com as SEQ ID NOs: 10 até 30, 32 até 34 e 93 até 138 e uma endolisina de acordo com as SEQ ID NOs: 1 até 9, 84 até 86 e 88 até 92 ou uma bacteriocina de acordo com a SEQ ID NO: 87. Em uma modalidade preferida a proteína de fusão compreende um peptídeo selecionado do grupo de peptídeos de acordo com as SEQ ID NOs: 10 até 30, 32 até 34 e 93 até 138 e uma endolisina selecionada do grupo de endolisinas de acordo com as SEQ ID NOs: 1 até 9, 84 até 86 e 88 até 92 ou uma bacteriocina de acordo com a SEQ ID NO: 87.

[091]São especialmente preferidas proteínas de fusão selecionadas do grupo que consiste das proteínas de fusão a seguir apresentadas na Tabela 4.Tabela 4:

[092]As proteínas de fusão de acordo com a presente invenção e assim em particular as proteínas de fusão especialmente preferidas de acordo com as SEQ ID NOs: 35 até 49, 53, 57, 61 até 64, 66 até 78 e 139 até 142 podem compreender adi-cionalmente uma metionina sobre o N-terminal.

[093]As proteínas de fusão de acordo com a presente invenção e assim em particular as proteínas de fusão especialmente preferidas de acordo com as SEQ ID NOs: 35 até 49, 53, 57, 61 até 64, 66 até 78 e 139 até 142 podem compreender adi-cionalmente um tag, por exemplo, para purificação. É preferido um His6-tag, prefe-rencialmente no C-terminal da proteína de fusão. O dito tag pode estar ligado à proteína de fusão através de resíduos de aminoácidos adicionais, por exemplo, através de meios de clonagem. Preferencialmente o dito tag pode estar ligado à proteína de fusão através de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos de aminoácidos adicionais. Em uma modalidade preferida a proteína de fusão compreende um His6- tag seu C-terminal ligado à proteína de fusão através dos resíduos de aminoácidos adicionais lisina e glicina (Lys-Gly) ou leucina e ácido glutâmyco (Leu-Glu). Preferencialmente, os ditos resíduos de aminoácidos adicionais podem não ser reconhecidos ou clivados por proteases. Em outra modalidade preferida a proteína de fusão compreende um His6-tag em seu N-terminal ligado à proteína de fusão através dos resíduos de aminoácidos adicionais lisina e glicina (Lys-Gly) ou leucina e ácido glu- tâmyco (Leu-Glu). Em outra modalidade preferida a proteína de fusão compreende um His6-tag em seu N-terminal e C ligado à enzima, preferencialmente à endolisina, à autolisina ou à bacteriocina através dos resíduos de aminoácidos adicionais lisina e glicina (Lys-Gly) ou leucina e ácido glutâmyco (Leu-Glu).

[094]Em particular, as proteínas de fusão que são utilizadas nos exemplos que são descritos a seguir são preferidas. As proteínas de fusão de acordo com as SEQ ID NOs: 35 até 42, 53, 57 e 61 que são utilizadas nos exemplos compreendem um His6-tag no C-terminal ligado à proteína de fusão através dos resíduos de ami- noácidos adicionais lisina e glicina (Lys-Gly). A proteína de fusão de acordo com as SEQ ID NOs: 43 até 49, 75, 139, 141 e 142 que são utilizadas nos exemplos compreendem um His6-tag no C-terminal ligado à respectiva proteína de fusão através dos resíduos de aminoácidos adicionais leucina e ácido glutâmyco (Leu-Glu).

[095]As proteínas de fusão são construídas através da ligação de pelo menos duas sequências de ácidos nucléicos utilizando técnicas de clonagem padronizadas que são descritas, por exemplo, por Sambrook e outros 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Tal proteína pode ser produzida, por exemplo, em sistemas de expressão de DNA recombinante. Tais proteínas de fusão de acordo com a presente invenção podem ser obtidas através da fusão dos ácidos nucléicos para endolisina, autolisina ou bacteriocina e o respectivo peptídeo.

[096]Uma vez que algumas proteínas de fusão podem ser tóxicas após a expressão em bactérias ou não homogêneas à degradação das proteínas, a estratégia poderia ser expressar estas proteínas de fusão fundidas ou ligadas a outras proteínas adicionais. O exemplo para estas outras proteínas adicionais é Tiorredoxina, que mostrou mediar a expressão de peptídeos antimicrobianos tóxicos em E.coli (TrxA mediando a expressão de fusão de peptídeo antimicrobiano CM4 partindo de vários genes ligados em Escherichia coli. Zhou L, Zhao Z, Li B, Cai Y, Zhang S. Protein Expr Purif. 2009 Abr;64(2):225-230).

[097]Para a função antimicrobiana das proteínas de fusão pode ser necessário remover a proteína de fusão adicional através de clivagem proteolítica. Os kits disponíveis comercialmente como o sistema de expressão de pET32 (Novagen), podem precisar modificar, por exemplo, o N-terminal da fusão dependendo da protease utilizada, como de MGS para AMGS (SEQ ID NO: 31), em que o resíduo de alanina remanescente resulta de um sítio de clivagem de Enteroquinase introduzido.

[098]Em outra modalidade preferida da presente invenção os peptídeos das proteínas de fusão de acordo com a presente invenção compreendem modificações e/ou alterações das sequências de aminoácidos. Tais alterações e/ou modificações podem compreender mutações tais como deleções, inserções e adições, substituições ou combinações dos mesmos e/ou alterações químicas dos resíduos de ami- noácidos, por exemplo, biotinilação, acetilação, PEGilação, alterações químicas dos grupos amino, SH- ou carboxila.

[099]A presente invenção refere-se ainda a métodos de eliminação, redução ou prevenção de biofilmes bacterianos através de uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica a proteína de fusão de acordo com a presente invenção. A presente invenção refere-se ainda a um vetor que compreende a molécula de ácido nu- cléico de acordo com a presente invenção. O dito vetor pode fornecer a expressão constitutiva ou induzível da dita proteína de fusão de acordo com a presente invenção.

[0100]As proteínas de fusão podem ser obtidas partindo de um microorganismo, tal como uma célula hospedeira adequada modificada geneticamente que expressa as ditas proteínas de fusão. A dita célula hospedeira pode ser um micro-organismo tal como bactérias ou levedura ou fungos ou uma célula animal cell, por exemplo, como uma célula de mamífero, em particular, uma célula humana. Em uma modalidade da presente invenção a célula de levedura é uma célula de Pichia pastoris. O hospedeiro pode ser selecionado através de meios biotecnológicos sim ples, por exemplo, rendimento, solubilidade, custos etc., mas pode também ser sele-cionado de um ponto de vista médico, por exemplo, bactérias ou leveduras não pato-lógicas, células humanas.

[0101]Em um aspecto adicional a presente invenção refere-se a métodos de eliminação, redução ou prevenção de biofilmes bacterianos através de uma composição, preferencialmente uma composição farmacêutica, que compreende uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção e/ou um hospedeiro transformado com uma molécula de ácido nucléico ou um vetor que compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção.

[0102]Em uma modalidade preferida da presente invenção os métodos de eliminação, redução ou prevenção de biofilmes bacterianos através da composição compreendem agentes de permeabilização adicionais da membrana externa de bac-térias Gram-negativas tais como quelantes metálicos, por exemplo, como EDTA, TRIS, ácido láctico, lactoferrina, polimixina, ácido cítrico e/ou outras substâncias que são descritas, por exemplo, por Vaara (Agentes que aumentam a permeabilidade da membrana externa. Vaara M. Microbiol Rev. 1992 Set;56(3):395-441). São ainda preferidas composições que compreendem combinações dos agentes de permeabi- lização mencionados anteriormente. É especialmente preferida uma composição que compreende aproximadamente 10 μM até aproximadamente 100 mM de EDTA, mais preferencialmente aproximadamente 50 μM até aproximadamente 10 mM de EDTA, mais preferencialmente aproximadamente 0,5 mM até aproximadamente 10 mM de EDTA, mais preferencialmente aproximadamente 0,5 mM até aproximadamente 2 mM de EDTA, mais preferencialmente aproximadamente 0,5 mM até 1 mM de EDTA. Entretanto, ainda composições que compreendem aproximadamente 10 μM até aproximadamente 0,5 mM de EDTA são preferidas. É também preferida uma composição que compreende aproximadamente 0,5 mM até aproximadamente 2 mM de EDTA, mais preferencialmente aproximadamente 1 mM de EDTA e adicionalmente aproximadamente 10 até aproximadamente 100 mM de TRIS.

[0103]A presente invenção refere-se ainda a métodos de eliminação, redução ou prevenção de biofilmes bacterianos através de uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção e/ou um hospedeiro transformado com um ácido nucléico que compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção para uso como um medicamento.

[0104]Em um aspecto adicional a presente invenção refere-se ao uso de uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção e/ou um hospedeiro transformado com um vetor que compreende uma molécula de ácido nucléico que compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção para eliminação, redução e prevenção de biofilmes bacterianos. É preferido o uso em que as bactérias que produzem o biofilme causam um distúrbio, uma doença ou um estado de saúde prejudicial a plantas, animais e/ou seres humanos. É preferido o uso em que as bactérias que produzem o biofilme podem ser bactérias Gram-negativas de grupos, famílias, gêneros ou espécies bacteri- anas que compreendem cepas patogênicas para humanos ou animais como Entero- bacteriaceae (Escherichia, especialmente E. coli, Salmonella, Shigella, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, especialmente K. pneumoniae, Mor- ganella, Proteus, Providencia, Serratia, Yersinia), Pseudomonadaceae (Pseudomonas, especialmente P. aeruginosa, Burkholderia, Stenotrophomonas, Shewanella, Sphingomonas, Comamonas), Neisseria, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, Brucella, Francisella, Bordetella, Legionella, Bartonella, Coxiella, Haemophilus, Pasteurella, Mannheimia, Actinobacillus, Gardnerella, Spirochaetaceae (Treponema e Borrelia), Leptospiraceae, Campylobacter, Helicobacter, Spirillum, Streptobacillus, Bacteroida- ceae (Bacteroides, Fusobacteria, Prevotella, Porphyromonas), Acinetobacter, especialmente A. baumannii. Preferencialmente, o dito distúrbio, doença ou estado de saúde pode ser causado por Pseudomonas, em particular Pseudomonas aeruginosa e/ou Pseudomonas putida, Burkholderia, em particular Burkholderia pseudomallei e/ou Burkholderia solanacearum, Salmonella, em particular Salmonella typhimurium e/ou Salmonella Enteritidis, Acinetobacter, em particular Acinetobacter baumannii, Escherichia coli e/ou Klebsiella, em particular Klebsiella pneumoniae. Em particular o tratamento e/ou a prevenção do distúrbio, doença ou estado de saúde pode ser causada por bactérias Gram-positivas de grupos, famílias, gêneros ou espécies bacteri- anas que compreendem cepas patogênicas para humanos ou animais como Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Enterococcus fae- cium, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus mutans, Streptococcus equi, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Clostridium perfringens, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Propionibacterium acnes, Mycobacteria avium, Mycobacteria tuberculosis, Corynebacterium diphteriae, Myco-plasma pneumoniae, Actinomyces.

[0105]Em uma modalidade preferida, a proteína de fusão, preferencialmente a variante de endolisina, a variante de autolisina ou a variante de bacteriocina.

[0106]Em um aspecto adicional a presente invenção refere-se a um método de tratamento de um distúrbio, uma doença ou um estado de saúde associado ao biofilme bacteriano em um indivíduo que necessita de tratamento e/ou prevenção, cujo método compreende a administração ao dito indivíduo de uma quantidade eficiente de uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção e/ou uma quantidade eficiente de um hospedeiro transformado com um ácido nucléico que compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção ou uma composição de acordo com a presente invenção. O indivíduo pode ser um ser humano ou um animal.

[0107]Preferencialmente o dito método de tratamento pode ser para o tratamento e/ou para a prevenção de infecções causadas por bactérias Gram-negativas e/ou Gram-positivas associadas ao biofilme bacteriano, em particular pelas bactérias Gram-negativas e Gram-positivas que são listadas anteriormente. Em particular o dito método de tratamento pode ser para o tratamento e/ou para a prevenção de infecções da pele, de tecidos moles, do sistema respiratório, dos pulmões, do trato digestivo, dos olhos, dos dentes, da nasofaringe, da boca, dos ossos, da vagina, de ferimentos de bacteremia e/ou endocardite causados por bactérias Gram-negativas e/ou Gram-positivas associadas ao biofilme bacteriano, em particular por bactérias Gram-negativas e Gram-positivas que são listadas anteriormente.

[0108]A dosagem e a rota de administração utilizadas em um método de tra-tamento ou profilaxia de acordo com a presente invenção dependem da doença/sítio de infecção específico que será tratado. A rota de administração pode ser, por exemplo, oral, tópica, nasofaringeal, parenteral, por inalação, intravenosa, intramuscular, intratecal, intraespinhal, endobronquial, intrapulmonar, intraóssea, intracardía- ca, intraarticular, retal, vaginal ou qualquer outra rota de administração. Em uma modalidade preferida a proteína de fusão é aplicada de forma tópica ao material biológico, preferencialmente a pele, em particular de mamíferos, preferencialmente de humano. Em uma modalidade preferida a proteína de fusão é aplicada de forma sistêmica ao material biológico, preferencialmente o sangue, em particular de mamíferos, preferencialmente de humano.

[0109]Para a aplicação de uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção e/ou uma quantidade eficiente de um hospedeiro transformado com um ácido nucléico que compreendem uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção ou uma composição de acordo com a presente invenção a um local de infecção (ou local em risco de ser infectado) pode ser utilizada uma formulação que protege os compostos ativos das influências ambientais tais como proteases, oxidação, resposta imunológica etc., até atingir o local de infecção. Portanto, a formulação pode ser cápsula, drágea, pílula, pó, supo- sitório, emulsão, suspensão, gel, loção, creme, pomada, solução injetável, xarope, spray, inalante ou qualquer outra formulação galênica medicinal razoável; Preferencialmente, a formulação galênica pode compreender carreadores, estabilizantes, aromatizantes, tampões adequados ou outros reagentes adequados. Por exemplo, para aplicação tópica a formulação pode ser uma loção, um creme, um gel, uma pomada ou um emplastro, para aplicação nasofaringeal a formulação pode ser solução salina que será aplicada através de um spray nas narinas. Para administração oral no caso do tratamento e/ou da prevenção de um local de infecção específico, por exemplo, nos intestinos, pode ser necessário proteger uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção do ambiente digestivo ríspido do trato gastrointestinal até o local da infecção ser atingido. Assim, podem ser utilizadas bactérias como carreadoras, que sobrevivem às etapas iniciais da digestão no estômago e que se- cretam posteriormente uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção dentro do ambiente intestinal.

[0110]Em uma modalidade específica a presente invenção refere-se ao uso de uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção e/ou um hospedeiro transformado com um vetor que compreende uma molécula de ácido nucléico que compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção na produção de um medicamento para o tratamento e/ou para a prevenção de um distúrbio, uma doença ou um estado de saúde causado por infecções causadas por bactérias Gram-positivas e/ou Gram-negativas associadas ao biofilme bacteriano. Uma modalidade preferida refere-se ao uso de uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção na produção de um medicamento para o tratamento e/ou para a prevenção de um distúrbio, uma doença ou um estado de saúde causado por infecções causadas por bactérias Gram-positivas e/ou Gram-negativas associadas ao biofilme bacteriano em combinação ou em adição a antibióticos.

[0111]Em uma modalidade específica a presente invenção refere-se ao uso de uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção e/ou um hospedeiro transformado com um vetor que compreende uma molécula de ácido nucléico que compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção na produção de um medicamento para o tratamento e/ou para a prevenção de um distúrbio, uma doença ou um estado de saúde causado por Pseudomonas associado ao biofilme bacteriano, particularmente por Pseudomonas aeruginosa em particular doenças intestinais, em particular em crianças, infecções nas meninges, por exemplo, meningite hemorrágica, infecções do ouvido médio, da pele (Ecthyma gangraenosum), em particular queimaduras, do trato urinário, rinite, pneumonia bacterêmica, em particular em que o paciente está sofrendo de fibrose cística ou malignidades hematológicas tal como leucemia ou com neutropenia proveniente de terapia imunossupressora, septicemia, em particular por causa de cateterização intravenosa ou urinária de longa duração, procedimentos cirúrgicos invasivos e queimaduras graves, endocardite, em particular em que o paciente é um usuário de fármacos intravenosos ou um paciente com complicações provenientes de cirurgia cardíaca aberta, infecções oculares altamente destrutivas. em particular após o uso de soluções oftalmológicas contaminadas ou queimaduras faciais graves, osteocondrite, em particular como um resultado de trauma grave ou ferimentos de perfuração através de roupas contaminadas.

[0112]Em outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, a doença ou o estado de saúde é causado por Burkholderia pseudomallei associada ao biofilme bacteriano, em particular Doença de Whitmore, pneumonia crônica, septicemia, em particular em que o paciente possui uma lesão na pele traumatizada. Em outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, a doença ou o estado de saúde é causado por Salmonella thyphimurium e Salmonella enteritidis associadas ao biofilme bacteriano, em particular gastroenterite aguda e processos purulen- tos locais, particularmente osteomielite, endocardite, colecistite e especialmente causado por Salmonella thyphimurium meningitis, em particular em que o paciente tem menos de dois anos de idade. Em outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, a doença ou o estado de saúde é causado por Salmonella typhi, em particular tifo. Em outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, a doença ou o estado de saúde é causado por Salmonell paratyphi, em particular paratifo. Em outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, a doença ou o estado de saúde é causado por Acinetobacter baumannii associada ao biofilme bacteriano, em particular bronquite, pneumonia, infecções de ferimentos e septicemia, em particular como um resultado de cateterização intravenosa. Em outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, a doença ou o estado de saúde é causado por Escherichia coli associada ao biofilme bacteriano, em particular infecções extras intestinais, particularmente apendicite, colecistite purulenta, peritonite, meningite purulenta e infecção do trato urinário, infecções intraintestinais por E. coli, particularmente enterite epidêmica e doença infecciosa similar a disinteria, septicemia, enterotoxemia, mastite e disinteria. Em outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, a doença ou o estado de saúde é causado por Klebsiella pneumoniae associada ao biofilme bacteriano, em particular pneumonia, bacteremia, meningite e infecções do trato urinário. Em uma modalidade específica a presente invenção refere-se ao uso de uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção e/ou um hospedeiro transformado com um vetor que compreende uma molécula de ácido nucléico que compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção na produção de um medicamento para o tratamento e/ou para a prevenção de um distúrbio, uma doença ou um estado de saúde causado por Listeria monocytogenes, em particular Granulomatosis infantiseptica (listeriose de recém-nascidos), mononucleose, conjuntivite, meningite, granulomatose séptica e a listeriose de mulheres grávidas. Em outra modali- dade específica da presente invenção o distúrbio, a doença ou o estado de saúde é causado por Staphylococcus aureus, em particular infecções da pele como pioder- ma, particularmente foliculite, furúnculo, carbúnculo, abscessos das glândulas sudoríparas e pênfigo e síndrome da pele similar a escamas. A síndrome da pele escamosa pode aparecer em três quadros clínicos: dermatite exfoliativa, impetigo bullosa e eritroderma escarlatiniforme. Além disso, o distúrbio, a doença ou o estado de saúde causado por Staphylococcus aureus é pneumonia causada por Staphylococcus, hospitalismo, em particular infecções de ferimentos cirúrgicos, mastite puerperalis e enterocólito e infecções alimentares. Em outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, a doença ou o estado de saúde é causado por Streptococcus pyogenes, em particular amigdalite, faringite, escarlatina, erisipelas, febre reumática e glomerulonefrite aguda. Em outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, a doença ou o estado de saúde é causado por Streptococcus pneumoniae, em particular pneumonia, ulcus serpens corneae, otite media, meningite, peritonite, mastoidite e osteomielite.

[0113]Em outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, a doença ou o estado de saúde é causado por Clostridium perfringens, em particular gangrena gasosa, enterite necrosante ulcerosa e infecções alimentares. Em outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, a doença ou o estado de saúde é causado por Clostridium botulinum, em particular botulismo. Em outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, a doença ou o estado de saúde é causado por Clostridium difficile, em particular enterocolinte pseudomembrano- sa. Em outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, a doença ou o estado de saúde é causado por Bacillus anthracis, em particular antraz cutâneo, antraz por inalação e antraz gastrointestinal. Em outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, a doença ou o estado de saúde é causado por Enterococcus faecalis ou E. faecium, como infecções nosocomiais e endocardite. Em outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, a doença ou o estado de saúde é causado por Bacillus cereus, em particular infecções alimentares, pneumonia bronquial, septicemia e meningite. Em outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, a doença ou o estado de saúde é causado por Mycobacteria avium, Mycobacteria paratuberculosis e Mycobacteria tuberculosis, em particular tuberculose. Em outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, a doença ou o estado de saúde é causado por Mycoplasma pneumoniae, em particular pneumonia, doenças do trato respiratório superior e inflamações do tímpano. Em outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, a doença ou o estado de saúde é causado por Actinomyces, em particular actinomicose em humanos, gado, gatos e cães. Em outra modalidade específica da presente invenção o distúrbio, a doença ou o estado de saúde é causado por Corynebacterium diphteriae, em particular difteria localizada das amígdalas, do nariz, da nasofaringe ou do ouvido médio, difteria progressiva da laringe, da traqueia e dos brônquios, difteria tóxica ou maligna, difteria da pele ou de ferimentos.

[0114]Os métodos de eliminação, redução ou prevenção de biofilmes bacte- rianos através de proteínas de fusão de acordo com a presente invenção fornecem uma possiblidade de invasão dentro do biofilme bacteriano e eliminar, reduzir e prevenir o biofilme bacteriano.

[0115]Os métodos de eliminação, redução ou prevenção de biofilmes bacte- rianos através de proteínas de fusão de acordo com a presente invenção pode ser para o tratamento e/ou para a prevenção das infecções a seguir: infecções de ferimentos, em particular ferimentos associados a diabetes mellitus, amigdalite, oste- omielite, endocardite bacteriana, sinusite, infecções da córnea, infecção do trato urinário, infecção do trato biliar, pedras renais infecciosas, uretrite, prostatite, infecções causadas por catéteres, infecções do ouvido médio, formação de placa dentária, gingivite, periodontite, fibrose cística e infecções de dispositivos internos permanen- tes tais como protéses de articulações e válvulas cardíacas.

[0116]Em outra modalidade preferida de eliminação, redução e prevenção de biofilmes bacterianos através de proteínas de fusão de acordo com a presente invenção pode ser para o tratamento e/ou para a prevenção de infecções associadas com material estranho, como contaminação e colonização de catéteres, implantes e dispositivos médicos, em particular instrumentos, aparelhos, endoscópios, dispositivos dentários, equipmento de diálise, como cateter de diálise peritoneal, marca passos, tubos endotraqueais, próteses vocais, pontes de fluido cerebrospinal, cate- ter venoso, válvulas cardíacas artificiais e próteses de articulações.

[0117]Em outra modalidade preferida de eliminação, redução e prevenção biofilmes bacterianos através de proteínas de fusão de acordo com a presente invenção o biofilme bacteriano é formado por Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Candida albicans.

[0118]Em outra modalidade preferida de eliminação, redução e prevenção de biofilmes bacterianos através de proteínas de fusão de acordo com a presente invenção pode ser para a prevenção ou a remoção de contaminações em unidades de cuidado da saúde, agrícolas e industriais, em particular em tubulações de água de hospitais, na água, nas tubulações, na ventilação, no aquecimento do prédio, no ar condicionado, poços de petróleo, cosméticos e medicamentos.

[0119]Em outra modalidade preferida de eliminação, redução e prevenção de biofilmes bacterianos através de proteínas de fusão de acordo com a presente invenção pode ser para a prevenção de biocorrosão, em particular em circuitos de resfriamento, plantas de tratamento de água, sistemas de água quente domésticos, plantas de força, sistemas de produção e maquinários para automóveis, computadores, pigmentação, óleo e gás.

[0120]Em outra modalidade preferida de eliminação, redução e prevenção de biofilmes bacterianos através de proteínas de fusão de acordo com a presente invenção pode ser para a prevenção de enconstração biológica, em particular sobre objetos submarinos, navios, plataformas, sistemas sensores para finalidades científicas ou de vigilância no campo maritmo.

[0121]Em uma modalidade preferida da presente invenção uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção é utilizada para tratamento médico, se a infecção que será tratada ou prevenida for causada por cepas bacterianas multirre- sistentes associadas ao biofilme bacteriano, em particular por cepas resistentes contra um ou mais dos antibióticos a seguir: estreptomicina, tetraciclina, cefalotina, gen- tamicina, cefotaxima, cefalosporina, ceftazidima ou imipenem.

[0122]Além disso, nos métodos ou no uso da presente invenção a proteína de fusão, preferencialmente a variante de endolisina, a variante de autolisina ou a variante de bacteriocina pode ser utilizada, adicionada ou administrada em combinação ou em adição com agentes antibacterianos convencionais, tais como antibióticos, lantibióticos, bacteriocinas ou endolisinas. Em outra modalidade preferida, os antibióticos são adicionados, utilizados ou administrados nos métodos e no uso de acordo com a presente invenção simoultaneamente com a proteína de fusão, após ou antes da administração ou da adição de proteína de fusão.

[0123]Em uma modalidade preferida da presente invenção a proteína de fusão pode ser utilizada ou administrada em combinação com pelo menos dos antibióticos a seguir: β-lactams, aminoglicosídeos, fluoroquinolonas, macrolidas, novobioci- na, rifampicina, oxazolidinonas, ácido fusídico, mupirocina, pleuromutilinas, daptomi- cina, vancomicina, tetraciclinas, sulfonamidas, cloranfenicol, trimetoprim, fosfomici- na, cicloserina e polimixina.

[0124]Em outra modalidade preferida da presente invenção a proteína de fusão pode ser utilizada nos métodos de eliminação, redução ou prevenção de biofil- mes bacterianos de Staphylococcus aureus através da administração da mesma em combinação com pelo menos um dos antibióticos a seguir: β-lactams, aminoglicosí- deos, fluoroquinolonas, macrolidas, novobiocina, rifampicina, oxazolidinonas, ácido fusídico, mupirocina, pleuromutilinas, daptomicina, vancomicina, tetraciclinas, sulfo- namidas, cloranfenicol, trimetoprim, fosfomicina e cicloserina.

[0125]Em outra modalidade preferida da presente invenção uma proteína de fusão pode ser utilizada nos métodos de eliminação, redução ou prevenção de bio- filmes bacterianos de Escherichia coli através da administração da mesma em com-binação com pelo menos um dos antibióticos a seguir: β-lactams, aminoglicosídeos, fluoroquinolonas, tetraciclinas, sulfonamidas, cloranfenicol, trimetoprim, fosfomicina, cicloserina e polimixina.

[0126]Em outra modalidade preferida da presente invenção uma proteína de fusão pode ser utilizada nos métodos de eliminação, redução ou prevenção de bio- filmes bacterianos de Pseudomonas aeruginosa através da administração da mesma em combinação com pelo menos um dos antibióticos a seguir: β-lactams, aminogli- cosídeos, fluoroquinolonas e polimixina.

[0127]A presente invenção refere-se ainda a uma embalagem farmacêutica para uso na eliminação, redução e prevenção de biofilme bacteriano que compreende um ou mais compartimentos, em que pelo menos um compartimento compreende uma ou mais proteína de fusão de acordo com a presente invenção e/ou um ou mais hospedeiros transformados com um ácido nucléico que compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção ou uma composição de acordo com a presente invenção.

[0128]Em outro aspecto a presente invenção refere-se a um processo de preparação de uma composição farmacêutica para uso na eliminação, redução e prevenção de biofilme bacteriano, o dito processo compreendendo a mistura de uma ou mais proteína de fusão de acordo com a presente invenção e/ou um ou mais hospedeiros transformados com um ácido nucléico que compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção com um diluente, excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável.

[0129]Ainda em um aspecto adicional a composição de acordo com a presente invenção é uma composição cosmética para uso na eliminação, redução e prevenção de biofilme bacteriano. Várias espécies de bactérias podem causar irritações sobre superfícies expostas ao ambiente do corpo do paciente tal como a pele. Com a finalidade de prevenir tais irritações ou com a finalidade de eliminar manifestações menores dos ditos agentes patogênicos bacterianos, podem ser empregadas preparações cosméticas especiais, que compreendem quantidades suficientes da proteína de fusão de acordo com a presente invenção com a finalidade de degradar bactérias Gram-negativas e/ou Gram-positivas patogênicas já existentes ou recém- sedimentadas.

[0130]Em um aspecto adicional a presente invenção refere-se à proteína de fusão de acordo com a presente invenção para uso como um meio para diagnóstico em diagnósticos medicinais, de alimentos ou produtos alimentícios ou ambientais, em particular como um meio para diagnósitoc para o diagnóstico de infecção bacte- riana causada em particular por bactérias Gram-negativas e/ou Gram-positivas associadas ao biofilme bacteriano. Sob este aspecto a proteína de fusão de acordo com a presente invenção pode ser utilizada como uma ferramenta para degradar especificamente bactérias patogênicas associadas ao biofilme bacteriano, em particular bactérias Gram-negativas e/ou Gram-positivas patogênicas. A degradação das células bacterianas pela proteína de fusão de acordo com a presente invenção pode ser sustentada pela adição de detergentes como Triton X-100 ou outros aditivos que enfraquecem o envelope da célula bacteriana como polimixina B. A degradação celular específica é necessária como uma etapa inicial para a detecção específica subsequente de bactérias utilizando métodos baseados nos ácido nucléico como PCR, hibridização de ácidos nucléicos ou NASBA (Amplificação Baseada na Sequência de Ácidos Nucléicos), métodos imunológicos como técnicas de IMS, imunofluorescência ou ELISA ou outros métodos que se baseiam no conteúdo celular das células bacte- rianas como ensaios enzimáticos utilizando proteínas específicas para grupos ou espécies bacterianas distintas (por exemplo, β-galactosidase para enterobactérias, coagulase para cepas positivas para coagulase).

[0131]Em um aspecto adicional a presente invenção refere-se ao uso da pro-teína de fusão de acordo com a presente invenção para a remoção, a redução e/ou a prevenção de contaminação por bactérias Gram-negativa e/ou Gram-positiva associada ao biofilme bacteriano de matéria alimentícia, de equipamento para processamento de alimentos, de plantas de processamento de alimentos, de superfícies que entram em contato com matéria alimentícia tais como prateleiras e áreas de depósito de alimentos e em todas as outras situações, em que bactérias patogênicas, patogênicas facultativas ou outras bactérias indesejáveis podem potencialmente infestar o material alimentício, de dispositivos médicos e de todos os tipos de superfícies em hospitais e cirurgia.

[0132]Em particular, uma proteína de fusão da presente invenção pode ser utilizada nos métodos de eliminação, redução ou prevenção de biofilmes bacterianos de maneira profilática como agente desinfetante. O dito agente desinfetante pode ser utilizado antes ou após a cirurgia ou, por exemplo, durante a hemodiálise. Além disso, bebês prematuros e pessoas imunocomprometidas ou aqueles indivíduos com necessidade de dispositivos prostéticos podem ser tratados com uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção. O dito tratamento pode ser ocorrer de maneira profilática ou durante infecção aguda. No mesmo contexto, infecções noso- comiais, especialmente por cepas resistentes a antibióticos como Pseudomonas aeruginosa (FQRP), espécies de Acinetobacter e Enterobacteriaceae tais como espécies de E.coli, Salmonella, Shigella, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Fornecemncia, Serratia e Yersinia; Staphylococcus aureus resistente à Meticilina, Enterococcus faecalis resistente à Vancomicina, Ente rococcus faecium resistente à Vancomicina, Streptococcus pneumoniae, Propioni- bacterium acnes, Mycobacteria tuberculosis resistente a várias drogas, podem ser tratadas de maneira profilática ou durante a fase aguda com uma proteína de fusão da presente invenção. Portanto, uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção pode ser utilizada como um desinfetante para eliminar, reduzir ou prevenir biofilmes bacterianos também em combinação com outros ingredientes úteis em uma solução de desinfecção como detergentes, agentes detergentes, solventes, antibióticos, lantibióticos ou bacteriocinas.

[0133]Para o uso da proteína de fusão de acordo com a presente invenção para eliminação, redução ou prevenção de biofilmes bacterianos como um desinfetante, por exemplo, em hospital, cirurgia dentária, veterinário, cozinha ou banheiro, a proteína de fusão pode ser preparada em uma composição na forma de, por exemplo, um fluido, um pó, um gel ou um ingrediente de um produto de lenço umedecido ou um lenço de desinfecção. A dita composição pode compreender adicionalmente carreador, aditivos, agentes de diluição e/ou excipientes adequados para seu respectivo uso e forma, respectivamente, - mas também agentes que sustentam a atividade antimicrobiana como EDTA ou agentes que aumentam a atividade antimicrobi- ana das proteínas de fusão. A proteína de fusão também pode ser utilizada com agentes desinfetantes comuns como, Alcoóis, Aldeídos, Agentes oxidantes, Fenóli- cos, Compostos de amônio quaternário ou luz UV. Para a desinfecção, por exemplo, de superfícies, objetos e/ou dispositivos a proteína de fusão pode ser aplicada nas ditas superfícies, objetos e/ou dispositivos. A aplicação pode ocorrer, por exemplo, através do umedecimento da composição de desinfecção com quaisquer meios tais como um pano ou um trapo, através de borrifação, derramamento. As proteínas de fusão podem ser utilizadas em concentração variável dependendo da respectiva aplicação e do “tempo de reação” pretendido para a obtenção da atividade antimi- crobiana total.

[0134]Em um aspecto adicional a presente invenção refere-se ao uso da pro-teína de fusão de acordo com a presente invenção como um aditivo para alimentos.

[0135]O âmbito adicional da capacidade de aplicação da presente invenção se tornará evidente partindo da descrição detelhada fornecida posteriormente aqui, entretanto, deve ser entendido que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indiquem tal descrição detalhada e exemplos específicos, embora indiquem as modalidades preferidas da invenção, são fornecidos apenas com a finalidade de ilustração, uma vez que várias alterações e modificações dentro do espírito e do âmbito de a invenção se tornarão evidentes para os peritos na arte partindo desta descrição detalhada. Deve ser entendido que tanto a descrição geral anterior quanto a descrição detalhada a seguir são exemplos e explicativas apenas e não são restritivas da invenção, como reivindicado.

[0136]Os exemplos a seguir explicam a presente invenção, mas não são considerados como sendo limitantes. A não ser que seja indicado de maneira diferente, métodos padronizados de biologia molecular foram utilizados, como, por exemplo, descrito por Sambrock e outros, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

[0137]EXEMPLO 1: Clonagem, expressão e purificação de variantes de en-dolisina phiKZgp144 e ELgpgp188 modificados.

[0138]phiKZgp144 como representado na SEQ ID NO: 1 e ELgp188 como representado na SEQ ID NO: 2 são endolisinas modulares que se originam dos fa- gos ΦKZ e EL de Pseudomonas aeruginosa com uma peptideoglicana N-terminal de ligação e um domínio catalítico C-terminal (Briers e outros, 2007).

[0139]Para a amplificação do quadro aberto de leitura (ORF) da PCR de phiKZgp144 e ELgp188 um iniciador a 5’ padronizado (para phiKZgp144: 5’ ATGAAAGTATTACGCAAA 3’ (SEQ ID NO: 83); para ELgp188 5’ ATGAACTTCCGGACGAAG 3’ (SEQ ID NO: 65)) e os iniciadores a 3’ padronizados de acordo com a SEQ ID NO: 81 e 82 foram amplificados (para phiKZgp144: TTTTCTATGTGCTGCAAC (SEQ ID NO: 81); para ELgp188: ATACGAAAT AACGTGACGA (SEQ ID NO: 82)) foram utilizados. Para estender a extremidade a 5’ do quadro aberto de leitura que codifica phiKZgp144 ou ELgp188 com um fragmento gênico que codifica nove resíduos carregados positivamente (Lys-Arg-Lys-Lys-Arg- Lys-Lys-Arg-Lys - SEQ ID NO: 11) uma PCR de cauda com um iniciador a 5’ estendido (para phiKZgp144: 5’ ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAA CGCAAAAAAGTATTACGCAAAG 3’ (SEQ ID NO 79); para ELgp188: 5’ ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAA CGCAAAAACTTCCGGACGAAG 3’ (SEQ ID NO: 80)) e os iniciadores a 3’ padronizados de acordo com a SEQ ID NO: 81 e 82 foram amplificados. O produto da PCR foi clonado no vetor de expressão pEXP5CT/TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) de acordo com o protocolo do fabricante. Os tripletos de arginina foram incorporados além dos tripletos de lisina para evitar a eliminação de tRNA e reduzir o risco de alterações de quadro (os dois únicos tripletos disponíveis para lisina são AAA e AAG, levando a filamentos de A longos). A inserção de cassetes policatiônicos adicionais dentro do sítio de restrição de BamHI planejado aumenta o comprimento da cauda com resíduos catiônicos extras. Esta inserção cria um tripleto de arginina e serina em cada sítio de junção (Figura 1). Até quatro peptídeos policatiônicos foram fundidos tanto ao phiKZgp144 quanto ao ELgp188, denominado (POLY)n-gp144 ou (POLY)n-gp188 (n=1,2,3,4), que compreendem respectivamente 9, 19, 29 e 39 resíduos de aminoácidos carregados postivamente no N-terminal. Consequentemente, as construções a seguir foram expressas em células pLysS de E. coli BL21 (DE3) (células que cresce exponencialmente a 37°C, indução utilizando IPTG a 1 mM, expressão durante 4 h a 37°C):

[0140]As variantes de endolisina modificadas POLY-gp144 (SEQ ID NO: 35), (POLY)2-gp144 (SEQ ID NO: 36), POLY-gp188 (SEQ ID NO: 39) e (POLY)2-gp188 (SEQ ID NO: 40) foram utilizadas para investigações adicionais. As ditas proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade com Ni2+ utilizando o 6xHis-tag C- terminal (Akta Fast Protein Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida de Proteínas Rápida Akta. Os rendimentos totais por litro de cultrua de expressão de E.coli foram determinados através de medida espectrofotométrica da concentração de proteína e o volume total da solução estoque purificada. A purificação dos derivados de gp188 foi realizada sob condições mais rigorosas (65 mM de imidazol) comparos com os derivados de gpl44 (50 mM de imidazol) para garantir alta pureza. Os rendimentos totais por litro da cultura de expressão de E. coli são mostrados na tabela 5.

[0141]Tabela 5 - Rendimentos dos derivados recombinantes da purificação de endolisina por litro de cultura de expressão de E. coli.

[0142]As soluções de estoque purificadas eram ~90% puras. A análise es- pectrométrica de massa de soluções purificadas de POLY-derivados revelou traços da proteína L2 da subunidade ribossomal 50S de E. coli e a 16S rRNA uridina-516 pseudo-uridilato sintase. Todos os derivados de phiKZgp144 exibiam formação de multímeros que poderiam ser convertidos em monômeros através da adição de β- mercaptoetanol, indicando que ligações interdissulfeto causam a multimerização.

[0143]EXEMPLO 2: Atividade antibacteriana de variantes modificados de phiKZgp144 e ELgp188

[0144]Células exponentiais (~106/mL) de P. aeruginosa PAO1p (Pirnay JP e outros (2003), J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202) foram diluídas 100 x (a densidade final era de ~106/mL) e incubadas à temperatura ambiente com cada 10 μg de proteína não dialisada (endolisinas não modificadas phiKZgp144 (SEQ ID NO: 1) e ELpg188 (SEQ ID NO: 2) e variantes de endolisina modificadas POLY-gp144 (SEQ ID NO:35), (POLY)2-gp144 (SEQ ID NO: 36), POLY-gp188 (SEQ ID NO: 39) e (POLY)2-gp188 (SEQ ID NO: 40) a uma concentração final de 100 μg/mL em tampão (20 mM de NaH2PO4-NaOH pH7,4; 0,5 M de NaCl; 0,5 M de imidazol). Após 1 hora as suspensões de células foram diluídas em tampão PBS (10e-5, 10e-4 e 10e-3) e plaqueadas (meio LB padronizado, incubado durante a noite a 37°C). Adicionalmente, um controle negativo contendo células em tampão PBS foi plaqueado. As colônias residuais foram contadas após uma incubação durante a noite. Com base nos números de células contadas a atividade antibacteriana na forma da inativação relativa (%) (=100-(Ni/No)*l00 com N0 = número de células não tratadas e Ni = número de células tratadas) e em unidades logarítimicas (=log10N0/Ni) foi calculada (Tabela 6). Todas as amostras foram repetidas seis vezes. Médias/desvios padrões são representados. A análise estatística foi realizada utilizando um teste t de Student.

[0145]As endolisinas não modificadas phiKZgp144 e ELgp188 não reduzem os números de células de forma significativa comparadas com o controle negativo. Esta observação ilustra a eficácia da membrana externa como uma barreira para a endolisina degraar a parede celular das bactérias Gram-negativas. Em contraste, como mostrado na Tabela 6 a incubação com as endolisinas modificadas POLY- gp144, (POLY)2-gp144, POLY-gp188 e (POLY)2-gp188 causa uma redução significativa (α = 0,05) do número de células bacterianas (99,85 ± 0,09 % para POLY-gp144 e 98,0 ± 0,2% para POLY-gp188). Um aumento do comprimento do peptídeo polica- tiônico tende adicionalmente a reforçar a atividade antibacteriana, especialmente no caso de phiKZgp144 (uma redução de até 99,98 ± 0,02 % ou 3,7 ± 0,3 unidades de log é atingida dentro de 1 hora para (POLY)2-gp144). Além disso, os experimentos demonstraram que as endolisinas modificadas de phiKZgp144 possuem uma atividade antibacteriana maior que as endolisinas modificadas de ELgp188.

[0146]Tabela 6 - Efeito antibacteriano de endolisinas não modificadas e modificadas de variantes phiKZgpl 44 e ELgpl 88.

[0147]Assim, o exemplo demonstrou que a adição de um peptídeo curto de nove resíduos catiônicos no N-terminal em phiKZgp144 (SEQ ID NO: 1) já é suficiente para matar quase 99,9% das células dentro de 1 hora. A Poli-L-Lisina possui atividade antibacteriana intrínseca também, embora esta propriedade tenha sido até agora atribuída apenas aos polímeros de pelo menos 20 resíduos (Vaara e Vaara, 1983a, 1983b). Entretanto, a ação combinada do peptídeo policatiônico e a endolisina mata as células.

[0148]Em um experimento adicional a endolisina modificada POLY-gp144 foi submetida à diálise a 50 mM de KH2PO4/K2HPO4 pH 7 e utilizada ao invés da solução de proteína não dialisada como descrito anteriormente. Dessa maneira, o nível de inativação foi adicionalmente aumentado de 2,9 ± 0,3 unidades de log até 3,9 ± 0,2 unidades de log.

[0149]EXEMPLO 3: Expressão de variantes modificados de phiKZgp144 e ELgp188 em Pichia pastoris como um hospedeiro para a produção recombinante não tóxica

[0150]O quadro aberto de leitura que codifica POLY-gp144 (SEQ ID NO: 35) foi clonado no vetor bifuncional pPICZαA (Invitrogen), que foi subsequentemente integrado no genoma de P. pastoris através de recombinação homóloga (como indicado pelo fabricante; células de P. pastoris X33, Invitrogen). A expressão gênica foi induzida com metanol (1%) em meio BMMY e o sobrenadante foi analisado em relação à presença de atividade enzimática após 1, 3 e 4 dias. Portanto, uma quantidade de 30 μL sobrenadante da cultura de expressão de P. pastoris foram adicionados a 270 μL de células de P. aeruginosa PAO1p permeabilizadas com clorofórmio (Pir- nay JP e outros (2003), J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202) após 1, 3 e 4 dias (condição de tampão: KH2PO4/K2HPO4 I = 120 mM pH 6,2). Subsequentemente, a densidade óptica foi registrada de forma espectrofotométrica (Figura 2). Uma queda na densidade óptica indica a secreção de uma enzima muralítica por P. pastoris. Como um controle negativo, P. pastoris X33 sem plasmídeo de expressão foi incluída. Assim, a lise do substrato após a adição da amostra do sobrenadante é uma medida para a produção recombinante bem sucedida e para a secreção de POLY-gp144 (SEQ ID NO: 35) por P. pastoris. Após 1 dia, uma atividade enzimática limitada podia ser detectada. A atividade máxima foi observada após 3 dias uma vez que nenhum decréscimo significativo da atividade nos sobrenadantes foi observado no quarto dia. Nenhum efeito tóxico sobre a densidade celular de P. pastoris foi observado.

[0151]Durante a expressão por P. pastoris a secreção do sinal α do vetor causa a secreção da proteína recombinante no meio circundante, o que permite uma purificação simplificada uma vez que apenas um número limitado de outras proteínas é secretado. Um sítio de restrição de BamHI na extremidade a 5’ dos quadros abertos de leitura possibilita a adição de mais cassetes que codificam peptídeos po- licatiônicos adicionais.

[0152]EXEMPLO 4: Variantes de endolisina phiKZgp144 adicionalmente modificadas com peptídeos policatiônicos diferentes

[0153]Para testar e para comparar o potencial de peptídeos policatiônicos foram sintetizadas variantes de phiKZgp144 e outros genes que codificam endolisina que possuem peptídeos policatiônicos diferentes na extremidade N-terminal da proteína. A variação peptídica refere-se ao comprimento, à composição e à inserção de sequências ligantes. Por um lado peptídeos policatiônicos adicionais que possuem vários N-terminais do motivo KRK foram produzidos. Por outro lado os peptídeos policatiônicos que consistem apenas de arginina (R) ou lisina (K) foram produzidos. Além disso, para aumentar a tradução de peptídeos policatiônicos longos, peptídeos policatiônicos que compreendem uma sequência ligante foram produzidos.

[0154]Os produtos diferentes foram clonados no vetor de expressão pET32b (Novagen, Darmstadt, Alemanha). pET32b foi utilizado para reduzir a toxicidade po-tencial do peptídeo policatiônico contra o hospedeiro E. coli. Uma proteína de fusão codificada pelo vetor (tiorredoxina), mascara o peptídeo policatiônico e pode ser eli-minada durante o processo de purificação.

[0155]Consequentemente, as variantes a seguir de endolisina modificadas foram expressas em células de E. coli BL21 (DE3) a 37°C até uma densidade óptica de DO600nm=0,6 ser atingida. Então a expressão da proteína foi induzida com 1 mM de IPTG (concentração final) e a expressão foi realizada durante quatro horas. Então as células de E. coli foram coletadas por centrifugação durante 20 min em 6000g e o rompimento celular e a purificação de proteína foram realizados de acordo com o kit de purificação S-tag (Novagen, Darmstadt, Alemanha):

[0156]Todas as proteínas foram purificadas utilizando o S-Tag™ rEK Purification Kit (Novagen, Darmstadt, Alemanha). Utilizando o vetor pET32b, as proteínas expressas não eram tóxicas para o hospedeiro resultando em altos rendimentos da proteína produzida. Soluções estoque purificadas exibiam alta pureza.

[0157]Células exponentiais (~106/mL) de P. aeruginosa PAO1p (Isolado de ferimento causado por queimadura, Queen Astrid Hospital, Bruxelas; Pirnay JP e outros (2003), J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202) foram diluídas 100 x (a densidade final era de ~106/mL) incubadas à temperatura ambiente com cada 10 μg de proteína não dialisada que são listadas anteriormente a uma concentração final de 100 μg/mL em tampão (20 mM de NaH2PO4-NaOH pH7,4; 0,5 M de NaCl; 0,5 M de imidazol). Após 1 hora as suspensões de células foram diluídas 1:100 e plaqueadas em LB. Adicionalmente, um controle negativo foi plaqueado utilizando tampão (20 mM de NaH2PO4-NaOH pH7,4; 0,5 M de NaCl; 0,5 M de imidazol). As colônias residuais foram contadas após uma incubação durante a noite a 37°C. Com base nos números de células contadas a atividade antibacteriana na forma da inativação relativa (%) (=100-(Ni/No)*l00 com N0 = número de células não tratadas e Ni = número de células tratadas) foi calculada (Tabela 7). Todas as amostras foram repetidas pelo menos quatro vezes.Tabela 7 - Efeito antibacteriano de endolisinas não modificadas e modificadas phiKZgp144 e ELgp188

[0158]phiKZgp144 não modificada não reduz os números de células de forma significativa comparada com o controle negativo. Além disso, variantes de phiKZgp144 modificadas que carregam um peptídeo policatiônico com vários N- terminais do motivo KRK aumentam o efeito antimicrobiano enormemente. Entretanto, ainda variantes que possuem um peptídeo homômero de lisina ou arginina mostram redução significativa de células comparadas com phiKZgp144 não modificada como é medido. Além disso, também a variante que possui um peptídeo policatiôni- co de 38 resíduos de aminoácidos e que compreende uma sequência ligante aumenta o efeito antimicrobiano enormemente.

[0159]EXEMPLO 5: Variantes de endolisina modificadas de fago PSP3 de Salmonella typhimurium

[0160]PSP3gp10 de acordo com a SEQ ID NO: 8 é uma endolisina globular com 165 resíduos de aminoácidos que se origina do fago PSP3 de Salmonella typhimurium com um domínio de muramidase similar a lambda catalítico. Como previsto através das análises de BLASTp e Pfam a endolisina PSP3gp10 compreende seu domínio catalítico na faixa de aproximadamente o resíduo de aminoácido 34 até aproximadamente o resíduo de aminoácido 152.

[0161]O DNA genômico purificado de fago PSP3 foi utilizado como um molde para a amplificação do quadro aberto de leitura (ORF) de PSP3gp10 em uma reação Hot Start Taq polimerase PCR (Qiagen, Alemanha) utilizando os parâmetros dePCR a seguir:

[0162]Para a dita PCR um iniciador a 5’ padronizado (5’ ATGGGATCCCCGGTCATTAATACTCACCAG 3’ (SEQ ID NO: 50)) e um iniciador a 3’ padronizado (5’ TGCCATCACCCCGCCAGCCGTG 3’ (SEQ ID NO: 51)) foram utilizados. Para estender a extremidade a 5’ do ORF which codifica PSP3gp10 com um fragmento gênico que codifica o peptídeo policatiônico de 9-mer Lys-Arg-Lys- Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys (SEQ ID NO: 11) uma PCR de cauda (Hot Start Taq poli- merase PCR com os mesmos parâmetros) com um iniciador a 5’ estendido (5’ ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGCAAACCGGTCATTAATACTCACCAG 3’ (SEQ ID NO: 52)) e o iniciador a 3’ padronizado de acordo com a SEQ ID NO: 51 foi aplicada. Tanto o fragmento de PCR de PSP3gp10 não modificado original quanto o fragmento estendido por PK foram ligados no vetor de expressão pEXP5CT/TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) seguindo o protocolo de clonagem TA do fabricante.

[0163]A expressão recombinante de PSP3gp10 de acordo com a SEQ ID NO: 8 e PKPSP3gp10 de acordo com a SEQ ID NO: 53 é realizada em células E. coli BL21 (ÀDE3) pLysS em crescimento exponencial (Invitrogen) após a indução com 1 mM de IPTG (isopropiltiogalactosídeo) a 37°C durante um período de 4 horas. Ambas as proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade com Ni2+ (Akta FPLC, GE Healthcare) utilizando o 6xHis-tag C-terminal, codificado pelo vetor de expressão pEXP5CT/TOPO®. A cromatografia de afinidade com Ni2+ é realizada em 4 etapas subsequentes, todas à temperatura ambiente: 1.Equilíbrio da coluna Histrap HP de 1 mL (GE Healthcare) com 10 volumes da coluna do Tampão de Lavagem (60 mM de imidazol, 0,5 mM de NaCl e 20 mM de NaH2PO4-NaOH em pH 7,4) a uma vazão de 0,5 mL/min. 2.Carregamento do lisado total (com a endolisina desejada) na coluna His- trap HP de 1 mL a uma vazão de 0,5 mL/min. 3.Lavagem da coluna com 15 volumes da coluna de Tampão de Lavagem a uma vazão de 1 mL/min. 4.Elution de endolisina ligada partindo da coluna com 10 volumes da coluna de Tampão de Eluição (500 mM de imidazol, 5 mM de NaCl e 20 mM de NaH2PO4- NaOH em pH 7,4) a uma vazão de 0,5 mL/min.

[0164]Os rendimentos totais de ambas as proteínas recombinantes purificadas por litro de cultura de expressão de E.coli são mostrados na tabela 8. Os valores foram determinados através da medida espectrofotométrica da concentração de proteína e do volume total da solução estoque purificada em um comprimento de onda de 280 nm. As soluções estoque purificadas que consistem de PSP3gp10 e PKPSP3gp10, respectivamente, em tampão de eluição (20 mM de NaH2PO4-NaOH pH7,4; 0,5 M de NaCl; 500 mM de imidazol) eram pelo menos 90% puras como determinado visualmente nos géis de SDS-PAGE.Tabela 8 - Rendimentos de endolisina PSP3gp10 recombinante purificada e sua variante modificada PKPSP3gp10 por litro de cultura de expressão de E. coli.

[0165]Para determinar o espectro anti Gram-negativas da endolisina PKPSP3gp10 de acordo com a SEQ ID NO: 53, uma combinação de 1,315 μM de endolisina PKPSP3gp10 e 0,5 mM de EDTA foi testada sobre as cepas clínicas de P. aeruginosa PAO1p e Br667, Escherichia coli WK6 e Salmonella typhimurium (ver a Tabela 9). As células bacterianas em crescimento exponencial (DO600nm de 0,6) foram diluídas 100 vezes até uma densidade final de aproximadamente 106/mL de cada cepa foram incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente sem agitação com endolisina não modificada PSP2gp10 (SEQ ID NO: 8) e endolisina modificada PKPSP3gp10 (SEQ ID NO: 53) cada uma em combinação sem e com 0,5 mM de EDTA. Para a incubação, as endolisinas foram utilizadas cada uma em tampão (20 mM de NaH2PO4-NaOH pH7,4; 0,5 M de NaCl; 0,5 M de imidazol) e a incubação ocorreu a uma concentração final de endolisina de 1,315 μM. Como um controle cada cepa também foi incubada durante 30 minutos com 0,5 mM de EDTA (no same tampão que é descrito anteriormente), mas sem endolisina. Tabela 9 - Lista de cepas Gram-negativas utilizadas

[0166]Após a incubação as suspensões de células foram diluídas três vezes (respectivamente 105-104-103 células/mL) e 100 μL de cada diluição foram plaquea- dos em meio LB. As colônias residuais foram contadas após uma incubação durante a noite a 37°C. Com base nos números de células contadas a atividade antibacteria- na na forma da inativação relativa em unidades logarítimicas (=log10N0/Ni com N0 = número de células não tratadas e Ni = número de células tratadas) foi calculada (Tabela 10).Tabela 10 - Atividade antibacteriana da endolisina não modificada (PSP3gp10) e sua variante de endolisina modificada (PKPSP3gp10) com e sem EDTA-Na2 em espécies Gram-negativas com crescimento exponencial diferente.

[0167]Todas as amostras foram repetidas três vezes. As médias +/- desvios padrões são representadas. A redução máxima observada é dependente do nível de detecção de 10 células/mL e da densidade celular inicial. Para PAO1p, EDTA funci-ona de forma sinérgica com tanto a PSP3gp10 endolisina não modificada quanto sua variante modificada PKPSP3gp10.

[0168]EXEMPLO 6: Variantes de endolisinas modificadas de fago P2 de Es-cherichia coli

[0169]P2gPO9 de acordo com a SEQ ID NO: 9 é uma endolisina globular de 165 resíduos de aminoácidos que se origina do fago P2 de Escherichia coli com um domínio de muramidase similar a lambda catalítico. Como previsto pelas análises de BLASTp e Pfam a P2gPO9 endolisina compreende seu domínio catalítico na faixa de aproximadamente o resíduo de aminoácido 34 até aproximadamente o resíduo de aminoácido 152.

[0170]O DNA genômico purificado de fago P2 foi utilizado como um molde para a amplificação do quadro aberto de leitura (ORF) de P2gPO9 na reação de PCR padronizada com Pfu polimerase (Fermentas) utilizando os parâmetros de PCR a seguir:

[0171]Para a dita PCR um iniciador a 5’ padronizado (5’ ATGGGATCCCCGGTAATTAACACGCATC 3’ (SEQ ID NO: 54)) e um iniciador a 3’ padronizado (5’ AGCCGGTACGCCGCCAGCGGTACGC 3’ (SEQ ID NO: 55)) foram utilizados. Para estender a extremidade a 5’ do ORF que codifica P2gPO9 com um fragmento gênico que codifica o peptídeo policatiônico de 9-mer Lys-Arg-Lys-Lys- Arg-Lys-Lys-Arg-Lys (SEQ ID NO: 11) uma PCR de cauda (com os mesmos parâmetros que a PCR padronizada anterior) com um iniciador a 5’ estendido (5’ ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGC AAACCGGTAATTAACACGCATC 3’ (SEQ ID NO: 56) e o iniciador a 3’ padronizado de acordo com a SEQ ID NO 55 foi aplicada. Tanto o fragmento de PCR de P2gPO9 não modificado original quanto o fragmento estendido foram ligados no vetor de expressão pEXP5CT/TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) seguindo o protocolo de clonagem TA do fabricante.

[0172]A expressão recombinante de P2gPO9 de acordo com a SEQ ID NO: 9 e PKP2gPO9 de acordo com a SEQ ID NO: 57 é realizada em células de E. coli BL21 (ÀDE3) pLysS com crescimento exponencial (Invitrogen) após a indução com 1 mM de IPTG (isopropiltiogalactosídeo) a 37°C durante um período de 4 horas. Ambas as proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade com Ni2+ (Akta FPLC, GE Healthcare) utilizando o 6xHis-tag C-terminal, codificado pelo vetor de expressão pEXP5CT/TOPO®. A cromatografia de afinidade com Ni2+ é realizada em 4 etapas subsequentes, todas à temperatura ambiente: 1.Equilíbrio da coluna Histrap HP de 1 mL (GE Healthcare) com 10 volumes da coluna de Tampão de Lavagem (60 mM de imidazol, 0,5 mM de NaCl e 20 mM de NaH2PO4-NaOH em pH 7,4) a uma vazão de 0,5 mL/min. 2.Carregamento do lisado total (com a endolisina desejada) na coluna His- trap HP de 1 mL a uma vazão de 0,5 mL/min. 3.Lavagem da coluna com 15 volumes da coluna de Tampão de Lavagem a uma vazão de 1 mL/min. 4.Eluição da endolisina ligada da coluna com 10 volumes da coluna de Tam-pão de Eluição (500 mM de imidazol, 5 mM de NaCl e 20 mM de NaH2PO4-NaOH em pH 7,4) a uma vazão de 0,5 mL/min.

[0173]Os rendimentos totais de ambas as proteínas recombinantes purificadas por litro cultura de expressão de E.coli são mostrados na tabela 11. Os valores foram determinados através da medida espectrofotométrica da concentração de proteína e do volume total da solução estoque purificada em um comprimento de onda de 280 nm. As soluções estoque purificadas que consistem de P2gPO9 e PKP2gPO9, respectivamente, em tampão de eluição (20 mM de NaH2PO4-NaOH pH7,4; 0,5 M de NaCl; 500 mM de imidazol) eram pelo menos 95% puras como determinado visualmente nos géis de SDS-PAGE.Tabela 11 - Rendimentos de endolisina P2gPO9 recombinante purificada e seu derivado PKP2gPO9 modificado com PK por litro de cultura de expressão de E. coli.

[0174]Para determinar o espectro anti Gram-negativas da PK2gPO9 endoli-sina de acordo com a SEQ ID NO: 57, uma combinação de 1,315 μM de PK2gPO9 endolisina e 0,5 mM de EDTA foi testada nas cepas clínicas de P. aeruginosa PAO1p e Br667, Burkholderia pseudomallei, Pseudomonas putida G1 e em Escherichia coli WK6 (ver a Tabela 13). As células bacterianas em crescimento exponencial (DO600nm de 0,6) foram diluídas 100 vezes até uma densidade final de aproximadamente 106/mL de cada cepa foram incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente sem agitação com endolisina não modificada P2gPO9 (SEQ ID NO: 9) e endolisina modificada PKP2gPO9 (SEQ ID NO: 57) cada uma em combinação sem e com 0,5 mM de EDTA. Para a incubação, as endolisinas foram utilizadas cada uma em tampão (20 mM de NaH2PO4-NaOH pH7,4; 0,5 M de NaCl; 0,5 M de imi- dazol) e a incubação ocorreu a uma concentração final de endolisina de 1,315 μM. Como um controle cada cepa também foi incubada durante 30 minutos com 0,5 mM de EDTA (no mesmo tampão que é descrito anteriormente), mas sem endolisina. Após a incubação as suspensões de células foram diluídas três vezes (respectivamente 105-104-103 células/mL) e 100 μL de cada diluição foram plaqueados em meio LB. As colônias residuais foram contadas após uma incubação durante a noite a 37°C. Com base nos números de células contadas a atividade antibacteriana na forma da inativação relativa em unidades logarítimicas (=log10N0/Ni com N0 = número de células não tratadas e Ni = número de células tratadas, ambos contados após a incubação) foi calculada (Tabela 12).Tabela 12 - Atividade antibacteriana de endolisina não modificada (P2gPO9) e sua variante de endolisina modificada (P2gPO9) com e sem EDTA-Na2 sobre espécies Gram-negativas em crescimento exponencial diferente.

[0175]Todas as amostras foram repetidas três vezes. As médias +/- desvios padrões são representadas. A redução máxima observada é dependente do nível de detecção de 10 células/mL e da densidade celular inicial.Tabela 13 - Lista de cepas Gram-negativas utilizadas

*Pirnay JP e outros, (2003). Molecular epidemiology of Pseudomonas aeruginosacolonization in a burn unit: persistence of a multidrug-resistant clone and a silver sulfadiazine-resistant clone. J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202.

[0176]EXEMPLO 7: Variantes de endolisina modificadas de fago OBP de Pseudomonas putida

[0177]OBPgpLYS de acordo com a SEQ ID NO: 7 é uma endolisina modular de 328 resíduos de aminoácidos que se origina do fago OBP de Pseudomonas puti- da com supostos domínios que se ligam à peptideoglicana N-terminal e um domínio de quitinase catalítica C-terminal. Como previsto através das análises de BLASTp e Pfam a OBPgpLYS endolisina compreende seu domínio catalítico na faixa de apro-ximadamente o resíduo de aminoácido 126 até aproximadamente o resíduo de ami- noácido 292 e o domínio de ligação à peptideoglicana N-terminal na faixa de apro-ximadamente os resíduos de aminoácidos 7 até 96.

[0178]O DNA genômico purificado de fago OBP foi utilizado como um molde para a amplificação do quadro aberto de leitura (ORF) de OBPgpLYS na reação de PCR padronizada com Pfu polimerase (Fermentas, Ontario, Canadá) utilizando os parâmetros de PCR a seguir:

[0179]Portanto, um iniciador a 5’ padronizado (5’ ATGAAAAATAGCGAGAAGAAT 3’ (SEQ ID NO: 58)) e um iniciador a 3’ padronizado (5’ AACTATTCCGAGTGCTTTCTTTGT 3’ (SEQ ID NO: 59)) foram utilizados. Para estender a extremidade a 5’ do ORF que codifica OBPgpLYS com um fragmento gênico que codifica o peptídeo policatiônico de 9-mer Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys- Arg-Lys- (SEQ ID NO: 11) uma PCR de cauda (com os mesmos parâmetros que a PCR padronizada anterior) com um iniciador a 5’ estendido (5’ ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGCAAAAAAAATAGCGAG AAGAAT 3’ (SEQ ID NO: 60)) e o iniciador a 3’ padronizado de acordo com a SEQ ID NO 59 foi aplicada. Tanto o fragmento de OBPgpLYS não modificada original quanto o fra-gmento estendido foram ligados no vetor de expressão pEXP5CT/TOPO® (Invitro- gen, Carlsbad, CA, USA) seguindo o protocolo de clonagem TA do fabricante.

[0180]A expressão recombinante de OBPgpLYS de acordo com a SEQ ID NO: 7 e PKOBPgpLYS de acordo com a SEQ ID NO: 61 é realizada em células de E. coli BL21 (ÀDE3) pLysS (Invitrogen) com crescimento exponencial após a indução com 1 mM de IPTG (isopropiltiogalactosídeo) a 37°C durante um período de 4 horas. Ambas as proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade com Ni2+ (Akta FPLC, GE Healthcare) utilizando o 6xHis-tag C-terminal, codificado pelo vetor de expressão pEXP5CT/TOPO®. A cromatografia de afinidade com Ni2+ é realizada em 4 etapas subsequentes, todas à temperatura ambiente: 1.Equilíbrio da coluna Histrap HP de 1 mL (GE Healthcare) com 10 volumes da coluna de Tampão de Lavagem (60 mM de imidazol, 0,5 mM de NaCl e 20 mM de NaH2PO4-NaOH em pH 7,4) a uma vazão de 0,5 mL/min. 2.Carregamento do lisado total (com a endolisina desejada) na coluna His- trap HP de 1 mL a uma vazão de 0,5 mL/min. 3.Lavagem da coluna com 15 volumes da coluna de Tampão de Lavagem a uma vazão de 1 mL/min. 4.Eluição da endolisina ligada da coluna com 10 volumes da coluna de Tam-pão de Eluição (500 mM de imidazol, 5 mM de NaCl e 20 mM de NaH2PO4-NaOH em pH 7,4) a uma vazão de 0,5 mL/min.

[0181]Os rendimentos totais de ambas as proteínas recombinantes purificadas por litro de cultura de expressão de E. coli são mostrados na tabela 14. Os valores foram determinados através da medida espectrofotométrica da concentração de proteína e do volume total da solução estoque purificada em um comprimento de onda de 280 nm. As soluções estoque purificadas que consistem de OBPgpLYS e PKOBPgpLYS, respectivamente, em tampão de eluição (20 mM de NaH2PO4-NaOH pH7,4; 0,5 M de NaCl; 500 mM de imidazol) eram pelo menos 90% puras como de-terminado visualmente nos géis de SDS-PAGE.Tabela 14 - Rendimentos de OBPgpLYS endolisina recombinante purificada e seu derivado de PKOBPgpLYS modificado com PK por litro cultura de expressão de E. coli.

[0182]Para determinar o espectro anti Gram-negativas da PKOBPgpLYS en-dolisina de acordo com a SEQ ID NO: 61, uma combinação de 1,313 μM de PK OB- PgpLYS endolisina e 0,5 mM de EDTA foi testada sobre a cepa de P. aeruginosa Br667 multirresistente clínica, Pseudomonas putida G1 (hospedeira de fago OBP) e uma faixa de outros agentes patogênicos Gram-negativos (Escherichia coli WK6, Salmonella typhimurium LT2 e Burkholderia pseudomallei) (ver a Tabela 16). As cé-lulas bacterianas em crescimento exponencial (DO600nm de 0,6) foram diluídas 100 vezes até uma densidade final de aproximadamente 106/mL de cada cepa foram in-cubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente sem agitação com endolisina não modificada OBPgpLYS (SEQ ID NO: 7) e endolisina modificada PKOBPgpLYS (SEQ ID NO: 61) cada uma em combinação sem e com 0,5 mM de EDTA. Para a incubação, as endolisinas foram utilizadas cada uma em tampão (20 mM de NaH2PO4-NaOH pH7,4; 0,5 M de NaCl; 0,5 M de imidazol) e a incubação ocorreu a uma concentração final de endolisina de 1,313 μM. Como um controle cada cepa também foi incubada durante 30 minutos com 0,5 mM de EDTA (no mesmo tampão que é descrito anteriormente), mas sem endolisina. Após a incubação as suspensões de células foram diluídas três vezes (respectivamente 105-104-103 células/mL) e 100 μL de cada diluição foram plaqueados em meio LB. As colônias residuais foram contadas após uma incubação durante a noite a 37°C. Com base nos números de células contadas a atividade antibacteriana na forma da inativação relativa em unidades logarítimicas (=log10N0/Ni com N0 = número de células não tratadas e Ni = número de células tratadas, ambos contados após a incubação) foi calculada (Tabela 15). Todas as amostras foram repetidas três vezes. As médias +/- desvios pa-drões são representadas. A redução máxima observada é dependente do nível de detecção de 10 células/mL e da densidade celular inicial.

[0183]Tabela 15 - Atividade antibacteriana de endolisina não modificada (OBPgpLYS) e sua variante de endolisina modificada (PKOBPgpLYS) com e sem EDTA-Na2 sobre espécies Gram-negativas em crescimento exponencial diferente.

Tabela 16 - Lista de cepas Gram-negativas utilizadas

*Pirnay JP, De Vos D, Cochez C, Bilocq F, Pirson J, StruelensM, Duinslaeger L,Cornelis P, Zizi M, Vanderkelen A. (2003). Molecular epidemiology of Pseudomonas aeruginosa colonization in a burn unit: persistence of a multidrug-resistant clone and a silver sulfadiazine-resistant clone. J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202.

[0184]Embora a eficácia global do tratamento com OBPgpLYS seja depen-dente da espécie, os resultados na tabela 16 mostram um efeito adicoinado da PKOBPgpLYS comparada com a OBPgpLYS não modificada para todas as espécies de bactérias testadas, tanto na ausência quanto na presença de 0,5 mM de EDTA. Para as espécies de Pseudomonas e Burkholderia, um efeito sinérgico evidente com EDTA é observado para a atividade de PKOBPgpLYS.

[0185]EXEMPLO 8: Efeito de concentração de EDTA diferente sobre a ativi-dade antibacteriana de OBPgpLYS e PKOBPgpLYS

[0186]Para determinar a influência de EDTA sobre a atividade antibacteriana de endolisinas não modificadas e modificadas a atividade antibacteriana da endolisi-na OBPgpLYS não modificada (SEQ ID NO: 7) e da endolisina PKOBPgpLYS (SEQ ID NO: 61) foi testada sobre células de Pseudomonas aeruginosa PAO1p (Pirnay JP e outros J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202 (2003)) utilizando concentrações diferentes de EDTA e endolisinas. As células bacterianas em crescimento exponencial (DO600nm de 0,6) foram diluídas 100 vezes até uma densidade final de aproxima-damente 106/mL e incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente sem agi-tação com endolisina não modificada OBPgpLYS (SEQ ID NO: 7) e endolisina modi-ficada PKOBPgpLYS (SEQ ID NO: 61). Para a incubação, as endolisinas foram utili-zadas cada uma em tampão (20 mM de NaH2PO4-NaOH pH7,4; 0,5 M de NaCl; 0,5 M de imidazol) a concentrações finais de endolisina de 0,013 μM, 0,131 μM e 1,315 μM. Dessa maneira, as concentrações de EDTA diferentes a seguir foram utilizadas: 0 mM, 0,05 mM, 0,5 mM de E 10 mM. Como um controle uma amostra também foi incubada durante 30 minutos sem endolisina, ao invés disso, tinha tampão (20 mM de NaH2PO4-NaOH pH7,4; 0,5 M de NaCl; 0,5 M de imidazol) adicionado. Após a incubação as suspensões de células foram diluídas três vezes (respectivamente 105-104-103 células/mL) e 100 μL de cada diluição foram plaqueados no meio LB. As co-lônias residuais foram contadas após uma incubação durante a noite on 37°C. Com base nos números de células contadas a atividade antibacteriana na forma da inati- vação relativa em unidades logarítimicas (=log10N0/Ni com N0 = número de células não tratadas e Ni = número de células tratadas, ambos contados após a incubação) foi calculada (Tabela 17). Todas as amostras foram repetidas três vezes. As médias +/- desvios padrões são representadas. A redução máxima observada (5,69 unidades de log) é dependente do nível de detecção de 10 células/mL e da densidade celular inicial. “Δ“ fornece a diferença de atividade entre as respectivas amostras de OBPgpLYS e PKOBPgpLYS.Tabela 17 - Atividade antibacteriana de endolisina não modificada (OBPg- pLYS) e sua variante de endolisina modificada (PKOBPgpLYS) em combinação com concentrações diferentes de EDTA sobre células de Pseudomonas aeruginosaPAO1p em crescimento exponencial

[0187]Como mostrado na Tabela 17 a endolisina não modificada OBPgpLYS reduz os números de células de forma significativa com mais de 2,5 unidades de log para 1,315 μM e com +/- 1 unidade de log para 0,013 μM, comparada com o controle negativo. A endolisina modificada PKOBPgpLYS resulta em uma redução de 0,5 unidade de log adicionada para as células PAO1p com crescimento exponencial. O efeito antibacteriano observado pode ser increased até mais que uma redução de 5,69 unidades de log (abaixo do nível de detecção) através da combinação de PKO- BPgpLYS com o permeabilizador de membrana externa EDTA-Na2 a uma concen-tração de 0,5 e 10 mM de EDTA. A diferença na atividade entre a OBPgpLYS não modificada e a OBPgpLYS modificada com PK aumenta através da elevação da quantidade de endolisina adicionada (de 0,013 - 1,315 μM de endolisina).

EXEMPLO 9: Atividade antibacteriana de variantes de phiKZgp144 modifica-das sobre bactérias Gram-negativas diferentes

[0188]Para testar e para comparar o potencial de peptídeos policatiônicos variantes de phiKZgp144 e outras endolisinas, foram sintetizados genes codificado- res que possuem peptídeos policatiônicos na extremidade N-terminal da proteína.

[0189]Os produtos diferentes foram clonados no vetor de expressão pET32b (Novagen, Darmstadt, Alemanha). pET32b foi utilizado para reduzir a toxicidade po-tencial do peptídeo policatiônico contra o hospedeiro de E. coli. Uma proteína de fusão codificada pelo vetor (tiorredoxina), mascara o peptídeo policatiônico e pode ser eliminada durante o processo de purificação.

[0190]Os genes que codificam smi01 (YP_001712536) e KRK9_smi01 (SEQ ID NO: 75) foram totalmente sintetizados (Entelechon, Regensburg, Alemanha) e clonados no pET32b.

[0191]Consequentemente, as variantes a seguir de endolisina modificadas foram expressas em células de E. coli BL21 (DE3) a 37°C até uma densidade óptica de DO600nm=0,6 ser atingida: smi01 (YP_001712536), KRK9_smi01 (SEQ ID NO: 75), phiKZgp144 (SEQ ID NO: 1), pKKZ144pET32b (SEQ ID NO: 43) e POLIKZ144 (SEQ ID NO: 35). A expressão da proteína foi induzida com IPTG a 1 mM (concen-tração final) e a expressão foi realizada durante quatro horas. Então as células de E.coli foram coletadas por centrifugação durante 20 min em 6000g e o rompimento celular e a purificação de proteína foram realizados utilizando o S-Tag™ rEK Purifica-tion Kit (Novagen, Darmstadt, Alemanha). Utilizando o vetor pET32b, as proteínas expressas não eram tóxicas para o hospedeiro resultando em altos rendimentos de proteína produzida. As soluções estoque purificadas exibiam alta pureza.

[0192]Para o teste e como referência para comparação phiKZgp144 e PO- LIgp144 foram sintetizadas e purificadas como descrito no EXEMPLO 1.

[0193]Células em crescimento exponencial (~106/mL) de P. aeruginosa PAO1p (Isolada de ferimento causado por queimadura, Queen Astrid Hospital, Bru-xelas; Pirnay JP e outros (2003), J Clin Microbiol., 41(3):1192-1202), Acinetobacter baumannii (DSMZ 30007) ou Burkholderia solanaceum (Isolado fornecido pelo Prof. C. Michiels) foram diluídas 100 x (a densidade final era de ~106/mL) incubadas à temperatura ambiente com cada 10 μg de proteínas não dialisadas que são listadas anteriormente a uma concentração final de 100 μg/mL em tampão (20 mM de NaH2PO4-NaOH pH7,4; 0,5 M de NaCl; 0,5 M de imidazol). Após 1 hora as suspen-sões de células foram diluídas 1:100 e plaqueadas em LB. Adicionalmente, um con-trole negativo foi plaqueado utilizando tampão (20 mM de NaH2PO4-NaOH pH7,4; 0,5 M de NaCl; 0,5 M de imidazol). As colônias residuais foram contadas após uma incubação durante a noite a 37°C. Com base nos números de células contadas a atividade antibacteriana na forma da inativação relativa (%) (=100-(Ni/No)*l00 com N0 = número de células não tratadas e Ni = número de células tratadas) foi calculada (Tabela 18). Todas as amostras foram repetidas pelo menos quatro vezes.Tabela 18 - Efeito antibacteriano de variantes de endolisina modificadas diferentes(números do NCBI enlre parênteses) sobre espécies de bactérias diferentes

[0194]As endolisinas não modificadas phiKZgp144 e smi01 (YP_001712536) não reduzem os números de células de forma significativa comparadas com o controle negativo. Esta observação ilustra novamente a eficácia da membrana externa como uma barreira para a endolisina degradar a parede celular das bactérias Gram- negativas. Em contraste como mostrado na Tabela 18 a incubação com as endolisinas modificadas KRK9_smi01, pKKZ144pET32b e POLY-gp144 causa uma redução significativa do número de células bacterianas sobre Acinetobacter baumannii (50% para KRK_smi01; 99,9 % para pKKZ144pET32b), Pseudomonas aeruginosa (9099,9 % para pKKZ144pET32b) e Burkholderia solanaceum (90 - 99,9 % paraPOLIKZ144).

[0195]Estes experimentos demonstram a aplicabilidade da abordagem de fusão de catiônicos/policatiônicos para outras endolisinas. Além disso, os experi-mentos demonstravam que as endolisinas modificadas são ativas sobre uma varie-dade de bactérias.

EXEMPLO 10: Redução de biofilme de Pseudomonas aeruginosa

[0196]No presente experimento a atividade antimicrobiana das variantes de endolisina modificadas SMAP29-KZ144 e PK-OBP, das endolisinas OBP e KZ144 e do peptídeo PK foi testada contra o biofilme das cepas 2572 e 2573 de Pseudomonas aeruginosa.

[0197]A redução de biofilme foi quantificada utilizando ensaio de cristal viole-ta (Peeters e outros, J Microbiol Methods 72: 157-165 (2008)).

Formação de biofilme:

[0198]Culturas líquidas realizadas durante a noite de uma cepa mucóide de Pseudomonas aeruginosa 2572 (isolado do paciente), Pseudomonas aeruginosa 2573 e uma E. coli BL21(DE3) não mucóide foram diluídas até DO600 = 0,1. Uma placa de 96 poços de polistireno foi inoculada com 100 μL de cultura/poço. Após in-cubação durante 4 h a 37°C o sobrenadante foi descartado e as bactérias aderentes foram lavadas utilizando 100 μL de solução salina fisiológica (PS). Os poços inocu-lados foram preenchidos com 100 μL de meio LB líquido e incubados ao longo de um período adicional de 24 h. Após o descarte do sobrenadante o biofilme desenvolvido foi lavado novamente com 100 μL de PS.

Tratamento do biofilme:

[0199]O biofilme foi tratado utilizando 50 μg/po^o de PKKZ144 ou 20 μg/po^o de alginato liase ou 50 μg/po^o de SMAP29-KZ144 e KZ144 ou 25 μg/po^o de PK-OBP e OBP ou 1,25 μg de peptídeo PK (todos em tampão com 500mM de NaCl) diluídos uma parte para uma parte de 2x meio LB (sem NaCl) e incubados durante 12 h. A série não tratada foi realizada como controles negativos (uma parte de tampão de proteína para uma parte de 2x LB sem NaCl). Após o descarte do so- brenadante o biofilme desenvolvido foi novamente lavado com 100 μL de PS.

Quantificação do biofilme:

[0200]O biofilme lavado foi fixado com 300 μL de metanol (99%; 15 min) e seco no ar. A coloração foi realizada utilizando 100 μL de cristal violeta a 0,3%. Após 20 min os poços foram lavados com água da torneira e 300 μL de ácido acético a 33% foram utilizado dissolvendo o cristal violeta ligado da matriz extracelular do bio- filme. Após 20 min uma diluição de 1:10 foi feita e a absorção (590 nm) foi medida.

[0201]A análise estatística mostrou uma redução massiva do biofilme detec-tada utilizando PKKZ144 comparada com inoculados tratados ou não tratados com alginato liase. Utilizando PKKZ144 era possível reduzir o biofilme até o nível de uma cepa de laboratório de E. coli não mucóide.

[0202]Ainda as variantes de endolisina modificadas SMAP29-KZ144 e PK- OBP exibiam redução massiva do biofilme de Pseudomonas aeruginosa comparadas com as endolisinas OBP e KZ144. Contrariamente, o peptídeo PK parecia aumentar a formação do biofilme de Pseudomonas aeruginosa.

EXEMPLO 11: Redução de biofilme de Acinetobacter baumannii'

[0203]No presente experimento a atividade antimicrobiana da variante de endolisina modificada PK-OBP, da endolisina OBP e do peptídeo PK foi testada con-tra o biofilme da cepa DSMZ30007 de Acinetobacter baumannii.

[0204]A redução de biofilme foi quantificada utilizando ensaio de cristal viole-ta (Peeters e outros, J Microbiol Methods 72: 157-165 (2008)).

[0205]A formação, o tratamento e a quantificação de biofilme foram realizados como descrito em Exemplo 10.

[0206]A variante de endolisina modificada PK-OBP exibia redução massiva de biofilme de Acinetobacter baumannii comparada com a endolisina OBP. Contrari- amente, o peptídeo PK parecia aumentar a formação do biofilme de Acinetobacter baumannii.

EXEMPLO 12: Redução do biofilme de Staphylococcus aureus

[0207]No presente experimento a atividade antimicrobiana das proteínas de fusão Ply2638-PK e PK-Lisostafina, das enzimas Lisostafina e Ply2638 e do peptí- deo PK foi testada contra o biofilme da cepa KS13 de Staphylococcus aureus.

[0208]A redução de biofilme foi quantificada utilizando ensaio de cristal viole-ta (Peeters e outros, J Microbiol Methods 72: 157-165 (2008)).

[0209]A formação, o tratamento e a quantificação de biofilme foram realizados como descrito em Exemplo 10. Exceto pelo fato de que o tratamento de biofilme, 25 μg/po^o de Ply2638A-PK e Ply2638A ou 18 μg/po^o de PK-Lisostafina e Lisosta- fina ou 1,25 μg peptídeo PK foi utilizado.

[0210]As proteínas de fusão PK-Lisostafina e PK-Ply2638 exibiam redução massiva do biofilme de Staphylococcus aureus comparadas com as enzimas Lisos- tafina e Ply2638. Contrariamente, o peptídeo PK parecia aumentar a formação do biofilme de Staphylococcus aureus.

EXEMPLO 13: Redução de biofilme de Listeria monocytogenes

[0211]No presente experimento a atividade antimicrobiana da variante de endolisina modificada Pentapeptídeo-Ply511 foi testada contra o biofilme da cepa ScottA de Listeria monocytogenes.

[0212]A redução de biofilme foi quantificada utilizando ensaio de cristal viole-ta (Peeters e outros, J Microbiol Methods 72: 157-165 (2008)).

[0213]A formação, o tratamento e a quantificação de biofilme foram realizados como descrito no Exemplo 10. Exceto pelo fato de que para o tratamento do bio- filme, 25 μg/po^o de Pentapeptídeo-Ply511 foram utilizados.

[0214]A variante de endolisina modificada PK-Ply511 exibia redução massi- va do biofilme de Listeria monocytogenes.

Claims

1.Método para eliminação ou redução de um biofilme bacteriano CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a)fornecer uma proteína de fusão que compreende uma endolisina ou bacteriocina à qual um peptídeo com atividade de ruptura de membrana ou de LPS é fundido; e b)colocar em contato um material, líquido, superfície ou material biológico com a dita proteína de fusão, em que o método não é um método para tratamento do corpo humano ou animal por cirurgia ou terapia, em que a dita endolisina ou bacteriocina tem a atividade de degradar a parede celular de bactérias Gram-negativas, e em que as bactérias Gram-negativas são selecionadas do grupo que consiste em Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae e Acinetobacter, e/ou em que a dita endolisina ou bacteriocina tem a atividade de degradar a parede celular de bactérias Gram-positivas e em que as bactérias Gram-positivas são selecionadas do grupo que consiste em Listeriaceae e Staphylococcaceae, em que a dita endolisina é selecionada do grupo que consiste em phiKZgp144 de acordo com a SEQ ID NO: 1, ELgp188 de acordo com a SEQ ID NO: 2, endolisina de Salmonella de acordo com a SEQ ID NO: 3, endolisina do fago T4 de enterobactérias de acordo com a SEQ ID NO: 4, endolisina de Acinetobacter baumannii de acordo com a SEQ ID NO: 5, endolisina do Fago K1F de E.coli de acordo com a SEQ ID NO: 6, OBPgpLys de acordo com a SEQ ID NO: 7, endolisina de PSP3 salmonella de acordo com a SEQ ID NO: 8, endolisina do Fago P2 de E.coli de acordo com a SEQ ID NO: 9, Ply511 de acordo com a SEQ ID NO: 85, Ply2638 de acordo com a SEQ ID NO: 92 ou em que a dita bacteriocina está de acordo com a SEQ ID NO: 87; e em que o peptídeo exibe uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 10 a 30 e 32 a 34, ou em que o peptídeo exibe uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 93 a 133, ou em que o peptídeo exibe uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 134 e 135; ou em que o peptídeo exibe uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 136 a 138.

2.Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito peptídeo é fundido ao N e/ou C-terminal da endolisina.

3.Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a parede celular das bactérias Gram-negativas é selecionada do grupo que consiste em Escherichia, Salmonella, Shigella, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Serratia, Yersinia, Pseudomonas, Burkholderia, Stenotrophomonas, Shewanella, Sphingomonas, Comamonas, A. baumannii e em que as bactérias Gram-positivas são selecionadas do grupo que consiste em Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus.

4.Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a parede celular das bactérias Gram-negativas é selecionada do grupo que consiste em E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa e A. baumannii.

5.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita variante de endolisina ou variante de bacteriocina compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 35 a 49, 53, 57, 62 a 64, 66 a 78 e 139 a 142.

6.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o material em contato com a proteína de fusão é uma pedra, rocha, solo, sedimentos, alimento, ração ou cosméticos.

7.Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o líquido em contato com a proteína de fusão é água.

8.Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a água é água potável, água subterrânea ou água de esgoto, fonte termal, mar, lago, rio, qualquer tipo de sistema aquoso, soluções de limpeza e de armazenamento de lentes de contato, dentaduras, implantes, próteses ou aparelhos dentários.

9.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o líquido em contato com a proteína de fusão é qualquer substância derivada ou obtida de um organismo vivo.

10.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o líquido em contato com a proteína de fusão é selecionado do grupo que consiste em uma superfície: de dispositivos médicos, de tubulação do sistema de água industrial ou potável e de sistemas aquáticos naturais.

11.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que em combinação ou em adição à proteína de fusão podem ser adicionados antibióticos.

12.Variante de endolisina ou variante de bacteriocina CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma endolisina ou uma bacteriocina à qual um peptídeo com atividade de ruptura de membrana ou de LPS é fundido para uso como um medicamento para o tratamento de infecções por bactérias Gram- positivas e/ou Gram-negativas associadas ao biofilme bacteriano, em que o biofilme bacteriano é formado por micro-organismos bacterianos, em que a dita endolisina é selecionada do grupo que consiste em phiKZgp144 de acordo com a SEQ ID NO: 1, ELgp188 de acordo com a SEQ ID NO: 2, endolisina de Salmonella de acordo com a SEQ ID NO: 3, endolisina do fago T4 de enterobactérias de acordo com a SEQ ID NO: 4, endolisina de Acinetobacter baumannii de acordo com a SEQ ID NO: 5, endolisina do Fago K1F de E.coli de acordo com a SEQ ID NO: 6, OBPgpLys de acordo com a SEQ ID NO: 7, endolisina de PSP3 salmonella de acordo com a SEQ ID NO: 8, endolisina do Fago P2 de E.coli de acordo com a SEQ ID NO: 9, Ply511 de acordo com a SEQ ID NO: 85, Ply2638 de acordo com a SEQ ID NO: 92 ou em que a dita bacteriocina está de acordo com a SEQ ID NO: 87; e em que o peptídeo exibe uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 10 a 30 e 32 a 34, ou em que o peptídeo exibe uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 93 a 133, ou em que o peptídeo exibe uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 134 e 135; ou em que o peptídeo exibe uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 136 a 138.

13.Variante de endolisina ou variante de bacteriocina, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de que a variante de endolisina ou a variante de bacteriocina é utilizada em combinação ou em adição à antibióticos.

14.Uso de uma variante de endolisina ou de uma variante de bacteriocina compreendendo uma endolisina ou uma bacteriocina à qual um peptídeo com atividade de ruptura de membrana ou de LPS é fundido, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a remoção e/ou redução da contaminação por bactérias Gram- negativa e/ou Gram-positiva associadas ao biofilme bacteriano de matéria alimentícia, de equipamento para processamento de alimentos, de plantas de processamento de alimentos, de superfícies que entram em contato com matéria alimentícia, de dispositivos médicos, de superfícies em hospitais ou cirurgia, em que o biofilme bacteriano é formado por micro-organismos bacterianos, em que a dita endolisina é selecionada do grupo que consiste em phiKZgp144 de acordo com a SEQ ID NO: 1, ELgp188 de acordo com a SEQ ID NO: 2, endolisina de Salmonella de acordo com a SEQ ID NO: 3, endolisina do fago T4 de enterobactérias de acordo com a SEQ ID NO: 4, endolisina de Acinetobacter baumannii de acordo com a SEQ ID NO: 5, endolisina do Fago K1F de E.coli de acordo com a SEQ ID NO: 6, OBPgpLys de acordo com a SEQ ID NO: 7, endolisina de PSP3 salmonella de acordo com a SEQ ID NO: 8, endolisina do Fago P2 de E.coli de acordo com a SEQ ID NO: 9, Ply511 de acordo com a SEQ ID NO: 85, Ply2638 de acordo com a SEQ ID NO: 92 ou em que a dita bacteriocina está de acordo com a SEQ ID NO: 87; e em que o peptídeo exibe uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 10 a 30 e 32 a 34, ou em que o peptídeo exibe uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 93 a 133, ou em que o peptídeo exibe uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 134 e 135; ou em que o peptídeo exibe uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 136 a 138.

15.Uso de uma variante de endolisina ou de uma variante de bacteriocina compreendendo uma endolisina ou uma bacteriocina à qual um peptídeo com atividade de ruptura de membrana ou de LPS é fundido, CARACTERIZADO pelo fato de que é como um meio de diagnóstico em diagnósticos de alimentos ou ração ou ambientais de infecção bacteriana associada ao biofilme bacteriano, como um meio de diagnóstico em diagnósticos médicos in vitro de infecção bacteriana associada ao biofilme bacteriano, ou como desinfetante ou substância cosmética, em que a dita endolisina é selecionada do grupo que consiste em phiKZgp144 de acordo com a SEQ ID NO: 1, ELgp188 de acordo com a SEQ ID NO: 2, endolisina de Salmonella de acordo com a SEQ ID NO: 3, endolisina do fago T4 de enterobactérias de acordo com a SEQ ID NO: 4, endolisina de Acinetobacter baumannii de acordo com a SEQ ID NO: 5, endolisina do Fago K1F de E.coli de acordo com a SEQ ID NO: 6, OBPgpLys de acordo com a SEQ ID NO: 7, endolisina de PSP3 salmonella de acordo com a SEQ ID NO: 8, endolisina do Fago P2 de E.coli de acordo com a SEQ ID NO: 9, Ply511 de acordo com a SEQ ID NO: 85, Ply2638 de acordo com a SEQ ID NO: 92 ou em que a dita bacteriocina está de acordo com a SEQ ID NO: 87; e em que o peptídeo exibe uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 10 a 30 e 32 a 34, ou em que o peptídeo exibe uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 93 a 133, ou em que o peptídeo exibe uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 134 e 135; ou em que o peptídeo exibe uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 136 a 138.

16.Uso, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a variante de endolisina ou a variante de bacteriocina é utilizada em combinação ou em adição à antibióticos.