JP2020500535A - 修飾型ペプチド - Google Patents
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Abstract
本発明は、抗微生物剤の分野に関する。具体的には、本発明は、ペプチドグリカン加水分解酵素の配列とペプチドグリカン加水分解酵素に対して異種のペプチド配列とを含むポリペプチドに関し、ここで異種ペプチド配列は、16アミノ酸長、17アミノ酸長、18アミノ酸長、19アミノ酸長、または20アミノ酸長である特定の配列モチーフを含む。本発明は、対応する核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞、組成物、およびキットにも関する。本発明は、手術もしくは治療によるヒトもしくは動物の身体の処置の方法における、またはヒトもしくは動物の身体に対して実施される診断の方法における、該ポリペプチド、核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞、組成物、およびキットの使用にも関する。本発明によるポリペプチド、核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞、組成物、およびキットは、例えば、食品もしくは飼料、化粧品の中の抗微生物薬としても、または消毒剤としても使用され得る。
Description
I. 発明の分野
本発明は、抗微生物剤の分野に関する。具体的には、本発明は、ペプチドグリカン加水分解酵素の配列とペプチドグリカン加水分解酵素に対して異種のペプチド配列とを含むポリペプチドに関し、ここで異種ペプチド配列は、16アミノ酸長、17アミノ酸長、18アミノ酸長、19アミノ酸長、または20アミノ酸長である特定の配列モチーフを含む。本発明は、対応する核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞、組成物、およびキットにも関する。本発明は、手術もしくは治療によるヒトもしくは動物の身体の処置の方法における、またはヒトもしくは動物の身体に対して実施される診断の方法における、ポリペプチド、核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞、組成物、およびキットの使用にも関する。本発明によるポリペプチド、核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞、組成物、およびキットは、例えば、食物もしくは飼料、化粧品の中の抗微生物薬としても、または消毒剤としても使用され得る。
本発明は、抗微生物剤の分野に関する。具体的には、本発明は、ペプチドグリカン加水分解酵素の配列とペプチドグリカン加水分解酵素に対して異種のペプチド配列とを含むポリペプチドに関し、ここで異種ペプチド配列は、16アミノ酸長、17アミノ酸長、18アミノ酸長、19アミノ酸長、または20アミノ酸長である特定の配列モチーフを含む。本発明は、対応する核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞、組成物、およびキットにも関する。本発明は、手術もしくは治療によるヒトもしくは動物の身体の処置の方法における、またはヒトもしくは動物の身体に対して実施される診断の方法における、ポリペプチド、核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞、組成物、およびキットの使用にも関する。本発明によるポリペプチド、核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞、組成物、およびキットは、例えば、食物もしくは飼料、化粧品の中の抗微生物薬としても、または消毒剤としても使用され得る。
II. 関連分野の説明
従来の抗生物質に対する耐性は、人類にとって増え続ける健康リスクになっている。新しい抗生物質耐性機序が出現し、世界中に急速に蔓延している。その結果、一般的な感染性疾患を処置する能力が、近い将来、ますます困難になる可能性がある。この危険は、当技術分野において容易に理解されており、感染性病原体に対抗する新しいアプローチが探究されている。
従来の抗生物質に対する耐性は、人類にとって増え続ける健康リスクになっている。新しい抗生物質耐性機序が出現し、世界中に急速に蔓延している。その結果、一般的な感染性疾患を処置する能力が、近い将来、ますます困難になる可能性がある。この危険は、当技術分野において容易に理解されており、感染性病原体に対抗する新しいアプローチが探究されている。
これらの新しいアプローチには、ペプチドグリカン加水分解酵素と抗微生物ペプチドとの融合物が含まれる。WO 2010/149792（特許文献1）において、そのような融合物は、多数の細菌の処置において有効であることが示された。WO 2010/149792（特許文献1）は、ペプチドグリカン加水分解酵素とペプチドとの様々な組み合わせを開示している。興味深いことに、理由は不明であるが、ペプチドグリカン加水分解酵素とペプチドとの全ての組み合わせが等しく有効であるわけではない。29残基長の抗微生物ペプチドSMAP-29ペプチド（SEQ ID NO:1）との組み合わせは、極めて高い抗微生物活性を示したが、同一のペプチドグリカン加水分解酵素と組み合わせられた他のペプチドは、より少ない程度にしか抗微生物活性を増加させなかった。
従って、そのような抗菌剤の設計のさらなる改善が、当技術分野において未だ必要とされている。
従って、ペプチドグリカン加水分解酵素と抗微生物ペプチドとのランダムな組み合わせと比較して改善された結果を提供する、新しい抗微生物剤を提供することが、本発明者らの目的であった。
この課題は、下記および添付の特許請求の範囲において示される主題によって解決される。
ある種の一般的なアミノ酸配列モチーフを示すペプチドが使用された場合に、ペプチドグリカン加水分解酵素とペプチドとの有効な抗微生物性の組み合わせが有意義に生成され得ることを、本発明者らは驚くべきことに見出した。このパターンを適用することによって、本発明者らは、既存の抗微生物ペプチドをより有効なものにした。さらに、それぞれの変異を導入することによって、本発明者らは、完全に無関係なペプチド、即ち、抗微生物活性に関して以前に未知であったものを、この点に関して有用な化合物へと新たに変換することにすら成功した。
第1の局面において、本発明は、配列モチーフを含むポリペプチドに関し、ここで、
（i）配列モチーフは、16アミノ酸長、17アミノ酸長、18アミノ酸長、19アミノ酸長、または20アミノ酸長であり；
（ii）配列モチーフは、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなるアミノ酸の第1の群より選択されるアミノ酸を、少なくとも40％かつ多くとも60％、含み、
各アミノ酸は、第1の群より独立に選択され、
この第1の群より選択される各アミノ酸は、単独で、第1の群より選択されるさらなるアミノ酸との対で、または第1の群より選択される2個のさらなるアミノ酸とのブロックでのいずれかで、配列モチーフ内に配置されるが、第1の群より選択される3個以上のアミノ酸とのブロックでは生じず、第1の群より選択されるアミノ酸の対が、少なくとも2個、配列モチーフ内に存在し、第1の群より選択されるアミノ酸のうちの3個を連続して含むブロックは、多くとも1個、配列モチーフ内に存在し、但しさらなる条件として、第1の群の3個のアミノ酸を含むそのようなブロックが配列モチーフ内に存在する場合、3アミノ酸ブロックの最初のアミノ酸に対して-12位、-11位、-8位、-5位、-4位、+6位、+7位、+10位、+13位、および+14位のアミノ酸は、それぞれの位置が配列モチーフ内に見出される場合、第1の群から選択されず、
（iii）配列モチーフは、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなるアミノ酸の第2の群より選択されるアミノ酸を、少なくとも40％かつ多くとも60％、含み、
各アミノ酸は、第2の群より独立に選択され、
第1の群より選択されるアミノ酸および第2の群より選択されるアミノ酸の合計が配列モチーフの100％となる場合、少なくとも3個の異なるアミノ酸が、この第2の群より選択され、
配列モチーフが少なくとも2個の単一の非隣接フェニルアラニン残基を含有しており、かつこれらのフェニルアラニン残基のうちの少なくとも1個の直前にリジン残基が存在する場合、配列モチーフは、配列AFVを含まず、配列モチーフが少なくとも3個の非隣接ヒスチジン残基を含有する場合、配列モチーフは、配列AALTH（SEQ ID NO:2）を含まず、
（iv）配列モチーフの残りのアミノ酸は、モチーフ内に存在する場合、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、メチオニン、またはシステインからなる第3の群より選択され、各アミノ酸は、第3の群より独立に選択され、グルタミンは、1回のみ選択され得、選択は、グルタミンおよびグルタミン酸の組み合わせをさらに含み得ず、かつ
該ポリペプチドは、SMAP-29ペプチド（SEQ ID NO:1）の配列を含まない。
（i）配列モチーフは、16アミノ酸長、17アミノ酸長、18アミノ酸長、19アミノ酸長、または20アミノ酸長であり；
（ii）配列モチーフは、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなるアミノ酸の第1の群より選択されるアミノ酸を、少なくとも40％かつ多くとも60％、含み、
各アミノ酸は、第1の群より独立に選択され、
この第1の群より選択される各アミノ酸は、単独で、第1の群より選択されるさらなるアミノ酸との対で、または第1の群より選択される2個のさらなるアミノ酸とのブロックでのいずれかで、配列モチーフ内に配置されるが、第1の群より選択される3個以上のアミノ酸とのブロックでは生じず、第1の群より選択されるアミノ酸の対が、少なくとも2個、配列モチーフ内に存在し、第1の群より選択されるアミノ酸のうちの3個を連続して含むブロックは、多くとも1個、配列モチーフ内に存在し、但しさらなる条件として、第1の群の3個のアミノ酸を含むそのようなブロックが配列モチーフ内に存在する場合、3アミノ酸ブロックの最初のアミノ酸に対して-12位、-11位、-8位、-5位、-4位、+6位、+7位、+10位、+13位、および+14位のアミノ酸は、それぞれの位置が配列モチーフ内に見出される場合、第1の群から選択されず、
（iii）配列モチーフは、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなるアミノ酸の第2の群より選択されるアミノ酸を、少なくとも40％かつ多くとも60％、含み、
各アミノ酸は、第2の群より独立に選択され、
第1の群より選択されるアミノ酸および第2の群より選択されるアミノ酸の合計が配列モチーフの100％となる場合、少なくとも3個の異なるアミノ酸が、この第2の群より選択され、
配列モチーフが少なくとも2個の単一の非隣接フェニルアラニン残基を含有しており、かつこれらのフェニルアラニン残基のうちの少なくとも1個の直前にリジン残基が存在する場合、配列モチーフは、配列AFVを含まず、配列モチーフが少なくとも3個の非隣接ヒスチジン残基を含有する場合、配列モチーフは、配列AALTH（SEQ ID NO:2）を含まず、
（iv）配列モチーフの残りのアミノ酸は、モチーフ内に存在する場合、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、メチオニン、またはシステインからなる第3の群より選択され、各アミノ酸は、第3の群より独立に選択され、グルタミンは、1回のみ選択され得、選択は、グルタミンおよびグルタミン酸の組み合わせをさらに含み得ず、かつ
該ポリペプチドは、SMAP-29ペプチド（SEQ ID NO:1）の配列を含まない。
本発明のポリペプチドの特に好ましい態様は、本発明のポリペプチドがペプチドグリカン加水分解酵素の配列をさらに含む、本発明の融合タンパク質である。
さらなる局面において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸、本発明の核酸を含むベクターまたはバクテリオファージ、ならびに本発明のポリペプチド、核酸、ベクター、および/またはバクテリオファージを含む宿主細胞にも関する。
本発明は、さらなる局面において、本発明によるポリペプチド、核酸、ベクター、バクテリオファージ、および/または宿主細胞を含む組成物にも関する。そのような組成物は、好ましくは、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む薬学的組成物である。
さらなる局面において、本発明は、本発明のポリペプチド、核酸、ベクター、バクテリオファージ、および/または宿主細胞を含み、かつペプチドグリカン加水分解酵素、または、それぞれがペプチドグリカン加水分解酵素をコードするかもしくは含む核酸、ベクター、バクテリオファージ、および/もしくは宿主細胞をさらに含むキットを企図する。
最後に、本発明は、処置の方法において使用するための、具体的には、細菌感染の処置または防止のための、本発明のポリペプチド、核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞、組成物、および/またはキットに関する。
例示的な態様の説明
I. 定義
「ポリペプチド」という用語は、本明細書中で使用されるように、具体的には、特定の配列でペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーをさす。ポリペプチドのアミノ酸残基は、例えば、炭水化物およびリン酸のような様々な基の共有結合性の付着によって修飾されていてよい。ヘムまたは脂質のような他の物質が、ポリペプチドと比較的緩く会合し、コンジュゲートされたポリペプチドを生じていてもよく、それも、本明細書中で使用されるように、「ポリペプチド」という用語に含まれる。その用語には、本明細書中で使用されるように、タンパク質も包含されるものとする。従って、「ポリペプチド」という用語には、例えば、2本以上のアミノ酸ポリマー鎖の複合体も包含される。「ポリペプチド」という用語には、当技術分野において典型的に使用される修飾、例えば、ビオチン化、アセチル化、PEG化、アミノ基、SH基、またはカルボキシル基（例えば、保護基）の化学変化等を任意で示す、ポリペプチドの態様が包含される。下記の説明から明白になるように、本発明によるポリペプチドは、天然にはこの型で存在しない人工的に改変されたポリペプチドであってもよい。そのようなポリペプチドは、例えば、天然に存在するポリペプチドと比べて人工的な変異を示してもよいし、または異種配列を含んでいてもよいし、または天然にはこの型で存在しない天然に存在するポリペプチドの断片であってもよい。さらに、本発明によるポリペプチドは、融合タンパク質であってもよい、即ち、天然にはこの組み合わせで存在しない少なくとも2種のアミノ酸配列の連結を表していてもよい。「ポリペプチド」という用語は、本明細書中で使用されるように、アミノ酸ポリマー鎖の特定の長さに限定されない。しかしながら、最小の長さは、16アミノ酸である。通常は、必ずではないが、本発明の典型的なポリペプチドは、約1000アミノ酸長を超えないであろう。本発明のポリペプチドは、例えば、多くとも約750アミノ酸長、多くとも約500アミノ酸長、または多くとも約300アミノ酸長であり得る。従って、本発明のポリペプチドについて可能な長さの範囲は、以下に限定されるわけではないが、例えば、16〜1000アミノ酸、16〜約50アミノ酸、約200〜約750アミノ酸、または約225〜約600アミノ酸、または約250〜約350アミノ酸である。
I. 定義
「ポリペプチド」という用語は、本明細書中で使用されるように、具体的には、特定の配列でペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーをさす。ポリペプチドのアミノ酸残基は、例えば、炭水化物およびリン酸のような様々な基の共有結合性の付着によって修飾されていてよい。ヘムまたは脂質のような他の物質が、ポリペプチドと比較的緩く会合し、コンジュゲートされたポリペプチドを生じていてもよく、それも、本明細書中で使用されるように、「ポリペプチド」という用語に含まれる。その用語には、本明細書中で使用されるように、タンパク質も包含されるものとする。従って、「ポリペプチド」という用語には、例えば、2本以上のアミノ酸ポリマー鎖の複合体も包含される。「ポリペプチド」という用語には、当技術分野において典型的に使用される修飾、例えば、ビオチン化、アセチル化、PEG化、アミノ基、SH基、またはカルボキシル基（例えば、保護基）の化学変化等を任意で示す、ポリペプチドの態様が包含される。下記の説明から明白になるように、本発明によるポリペプチドは、天然にはこの型で存在しない人工的に改変されたポリペプチドであってもよい。そのようなポリペプチドは、例えば、天然に存在するポリペプチドと比べて人工的な変異を示してもよいし、または異種配列を含んでいてもよいし、または天然にはこの型で存在しない天然に存在するポリペプチドの断片であってもよい。さらに、本発明によるポリペプチドは、融合タンパク質であってもよい、即ち、天然にはこの組み合わせで存在しない少なくとも2種のアミノ酸配列の連結を表していてもよい。「ポリペプチド」という用語は、本明細書中で使用されるように、アミノ酸ポリマー鎖の特定の長さに限定されない。しかしながら、最小の長さは、16アミノ酸である。通常は、必ずではないが、本発明の典型的なポリペプチドは、約1000アミノ酸長を超えないであろう。本発明のポリペプチドは、例えば、多くとも約750アミノ酸長、多くとも約500アミノ酸長、または多くとも約300アミノ酸長であり得る。従って、本発明のポリペプチドについて可能な長さの範囲は、以下に限定されるわけではないが、例えば、16〜1000アミノ酸、16〜約50アミノ酸、約200〜約750アミノ酸、または約225〜約600アミノ酸、または約250〜約350アミノ酸である。
「ペプチドグリカン加水分解酵素」という用語は、本明細書中で使用されるように、当技術分野において一般に理解されている。それは、グラム陰性菌のような細菌のペプチドグリカンを加水分解することができるポリペプチドをさす。この用語は、特定の酵素切断機序に制約されない。切断機序に関して、ペプチドグリカン加水分解酵素は、例えば、エンドペプチダーゼ、キチナーゼ、T4様ムラミニダーゼ（muraminidase）、λ様ムラミニダーゼ、N-アセチル-ムラモイル（muramoyl）-L-アラニン-アミダーゼ（アミダーゼ）、ムラモイル-L-アラニン-アミダーゼ、ムラミダーゼ、溶解性トランスグリコシラーゼ（transglycosylase）（C）、溶解性トランスグリコシラーゼ（M）、N-アセチル-ムラミダーゼ（リゾチーム）、N-アセチル-グルコサミニダーゼ、またはトランスグリコシラーゼであり得る。さらに、この用語には、真核生物、原核生物、またはウイルス（具体的には、バクテリオファージ）に由来するペプチドグリカン加水分解酵素のような、天然に存在するペプチドグリカン加水分解酵素が包含される。この用語には、例えば、（ニワトリ卵白リゾチームおよびヒトリゾチームのような）脊椎動物リゾチーム、エンドリシン（例えば、KZ144エンドリシンまたはLys394エンドリシン）、ビリオン関連ペプチドグリカン加水分解酵素（VAPGH）、バクテリオシン（例えば、リゾスタフィン）、ならびにオートリシンが包含される。「ペプチドグリカン加水分解酵素」は、細菌のペプチドグリカンを加水分解することができる合成のまたは人工的に修飾されたポリペプチドであってもよい。例えば、2種以上のエンドリシンのドメインが入れ替え/交換された、酵素活性を有するシャッフリング型エンドリシンは、「ペプチドグリカン加水分解酵素」として認定され、酵素活性ドメインのみが残存する短縮型エンドリシンも同様である。活性は、例えば、Briersら（J.Biochem.Biophys Methods;2007;70:531-533）またはDonovanら（J.FEMS Microbiol Lett.2006 Dec;265(1)および類似の刊行物に記載されている、例えば、抗菌アッセイのような、当技術分野において当業者に周知のアッセイによって測定され得る。
「アミノ酸残基」が本明細書中で言及される場合、通常それはL-アミノ酸残基を意味する。
「エンドリシン」という用語は、本明細書中で使用されるように、細菌細胞壁を加水分解するために適当なバクテリオファージ由来酵素をさす。エンドリシンは、以下の活性のうちの少なくとも一つを有する少なくとも1個の「酵素活性ドメイン」（EAD）を含む：エンドペプチダーゼ、キチナーゼ、T4様ムラミニダーゼ、λ様ムラミニダーゼ、N-アセチル-ムラモイル-L-アラニン-アミダーゼ（アミダーゼ）、ムラモイル-L-アラニン-アミダーゼ、ムラミダーゼ、溶解性トランスグリコシラーゼ（C）、溶解性トランスグリコシラーゼ（M）、N-アセチル-ムラミダーゼ（リゾチーム）、N-アセチル-グルコサミニダーゼ、またはトランスグリコシラーゼ。さらに、エンドリシンは、酵素活性を有しないが、宿主細菌の細胞壁に結合する領域、いわゆる、CBD（細胞壁結合ドメイン）も含有していてよい。
「を含む」という用語は、本明細書中で使用されるように、「からなる」（即ち、付加的な他の物質の存在を除外する）という意味に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、「を含む」は、任意で、付加的な物質が存在してもよいことを暗示する。「を含む」という用語には、その範囲内にある具体的に構想される態様として、「からなる」（即ち、付加的な他の物質の存在を除外する）および「を含むが、それらからならない」（即ち、付加的な他の物質の存在を必要とする）が包含され、前者がより好ましい。
「a」または「an」という単語の使用は、本明細書中で使用された時、「1」を意味してもよいが、「1以上」、「少なくとも1」、および「1または複数」の意味とも一致する。
II. ポリペプチド
前述のように、本発明は、第1に、配列モチーフを含むポリペプチドに関し、ここで、
（i）配列モチーフは、16アミノ酸長、17アミノ酸長、18アミノ酸長、19アミノ酸長、または20アミノ酸長であり；
（ii）配列モチーフは、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなるアミノ酸の第1の群より選択されるアミノ酸を、少なくとも40％かつ多くとも60％、含み、
各アミノ酸は、第1の群より独立に選択され、
この第1の群より選択される各アミノ酸は、単独で、第1の群より選択されるさらなるアミノ酸との対で、または第1の群より選択される2個のさらなるアミノ酸とのブロックでのいずれかで、配列モチーフ内に配置されるが、第1の群より選択される3個以上のアミノ酸とのブロックでは生じず、第1の群より選択されるアミノ酸の対が、少なくとも2個、配列モチーフ内に存在し、第1の群より選択されるアミノ酸のうちの3個を連続して含むブロックは、多くとも1個、配列モチーフ内に存在し、但しさらなる条件として、第1の群の3個のアミノ酸を含むそのようなブロックが配列モチーフ内に存在する場合、3アミノ酸ブロックの最初のアミノ酸に対して-12位、-11位、-8位、-5位、-4位、+6位、+7位、+10位、+13位、および+14位のアミノ酸は、それぞれの位置が配列モチーフ内に見出される場合、第1の群から選択されず、
（iii）配列モチーフは、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなるアミノ酸の第2の群より選択されるアミノ酸を、少なくとも40％かつ多くとも60％、含み、
各アミノ酸は、第2の群より独立に選択され、
第1の群より選択されるアミノ酸および第2の群より選択されるアミノ酸の合計が配列モチーフの100％となる場合、少なくとも3個の異なるアミノ酸が、この第2の群より選択され、
配列モチーフが少なくとも2個の単一の非隣接フェニルアラニン残基を含有しており、かつこれらのフェニルアラニン残基のうちの少なくとも1個の直前にリジン残基が存在する場合、配列モチーフは、配列AFVを含まず、配列モチーフが少なくとも3個の非隣接ヒスチジン残基を含有する場合、配列モチーフは、配列AALTH（SEQ ID NO:2）を含まず、
（iv）配列モチーフの残りのアミノ酸は、モチーフ内に存在する場合、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、メチオニン、またはシステインからなる第3の群より選択され、各アミノ酸は、第3の群より独立に選択され、グルタミンは、1回のみ選択され得、選択は、グルタミンおよびグルタミン酸の組み合わせをさらに含み得ず、かつ
融合タンパク質は、SMAP-29ペプチド（SEQ ID NO:1）の配列を含まない。
前述のように、本発明は、第1に、配列モチーフを含むポリペプチドに関し、ここで、
（i）配列モチーフは、16アミノ酸長、17アミノ酸長、18アミノ酸長、19アミノ酸長、または20アミノ酸長であり；
（ii）配列モチーフは、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなるアミノ酸の第1の群より選択されるアミノ酸を、少なくとも40％かつ多くとも60％、含み、
各アミノ酸は、第1の群より独立に選択され、
この第1の群より選択される各アミノ酸は、単独で、第1の群より選択されるさらなるアミノ酸との対で、または第1の群より選択される2個のさらなるアミノ酸とのブロックでのいずれかで、配列モチーフ内に配置されるが、第1の群より選択される3個以上のアミノ酸とのブロックでは生じず、第1の群より選択されるアミノ酸の対が、少なくとも2個、配列モチーフ内に存在し、第1の群より選択されるアミノ酸のうちの3個を連続して含むブロックは、多くとも1個、配列モチーフ内に存在し、但しさらなる条件として、第1の群の3個のアミノ酸を含むそのようなブロックが配列モチーフ内に存在する場合、3アミノ酸ブロックの最初のアミノ酸に対して-12位、-11位、-8位、-5位、-4位、+6位、+7位、+10位、+13位、および+14位のアミノ酸は、それぞれの位置が配列モチーフ内に見出される場合、第1の群から選択されず、
（iii）配列モチーフは、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなるアミノ酸の第2の群より選択されるアミノ酸を、少なくとも40％かつ多くとも60％、含み、
各アミノ酸は、第2の群より独立に選択され、
第1の群より選択されるアミノ酸および第2の群より選択されるアミノ酸の合計が配列モチーフの100％となる場合、少なくとも3個の異なるアミノ酸が、この第2の群より選択され、
配列モチーフが少なくとも2個の単一の非隣接フェニルアラニン残基を含有しており、かつこれらのフェニルアラニン残基のうちの少なくとも1個の直前にリジン残基が存在する場合、配列モチーフは、配列AFVを含まず、配列モチーフが少なくとも3個の非隣接ヒスチジン残基を含有する場合、配列モチーフは、配列AALTH（SEQ ID NO:2）を含まず、
（iv）配列モチーフの残りのアミノ酸は、モチーフ内に存在する場合、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、メチオニン、またはシステインからなる第3の群より選択され、各アミノ酸は、第3の群より独立に選択され、グルタミンは、1回のみ選択され得、選択は、グルタミンおよびグルタミン酸の組み合わせをさらに含み得ず、かつ
融合タンパク質は、SMAP-29ペプチド（SEQ ID NO:1）の配列を含まない。
前記の（i）〜（iii）において定義された配列モチーフは、本発明のポリペプチドの配列の一部のみを表していてもよい、即ち、本発明のポリペプチドは、配列モチーフより長くてもよい。あるいは、配列モチーフは、本発明のポリペプチドの配列であってもよい、即ち、本発明のポリペプチドの配列は、配列モチーフの配列と同一であってもよい。さらに、図1に提供される例から明白であるように、本発明のポリペプチドは、1個または複数個のそのような配列モチーフを含むことが可能である。例えば、20残基長モチーフは、前記の基準に適合する16残基長モチーフを本質的に含み得る。従って、本発明のポリペプチドが前記定義の「ある（a）」配列モチーフを含むという事実は、本発明のポリペプチドが、「1」個の配列モチーフのみを含み得、前記の制限に適合するさらなる（例えば、オーバーラップする）配列モチーフを含み得ないと理解されてはならない。
本発明のポリペプチドの配列モチーフは、16アミノ酸長、17アミノ酸長、18アミノ酸長、19アミノ酸長、または20アミノ酸長であり得る。好ましくは、配列モチーフは、17アミノ酸長、18アミノ酸長、または19アミノ酸長、さらに好ましくは、17アミノ酸長または18アミノ酸長である。
本発明のポリペプチドの配列モチーフは、アミノ酸の第1の群より選択されるアミノ酸を、少なくとも40％かつ多くとも60％、含む。第1の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる。配列モチーフが16アミノ酸長である場合、それは、この第1の群より選択されるアミノ酸を、少なくとも7個、多くとも9個、示すであろう。配列モチーフが17アミノ酸長である場合、それは、この第1の群より選択されるアミノ酸を、少なくとも7個、多くとも10個、示すであろう。配列モチーフが18アミノ酸長である場合、それは、この第1の群より選択されるアミノ酸を、少なくとも8個、多くとも10個、示すであろう。配列モチーフが19アミノ酸長である場合、それは、この第1の群より選択されるアミノ酸を、少なくとも8個、多くとも11個、示すであろう。配列モチーフが20アミノ酸長である場合、それは、この第1の群より選択されるアミノ酸を、少なくとも8個、多くとも12個、示すであろう。
この第1の群の中で選択される好ましいアミノ酸は、リジンおよびアルギニンである。好ましくは、配列モチーフは、50％を超えるヒスチジン残基を含まない。さらに好ましくは、配列モチーフは、25％を超えるヒスチジン残基を含まない。本発明のいくつかの態様において、配列モチーフは、ヒスチジン残基を1個のみ含むか、またはさらには全く含まない。
第1の群より選択されるアミノ酸は、独立に選択される。これは、例えば、所定の配列モチーフが、例えば、第1の群より選択されるアミノ酸を8個含む場合、これらの8個のアミノ酸残基の各々が、第1の群からの前または後の選択とは独立に選択され得ることを意味する。従って、選択されたアミノ酸は、3種のアミノ酸全て（リジン、アルギニン、およびヒスチジン）を含んでいてもよいし、同一（例えば、それぞれ、8個のリジン残基もしくは8個のアルギニン残基）であってもよいし、または3種のアミノ酸のうちの2種のみ（例えば、リジンおよびアルギニン）を含んでいてもよい。同様に、独立の選択は、個々に選択されたアミノ酸の間の特定の比を規定しない。例えば、以下に限定されるわけではないが、この第1の群より選択される8個のアミノ酸は、8個のリジン残基であってもよいし、7個のアルギニン残基および1個のヒスチジン残基であってもよいし、または3個のアルギニン残基、4個のリジン残基、および1個のヒスチジン残基であってもよい。
第1の群より選択されるアミノ酸残基の配列モチーフ内の位置付けは、ある種の制限に従う。この第1の群より選択される各アミノ酸は、単独で、第1の群より選択されるさらなるアミノ酸との対で、または第1の群より選択される2個のさらなるアミノ酸とのブロックでのいずれかで、配列モチーフ内に配置され得る。
「単独で」とは、第1の群より選択されるアミノ酸、例えばリジン（K）に、N末端側においても、C末端側においても、第1の群からの別のアミノ酸が隣接していないことを意味する。隣接アミノ酸残基は、第2の群、場合によっては、第3の群より選択され得る（例えば、LKE、N-KE（モチーフのN末端）、LK-C（モチーフのC末端））。注目すべきことに、本発明のポリペプチド内にあるが、配列モチーフ外にある、可能性のあるさらなるアミノ酸は、この位置決定のために考慮されない。従って、配列モチーフの2個の末端のうちの1個にある、第1の群からのアミノ酸は、配列モチーフ外の前（N末端側）または後（C末端側）のアミノ酸残基が、偶然、アルギニン残基、ヒスチジン残基、またはリジン残基である場合ですら、単独で位置付けられていると見なされる。
「第1の群より選択されるさらなるアミノ酸との対で」とは、配列モチーフ内で、第1の群より選択されるアミノ酸が、第1の群より選択される別のアミノ酸と直接隣接していることを意味する。従って、この2個のアミノ酸は、第1の群より選択されるアミノ酸の対を形成する。その対には、次に、C末端側およびN末端側において、第2の群、場合によっては、第3の群からのアミノ酸が隣接している（例えば、LKRE（SEQ ID NO:3）、N-KRE（モチーフのN末端）、LKR-C（モチーフのC末端））。本発明のポリペプチド内にあるが、配列モチーフ外にある、可能性のあるさらなるアミノ酸は、再び、この位置決定のために考慮されない。
「第1の群より選択される2個のさらなるアミノ酸とのブロックで」とは、第1の群より選択される3個のアミノ酸が相互に直接隣接していることを意味する。そのブロック（またはトリプレット）には、C末端側およびN末端側において、第2の群、場合によっては、第3の群からのアミノ酸が隣接している（例えば、LKRKE（SEQ ID NO:4）、N-KRKE（モチーフのN末端；SEQ ID NO:5）、LKRK-C（モチーフのC末端；SEQ ID NO:6））。本発明のポリペプチド内にあるが、配列モチーフ外にある、可能性のあるさらなるアミノ酸は、再び、この位置決定のために考慮されない。そのような様式（トリプレット；第1の群の3個のアミノ酸を含むブロック）で配置されたアミノ酸については、付加的な位置要件が満たされなければならない、即ち、3アミノ酸ブロックの最初のアミノ酸に対して-12位、-11位、-8位、-5位、-4位、+6位、+7位、+10位、+13位、および+14位のアミノ酸は、それぞれの位置が配列モチーフ内に見出される場合、第1の群より選択されるアミノ酸であってはならない。負の値は、トリプレットの最初のアミノ酸のN末端側の位置を示し；正の値は、トリプレットの最初のアミノ酸のC末端側の位置をさす。位置計算のための基礎は、トリプレットの最初（N末端側）のアミノ酸である（例えば、トリプレットの直接N末端側のアミノ酸は、-1であり、トリプレットの直接C末端側のアミノ酸は、+3であろう）。従って、この制限は、
のような配列を、+6位（H）が第1の群のアミノ酸であるため、排除する。それぞれの位置（-12、-11、-8、-5、-4、+6、+7、+10、+13、および+14）が配列モチーフ内に存在するか否かは、配列モチーフ内のトリプレットの位置および配列モチーフの長さに依るであろう。例えば、トリプレットが、配列モチーフのN末端に位置している場合、負の値は、全て、使用されない（即ち、考慮される必要がない）。正の値についても、トリプレットが、配列モチーフのC末端に位置している場合、同様である。しかしながら、好ましい態様において、配列モチーフは、第1の群のアミノ酸のそのようなトリプレッとのブロックを全く含まない、即ち、第1の群より選択される3個のアミノ酸からなるブロックを含まない。
単独の場合の位置要件、第1の群より選択されるさらなるアミノ酸との対の場合の位置要件、および第1の群より選択される2個のさらなるアミノ酸とのブロックの場合の位置要件は、オーバーラップせず、これらの用語は、相互に排他的である（例えば、トリプレットは、「単独で」および/または「との対で」に当てはまらない、等）ことが理解される。
第1の群より選択されるアミノ酸についてのさらなる位置要件は、配列モチーフが、第1の群より選択されるアミノ酸の対を、少なくとも2個、含まなければならないことである。しかしながら、第1の群より選択される全てのアミノ酸が配列モチーフ内に対で配置されるのではないことが好ましい。
本発明のポリペプチドの配列モチーフは、第1の群より選択される4個（カルテット）またはそれ以上（クインテット、セクステット）のアミノ酸のブロックを含まない（即ち、第1の群のアミノ酸は、第1の群より選択される3個以上のアミノ酸とのブロックでは生じない）。従って、配列モチーフは、例えば、「KRKK」（SEQ ID NO:8）または「RRRR」（SEQ ID NO:9）のような配列を含み得ない。
第1の群のアミノ酸は、配列モチーフの40％〜60％のみを構成するため、残りのアミノ酸は、他のアミノ酸残基より選択される必要がある。前記のように、配列モチーフは、アミノ酸の第2の群より選択されるアミノ酸も、少なくとも40％かつ多くとも60％、含む。第2の群は、アミノ酸残基アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる。前記のアミノ酸の第1の群と同様に、第2の群のアミノ酸の各々が、原則として、独立に選択される、即ち、各アミノ酸は、第2の群からの前または後の選択とは独立に選択される。
しかしながら、第2の群については、この一般的な独立選択の原理に、いくつかの制約が存在する。第1の群より選択されるアミノ酸および第2の群より選択されるアミノ酸の合計が配列モチーフのアミノ酸の100％となる（即ち、第3の群からのアミノ酸が配列モチーフ内に存在しない）場合、第1の制約が適用される。そのようなシナリオにおいては、少なくとも3個の異なるアミノ酸が、第2の群より選択されなければならない。そのようなシナリオにおいては、第2の群のアミノ酸は、例えば、バリン残基およびトリプトファン残基のみに制約され得ない。
さらなる（位置）制約は、配列モチーフが少なくとも2個の単一の非隣接フェニルアラニン残基を含有しており、かつこれらのフェニルアラニン残基のうちの少なくとも1個の直前（N末端側）にリジン残基（即ち、KF）が存在する場合、配列モチーフは、トリプレット配列AFV（アラニン、フェニルアラニン、バリン）を含み得ないというものである。非隣接フェニルアラニン残基とは、配列内に連続して存在せず、1個または複数個の他のアミノ酸によって隔てられているフェニルアラニン残基である。単一のフェニルアラニン残基とは、フェニルアラニン残基の対または数個のフェニルアラニン残基のブロックの一部ではなく、配列モチーフ内に単独で位置付けられていることを意味する。
次の制約は、配列モチーフが、少なくとも3個の単一の非隣接ヒスチジン残基を含有している場合、配列モチーフは、配列AALTH（即ち、アラニン、アラニン、リジン、トレオニン、ヒスチジン）を含まないというものである。非隣接ヒスチジン残基とは、配列内に連続して存在せず、1個または複数個の他のアミノ酸によって隔てられているヒスチジン残基である。単一のヒスチジン残基とは、ヒスチジン残基の対または数個のヒスチジン残基のブロックの一部ではなく、配列モチーフ内に単独で位置付けられていることを意味する。
好ましい態様において、特に、ポリペプチドがペプチドグリカン加水分解酵素の配列を含まず、かつ/または短い長さ、例えば、16〜50アミノ酸の範囲の長さを有する場合、5個未満（例えば、4個、3個、2個、1個、または0個）のイソロイシン残基が、第2の群より選択される。
本発明のポリペプチドの配列モチーフは、第1の群および第2の群より選択されるアミノ酸から排他的に構成されていない（即ち、共に100％未満を表す）ことも可能である。そのようなシナリオにおいて、配列モチーフの残りのアミノ酸は、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、メチオニン、およびシステインからなるアミノ酸の第3の群より選択される。前記のアミノ酸の第1の群および第2の群と同様に、第3の群のアミノ酸の各々が、原則として、独立に選択される、即ち、各アミノ酸は、第2の群からの前または後の選択と独立に選択される。しかしながら、前記の第2の群と同様に、第3の群からのアミノ酸の選択にも、いくつかの制約が存在する：グルタミンは1回のみ選択され得、平行してグルタミンおよびグルタミン酸を選択することはできない、即ち、グルタミンが配列モチーフ内に存在する場合には、グルタミン酸は存在し得ず、その逆も同様である。好ましくは、第3の群より選択されるアミノ酸は、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、およびグルタミン酸に限定される、即ち、選択される第3の群のアミノ酸には、メチオニン残基またはシステイン残基が含まれない。
好ましい態様において、配列モチーフは、第3の群からのアミノ酸残基を1個のみ含むか、または、さらに好ましくは、全く含まない。
本発明の好ましい態様において、配列モチーフ内の選択されたアミノ酸の配置は、図1（ならびに、それぞれ、図2a、図2b、図2c、図2d、および図2e）に示された可能な配列モチーフ選択肢のうちの一つにおいて示された要件に適合する。図1は、所定の16残基長、17残基長、18残基長、19残基長、または20残基長について、特定の位置に、第1の群より選択されるアミノ酸が存在し得ないことを明示している。これらの位置には、第2の群および/または第3の群（存在する場合）より選択されるアミノ酸のみが存在し得る。好ましくは、第2の群のアミノ酸が、それらの位置に存在する。第1の群のアミノ酸は、配列モチーフの残りの位置のいずれかにのみ存在し得る。これは、これらの残りの位置に、第1の群のアミノ酸のみが見出され得ることを暗示しない。第1の群および第2の群についての全体百分率要件が満たされる限り、第2の群のアミノ酸、場合によっては、第3の群のアミノ酸も、これらの残りの位置に見出され得る。
好ましくは、本発明のポリペプチドの配列モチーフは、ヘリックス構造を有する。
本発明のポリペプチドの配列モチーフは、第1の群、第2の群、または第3の群に含まれると定義されたアミノ酸以外のアミノ酸残基を含まない。具体的には、本発明のポリペプチドの配列モチーフは、プロリン残基を含まず、第3の群がアスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、およびグルタミン酸に限定される場合には、メチオニンおよびシステインも同様に含まない。
しかしながら、SMAP-29配列と同様に、プロリン残基が本発明のポリペプチド内に存在することは十分にあり得る。例えば、プロリン残基が配列モチーフのN末端側またはC末端側の1〜10アミノ酸残基内、好ましくは、1〜5アミノ酸残基内に位置する場合、それは好ましく、後者が好ましい。本発明のポリペプチドがペプチドグリカン加水分解酵素の配列も含むケースにおいて（以下を参照）、そのようなプロリン残基が、ペプチドグリカン加水分解酵素の配列と配列モチーフとの間に見出される場合、それは好ましい。好ましくは、配列モチーフは、ペプチドグリカン加水分解酵素の配列のN末端側にあり、プロリン残基は、その間の何処か、通常は、配列モチーフの近くに位置付けられる。
本発明によるポリペプチドは、SEQ ID NO:1の配列を含まない。いくつかの態様において、本発明によるポリペプチドは、SEQ ID NO:10を含んでいてよい。しかしながら、好ましい態様において、本発明によるポリペプチドは、SEQ ID NO:10の配列も含まない。
本発明によるポリペプチドは、好ましくは、天然には存在しない人工ポリペプチドである。そのような人工的に構築された配列の例は、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、およびSEQ ID NO:23である。他の例は、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、およびSEQ ID NO:74である。従って、本発明によるポリペプチドの特に好ましい例は、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、またはSEQ ID NO:74のいずれかを含むポリペプチドである。
好ましい態様において、本発明によるポリペプチドは、ペプチドグリカン加水分解酵素の配列をさらに含む。（本発明の融合タンパク質を表す）そのようなポリペプチドは、
（a）ペプチドグリカン加水分解酵素の配列、および
（b）ペプチド配列
を含み、ペプチド配列は、好ましくは、ペプチドグリカン加水分解酵素に対して異種であり、ここで、（異種）ペプチド配列は配列モチーフを含み、
（i）配列モチーフは、16アミノ酸長、17アミノ酸長、18アミノ酸長、19アミノ酸長、または20アミノ酸長であり；
（ii）配列モチーフは、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなるアミノ酸の第1の群より選択されるアミノ酸を、少なくとも40％かつ多くとも60％、含み、
各アミノ酸は、第1の群より独立に選択され、
この第1の群より選択される各アミノ酸は、単独で、第1の群より選択されるさらなるアミノ酸との対で、または第1の群より選択される2個のさらなるアミノ酸とのブロックでのいずれかで、配列モチーフ内に配置されるが、第1の群より選択される3個以上のアミノ酸とのブロックでは生じず、第1の群より選択されるアミノ酸の対が、少なくとも2個、配列モチーフ内に存在し、第1の群より選択されるアミノ酸のうちの3個を連続して含むブロックは、多くとも1個、配列モチーフ内に存在し、但しさらなる条件として、第1の群の3個のアミノ酸を含むそのようなブロックが配列モチーフ内に存在する場合、3アミノ酸ブロックの最初のアミノ酸に対して-12位、-11位、-8位、-5位、-4位、+6位、+7位、+10位、+13位、および+14位のアミノ酸は、それぞれの位置が配列モチーフ内に見出される場合、第1の群から選択されず、
（iii）配列モチーフは、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなるアミノ酸の第2の群より選択されるアミノ酸を、少なくとも40％かつ多くとも60％、含み、
各アミノ酸は、第2の群より独立に選択され、
第1の群より選択されるアミノ酸および第2の群より選択されるアミノ酸の合計が配列モチーフの100％となる場合、少なくとも3個の異なるアミノ酸が、この第2の群より選択され、
配列モチーフが少なくとも2個の単一の非隣接フェニルアラニン残基を含有しており、かつこれらのフェニルアラニン残基のうちの少なくとも1個の直前にリジン残基が存在する場合、配列モチーフは、配列AFVを含まず、
配列モチーフが少なくとも3個の単一の非隣接ヒスチジン残基を含有する場合、配列モチーフは、配列AALTH（SEQ ID NO:2）を含まず、
（iv）配列モチーフの残りのアミノ酸は、モチーフ内に存在する場合、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、メチオニン、またはシステインからなる第3の群より選択され、各アミノ酸は、第3の群より独立に選択され、グルタミンは、1回のみ選択され得、選択は、グルタミンおよびグルタミン酸の組み合わせをさらに含み得ず、かつ
（c）融合タンパク質は、SEQ ID NO:1の配列を含まない。
（a）ペプチドグリカン加水分解酵素の配列、および
（b）ペプチド配列
を含み、ペプチド配列は、好ましくは、ペプチドグリカン加水分解酵素に対して異種であり、ここで、（異種）ペプチド配列は配列モチーフを含み、
（i）配列モチーフは、16アミノ酸長、17アミノ酸長、18アミノ酸長、19アミノ酸長、または20アミノ酸長であり；
（ii）配列モチーフは、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなるアミノ酸の第1の群より選択されるアミノ酸を、少なくとも40％かつ多くとも60％、含み、
各アミノ酸は、第1の群より独立に選択され、
この第1の群より選択される各アミノ酸は、単独で、第1の群より選択されるさらなるアミノ酸との対で、または第1の群より選択される2個のさらなるアミノ酸とのブロックでのいずれかで、配列モチーフ内に配置されるが、第1の群より選択される3個以上のアミノ酸とのブロックでは生じず、第1の群より選択されるアミノ酸の対が、少なくとも2個、配列モチーフ内に存在し、第1の群より選択されるアミノ酸のうちの3個を連続して含むブロックは、多くとも1個、配列モチーフ内に存在し、但しさらなる条件として、第1の群の3個のアミノ酸を含むそのようなブロックが配列モチーフ内に存在する場合、3アミノ酸ブロックの最初のアミノ酸に対して-12位、-11位、-8位、-5位、-4位、+6位、+7位、+10位、+13位、および+14位のアミノ酸は、それぞれの位置が配列モチーフ内に見出される場合、第1の群から選択されず、
（iii）配列モチーフは、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなるアミノ酸の第2の群より選択されるアミノ酸を、少なくとも40％かつ多くとも60％、含み、
各アミノ酸は、第2の群より独立に選択され、
第1の群より選択されるアミノ酸および第2の群より選択されるアミノ酸の合計が配列モチーフの100％となる場合、少なくとも3個の異なるアミノ酸が、この第2の群より選択され、
配列モチーフが少なくとも2個の単一の非隣接フェニルアラニン残基を含有しており、かつこれらのフェニルアラニン残基のうちの少なくとも1個の直前にリジン残基が存在する場合、配列モチーフは、配列AFVを含まず、
配列モチーフが少なくとも3個の単一の非隣接ヒスチジン残基を含有する場合、配列モチーフは、配列AALTH（SEQ ID NO:2）を含まず、
（iv）配列モチーフの残りのアミノ酸は、モチーフ内に存在する場合、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、メチオニン、またはシステインからなる第3の群より選択され、各アミノ酸は、第3の群より独立に選択され、グルタミンは、1回のみ選択され得、選択は、グルタミンおよびグルタミン酸の組み合わせをさらに含み得ず、かつ
（c）融合タンパク質は、SEQ ID NO:1の配列を含まない。
前記において詳細に説明された本発明のポリペプチドの配列モチーフの特色および特徴は、（異種）ペプチド配列の配列モチーフにも同様に当てはまることが理解される。
本発明の融合タンパク質のペプチドグリカン加水分解酵素は、細菌ペプチドグリカンを分解することができる任意のペプチドグリカン加水分解酵素であり得る。そのようなペプチドグリカン加水分解酵素は、酵素活性に関して、例えば、エンドペプチダーゼ、N-アセチル-ムラモイル-L-アラニン-アミダーゼ（アミダーゼ）、N-アセチル-ムラミダーゼ、N-アセチル-グルコサミニダーゼ、または溶解性トランスグリコシラーゼであり得、従って、細菌細胞壁のペプチドグリカンを分解するために適当である。好ましくは、ペプチドグリカン加水分解酵素は、肺炎桿菌（K.pneumoniae）、大腸菌（E.coli）、または緑膿菌（P.aeruginosa）のようなグラム陰性菌のペプチドグリカンを分解する。
細菌細胞壁のペプチドグリカン構造は、軽微な修飾を含むが、全体に概して保存されている（Schleifer & Kandler 1972）。細菌種は、異なるアミノ酸から構成されるペプチド間ブリッジを有するか、またはさらにはペプチド間ブリッジを欠いていてもよい。ペプチド間ブリッジを欠くペプチドグリカン構造においては、ジアミノピメリン酸（DAP）またはメソジアミノピメリン酸（mDAP；ペプチドグリカンの典型的な成分であるリジンのεカルボキシ誘導体を表すアミノ酸）が、アミノ酸L-Lysに取って代わり、反対のペプチド鎖の末端のアミノ酸D-Alaに直接架橋する。従って、ペプチドグリカン加水分解酵素によって加水分解され得る入手可能な化学結合の限定された型が存在する。ペプチドグリカン加水分解酵素は、上にリストされたような酵素活性を有する少なくとも1個の酵素ドメインを示す。さらに、ペプチドグリカン加水分解酵素は、いくつかのケースにおいて、ペプチドグリカンと結合し、ペプチドグリカン加水分解酵素の酵素活性を支持するために適当な少なくとも1個のドメインを含有している。結合ドメインは、典型的には、細胞壁結合ドメイン（CBD）と呼ばれる。
ペプチドグリカン加水分解酵素の例は、（ニワトリ卵白リゾチームおよびヒトリゾチームのような）脊椎動物リゾチーム、エンドリシン（例えば、KZ144エンドリシンまたはLys394エンドリシン）、ビリオン関連ペプチドグリカン加水分解酵素（VAPGH）、バクテリオシン（例えば、リソフスタフィン）、ならびにオートリシンである。最も好ましくは、本発明の融合タンパク質のペプチドグリカン加水分解酵素は、エンドリシンである。最も好ましくは、ペプチドグリカン加水分解酵素は、エンドリシンである。特に好ましいペプチドグリカン加水分解酵素配列は、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、およびSEQ ID NO:27としてリストされる。
グラム陰性菌およびグラム陽性菌に対するペプチドグリカン分解活性は、当技術分野において周知のアッセイによって、例えば、推定酵素がペプチドグリカン層に到達することを可能にするため、（例えば、クロロホルムによって）グラム陰性菌の外膜を透過性にするかまたは除去する壁溶解（muralytic）アッセイによって測定され得る。酵素が活性を有する場合、ペプチドグリカン層の分解は、濁度の低下をもたらし、それを、測光法で測定することができる（例えば、Briers et al.,J.Biochem.Biophys Methods 70:531-533,(2007)またはSchmelcher et al.,新規抗微生物薬としてのバクテリオファージエンドリシン（Bacteriophage endolysins as novel antimicrobials）Schmelcher M,Donovan DM,Loessner MJ.Future Microbiol.2012 Oct;7(10):1147-7を参照すること）。
本発明による融合タンパク質は、好ましくは、同様にペプチドグリカン分解酵素の活性を示す、即ち、細菌ペプチドグリカンを分解することができる。好ましくは、本発明の融合タンパク質は、肺炎桿菌、大腸菌、または緑膿菌のようなグラム陰性菌のペプチドグリカンを分解することができるであろう。
本発明の配列モチーフを含むペプチド配列は、好ましくは、ペプチドグリカン加水分解酵素配列に対して異種である。従って、本発明の配列モチーフを含むペプチド配列およびペプチドグリカン加水分解酵素配列は、好ましくは、天然に存在するポリペプチド鎖に共に存在しない。さらに好ましくは、配列モチーフおよびペプチドグリカン加水分解酵素配列は、天然に存在するポリペプチド鎖に共に存在しない。
本発明の融合タンパク質において、本発明の配列モチーフを含むペプチド配列は、好ましくは、天然に存在しない人工ペプチド配列である。本発明による配列モチーフを含む異種ペプチドの特に好ましい例は、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、およびSEQ ID NO:74である。
本発明の融合タンパク質の好ましい態様において、（異種）ペプチド配列（または配列モチーフ）は、アミノ酸残基グリシン、セリン、セリン（Gly-Ser-Ser）、グリシン、アラニン、グリシン、およびアラニン
、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、およびアラニン（Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala；SEQ ID NO:29）、またはグリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、アラニン、グリシン、およびアラニン
のような付加的な介在アミノ酸残基（リンカー）によってペプチドグリカン加水分解酵素配列に連結されている。
本発明のポリペプチド、具体的には、本発明の融合タンパク質は、当然、さらなるアミノ酸配列要素、例えば、1種または複数種のタグ、例えば、Hisタグ、Strepタグ、Aviタグ、Mycタグ、Gstタグ、JSタグ、システインタグ、FLAGタグ、または当技術分野において公知の他のタグ、チオレドキシン、マルトース結合タンパク質等（MBP）等を含んでいてよい。
これに関して、本発明のポリペプチドは、例えば、精製のためのタグをさらに含むであろう。好ましいのは、His6タグ（SEQ ID NO:31）であり、好ましくは、本発明によるポリペプチドのC末端および/またはN末端にある。タグは、例えば、クローニングのため、付加的なアミノ酸残基によってポリペプチドに連結されていてよい。好ましくは、タグは、少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個の付加的なアミノ酸残基によってタンパク質に連結されていてよい。いくつかの態様において、付加的なアミノ酸残基は、プロテアーゼによって認識され得ず、かつ/または切断され得ない。他の態様において、付加的なアミノ酸残基は、プロテアーゼによって切断され、かつ/または認識される。好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、付加的なアミノ酸残基リジンおよびグリシン（Lys-Gly）またはロイシンおよびグルタミン酸（Leu-Glu）によってポリペプチドに連結されたHis6タグをC末端に含む。別の好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、付加的なアミノ酸残基リジンおよびグリシン（Lys-Gly）またはロイシンおよびグルタミン酸（Leu-Glu）によってポリペプチドに連結されたHis6タグをN末端に含む。別の好ましい態様において、ポリペプチドは、付加的なアミノ酸残基リジンおよびグリシン（Lys-Gly）またはロイシンおよびグルタミン酸（Leu-Glu）によってポリペプチドに連結されたHis6タグをN末端およびC末端に含む。
本発明の特に好ましい融合タンパク質は、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、およびSEQ ID NO:43の配列を含み得る。本発明による融合タンパク質の別の群は、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、またはSEQ ID NO:78を含む。
本発明によるポリペプチドは、当技術分野において公知の標準的な手段によって、例えば、適切な宿主細胞におけるそれぞれのポリペプチドをコードする核酸の組換え発現によって作製され得る。本発明のポリペプチドが、例えば、アミノ酸配列ストレッチまたはタグ等をさらに含む場合、そのような融合タンパク質は、例えば、Sambrook et al.2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manualによって記載される標準的なクローニング技術を使用して、必要とされる個々の核酸配列を連結することによって作製され得る。そのようなポリペプチドは、同様に、当技術分野において公知の方法によって、例えば、組換えDNA発現系において作製されてもよい。本発明による比較的短い、例えば、50アミノ酸長までのポリペプチドは、例えば、合成手段によっても作製され得る。
III. 核酸、ベクター、バクテリオファージ、および宿主細胞
本発明は、本発明の1種または複数種のポリペプチドをコードする本発明の核酸にも関する。本発明の核酸は、核酸について考えられる全ての形態をとることができる。具体的には、本発明による核酸は、RNA、DNA、またはそれらのハイブリッドであり得る。それらは、一本鎖または二本鎖であり得る。それらは、小さい転写物、またはバクテリオファージゲノムのようなゲノム全体のサイズを有していてよい。本明細書中で使用されるように、1種または複数種の本発明のポリペプチドをコードする本発明の核酸は、センス鎖を反映する核酸であってよい。同様に、アンチセンス鎖も包含される。核酸は、本発明のポリペプチドの発現のための異種プロモーターを包含していてもよい。特に好ましい核酸は、本発明による融合タンパク質をコードする。
本発明は、本発明の1種または複数種のポリペプチドをコードする本発明の核酸にも関する。本発明の核酸は、核酸について考えられる全ての形態をとることができる。具体的には、本発明による核酸は、RNA、DNA、またはそれらのハイブリッドであり得る。それらは、一本鎖または二本鎖であり得る。それらは、小さい転写物、またはバクテリオファージゲノムのようなゲノム全体のサイズを有していてよい。本明細書中で使用されるように、1種または複数種の本発明のポリペプチドをコードする本発明の核酸は、センス鎖を反映する核酸であってよい。同様に、アンチセンス鎖も包含される。核酸は、本発明のポリペプチドの発現のための異種プロモーターを包含していてもよい。特に好ましい核酸は、本発明による融合タンパク質をコードする。
さらなる局面において、本発明は、本発明による核酸を含むベクターに関する。そのようなベクターは、例えば、本発明のポリペプチドの発現を可能にする発現ベクターであろう。発現は、構成性または誘導性であり得る。ベクターは、クローニング目的のための本発明の核酸配列を含むクローニングベクターであってもよい。
本発明は、本発明の核酸を含む、具体的には、本発明による融合タンパク質をコードする本発明の核酸を含むバクテリオファージにも関する。
本発明は、本発明によるポリペプチド、核酸、ベクター、またはバクテリオファージを含む（単離された）宿主細胞にも関する。宿主細胞は、具体的には、細菌細胞および酵母細胞からなる群より選択され得る。適切である場合、他の適当な宿主細胞は、例えば、哺乳類（具体的には、ヒト）に由来する不死化細胞株であり得る。特に好ましい宿主細胞は、本発明による融合タンパク質を含む。
IV. 組成物
さらなる局面において、本発明は、本発明によるポリペプチド、本発明による核酸、本発明によるベクター、本発明によるバクテリオファージ、および/または本発明による宿主細胞を含む組成物に関する。
さらなる局面において、本発明は、本発明によるポリペプチド、本発明による核酸、本発明によるベクター、本発明によるバクテリオファージ、および/または本発明による宿主細胞を含む組成物に関する。
本発明の特に好ましい組成物は、本発明による融合タンパク質を含む。他の好ましい組成物は、本発明によるポリペプチドおよびペプチドグリカン加水分解酵素を含む。
本発明による組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体を含む薬学的組成物であり得る。
さらなる局面において、本発明による組成物は、化粧用組成物である。いくつかの細菌種は、皮膚のような、患者の身体の環境に曝される表面に対して、刺激を引き起こし得る。そのような刺激を防止するため、または細菌性病原体の軽症の徴候を排除するため、面皰溶解（comedolytic）効果を達成するために十分な量の本発明のポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、および/または組成物を含む特別な化粧用調製物が利用され得る。
V. キット
さらなる局面において、本発明は、本発明によるポリペプチド、本発明による核酸、本発明によるベクター、本発明によるバクテリオファージ、および/または本発明による宿主細胞を含み、かつペプチドグリカン加水分解酵素、またはそれぞれがそのようなペプチドグリカン加水分解酵素をコードするかもしくは含む核酸、ベクター、バクテリオファージ、および/もしくは宿主細胞をさらに含むキットに関する。好ましくは、キットは、本発明によるポリペプチドおよび/またはペプチドグリカン加水分解酵素を含む。
さらなる局面において、本発明は、本発明によるポリペプチド、本発明による核酸、本発明によるベクター、本発明によるバクテリオファージ、および/または本発明による宿主細胞を含み、かつペプチドグリカン加水分解酵素、またはそれぞれがそのようなペプチドグリカン加水分解酵素をコードするかもしくは含む核酸、ベクター、バクテリオファージ、および/もしくは宿主細胞をさらに含むキットに関する。好ましくは、キットは、本発明によるポリペプチドおよび/またはペプチドグリカン加水分解酵素を含む。
本発明の特に好ましいキットは、本発明によるポリペプチドを含むが、本発明の融合タンパク質は含まない、即ち、キット内のポリペプチドは、ペプチドグリカン加水分解酵素の配列を含まない。
さらなる態様において、本発明のキットは、抗生物質または抗微生物ペプチドのような少なくとも1種のさらなる抗微生物剤を含む。
VI. 使用
さらなる局面において、本発明は、手術もしくは治療によるヒトもしくは動物の身体の処置の方法において、またはヒトもしくは動物の身体に対して実施される診断の方法において使用するための、本発明によるポリペプチド、本発明による核酸、本発明によるベクター、本発明によるバクテリオファージ、本発明による宿主細胞、および/または本発明による組成物に関する。そのようなシナリオにおいて、特に、本発明の融合タンパク質が使用される場合、本発明のポリペプチドの抗菌活性が活用され得る。
さらなる局面において、本発明は、手術もしくは治療によるヒトもしくは動物の身体の処置の方法において、またはヒトもしくは動物の身体に対して実施される診断の方法において使用するための、本発明によるポリペプチド、本発明による核酸、本発明によるベクター、本発明によるバクテリオファージ、本発明による宿主細胞、および/または本発明による組成物に関する。そのようなシナリオにおいて、特に、本発明の融合タンパク質が使用される場合、本発明のポリペプチドの抗菌活性が活用され得る。
そのような方法は、典型的には、有効量の本発明のポリペプチド（例えば、本発明の融合タンパク質）、核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞、または組成物を対象へ投与する工程を含む。対象は、例えば、ヒトまたは動物であり得、ヒとの対象がより好ましい。特に、本発明のポリペプチド、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明のバクテリオファージ、本発明の宿主細胞、および/または本発明の組成物は、グラム陰性菌感染のような細菌感染の処置または防止のための方法において使用され得る。以下に限定されるわけではないが、処置の方法には、皮膚、軟部組織、呼吸器系、肺、消化管、眼、耳、歯、鼻咽腔、口、骨、膣の感染、菌血症および/または心内膜炎の創傷の処置および/または防止が含まれ得る。
本発明による処置（または予防）の方法において使用される投薬量および投与ルートは、処置される具体的な疾患/感染部位に依る。投与ルートは、例えば、経口、局所、鼻咽頭、非経口、静脈内、直腸、またはその他の任意の投与ルートであり得る。
本発明のポリペプチド（例えば、本発明の融合タンパク質）、核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞、または組成物の感染部位（または感染の危険がある部位）への適用のため、感染部位に到達するまで、プロテアーゼ、酸化、免疫応答等のような環境的影響から活性化合物を保護する製剤が使用され得る。従って、製剤は、カプセル、糖衣錠、丸剤、坐剤、注射可能溶液、またはその他の医学的に合理的な生薬製剤であり得る。好ましくは、生薬製剤は、適当な担体、安定剤、香味剤、緩衝剤、またはその他の適当な試薬を含み得る。例えば、局所適用のための製剤は、ローションまたは軟膏であり得、鼻咽頭適用のための製剤は、スプレーを介して鼻に適用される生理食塩水溶液であり得る。
好ましくは、本発明のポリペプチド（例えば、融合タンパク質）、核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞、または組成物は、抗生物質、ランチビオティクス、バクテリオシン、またはエンドリシン等のような他の従来の抗菌剤と組み合わせて使用される。従来の抗菌剤の投与は、本発明のポリペプチド（例えば、融合タンパク質）、核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞、または組成物の投与の前に、それと同時に、またはその後に実施され得る。
さらなる局面において、本発明は、医学的診断、食品の診断、飼料の診断、または環境的診断における診断手段として、具体的には、細菌感染、具体的には、グラム陰性菌によって引き起こされるものの診断手段として使用するための、本発明のポリペプチド、核酸、ベクター、バクテリオファージ、宿主細胞、または組成物に関する。この点で、本発明のポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、または組成物は、病原菌、具体的には、グラム陰性病原菌のペプチドグリカンを特異的に分解するツールとして使用され得る。本発明のポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、または組成物による細菌細胞の分解は、トリトンX-100のような界面活性剤またはポリミキシンBのような細菌細胞エンベロープを弱めるその他の添加剤の添加によって支持され得る。特異的な細胞分解は、PCR、核酸ハイブリダイゼーション、もしくはNASBA（核酸配列ベース増幅）のような核酸に基づく方法、IMS、免疫蛍光、もしくはELISA技術のような免疫学的方法、または別個の細菌の群もしくは種に特異的なタンパク質（例えば、腸内細菌のためのβガラクトシダーゼおよびコアグラーゼ陽性株のためのコアグラーゼ）を使用した酵素アッセイのような細菌細胞の細胞内容物に頼るその他の方法を使用した、細菌のその後の特異的な検出のための初期工程として必要とされる。
さらなる局面において、本発明は、食品、飼料、もしくは化粧品の中の抗微生物薬としての、または消毒剤としての、本発明のポリペプチド、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明のバクテリオファージ、本発明の宿主細胞、および/または本発明の組成物の使用に関する。それらは、具体的には、食品材料、食品加工装置、食品加工工場、（棚および食品保管エリアのような）食品材料と接触する（無生物）表面、飼料材料、飼料加工装置、飼料加工工場、（棚および飼料保管エリアのような）飼料材料と接触する（無生物）表面、医療機器、または病院、診療所、およびその他の医療施設の（無生物）表面のグラム陰性菌汚染の処置または防止のために使用され得る。
以下に、添付の図面の簡単な説明が与えられる。図面は、本発明をより詳細に例示するためのものである。しかしながら、それは、本発明の範囲をこれらの具体例に限定するためのものではない。
以下に、本発明の様々な態様および局面を例示する具体例が提示される。しかしながら、本発明は、本明細書中に記載された具体的な態様によってその範囲を限定されない。実際、本明細書中に記載されたものに加えて、本発明の様々な修飾が、前述の説明、付随する図面、および以下の実施例から、当業者に容易に明白になるであろう。そのような修飾は、全て、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
実施例1：抗微生物ペプチドであるセクロピンA（ネッタイシマカ（A.aegypti））の本発明の配列モチーフへの適合は抗菌活性を増加させる
抗微生物ペプチドであるセクロピンA（ネッタイシマカ）
は、例えば、エンドリシンとの融合のための候補として当技術分野において提唱されている（WO 2010/149792を参照すること）。しかしながら、セクロピンA（ネッタイシマカ）のKZ144エンドリシンとの融合物は、SMAP-29ペプチドのKZ144との融合物ほど、緑膿菌および大腸菌に対して有効でない。さらに、セクロピンA（ネッタイシマカ）は、第1の群からのアミノ酸が、少なくとも40％、存在しなければならないという要件を満たす配列モチーフを示さないため、セクロピンA（ネッタイシマカ）は、本発明の配列モチーフに適合しない。従って、本発明者らは、その群のさらなるアミノ酸の導入が、抗菌活性を増加させる可能性があると判断した。
抗微生物ペプチドであるセクロピンA（ネッタイシマカ）
この仮説を検証するため、本発明者らは、セクロピンA（ネッタイシマカ）をLys394エンドリシンと融合させ、SEQ ID NO:45の配列を含む融合タンパク質を得た。平行して、セクロピンA（ネッタイシマカ）ペプチド配列をC末端において短縮し、様々な位置において変異させ（ペプチド：
）、Lys394エンドリシンに融合させた、類似した融合タンパク質を作製した。得られた融合タンパク質は、SEQ ID NO:32の配列を含む。付加的なリジン残基の導入のため、修飾されたセクロピンA（ネッタイシマカ）配列は、本発明の配列モチーフに適合するようになった。両方の融合タンパク質を、肺炎桿菌に対する抗菌活性について試験した。
細菌を（ルリア・ベルターニ）培地において培養し、ミューラー・ヒントン培地で1:10希釈した。約0.6の光学濃度OD600で、細菌を同培地で1:10希釈し、その後、1:500希釈した。タンパク質緩衝液（20mM HEPES、500mM NaCl、pH 7.4）およびタンパク質を、異なる濃度のタンパク質および500μM EDTA最終濃度を含む20μlの最終体積を使用して、96穴プレートにピペットで移した。180μlの細菌細胞または培地（ミューラー・ヒントン）対照を96穴プレートに与え、混合した。プレートを37℃で18〜22時間インキュベートし、ウェルのOD600値を測定して細菌増殖を決定した。非細菌対照と同一のOD600値を示すウェルのタンパク質濃度であるMICを決定した。
（表１）試験された融合タンパク質の最小発育阻止濃度
セクロピンA（ネッタイシマカ）のLys394エンドリシンとの融合物（SEQ ID NO:45）は、25μg/mlのMICで抗菌活性を示した。変異型セクロピンA（ネッタイシマカ）配列を含む融合物（SEQ ID NO:32）については、MICがはるかに低かった。≦5μg/mlとは、（最低）出発濃度で既に、細菌増殖が観察され得ないことを意味する。より低い濃度は試験されていない、即ち、実際のMICは5μg/mlよりさらに低い可能性がある。従って、本発明の配列モチーフに適合するセクロピンA（ネッタイシマカ）バリアントの設計は、最初の抗微生物ペプチドの抗菌活性を改善した。
実施例2：抗菌活性の改善はエンドリシンモエティに依存しない
抗菌活性の増加が、実施例1において利用されたペプチドとエンドリシンとの組み合わせに特有であるか否かを試験するため、本発明者らは、別のエンドリシン、OBPgpLysと融合した同一のペプチド（即ち、SEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:44）を試験した。得られたポリペプチド（SEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:33）を、本質的には実施例1に記載されたように、但し、緑膿菌PAO1菌に対して試験した。
抗菌活性の増加が、実施例1において利用されたペプチドとエンドリシンとの組み合わせに特有であるか否かを試験するため、本発明者らは、別のエンドリシン、OBPgpLysと融合した同一のペプチド（即ち、SEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:44）を試験した。得られたポリペプチド（SEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:33）を、本質的には実施例1に記載されたように、但し、緑膿菌PAO1菌に対して試験した。
（表２）試験された融合タンパク質の最小発育阻止濃度
セクロピンA（ネッタイシマカ）のOBPgpLysエンドリシンとの融合物（SEQ ID NO:46）は、17.5μg/mlのMICで抗菌活性を示した。変異型セクロピンA（ネッタイシマカ）配列（SEQ ID NO:33）を含む融合物については、MICが有意に低かった（12.5μg/ml）。従って、抗菌活性の改善は、使用されるエンドリシンの配列に依存しない。
実施例3：ペプチドBMAP-28の本発明の配列モチーフへの適合は抗菌活性を増加させる
カテリシジンファミリーのウシペプチドBMAP-28
を、KZ144エンドリシンの誘導体（SEQ ID NO:25）と融合させ、SEQ ID NO:48を含む融合タンパク質を得た。平行して、BMAP-28のペプチド配列を、2個の位置において変異させ（ペプチド：
）、KZ144エンドリシンの同一の誘導体と融合させた類似した融合タンパク質を作製した（融合タンパク質：SEQ ID NO:34）。BMAP-28ペプチドのN末端領域への2個のアルギニンアミノ酸の導入のため、その配列は、本発明の配列モチーフに適合するようになった。両方の融合タンパク質を、大腸菌に対する抗菌活性について試験した。
カテリシジンファミリーのウシペプチドBMAP-28
細菌を（ルリア・ベルターニ）培地において培養し、ミューラー・ヒントン培地で1:10希釈した。約0.6の光学濃度OD600で、細菌を同培地で1:10希釈し、その後、1:500希釈した。タンパク質緩衝液（20mM HEPES、500mM NaCl、pH 7.4）およびタンパク質を、異なる濃度のタンパク質、および500μM EDTA最終濃度を含む20μlの最終体積を使用して、96穴プレートにピペットで移した。180μlの細菌細胞または培地（ミューラー・ヒントン）対照を96穴プレートに与え、混合した。プレートを37℃で18〜22時間インキュベートし、ウェルのOD600値を測定して細菌増殖を決定した。非細菌対照と同一のOD600値を示すウェルのタンパク質濃度であるMICを決定した。
（表３）試験された融合タンパク質の最小発育阻止濃度
「＞30」とは、最初のBMAP-28ペプチドを含む非変異型融合タンパク質（SEQ ID NO:48）について、30μg/mlの濃度まで抗菌活性が観察され得なかったことを示す。より高い濃度における抗菌活性は可能性があるが、実験的に確認されなかった。対照的に、変異型BMAP-28ペプチド断片を含む融合タンパク質については、10μg/mlのMICで、有意な抗菌活性が観察された。この結果は、本発明者らによって同定された配列モチーフの重要性を強調しており、それぞれのポリペプチドの設計が新しい抗菌剤の生成を容易にするであろうことを示している。
実施例4：配列モチーフ内の陽性荷電アミノ酸の型には重要性がほとんどない
さらなる実験において、本発明者らは、MSI 78(4-20)断片
およびLys394エンドリシンから構成された融合タンパク質（SEQ ID NO:50を含む融合タンパク質）を、修飾されたMSI 78(4-20)ペプチド
がLys394エンドリシンと融合した類似した融合タンパク質（融合タンパク質：SEQ ID NO:35）と比較した。修飾されたMSI 78(4-20)ペプチド（SEQ ID NO:13）においては、MSI 78(4-20)ペプチドのリジン残基がアルギニン残基に置換されていた。両方の融合タンパク質を、大腸菌に対する抗菌活性について試験した。
さらなる実験において、本発明者らは、MSI 78(4-20)断片
細菌を（ルリア・ベルターニ）培地において培養し、ミューラー・ヒントン培地で1:10希釈した。約0.6の光学濃度OD600で、細菌を同培地で1:10希釈し、その後、1:500希釈した。タンパク質緩衝液（20mM HEPES、500mM NaCl、pH 7.4）およびタンパク質を、異なる濃度のタンパク質、および500μM EDTA最終濃度を含む20μlの最終体積を使用して、96穴プレートにピペットで移した。180μlの細菌細胞または培地（ミューラー・ヒントン）対照を、96穴プレートに与え、混合した。プレートを37℃で18〜22時間インキュベートし、ウェルのOD600値を測定して細菌増殖を決定した。非細菌対照と同一のOD600値を示すウェルのタンパク質濃度であるMICを決定した。
（表４）試験された融合タンパク質の最小発育阻止濃度
両方の融合タンパク質が、本質的に同一の範囲で抗菌活性を示した。従って、本発明の配列モチーフにおける第1の群より選択される陽性荷電アミノ酸の型（例えば、KであるかRであるか）は、重要でない。
実施例5：ペプチドであるマガイニンの本発明の配列モチーフへの適合は抗菌活性を改善する
アフリカツメガエル（Xenopus laevis）由来の抗微生物ペプチドであるマガイニン
を、Lys394エンドリシン（SEQ ID NO:24）と融合させ、SEQ ID NO:52を含む融合タンパク質を得た。平行して、類似した融合タンパク質を作製した。マガイニンのペプチド配列を短縮し、リンカー（ペプチド：
）とカップリングさせた。そのペプチド配列を、Lys394エンドリシンと融合させた（融合タンパク質：SEQ ID NO:36）。両方の融合タンパク質を、実施例2に記載されるように、緑膿菌 PAO1細菌に対する抗菌活性について試験した。
アフリカツメガエル（Xenopus laevis）由来の抗微生物ペプチドであるマガイニン
（表５）試験された融合タンパク質の最小発育阻止濃度
「＞30」とは、再び、最初のマガイニンペプチドを含む非変異型融合タンパク質（SEQ ID NO:52）については、30μg/mlの濃度まで抗菌活性が観察され得なかったことを意味する。より高い濃度における抗菌活性は、可能性があるが、実験的に確認されなかった。対照的に、変異型マガイニンペプチド断片を含む融合タンパク質については、≦5μg/mlのMICで、有意な抗菌活性が観察された。
実施例6：ペプチドHPA-NT3の本発明の配列モチーフへの適合は抗菌活性を増加させる
ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）由来ペプチドであるHPA-NT3
を、KZ144エンドリシンの誘導体（SEQ ID NO:25）と融合させ、SEQ ID NO:54を含む融合タンパク質を得た。平行して、HPA-NT3のペプチド配列を、本発明の配列モチーフに適応させ（ペプチド：
）、KZ144エンドリシンの同一の誘導体と融合させた類似した融合タンパク質（融合タンパク質：SEQ ID NO:37）を作製した。両方の融合タンパク質を、実施例2に記載されたように、緑膿菌PAO1菌に対する抗菌活性について試験した。
ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）由来ペプチドであるHPA-NT3
（表６）試験された融合タンパク質の最小発育阻止濃度
「＞18」とは、最初のHPA-NT3ペプチドを含む非変異型融合タンパク質（SEQ ID NO:54）については、18μg/mlの濃度まで抗菌活性が観察され得なかったことを意味する。より高い濃度における抗菌活性は、可能性があるが、実験的に確認されなかった。対照的に、変異型HPA-NT3ペプチドを含む融合タンパク質（SEQ ID NO:15）については、12.5μg/mlのMICで抗菌活性が観察された。従って、抗微生物ペプチドの本発明のモチーフへの適合は、融合タンパク質の抗菌活性を増加させた。
実施例7：ストナストキシン（stonustoxin）の配列モチーフから出発した人工抗微生物ペプチドのデノボ生成
同定された配列モチーフが適当であることをさらに確認する試みにおいて、本発明者らは、抗微生物活性について従来未知であったペプチド配列を、エンドリシンとの融合のために有用なペプチド配列にしようと努力した。この目的のため、本発明者らは、ストナストキシンのαサブユニットのアミノ酸298-326
に頼った。ストナストキシンは、リーフストーンフィッシュ毒の成分である。この毒の効果には、重度の疼痛、ショック、麻痺、および組織死が含まれる。しかしながら、抗微生物活性は、未知である。
同定された配列モチーフが適当であることをさらに確認する試みにおいて、本発明者らは、抗微生物活性について従来未知であったペプチド配列を、エンドリシンとの融合のために有用なペプチド配列にしようと努力した。この目的のため、本発明者らは、ストナストキシンのαサブユニットのアミノ酸298-326
SEQ ID NO:55を、KZ144エンドリシンの誘導体と融合させ、SEQ ID NO:56を含む融合タンパク質を得た。平行して、ストーンフィッシュ配列を、様々な位置において変異させ（ペプチド：
）、KZ144エンドリシンの同一の誘導体と融合させた類似した融合タンパク質（融合タンパク質：SEQ ID NO:38）を作製した。ストーンフィッシュ配列内の数個のアミノ酸の交換のため、その配列の最初の18アミノ酸は、本発明の配列モチーフに適合するようになった。具体的には、その配列モチーフ内の陽性荷電アミノ酸の百分率を（リジン残基およびアルギニン残基によって）増加させ、プロリン残基を除去した。両方の融合タンパク質を、緑膿菌に対する抗菌活性について試験した。
細菌を（ルリア・ベルターニ）培地において培養し、ミューラー・ヒントン培地において1:10希釈した。約0.6の光学濃度OD600で、細菌を同培地で1:10希釈し、その後、1:500希釈した。タンパク質緩衝液（20mM HEPES、500mM NaCl、pH 7.4）およびタンパク質を、異なる濃度のタンパク質、および500μM EDTA最終濃度を含む20μlの最終体積を使用して、96穴プレートにピペットで移した。180μlの細菌細胞または培地（ミューラー・ヒントン）対照を96穴プレートに与え、混合した。プレートを37℃で18〜22時間インキュベートし、ウェルのOD600値を測定して細菌増殖を決定した。非細菌対照と同一のOD600値を示すウェルのタンパク質濃度であるMICを決定した。
（表７）試験された融合タンパク質の最小発育阻止濃度
＞91とは、最初のストナストキシンペプチド（SEQ ID NO:55）を含む非変異型融合タンパク質（SEQ ID NO:56）については、91μg/mlの濃度まで、抗菌活性が観察され得なかったことを意味する。より高い濃度における抗菌活性は、除外され得ないが、試験されなかった。その融合物において使用されたストナストキシン断片は、抗微生物活性について未知であり、KZ144エンドリシンは、単独では、原理的に緑膿菌に対して不活性であるため、これは予想通りである。対照的に、変異型ストナストキシンペプチド断片を含む融合タンパク質については、17という低いMICで、予想外のデノボ抗菌活性が観察された。この結果は、本発明者らによって同定された配列モチーフの重要性を強調しており、それぞれのポリペプチドの設計が新しい抗菌剤の生成を容易にすることを示している。
実施例8：CagLタンパク質の配列モチーフから出発した人工抗微生物ペプチドのデノボ生成
本発明者らは、ヘリコバクター・ピロリのCagLタンパク質のアミノ酸26〜48
に基づき、2種のさらなるデノボ抗微生物ペプチドを作製した。CagLタンパク質は、繊毛表面へターゲティングされ、そこで、インテグリンα5β1に結合し、CagAタンパク質の胃上皮細胞への受容体依存性の送達を媒介する、ヘリコバクター・ピロリの特殊なアドヘシンである。抗微生物活性は、報告されていない。
本発明者らは、ヘリコバクター・ピロリのCagLタンパク質のアミノ酸26〜48
SEQ ID NO:57を、KZ144エンドリシンの誘導体と融合させ、SEQ ID NO:58を含む融合タンパク質を得た。平行して、CagL配列を、本発明のモチーフに適合するよう、様々な位置において変異させた、2種の類似した融合タンパク質（ペプチド1：C末端リンカーを含む
；ペプチド2：
）を作製した。それらのペプチドを、KZ144エンドリシンの同一の誘導体と融合させた（融合タンパク質：SEQ ID NO:39およびSEQ ID NO:40）。両方の融合タンパク質を、実施例2に記載されたように、緑膿菌に対する抗菌活性について試験した。
（表８）試験された融合タンパク質の最小発育阻止濃度
＞90とは、最初のCagLペプチド（SEQ ID NO:57）を含む非変異型融合タンパク質（SEQ ID NO:58）について、90μg/mlの濃度まで抗菌活性が観察され得なかったことを意味する。その融合物において使用されたCagL断片は、抗微生物活性について未知であり、KZ144エンドリシンは、単独では、緑膿菌に対して不活性であるため、これは予想通りである。対照的に、変異型CagLペプチド断片を含む両方の融合タンパク質については、12.5μg/mlおよび15μg/mlという低いMICで、予想外のデノボ抗菌活性が観察された。
実施例9：IE1タンパク質の配列モチーフから出発した人工抗微生物ペプチドのデノボ生成
次のデノボ抗微生物ペプチドは、IE1タンパク質のアミノ酸178-198
に基づき作製された。IE1は、ヒトサイトメガロウイルスに由来し、抗微生物活性は未知である。
次のデノボ抗微生物ペプチドは、IE1タンパク質のアミノ酸178-198
SEQ ID NO:59を再びKZ144エンドリシンの誘導体と融合させ、SEQ ID NO:60を含む融合タンパク質を得た。平行して、IE1配列を、様々な位置において変異させ（ペプチド：
）、KZ144エンドリシンの同一の誘導体と融合させた融合タンパク質（融合タンパク質：SEQ ID NO:41）を作製した。両方の融合タンパク質を、実施例2に記載されたように、緑膿菌に対する抗菌活性について試験した。
（表９）試験された融合タンパク質の最小発育阻止濃度
＞30とは、最初のIE1ペプチド（SEQ ID NO:59）を含む非変異型融合タンパク質（SEQ ID NO:60）について、30μg/mlの濃度まで、抗菌活性が観察され得なかったことを意味する。より高い濃度における抗菌活性は、除外され得ないが、試験されておらず、その融合物において使用されたIE1断片が抗微生物活性について未知であるため、予想されない。対照的に、変異型IE1ペプチド断片を含む融合タンパク質については、15〜20μg/mlのMICで、予想外のデノボ抗菌活性が観察された。
実施例10：本発明の配列モチーフを含むペプチドを含むさらなる融合タンパク質の生成
本発明者らは、SEQ ID NO:42の配列を含むさらなる融合タンパク質も作製した。その融合タンパク質は、本発明に適合するペプチド（SEQ ID NO:20）を含む。この融合タンパク質を、実施例2において報告されたように、緑膿菌に対する抗菌活性について試験した。
本発明者らは、SEQ ID NO:42の配列を含むさらなる融合タンパク質も作製した。その融合タンパク質は、本発明に適合するペプチド（SEQ ID NO:20）を含む。この融合タンパク質を、実施例2において報告されたように、緑膿菌に対する抗菌活性について試験した。
（表１０）試験された融合タンパク質の最小発育阻止濃度
新規ペプチドを含む融合タンパク質については、≦5μg/mlのMICで、有意な抗菌活性が観察された。
実施例11：本発明の配列モチーフを含むペプチドを含む融合タンパク質のさらなる変種の生成
本発明者らは、本発明のモチーフに適合するペプチドを含むさらなる融合タンパク質を作製した（SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68）。それらの融合タンパク質を、大腸菌に対する抗菌活性について試験した。
本発明者らは、本発明のモチーフに適合するペプチドを含むさらなる融合タンパク質を作製した（SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68）。それらの融合タンパク質を、大腸菌に対する抗菌活性について試験した。
（表１１）試験された融合タンパク質の最小発育阻止濃度
全ての融合タンパク質について、抗菌活性が観察された。
実施例12：BriersらのペプチドMW2の本発明の配列モチーフへの適合
Briersら（MBio.2014;5(4):e01379-14）は、とりわけ、ペプチドMW2（SEQ ID NO:69）を含む、様々な融合タンパク質の作製を報告した。このペプチドは、本発明の配列モチーフに適合しない。このペプチドから出発して、本発明者らは、そのペプチドおよびKZ144エンドリシンの誘導体（SEQ ID NO:25）を含む融合タンパク質を作製し、SEQ ID NO:70による融合タンパク質を得た。さらに、本発明者らは、SEQ ID NO:69のペプチドの多数の誘導体を作製した（SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、およびSEQ ID NO:74）。MW2は、本発明の配列モチーフにマッチしないが、これらの誘導体はマッチする。得られた融合タンパク質は、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、およびSEQ ID NO:78で提供される。それらの融合タンパク質を、実施例2に記載されたように、緑膿菌PAO1菌に対する抗菌活性について試験した。
Briersら（MBio.2014;5(4):e01379-14）は、とりわけ、ペプチドMW2（SEQ ID NO:69）を含む、様々な融合タンパク質の作製を報告した。このペプチドは、本発明の配列モチーフに適合しない。このペプチドから出発して、本発明者らは、そのペプチドおよびKZ144エンドリシンの誘導体（SEQ ID NO:25）を含む融合タンパク質を作製し、SEQ ID NO:70による融合タンパク質を得た。さらに、本発明者らは、SEQ ID NO:69のペプチドの多数の誘導体を作製した（SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、およびSEQ ID NO:74）。MW2は、本発明の配列モチーフにマッチしないが、これらの誘導体はマッチする。得られた融合タンパク質は、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、およびSEQ ID NO:78で提供される。それらの融合タンパク質を、実施例2に記載されたように、緑膿菌PAO1菌に対する抗菌活性について試験した。
（表１２）試験された融合タンパク質の最小発育阻止濃度
全ての融合タンパク質について、抗菌活性が観察された。注目すべきことに、MW2ペプチドの4種の誘導体に基づく（即ち、本発明の配列モチーフに適合された）融合タンパク質は、「野生型」MW2ペプチドを含む融合タンパク質と比較して、改善された抗菌活性を与えた。
実施例13：さらなるペプチドグリカン加水分解酵素と組み合わせられたペプチドであるマガイニンの使用
本発明者らは、実施例5の2種のペプチドを、さらなるペプチドグリカン加水分解酵素、即ち、ビブリオファージICP1のテールベースプレートタンパク質（SEQ ID NO:27）とも組み合わせた。得られた融合タンパク質は、SEQ ID NO:79およびSEQ ID NO:43の配列を含む。それらの融合タンパク質を、大腸菌に対する抗菌活性について試験した。
本発明者らは、実施例5の2種のペプチドを、さらなるペプチドグリカン加水分解酵素、即ち、ビブリオファージICP1のテールベースプレートタンパク質（SEQ ID NO:27）とも組み合わせた。得られた融合タンパク質は、SEQ ID NO:79およびSEQ ID NO:43の配列を含む。それらの融合タンパク質を、大腸菌に対する抗菌活性について試験した。
（表１３）試験された融合タンパク質の最小発育阻止濃度
得られた融合タンパク質は、いずれも、抗菌活性を示した。再び、本発明の配列モチーフに適合するペプチド（SEQ ID NO:14）は、野生型ペプチド（SEQ ID NO:51）より優れた活性を提供した。
実施例14：さらなるペプチド
実験の最終セットにおいて、本発明者らは、エンドリシン配列および本発明による配列モチーフに適合するペプチドを各々含む、3種のさらなる融合タンパク質を作製した。3種のペプチドは、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、およびSEQ ID NO:23であった。3種の得られた融合タンパク質は、全て、優れた抗菌活性を示した。
実験の最終セットにおいて、本発明者らは、エンドリシン配列および本発明による配列モチーフに適合するペプチドを各々含む、3種のさらなる融合タンパク質を作製した。3種のペプチドは、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、およびSEQ ID NO:23であった。3種の得られた融合タンパク質は、全て、優れた抗菌活性を示した。
Claims (25)
- （a）ペプチドグリカン加水分解酵素の配列、および
（b）ペプチドグリカン加水分解酵素に対して異種のペプチド配列
を含む融合タンパク質であって、
該異種ペプチド配列が配列モチーフを含み、
（i）配列モチーフが、16アミノ酸長、17アミノ酸長、18アミノ酸長、19アミノ酸長、または20アミノ酸長であり；
（ii）配列モチーフが、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなるアミノ酸の第1の群より選択されるアミノ酸を、少なくとも40％かつ多くとも60％含み、
各アミノ酸が第1の群より独立に選択され、
この第1の群より選択される各アミノ酸が、単独で、第1の群より選択されるさらなるアミノ酸との対で、または第1の群より選択される2個のさらなるアミノ酸とのブロックでのいずれかで、配列モチーフ内に配置されるが、第1の群より選択される3個以上のアミノ酸とのブロックでは生じず、第1の群より選択されるアミノ酸の対が、少なくとも2個、配列モチーフ内に存在し、連続する第1の群より選択されるアミノ酸のうちの3個を含むブロックは、多くとも1個、配列モチーフ内に存在し、但しさらなる条件として、第1の群の3個のアミノ酸を含むそのようなブロックが配列モチーフ内に存在する場合、3アミノ酸ブロックの最初のアミノ酸に対して-12位、-11位、-8位、-5位、-4位、+6位、+7位、+10位、+13位、および+14位のアミノ酸は、それぞれの位置が配列モチーフ内に見出され得るならば、第1の群より選択されず、
（iii）配列モチーフが、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなるアミノ酸の第2の群より選択されるアミノ酸を、少なくとも40％かつ多くとも60％含み、
各アミノ酸が第2の群より独立に選択され、
第1の群より選択されるアミノ酸および第2の群より選択されるアミノ酸の合計が配列モチーフの100％となる場合、少なくとも3個の異なるアミノ酸がこの第2の群より選択され、
配列モチーフが少なくとも2個の単一の非隣接フェニルアラニン残基を含有しており、かつこれらのフェニルアラニン残基のうちの少なくとも1個の直前にリジン残基が存在する場合、配列モチーフが配列AFVを含まず、
配列モチーフが少なくとも3個の単一の非隣接ヒスチジン残基を含有する場合、配列モチーフが配列AALTH（SEQ ID NO:2）を含まず、
（iv）配列モチーフの残りのアミノ酸が、モチーフ内に存在する場合、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、メチオニン、またはシステインからなる第3の群より選択され、各アミノ酸が第3の群より独立に選択され、グルタミンが1回のみ選択され得、選択がグルタミンおよびグルタミン酸の組み合わせをさらに含み得ず、
（c）融合タンパク質がSEQ ID NO:1の配列を含まない、
融合タンパク質。 - 配列モチーフが図1に示された配列モチーフのうちの1種に適合し、「X」が、配列モチーフが第1の群より選択されるアミノ酸をそれぞれの位置において示さないことを表す、請求項1記載の融合タンパク質。
- 「X」が、配列モチーフが第2の群より選択されるアミノ酸をその位置において示すことを表す、請求項2記載の融合タンパク質。
- 配列モチーフが、17アミノ酸長、18アミノ酸長、または19アミノ酸長である、前記請求項のいずれか一項記載の融合タンパク質。
- 第3の群より選択されるアミノ酸が、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、およびグルタミン酸より選択される、前記請求項のいずれか一項記載の融合タンパク質。
- 配列モチーフが、第3の群より選択されるアミノ酸を、複数個含有せず、好ましくは配列モチーフが第3の群より選択されるいかなるアミノ酸も含有しない、前記請求項のいずれか一項記載の融合タンパク質。
- 配列モチーフが第1の群の3個のアミノ酸からなるブロックを含まない、前記請求項のいずれか一項記載の融合タンパク質。
- ペプチド配列が天然に存在しない人工ペプチド配列である、前記請求項のいずれか一項記載の融合タンパク質。
- ペプチドグリカン加水分解酵素が、Lys394エンドリシン、KZ144エンドリシン、OBPgpLysエンドリシン、またはビブリオファージICP1のテールベースプレートタンパク質である、前記融合タンパク質であって、
具体的には、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、またはSEQ ID NO:27の配列を含む、前記請求項のいずれか一項記載の融合タンパク質。 - 配列モチーフがヘリックス状である、前記請求項のいずれか一項記載の融合タンパク質。
- プロリン残基が配列モチーフのN末端またはC末端の1〜5アミノ酸残基内に位置する、前記請求項のいずれか一項記載の融合タンパク質。
- プロリン残基が、ペプチドグリカン加水分解酵素の配列と配列モチーフとの間に位置する、請求項11記載の融合タンパク質。
- 配列モチーフが、ペプチドグリカン加水分解酵素の配列のN末端側に位置する、前記請求項のいずれか一項記載の融合タンパク質。
- SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、およびSEQ ID NO:43からなる群より選択される配列を含む、前記請求項のいずれか一項記載の融合タンパク質。
- SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、またはSEQ ID NO:23の配列を含む、ポリペプチド。
- 請求項1〜14のいずれか一項記載の融合タンパク質または請求項15記載のポリペプチドをコードする、核酸。
- 請求項16記載の核酸を含む、ベクター。
- 請求項16記載の核酸を含む、バクテリオファージ。
- 請求項1〜14のいずれか一項記載の融合タンパク質、請求項15記載のポリペプチド、請求項16記載の核酸、請求項17記載のベクター、および/または請求項18記載のバクテリオファージを含む、宿主細胞。
- 請求項1〜14のいずれか一項記載の融合タンパク質、請求項15記載のポリペプチド、請求項16記載の核酸、請求項17記載のベクター、請求項18記載のバクテリオファージ、および/または請求項19記載の宿主細胞を含む、組成物。
- 薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、もしくは担体を含む薬学的組成物であるか、または許容される希釈剤、賦形剤、もしくは担体を含む化粧用組成物である、請求項20記載の組成物。
- （i）請求項1〜14のいずれか一項記載の融合タンパク質、請求項15記載のポリペプチド、請求項16記載の核酸、請求項17記載のベクター、請求項18記載のバクテリオファージ、請求項19記載の宿主細胞、および/または請求項20〜21のいずれか一項記載の組成物を含み、かつ
（ii）ペプチドグリカン加水分解酵素、またはそれぞれがペプチドグリカン加水分解酵素をコードするかもしくは含む核酸、ベクター、バクテリオファージ、および/もしくは宿主細胞をさらに含む、
キット。 - 手術もしくは治療によるヒトもしくは動物の身体の処置の方法において、またはヒトもしくは動物の身体に対して実施される診断の方法において使用するための、具体的には、細菌感染の処置または防止の方法において使用するための、請求項1〜14のいずれか一項記載の融合タンパク質、請求項15記載のポリペプチド、請求項16記載の核酸、請求項17記載のベクター、請求項18記載のバクテリオファージ、請求項19記載の宿主細胞、請求項20〜21のいずれか一項記載の組成物、または請求項22記載のキット。
- 食品、飼料、もしくは化粧品の中の抗微生物薬としての、または消毒剤としての、請求項1〜14のいずれか一項記載の融合タンパク質、請求項15記載のポリペプチド、請求項16記載の核酸、請求項17記載のベクター、請求項18記載のバクテリオファージ、請求項19記載の宿主細胞、請求項20〜21のいずれか一項記載の組成物、または請求項22記載のキットの使用。
- 食品材料、食品加工装置、食品加工工場、食品材料と接触する表面、飼料材料、飼料加工装置、飼料加工工場、飼料材料と接触する表面、医療機器、または病院、診療所、およびその他の医療施設の無生物表面のグラム陰性菌汚染の処置または防止のための、請求項1〜14のいずれか一項記載の融合タンパク質、請求項15記載のポリペプチド、請求項16記載の核酸、請求項17記載のベクター、請求項18記載のバクテリオファージ、請求項19記載の宿主細胞、請求項20〜21のいずれか一項記載の組成物、または請求項22記載のキットの使用。
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