KR102573154B1 - 변성 펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항균제의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 펩티도글리칸 가수분해효소의 시퀀스 및 펩티도글리칸 가수분해효소에 대하여 이종인 펩티드 시퀀스를 포함하고 여기에서 상기 이종 펩티드 시퀀스가 16, 17, 18, 19 또는 20 개의 아미노산 길이인 특정한 시퀀스 모티브를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 대응하는 핵산, 벡터, 박테리오파지, 숙주 세포, 조성물 및 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 수술 또는 치료에 의하여 인체 또는 동물체의 치료의 방법에서 또는 인체 또는 동물체에 시행되는 진단 방법에서의 상기 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 박테리오파지, 숙주 세포, 조성물 및 키트의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 박테리오파지, 숙주 세포, 조성물 및 키트는 또한 예를 들어 식품 또는 사료에서, 화장품에서 항균제로서 또는 소독작용제로서 사용될 수 있다.

Description

변성 펩티드
I. 발명의 분야
본 발명은 항균제의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 펩티도글리칸 가수분해효소(peptidoglycan hydrolase)의 시퀀스 및 펩티도글리칸 가수분해효소에 대하여 이종인 펩티드 시퀀스를 포함하고 여기에서 상기 이종 펩티드 시퀀스가 16, 17, 18, 19 또는 20 개의 아미노산 길이인 특정한 시퀀스 모티브(sequence motif)를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 대응하는 핵산, 벡터, 박테리오파지, 숙주 세포, 조성물 및 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 수술 또는 치료에 의하여 인체 또는 동물체의 치료의 방법에서 또는 인체 또는 동물체에 시행되는 진단 방법에서의 상기 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 박테리오파지, 숙주 세포, 조성물 및 키트의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 박테리오파지, 숙주 세포, 조성물 및 키트는 또한 예를 들어 식품 또는 사료에서, 화장품에서 항균제로서 또는 소독작용제(disinfecting agent)로서 사용될 수 있다.
II. 연관된 선행기술의 설명
통상의 항균제에 대한 내성으로 인류에 대한 건강의 위험이 증가하고 있다. 새로운 항생제 내성 메카니즘이 출현하고 빠르게 전세계적으로 확산되고 있다. 따라서, 가까운 미래에 통상적인 감염 질환을 치료하는 능력이 점점 더 어려워질 수 있다. 이러한 위험은 당해 기술분야에서는 용이하게 이해될 수 있고 감염원과 싸우기 위한 새로운 접근법이 탐색되고 있다.
이러한 새로운 접근법들 중 하나는 펩티도글리칸 가수분해효소의 항균성 펩티드와의 융합이다. 국제공개특허 제WO 2010/149792호에서는, 이러한 융합이 다수의 박테리아를 치료하는데 효과적인 것으로 나타났다. 국제공개특허 제WO 2010/149792호는 펩티도글리칸 가수분해효소와 펩티드의 여러 조합들을 기술하고 있다. 흥미롭게도, 그리고 알려지지 않은 이유들로 인하여, 펩티도글리칸 가수분해효소와 펩티드의 모든 조합들이 동등하게 효과적이지는 않다. 29량체(29mer) 항균성 SMAP-29 펩티드(시퀀스 동정 번호: 1)와의 조합들이 매우 높은 항균 활성을 나타내기는 하나, 동일한 펩티도글리칸 가수분해효소와 결합된 다른 펩티드들은 단지 더 적은 정도까지만 항균 활성이 증가되었다.
따라서, 당해 기술분야에서는 이러한 항세균제의 설계에서의 추가의 개선의 필요가 여전히 존재하고 있다.
따라서 본 발명자의 목적은 펩티도글리칸 가수분해효소와 항균성 펩티드의 무작위 조합들에 비하여 개선된 결과를 제공하는 신규한 항균제를 제공하는 것이다.
이러한 문제는 이하에서 그리고 첨부된 특허청구범위에서 규정된 바와 같은 주제로 해결된다.
발명의 요약
본 발명의 발명자는 놀랍게도 모종의 일반 아미노산 시퀀스 모티브를 나타내는 펩티드가 사용되는 경우, 펩티도글리칸 가수분해효소와 펩티드의 유효한 항균성 조합이 목적에 부합하게 생성될 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 패턴을 적용하는 것에 의하여, 본 발명자는 이미 존재하는 항균성 펩티드에 보다 더 나은 효과를 부여하였다. 더욱이, 개별 돌연변이를 도입하는 것에 의하여, 본 발명자는 심지어 앞서 어떠한 항균 활성에 대하여도 알려지지 않은 전적으로 무관한 펩티드를 신규로 이러한 관점에서 유용한 화합물로 변환시키는 데 성공하였다.
본 발명의 제1 양태는:
i) 16, 17, 18, 19 또는 20 개의 아미노산의 길이이고;
ii) 라이신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어지는 아미노산의 제1 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 40% 그리고 최대 60% 포함하고,
여기에서 각 아미노산이 상기 제1 군으로부터 독립적으로 선택되고,
여기에서 이 제1 군으로부터 선택되는 각 아미노산이 단독으로, 제1 군으로부터 선택되는 추가의 아미노산과 쌍으로 함께, 또는 제1 군으로부터 선택되는 추가의 2개의 아미노산과 블록으로 상기 시퀀스 모티브 내에 배열되나, 하나의 블록 내에 제1 군으로부터 선택되는 3개 또는 그 이상의 아미노산이 발생하지 않고, 여기에서 제1 군으로부터 선택되는 적어도 2 쌍의 아미노산들이 상기 시퀀스 모티브 내에 존재하고, 그리고 여기에서 제1 군으로부터 선택되는 아미노산 3개를 일렬로수반하는 최대 하나의 블록이 상기 시퀀스 모티브 내에 존재하고, 이는 제1 군으로부터의 3개의 아미노산을 수반하는 이러한 블록이 상기 시퀀스 모티브 내에 존재하는 경우의 추가적인 가정을 수반하며, 그때, 상기 시퀀스 모티브 내에서 발견될 수 있는 개개 포지션으로 제공되는, 3개의 아미노산 블록의 제1 아미노산에 대한 포지션 12, -11, -8, -5, -4, +6, +7, +10, +13 및 +14에서의 아미노산이 상기 제1 군으로부터 선택되지 않으며,
iii) 알라닌, 글리신, 이소로이신(isoleucine), 로이신(leucine), 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어지는 아미노산의 제2 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 40% 그리고 최대 60% 아미노산 포함하고,
여기에서 각 아미노산이 상기 제2 군으로부터 독립적으로 선택되고,
여기에서 제1 군으로부터 그리고 제2 군으로부터 선택되는 아미노산들의 합이 시퀀스 모티브의 100%가 되는 경우, 적어도 3개의 서로 다른 아미노산들이 이 제2 군으로부터 선택되고;
여기에서 시퀀스 모티브가 적어도 2개의 단일의, 비-인접하는 페닐알라닌 잔기를 포함하고 이들 페닐알라닌 잔기들 중의 적어도 하나가 직접적으로 라이신 잔기에 선행하는 경우, 시퀀스 모티브가 시퀀스 AFV를 포함하지 않고, 그리고
여기에서 시퀀스 모티브가 적어도 3개의 비-인접하는 히스티딘 잔기를 포함하는 경우, 시퀀스 모티브가 시퀀스 AALTH(시퀀스 동정 번호: 2)를 포함하지 않고,
iv) 여기에서, 어떠한 것이라도 상기 모티브 내에 존재하는 경우, 상기 시퀀스의 잔여의 아미노산들이 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민, 글루탐산, 메티오닌 또는 시스테인으로 이루어지는 제3 군으로부터 선택되고, 여기에서 상기 아미노산 각각이 상기 제3 군으로부터 독립적으로 선택되고 그리고 여기에서 글루타민이 단지 한 번만 선택될 수 있고 그리고 여기에서 상기 선택이 추가로 글루타민과 글루탐산의 조합을 포함하지 않고, 그리고
여기에서 상기 폴리펩티드가 SMAP-29 펩티드의 시퀀스(시퀀스 동정 번호: 1)를 포함하지 않는
시퀀스 모티브를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다.
발명의 폴리펩티드의 특히 바람직한 구현예는 본 발명의 폴리펩티드가 펩티도글리칸 가수분해효소의 시퀀스를 추가로 포함하는 본 발명의 융합 단백질이다.
추가의 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드, 벡터 또는 박테리오파지를 인코딩하는 핵산과 마찬가지로 발명의 폴리펩티드, 핵산, 벡터 및/또는 박테리오파지를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 추가의 양태에 있어서 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 박테리오파지 및/또는 숙주 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이다.
추가의 양태에 있어서 본 발명은 발명의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 박테리오파지 및/또는 숙주 세포를 포함하고 추가로 펩티도글리칸 가수분해효소 또는 개별적으로 상기 펩티도글리칸 가수분해효소를 인코딩하거나 포함하는 핵산, 벡터, 박테리오파지 및/또는 숙주 세포를 포함하는 키트를 고려한다.
마지막으로, 본 발명은 치료, 특히 박테리아 감염의 치료 또는 방지를 위한 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 박테리오파지, 숙주 세포, 조성물 및/또는 키트에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
이하에서는 첨부된 도면의 간단한 설명이 주어진다. 도면은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위하여 의도된다. 그러나, 본 발명의 관점을 이들 특정한 실시예들로 제한하도록 의도된 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 바람직한 시퀀스 모티브의 위치적 요건들을 묘사하고 있다. 표는 그 위치에 제1 군으로부터 선택되는 아미노산이 존재하지 않을 수 있는(개개 포지션들을 "X"로 표지함) 길이 16개(백색) 내지 20개(짙은 회색)의 시퀀스 모티브를 표시하고 있다. 상기 포지션들(즉, "X"로 표지된 것들)에는, 제2 또는 경우에 따라 제3 군으로부터 선택되는 아미노산들 만이 존재할 수 있다. 보다 상세하게는, 제2 군으로부터 선택되는 아미노산들 만이 상기 포지션들에 위치된다. 시퀀스 모티브의 제1 군으로부터 선택되는 아미노산들 만이 "X"로 표지되지 않은 포지션들에 존재할 수 있다. 그러나, 상기 비-표지된 포지션들에서, 제2 또는 경우에 따라 제3 군의 아미노산들이 또한 존재할 수 있다. 각각 16, 17, 18, 19 또는 20개의 길이의 아미노산에 대하여 전체적으로 18개의 대안들이 제공된다. 표는 또한 분명하게 잠재적으로 제1 군의 3중 아미노산이 존재할 수 있는 포지션("X"를 수반하지 않는 열 내의 3개의 포지션들)을 특정하고 있다. 대안 1에 대하여는 이는 포지션 8 내지 10일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 시퀀스 모티브에 대하여 요구되는 바로서, 3개의 아미노산 블록(즉 포지션 #8)에 대하여 포지션 -5(즉 포지션 #3), -4(즉 포지션 #4), +6(즉 포지션 #14), +7(즉 포지션 #15) 및 +10(즉 포지션 #18)에서의 아미노산들이 제1 군으로부터 선택되지 않을 수 있다. 상대 포지션 -12, -11, -8, +13 및 +14들은 제1 대안에서 발견될 수 없고 따라서 고려되지 않는다.
도 2는 바람직한 시퀀스 모티브의 위치적 요건들을 보다 상세하게 묘사하고 있다. "X"는 시퀀스 모티브가 개개 포지션에서 제1 군으로부터 선택되는 아미노산을 나타내지 않는다는 것을 나타내고 있다. 도 2a: 16개의 아미노산 길이의 시퀀스 모티브에 대한 위치적 요건들. 도 2b: 17개의 아미노산 길이의 시퀀스 모티브에 대한 위치적 요건들. 도 2c: 18개의 아미노산 길이의 시퀀스 모티브에 대한 위치적 요건들. 도 2d: 19개의 아미노산 길이의 시퀀스 모티브에 대한 위치적 요건들. 도 2e: 20개의 아미노산 길이의 시퀀스 모티브에 대한 위치적 요건들.
예시적인 구현예들의 설명
I. 정의
여기에서 사용되는 바와 같은 용어 "폴리펩티드"는 특히 특정한 시퀀스 내에 펩티드 결합들로 연결되는 아미노산 잔기들의 폴리머를 의미한다. 폴리펩티드의 아미노산 잔기는 예를 들어 탄수화물 및 인산 등과 같은 여러 기들의 공유적 부착에 의해 변성될 수 있다. 헴(heme) 또는 지질 등과 같은 다른 물질들이 보다 느슨하게 폴리펩티드와 연관되어 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "폴리펩티드"에 포함되는 공액화된 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어는 또한 단백질을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 용어 "폴리펩티드"는 또한 예를 들어 2개 이상의 아미노산 폴리머 쇄의 복합체를 포함한다. 용어 "폴리펩티드"는 당해 기술분야에서 전형적으로 사용되는 선택적인 변성들을 나타내는 폴리펩티드의 구현예들, 예를 들어, 아미노-기, SH-기 또는 카르복실-기(예를 들어 보호기) 등의 비오티닐화, 아세틸화, 페길화(pegylation), 화학적 변화를 포함한다. 이하의 상세한 설명으로부터 명백하게 될 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 자연에서 이러한 형태로 존재하지 않는 인공적으로 조작된 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 예를 들어 자연적으로 발생하는 폴리펩티드에 대하여 인공 돌연변이를 나타낼 수 있거나 이종의 시퀀스를 포함하거나, 자연적으로 발생하는 폴리펩티드의 단편일 수 있으며, 이러한 단편은 이러한 형태로 자연에서 발생되지 않는다. 더욱이, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 융합 단백질일 수 있고 즉 적어도 2개의 아미노산 시퀀스의 연결을 나타내며 이는 자연에서는 이러한 조합으로 발생되지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "폴리펩티드"는 특정한 길이의 아미노산 폴리머 쇄로 한정되지 않는다. 그러나, 최소 길이는 16개의 아미노산이다. 대개, 그러나 필수적이지는 않게, 본 발명의 전형적인 폴리펩티드는 약 1000개의 아미노산 길이를 초과하지 않을 수 있다. 발명의 폴리펩티드는 예를 들어 최대 약 750개의 아미노산 길이, 적어도 약 500개의 아미노산 길이 또는 최대 약 300개의 아미노산 길이일 수 있다. 따라서 발명의 폴리펩티드에 대한 가능한 길이 범위는, 이에 제한됨이 없이, 예를 들어 16 내지 1000개의 아미노산, 16 내지 약 50개의 아미노산, 약 200 내지 약 750개의 아미노산 또는 약 225 내지 약 600개의 아미노산 또는 약 250 내지 약 350개의 아미노산일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "펩티도글리칸 가수분해효소"는 대체로 당해 기술분야에서 이해된다. 이는 그램 음성 박테리아 등과 같은 박테리아의 펩티도글리칸을 가수분해할 수 있는 임의의 폴리펩티드를 의미한다. 이 용어는 특정한 효소적 개열 메카니즘(enzymatic cleavage mechanism)으로 제한되지 않는다. 개열 메카니즘의 관점에 있어서, 펩티도글리칸 가수분해효소는 예를 들어 엔도펩티다아제(endopeptidase), 키티나아제(chitinase), T4형 뮤라미다아제(T4 like muraminidase), 람다형 뮤라미다아제(lambda like muraminidase), N-아세틸-뮤라모일-L-알라닌-아미다아제(아미다아제)(N-acetyl-muramoyl-L-alanine-amidase(amidase)), 뮤라모일-L-알라닌-아미다아제(muramoyl-L-alanine-amidase), 뮤라미다아제, 라이틱 트랜스글리코실라아제(C)(lytic transglycosylase(C)), 라이틱 트랜스글리코실라아제(M), N-아세틸-뮤라미다아제(라이소자임)(N-acetyl-muramidase(lysozyme)), N-아세틸-글루코스아미니다아제(N-acetyl-glucosaminidase) 또는 트랜스글리코실라아제(transglycosylases)일 수 있다. 더욱이, 이 용어는 진핵, 원핵 또는 바이러스(특히 박테리오파지) 유래의 펩티도글리칸 가수분해효소 등과 같은 자연적으로 발생하는 펩티도글리칸 가수분해효소를 포함한다. 이 용어는 예를 들어 척추동물 라이소자임(달걀 난백 라이소자임 및 인간 라이소자임 등), 엔도라이신(예를 들어 KZ144 엔도라이신 또는 Lys394 엔도라이신), 비리온-연관 펩티도글리칸 가수분해효소(VAPGH), 박테리오신(예를 들어 라이소스타핀) 및 오토라이신을 포함한다. "펩티도글리칸 가수분해효소"는 또한 박테리아의 펩티도글리칸을 가수분해할 수 있는 합성 또는 인공적으로 변성된 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 엔도라이신의 2 이상의 도메인들이 교환되고/교체된, 효소적 활성이고 뒤섞인 엔도라이신은 단지 효소적 활성인 도메인이 잔류하는, 끝이 절단된 엔도라이신과 같이 "펩티도글리칸 가수분해효소"로서 적합하다. 활성은 예를 들어 Briers et al. (J. Biochem. Biophys Methods; 2007; 70: 531-533) 또는 Donovan et al. (J. FEMS Microbiol Lett. 2006 Dec; 265(1)) 및 유사한 문헌들과 같이 당해 기술분야에서 숙련된 자에 의해 당해 기술분야에서 잘 알려진 분석법들로 측정될 수 있다.
본 명세서에서 "아미노산 잔기"에 대하여 언급되는 경우, 일반적으로 L-아미노산 잔기를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "엔도라이신"은 박테리아 세포 벽을 가수분해하기에 적절한 박테리오파지-유래 효소를 의미한다. 엔도라이신은 하기 활성들: 엔도펩티다아제, 키티나아제, T4형 뮤라미다아제(muraminidase), 람다형 뮤라미다아제, N-아세틸-뮤라모일-L-알라닌-아미다아제(아미다아제), 뮤라모일-L-알라닌-아미다아제, 뮤라미다아제, 라이틱 트랜스글리코실라아제(C), 라이틱 트랜스글리코실라아제(M), N-아세틸-뮤라미다아제(라이소자임), N-아세틸-글루코스아미니다아제 또는 트랜스글리코실라아제 중의 적어도 하나를 갖는 적어도 하나의 "효소적 활성인 도메인"(EAD)을 포함한다. 게다가, 엔도라이신은 또한 효소적 비활성이나 숙주 박테리아의 세포 벽에 결합하는 영역들, 소위 CBD(세포 벽 결합 도메인(cell wall binding domain)을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "포함하는"은 의미 "~로 이루어지는"(즉 추가의 다른 물질의 존재를 배척하는)로 한정되는 것으로 이해되어서는 안된다. 오히려, "포함하는"은 선택적으로 추가의 물질이 존재할 수 있음을 의미한다. 용어 "포함하는"은 "~로 이루어지는"(즉 추가의 다른 물질의 존재를 배척하는) 및 "포함하나 ~로 이루어지지 않는"(즉 추가의 다른 물질의 존재를 요구하는) 그의 관점 내로 특히 구현된 구현예들로 포함하나, 전자가 보다 바람직하다.
본 명세서에서 사용되는 경우, 단어 "어느 하나(a 또는 an)"의 사용은 "하나"를 의미할 수 있으나, 이는 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 이상"의 의미와 일치한다.
II. 폴리펩티드
이미 언급된 바와 같이, 본 발명은 먼저
i) 16, 17, 18, 19 또는 20 개의 아미노산의 길이이고;
ii) 라이신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어지는 아미노산의 제1 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 40% 그리고 최대 60% 포함하고,
여기에서 각 아미노산이 상기 제1 군으로부터 독립적으로 선택되고,
여기에서 이 제1 군으로부터 선택되는 각 아미노산이 단독으로, 제1 군으로부터 선택되는 추가의 아미노산과 쌍으로 함께, 또는 제1 군으로부터 선택되는 추가의 2개의 아미노산과 블록으로 상기 시퀀스 모티브 내에 배열되나, 하나의 블록 내에 제1 군으로부터 선택되는 3개 또는 그 이상의 아미노산이 발생하지 않고, 여기에서 제1 군으로부터 선택되는 적어도 2 쌍의 아미노산들이 상기 시퀀스 모티브 내에 존재하고, 그리고 여기에서 제1 군으로부터 선택되는 아미노산 3개를 일렬로수반하는 최대 하나의 블록이 상기 시퀀스 모티브 내에 존재하고, 이는 제1 군으로부터의 3개의 아미노산을 수반하는 이러한 블록이 상기 시퀀스 모티브 내에 존재하는 경우의 추가적인 가정을 수반하며, 그때 상기 시퀀스 모티브 내에서 발견될 수 있는 개개 포지션으로 제공되는, 3개의 아미노산 블록의 제1 아미노산에 대한 포지션 12, -11, -8, -5, -4, +6, +7, +10, +13 및 +14에서의 아미노산이 상기 제1 군으로부터 선택되지 않고,
iii) 알라닌, 글리신, 이소로이신, 로이신, 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어지는 아미노산의 제2 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 40% 그리고 최대 60% 아미노산 포함하고,
여기에서 각 아미노산이 상기 제2 군으로부터 독립적으로 선택되고,
여기에서 제1 군으로부터 그리고 제2 군으로부터 선택되는 아미노산들의 합이 시퀀스 모티브의 100%가 되는 경우, 적어도 3개의 서로 다른 아미노산들이 이 제2 군으로부터 선택되고;
여기에서 시퀀스 모티브가 적어도 2개의 단일의, 비-인접하는 페닐알라닌 잔기를 포함하고 이들 페닐알라닌 잔기들 중의 적어도 하나가 직접적으로 라이신 잔기에 선행하는 경우, 시퀀스 모티브가 시퀀스 AFV를 포함하지 않고, 그리고
여기에서 시퀀스 모티브가 적어도 3개의 비-인접하는 히스티딘 잔기를 포함하는 경우, 시퀀스 모티브가 시퀀스 AALTH(시퀀스 동정 번호: 2)를 포함하지 않고,
iv) 여기에서, 어떠한 것이라도 상기 모티브 내에 존재하는 경우, 상기 시퀀스의 잔여의 아미노산들이 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민, 글루탐산, 메티오닌 또는 시스테인으로 이루어지는 제3 군으로부터 선택되고, 여기에서 상기 아미노산 각각이 상기 제3 군으로부터 독립적으로 선택되고 그리고 여기에서 글루타민이 단지 한 번만 선택될 수 있고 그리고 여기에서 상기 선택이 추가로 글루타민과 글루탐산의 조합을 포함하지 않고, 그리고
여기에서 상기 폴리펩티드가 SMAP-29 펩티드의 시퀀스(시퀀스 동정 번호: 1)를 포함하지 않는
시퀀스 모티브를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다.
i) 내지 iii)에서 상기 정의된 시퀀스 모티브는 발명의 폴리펩티드의 시퀀스의 단지 일부를 나타낼 수 있다. 즉 본 발명의 폴리펩티드는 시퀀스 모티브 보다 더 길다. 달리, 시퀀스 모티브는 발명의 폴리펩티드의 시퀀스일 수 있다. 즉 발명의 폴리펩티드의 시퀀스가 시퀀스 모티브의 시퀀스와 동일하다. 더욱이, 그리고 도 1에 제공된 실시예로부터 명백할 수 있는 바와 같이, 발명의 폴리펩티드가 하나 이상의 이러한 시퀀스 모티브를 포함하는 것이 가능하다. 예를 들어, 20량체 모티브는 내재적으로 16량체 모티브를 포함할 수 있고 또한 상기 정리된 기준들에 순응한다. 따라서 발명의 폴리펩티드가 상기 정의된 바와 같은 "하나의" 시퀀스 모티브를 포함한다는 사실은 발명의 폴리펩티드가 단 "하나의" 시퀀스 모티브를 포함하고 또한 상기 정리된 기준들에 순응하는 추가의(예를 들어 오버랩되는(overlapping)) 시퀀스 모티브를 포함하지 않는 것으로 이해되지 않을 수 있다.
발명의 폴리펩티드의 시퀀스 모티브는 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 길이일 수 있다. 바람직하게는, 시퀀스 모티브는 17, 18 또는 19개의 아미노산 길이, 심지어 보다 바람직하게는 17 또는 18개의 아미노산 길이이다.
발명의 폴리펩티드의 시퀀스 모티브는 제1 군의 아미노산으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 40% 그리고 최대 60% 포함한다. 상기 제1 군은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어진다. 시퀀스 모티브가 16개의 아미노산 길이인 경우, 이러한 제1 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 7개 그리고 최대 9개를 나타낼 수 있다. 시퀀스 모티브가 17개의 아미노산 길이인 경우, 이러한 제1 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 7개 그리고 최대 10개를 나타낼 수 있다. 시퀀스 모티브가 18개의 아미노산 길이인 경우, 이러한 제1 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 8개 그리고 최대 10개를 나타낼 것이다. 시퀀스 모티브가 19개의 아미노산 길이인 경우, 이러한 제1 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 8개 그리고 최대 11개를 나타낼 것이다. 시퀀스 모티브가 20개의 아미노산 길이인 경우, 이러한 제1 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 8개 그리고 최대 12개를 나타낼 것이다.
이러한 제1 군 내에서 선택되기에 바람직한 아미노산은 라이신 및 아르기닌이다. 바람직하게는, 시퀀스 모티브는 50% 이상의 히스티딘 잔기를 포함하지 않는다. 심지어 보다 바람직하게는, 시퀀스 모티브는 25% 이상의 히스티딘 잔기를 포함하지 않는다. 본 발명의 일부 구현예들에 있어서, 시퀀스 모티브는 단지 하나의 히스티딘 잔기를 포함하거나 심지어 히스티딘 잔기를 포함하지 않는다.
제1 군으로부터 선택되는 아미노산은 독립적으로 선택된다. 이는, 예를 들어, 주어진 시퀀스 모티브가 예를 들어 제1 군으로부터 선택되는 8개의 아미노산을 포함하는경우, 이들 8개의 아미노산 잔기들 각각은 상기 제1 군으로부터의 이전 또는 이후의 선택으로부터 독립적으로 선택될 수 있다는 것을 의미한다. 따라서 선택되는 아미노산들은 모두 3가지 형태의 아미노산들(라이신, 아르기닌 및 히스티딘)을 포함할 수 있고, 동일할 수 있거나(예를 들어 각각 8개의 라이신 또는 8개의 아르기닌 잔기), 또는 3가지 형태의 아미노산들 중의 단지 2가지 만을 포함하 수 있다(예를 들어 라이신 및 아르기닌). 유사하게, 독립적인 선택은 독립적으로 선택되는 아미노산들 간의 어떠한 특정한 비율도 규정하지 않는다. 예를 들어, 그리고 이에 제한됨이 없이, 이러한 제1 군으로부터 선택되는 8개의 아미노산들은 8개의 라이신 잔기들, 7개의 아르기닌 잔기 및 1개의 히스티딘 잔기들 또는 3개의 아르기닌 잔기들, 4개의 라이신 잔기들 및 1개의 히스티딘 잔기일 수 있다.
시퀀스 모티브 내에서의 제1 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기의 포지셔닝(positioning)은 특정한 제한들에 적용된다. 이러한 제1 군으로부터 선택되는 각 아미노산은 단지 단독으로, 제1 군으로부터 선택되는 추가의 아미노산과 쌍으로 함께, 또는 제1 군으로부터 선택되는 추가의 2개의 아미노산과 블록으로 상기 시퀀스 모티브 내에 배열될 수 있다.
"단독으로"는 상기 제1 군으로부터 선택되는 아미노산, 예를 들어 라이신(K),이 상기 제1 군으로부터의 다른 아미노산의 N-말단적으로 또는 C-말단적으로 인접하지 않은 것을 의미한다. 인접하는 아미노산 잔기는 제2 군으로부터, 또는 경우에 따라, 제3 군으로부터 선택될 수 있다(예를 들어 LKE, N-KE(모티브의 N-말단에서), LK-C(모티브의 C-말단에서)). 발명의 폴리펩티드 내의, 그러나 시퀀스 모티브의 외부가 아닌, 주목할 만한, 잠재적인 추가의 아미노산은 이러한 위치 결정에 대하여는 고려되지 않는다. 따라서 심지어 시퀀스 모티브의 외부의 선행하는(N-말단) 또는 후속의(C-말단) 아미노산 잔기가 우연히도 또한 아르기닌, 히스티딘 또는 라이신 잔기인 경우에도, 시퀀스 모티브의 2개의 말단들 중의 하나에서의 제1 군으로부터의 하나의 아미노산이 단독으로 위치되도록 고려된다.
"제1 군으로부터 선택되는 추가의 아미노산과 쌍으로 함께"는 시퀀스 모티브 내에서 제1 군으로부터 선택되는 아미노산이 제1 군으로부터 선택되는 다른 아미노산에 직접적으로 인접한다는 것을 의미한다. 이러한 2개의 아미노산들은 그에 의하여 제1 군으로부터 선택되는 아미노산들의 한 쌍을 형성한다. 상기 쌍은 차례로 제2 군으로부터, 또는 경우에 따라, 제3 군으로부터 선택될 수 있는 아미노산에 C-말단으로 또는 N-말단으로 인접한다(예를 들어, LKRE(시퀀스 동정 번호: 3), N-KRE(모티브의 N-말단에서), LKR-C(모티브의 C-말단에서)). 발명의 폴리펩티드 내의, 그러나 시퀀스 모티브의 외부가 아닌, 잠재적인 추가의 아미노산은 다시 이러한 위치 결정에 대하여는 고려되지 않는다.
"제1 군으로부터 선택되는 추가의 2개의 아미노산과 블록으로"는 제1 군으로부터 선택되는 3개의 아미노산들이 서로 직접적으로 인접한다는 것을 의미한다. 상기 블록(또는 삼중체(triplet))은 제2 군으로부터, 또는 경우에 따라, 제3 군으로부터 선택될 수 있는 아미노산으로 C-말단으로 또는 N-말단으로 인접한다(예를 들어, LKRKE(시퀀스 동정 번호: 4), N-KRKE(모티브의 N-말단에서; 시퀀스 동정 번호: 5), LKRK-C(모티브의 C-말단에서; 시퀀스 동정 번호: 6)). 시퀀스 모티브의 외부이지만 발명의 폴리펩티드 내인 잠재적인 추가의 아미노산은 이러한 위치 결정에 대하여는 다시 고려되지 않는다. 이러한 방법으로 배열된 아미노산(삼중체 ; 제1 군의 3개의 아미노산을 수반하는 블록)에 대하여는 추가의 위치 요건이 부합되어야 한다. 즉, 3개의 아미노산 블록의 제1 아미노산에 대하여 포지션 -12, -11, -8, -5, -4, +6, +7, +10, +13 및 +14에서의 아미노산들 중의 어떤 것도 - 개개 포지션이 상기 시퀀스 모티브 내에서 발견될 수 있다고 가정하면 - 상기 제1 군으로부터 선택되는 아미노산이 아니다. 음의 값은 삼중체의 제1 아미노산의 포지션 N-말단을 나타내고; 양의 값은 삼중체의 제1 아미노산의 포지션 C-말단을 의미한다. 포지션 산출을 위한 기준은 삼중체의 제1 (N-말단) 아미노산이다 (예를 들어 삼중체의 직접적 N-말단 아미노산은 -1일 수 있고, 삼중체의 직접적 C-말단 아미노산은 +3일 수 있다). 따라서 포지션 +6 (H)가 제1 군의 아미노산이기 때문에 이러한 제한은 RRRGLR[H](시퀀스 동정 번호: 7) 같은 시퀀스를 배제한다. 개개 포지션들(-12, -11, -8, -5, -4, +6, +7, +10, +13 및 +14)이 시퀀스 모티브 내에 존재하거나 시퀀스 모티브 내의 삼중체의 포지션 및 시퀀스 모티브의 길이에 의존적이지 않거나 무관하다. 예를 들어, 삼중체가 시퀀스 모티브의 N-말단에 위치될 수 있는 경우, 모든 음의 값들은 폐기된다(즉 고려할 필요가 없다). 삼중체가 시퀀스 모티브의 C-말단에 위치되는 경우, 양의 값들에 대하여도 동일하게 적용된다. 그러나, 바람직한 구현예에 있어서, 시퀀스 모티브는 제1 군의 아미노산의 이러한 삼중체를 전혀 포함하지 않는다. 즉 제1 군으로부터 선택되는 3개의 아미노산으로 이루어지는 블록을 포함하지 않는다.
제1 군으로부터 선택되는 단독, 추가의 아미노산과 쌍으로 함께, 그리고 제1 군으로부터 선택되는 추가의 2개의 아미노산과 블록으로의 포지션 요건들은 오버랩되지 않고 용어들은 상호 배타적인 것(예를 들어, 삼중체는 "단독으로" 및/또는 "쌍으로 함께" 등의 사례가 아니다)이 이해된다.
제1 군으로부터 선택되는 아미노산들에 대한 추가의 포지션 요건들은 시퀀스 모티브가 제1 군으로부터 선택되는 적어도 2 쌍의 아미노산들을 포함하여야 한다. 그러나, 제1 군으로부터 선택되는 아미노산들 모두가 시퀀스 모티브 내에 쌍으로 배열되지 않는 것이 바람직하다.
발명의 폴리펩티드의 시퀀스 모티브는 제1 군으로부터 선택되는 4(사중체(quartet) 또는 그 이상(오중체(quintet), 육중체(sextet) 등)의 아미노산들의 블록들을 포함하지 않는다(즉 제1 군의 아미노산은 하나의 블록 내에 제1 군으로부터 선택되는 3 또는 그 이상의 아미노산이 발생하지 않는다). 따라서 시퀀스 모티브는 예를 들어 "KRKK"(시퀀스 동정 번호: 8) 또는 "RRRR"(시퀀스 동정 번호: 9) 등과 같은 시퀀스를 포함하지 않을 수 있다.
제1 군의 아미노산들이 시퀀스 모티브의 단지 40% 내지 60% 만을 구성하기 때문에, 잔여의 아미노산들은 다른 아미노산들로부터 선택될 필요가 있다. 상기 규정된 바와 같이, 시퀀스 모티브는 또한 아미노산의 제2 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 40% 그리고 최대 60%를 포함한다. 상기 제2 군은 아미노산 잔기들 알라닌, 글리신, 이소로이신, 로이신, 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어진다. 앞서 아미노산의 제1 군에 대하여와 마찬가지로, 제2 군의 아미노산 각각이 유사하게 원칙적으로 독립적으로 선택된다. 즉 각 아미노산은 상기 제2 군으로부터의 이전 또는 이후의 선택으로부터 독립적으로 선택된다.
그러나, 제2 군에 대하여는, 이러한 독립 선택의 일반 원칙에 대하여 일부 제한들이 있다. 제1 군으로부터 선택되고 그리고 제2 군으로부터 선택되는 아미노산들의 합이 시퀀스 모티브의 100%가 되는 경우(즉 시퀀스 모티브 내에 제3 군으로부터 선택되는 아미노산이 존재하지 않음), 제1 제한이 적용된다. 이러한 상황에서 적어도 3개의 서로 다른 아미노산들이 제2 군으로부터 선택되어야만 한다. 이러한 상황에서 제2 군의 아미노산들은 예를 들어 단지 발린 및 트립토판 잔기들로 제한되지 않을 수 있다.
추가의(위치적인) 제한은 시퀀스 모티브가 적어도 2개의 단일의, 비-인접하는 페닐알라닌 잔기들 및 이들 페닐알라닌 잔기들 중의 적어도 하나가 (N-말단으로) 직접적으로 라이신 잔기에 선행하는 경우(즉 KF), 삼중체 시퀀스 AFV(알라닌, 페닐알라닌, 발린)를 포함하지 않을 수 있다는 것이다. 비-인접하는 페닐알라닌 잔기들은 시퀀스 내에 일렬로 발생하지 않으나, 하나 이상의 다른 아미노산들로 분리되는 페닐알라닌 잔기들이다. 단일의 페닐알라닌 잔기들은 이들이 페닐알라닌 잔기들의 쌍의 또는 여러 페닐알라닌 잔기들의 하나의 블록의 일부가 아니나 시퀀스 모티브 내에 홀로 위치되는 것을 의미한다.
다음 제한은, 시퀀스 모티브가 적어도 3개의 단독의, 비-인접하는 히스티딘 잔기들을 포함하는 경우, 시퀀스 모티브가 시퀀스 AALTH(즉 알라닌, 알라닌, 라이신, 트레오닌, 히스티딘)를 포함하지 않는다는 것이다. 비-인접하는 히스티딘 잔기들은 일렬로 발생하지 않으나, 하나 이상의 다른 아미노산들로 분리되는 히스티딘 잔기들이다. 단독의 히스티딘 잔기들은 이들이 히스티딘 잔기들의 쌍의 또는 여러 히스티딘 잔기들의 하나의 블록의 일부가 아니나 시퀀스 모티브 내에 홀로 위치되는 것을 의미한다.
바람직한 구현예에 있어서, 특히 폴리펩티드가 펩티도글리칸 가수분해효소의 시퀀스를 포함하고/하거나 짧은 길이, 예를 들어 16 내지 50개의 아미노산의 범위의 길이인 경우, 5개 미만의 이소로이신 잔기들(예를 들어 4, 3, 2, 1 또는 0)이 상기 제2 군으로부터 선택된다.
본 발명의 폴리펩티드가 배타적으로 제1 및 제2 군으로부터 선택되는 아미노산들로 배타적으로 구성되는 것이 가능하다(즉 이들은 함께 100% 미만을 나타낸다). 이러한 상황에서, 상기 시퀀스 모티브의 잔여의 아미노산들은 아미노산의 제3 군으로부터 선택되고, 상기 군은 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민, 글루탐산, 메티오닌 및 시스테인으로 이루어진다. 앞서 아미노산의 제1 및 제2 군에 대하여와 마찬가지로, 제3 군의 아미노산 각각이 유사하게 원칙적으로 독립적으로 선택된다. 즉 각 아미노산은 상기 제2 군으로부터의 이전 또는 이후의 선택으로부터 독립적으로 선택된다. 그러나, 앞서 제2 군에 대하여와 마찬가지로, 상기 제3 군으로부터의 아미노산의 선택에는 일부 제한들이 있다: 글루타민은 단지 한번 만 선택될 수 있고 글루타민과 글루탐산의 병행하는 선택은 또한 허용되지 않는다. 즉 글루타민이 시퀀스 모티브 내에 존재하는 경우, 글루탐산은 존재하지 않을 수 있고 그 역도 존재할 수 있다). 바람직하게는, 제3 군으로부터 선택되는 아미노산은 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민 및 글루탐산으로 제한된다. 즉 선택되는 제3 군 아미노산은 메티오닌 잔기 또는 시스테인 잔기들을 포함하지 않는다.
바람직한 구현예에 있어서, 시퀀스 모티브는 제3 군으로부터 단지 단일의 아미노산 잔기를 포함하거나 심지어 보다 바람직하게는 제3 군으로부터의 아미노산을 전혀 포함하지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 시퀀스 모티브 내의 선택된 아미노산들의 배열은 도 1(및 도 2a, 도 2b, 도 2c, 도 2d 및 도 2e 각각)에 묘사된 가능한 시퀀스 모티브 대안들 중의 하나에서 규정된 요건들에 순응한다. 도 1은 주어진 16량체, 17량체, 18량체, 19량체 또는 20량체에 대하여 특정한 포지션들에서 제1 군으로부터 선택되는 아미노산이 존재하지 않을 수 있음을 특정하고 있다. 이들 포지션들에 (어떠한 것이라도 존재하는 경우) 단지 제2 및/또는 제3 군으로부터 선택되는 아미노산들 만이 존재할 수 있다. 바람직하게는, 제2 군의 아미노산들이 상기 포지션들에 존재한다. 제1 군의 아미노산들은 단지 시퀀스 모티브의 잔여의 포지션들 중의 임의의 것에만 존재할 수 있다. 이는 이들 잔여의 포지션들에서 단지 제1 군의 아미노산들 만이 발견될 수 있다는 것을 의미하는 것은 아니다. 제1 및 제2 군에 대한 전체 백분율 요건들에 여전히 순응한다는 전제 하에, 제2 군 및 선택적으로 제3 군의 아미노산들이 또한 이들 잔여의 포지션들에서 발견될 수 있다.
바람직하게는, 발명의 폴리펩티드의 시퀀스 모티브는 헬리컬 구조이다.
발명의 폴리펩티드의 시퀀스 모티브는 제1, 제2 또는 제3 군 내에 존재하는 것으로 정의되는 것들과는 임의의 다른 아미노산 잔기들을 포함하지 않는다. 특히, 발명의 폴리펩티드의 시퀀스 모티브는 임의의 프롤린 잔기를 포함하지 않고, 만일 제3 군이 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민 및 글루탐산으로 제한되는 경우, 마찬가지로 메티오닌 및 시스테인을 포함하지 않는다.
그러나, SMAP-29 시퀀스 내에서와 같이, 프롤린 잔기는 확실히 발명의 폴리펩티드 내에 존재될 수 있다. 예를 들어, 프롤린 잔기가 시퀀스 모티브의 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 5개의 아미노산 잔기들 N-말단 또는 C-말단 내에 위치되는 경우가 바람직하며, 후자가 바람직하다. 발명의 폴리펩티드가 또한 펩티도글리칸 가수분해효소의 시퀀스(하기 참조)를 포함하는 경우, 이러한 프롤린 잔기가 펩티도글리칸 가수분해효소의 시퀀스와 시퀀스 모티브의 사이에서 발견되는 경우가 바람직하다. 바람직하게는, 시퀀스 모티브는 펩티도글리칸 가수분해효소의 시퀀스의 N-말단이고 프롤린 잔기는 이들 사이에, 대개는 시퀀스 모티브에 근접하게 위치된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 시퀀스 동정 번호: 1의 시퀀스를 포함하지 않는다. 일부 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 시퀀스 동정 번호: 10을 포함할 수 있다. 그러나, 바람직한 구현예에 있어서 본 발명에 따른 폴리펩티드는 시퀀스 동정 번호: 10의 시퀀스도 포함하지 않는다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 바람직하게는 자연에서 발생하지 않는 인공 폴리펩티드이다. 이러한 인공적으로 구축된 시퀀스에 대한 예는 시퀀스 동정 번호: 11, 시퀀스 동정 번호: 12, 시퀀스 동정 번호: 13, 시퀀스 동정 번호: 14, 시퀀스 동정 번호: 15, 시퀀스 동정 번호: 16, 시퀀스 동정 번호: 17, 시퀀스 동정 번호: 18, 시퀀스 동정 번호: 19, 시퀀스 동정 번호: 20, 시퀀스 동정 번호: 21, 시퀀스 동정 번호: 22 및 시퀀스 동정 번호: 23이다. 다른 예는 시퀀스 동정 번호: 71, 시퀀스 동정 번호: 72, 시퀀스 동정 번호: 73 및 시퀀스 동정 번호: 74이다. 따라서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 특히 바람직한 예는 시퀀스 동정 번호: 11, 시퀀스 동정 번호: 12, 시퀀스 동정 번호: 13, 시퀀스 동정 번호: 14, 시퀀스 동정 번호: 15, 시퀀스 동정 번호: 16, 시퀀스 동정 번호: 17, 시퀀스 동정 번호: 18, 시퀀스 동정 번호: 19, 시퀀스 동정 번호: 20, 시퀀스 동정 번호: 21, 시퀀스 동정 번호: 22, 시퀀스 동정 번호: 23, 시퀀스 동정 번호: 71, 시퀀스 동정 번호: 72, 시퀀스 동정 번호: 73 또는 시퀀스 동정 번호: 74 중의 임의의 것을 포함하는 폴리펩티드이다.
바람직한 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 펩티도글리칸 가수분해효소의 시퀀스를 추가로 포함한다. 이러한 폴리펩티드(본 발명의 융합 단백질을 나타냄)는 하기를 포함한다:
a) 펩티도글리칸 가수분해효소의 시퀀스 및
b) 펩티드 시퀀스, 상기 펩티드 시퀀스는 바람직하게는 펩티도글리칸 가수분해효소에 대하여 이종이고, 여기에서 상기 (이종) 펩티드 시퀀스는 시퀀스 모티브를 포함하고 이 시퀀스 모티브는:
i) 16, 17, 18, 19 또는 20 개의 아미노산의 길이이고;
ii) 라이신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어지는 아미노산의 제1 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 40% 그리고 최대 60% 포함하고,
여기에서 각 아미노산이 상기 제1 군으로부터 독립적으로 선택되고;
여기에서 이 제1 군으로부터 선택되는 각 아미노산이 단독으로, 제1 군으로부터 선택되는 추가의 아미노산과 쌍으로 함께, 또는 제1 군으로부터 선택되는 추가의 2개의 아미노산과 블록으로 상기 시퀀스 모티브 내에 배열되나, 하나의 블록 내에 제1 군으로부터 선택되는 3개 또는 그 이상의 아미노산이 발생하지 않고, 여기에서 제1 군으로부터 선택되는 적어도 2 쌍의 아미노산들이 상기 시퀀스 모티브 내에 존재하고, 그리고 여기에서 제1 군으로부터 선택되는 아미노산 3개를 일렬로수반하는 최대 하나의 블록이 상기 시퀀스 모티브 내에 존재하고, 이는 제1 군으로부터의 3개의 아미노산을 수반하는 이러한 블록이 상기 시퀀스 모티브 내에 존재하는 경우의 추가적인 가정을 수반하며, 상기 시퀀스 모티브 내에서 발견될 수 있는 개개 포지션으로 제공되는, 3개의 아미노산 블록의 제1 아미노산에 대한 포지션 -12, -11, -8, -5, -4, +6, +7, +10, +13 및 +14에서의 아미노산이 상기 제1 군으로부터 선택되지 않고,
iii) 알라닌, 글리신, 이소로이신, 로이신, 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어지는 아미노산의 제2 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 40% 그리고 최대 60% 아미노산 포함하고,
여기에서 각 아미노산이 상기 제2 군으로부터 독립적으로 선택되고,
여기에서 제1 군으로부터 그리고 제2 군으로부터 선택되는 아미노산들의 합이 시퀀스 모티브의 100%가 되는 경우, 적어도 3개의 서로 다른 아미노산들이 이 제2 군으로부터 선택되고;
여기에서 시퀀스 모티브가 적어도 2개의 단일의, 비-인접하는 페닐알라닌 잔기를 포함하고 이들 페닐알라닌 잔기들 중의 적어도 하나가 직접적으로 라이신 잔기에 선행하는 경우, 시퀀스 모티브가 시퀀스 AFV를 포함하지 않고, 그리고
여기에서 시퀀스 모티브가 적어도 3개의 비-인접하는 히스티딘 잔기를 포함하는 경우, 시퀀스 모티브가 시퀀스 AALTH(시퀀스 동정 번호: 2)를 포함하지 않고,
iv) 여기에서, 어떠한 것이라도 상기 모티브 내에 존재하는 경우, 상기 시퀀스의 잔여의 아미노산들이 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민, 글루탐산, 메티오닌 또는 시스테인으로 이루어지는 제3 군으로부터 선택되고, 여기에서 상기 아미노산 각각이 상기 제3 군으로부터 독립적으로 선택되고 그리고 여기에서 글루타민이 단지 한 번만 선택될 수 있고 그리고 여기에서 상기 선택이 추가로 글루타민과 글루탐산의 조합을 포함하지 않고, 그리고
c) 여기에서 상기 폴리펩티드가 SMAP-29 펩티드의 시퀀스(시퀀스 동정 번호: 1)를 포함하지 않는다.
상기에서 상세하게 설명된 본 발명의 폴리펩티드의 시퀀스 모티브의 특성 및 특징들이 (이종) 펩티드 시퀀스의 시퀀스 모티브에 대하여 유사하게 적용된다는 것은 이해된다.
본 발명의 융합 단백질의 펩티도글리칸 가수분해효소는 박테리아 펩티도글리칸을 분해할 수 있는 임의의 펩티도글리칸 가수분해효소일 수 있다. 이러한 펩티도글리칸 가수분해효소는 효소적 활성의 면에서 예를 들어 엔도펩티다아제, N-아세틸-뮤라모일-L-알라닌-아미다아제(아미다아제), N-아세틸-뮤라미다아제, N-아세틸-글루코스아미니다아제 또는 라이틱 트랜스글리코실라아제일 수 있고 따라서 박테리아 세포 벽의 펩티도글리칸을 분해하기에 적절하다. 바람직하게는, 펩티도글리칸 가수분해효소는 폐렴간균(K. pneumoniae), 대장균(E.　coli) 또는 녹농균(P. aeruginosa) 등과 같은 그램-음성 박테리아의 펩티도글리칸을 분해한다.
박테리아 세포 벽의 펩티도글리칸 구조는 작은 변형을 수반하여 전체적으로 대부분 보존된다(Schleifer & Kandler 1972). 박테리아 종들은 서로 다른 아미노산들로 구성되는 펩티드간 브릿지(interpeptide bridge)를 갖거나 심지어 펩티드간 브릿지를 결여할 수 있다. 펩티드간 브릿지를 결여하는 펩티도글리칸 구조에서 디아미노피멜산(DAP: Diaminopimelic acid) 또는 메조-디아미노피멜산(mDAP: 일종의 아미노산, 라이신의 입실론-카르복시 유도체가 펩티도글리칸의 전형적인 구성성분임을 나타냄)(디아미노피멜산은 아미노산 L-Lys를 대체하고 대향의 펩티드 쇄의 말단 아미노산 D-Ala에 직접적으로 가교-결합되는 잔기이다. 따라서, 제한된 형태들의 펩티도글리칸 가수분해효소에 의해 가수분해될 수 있는 사용가능한 화학 결합들이 존재한다. 펩티도글리칸 가수분해효소는 상기 나열된 바와 같은 효소적 활성을 갖는 적어도 하나의 효소 도메인을 나타낸다. 게다가 펩티도글리칸 가수분해효소는 일부 경우들에서 펩티도글리칸에 결합하고 펩티도글리칸 가수분해효소의 효소적 활성을 지지하기에 적절한 적어도 하나의 도메인을 포함한다. 결합 도메인은 전형적으로 세포-벽 결합 도메인(CBD)으로 불리운다.
펩티도글리칸 가수분해효소의 예는 척추동물 라이소자임(달걀 난백 라이소자임 및 인간 라이소자임 등), 엔도라이신(예를 들어 KZ144 엔도라이신 또는 Lys394 엔도라이신), 비리온-연관 펩티도글리칸 가수분해효소(VAPGH), 박테리오신(예를 들어 라이소스타핀) 및 오토라이신이다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 융합 단백질의 펩티도글리칸 가수분해효소는 엔도라이신이다. 가장 바람직하게는, 펩티도글리칸 가수분해효소는 엔도라이신이다. 특히 바람직한 펩티도글리칸 가수분해효소 시퀀스가 시퀀스 동정 번호: 24, 시퀀스 동정 번호: 25, 시퀀스 동정 번호: 26 및 시퀀스 동정 번호: 27로 나열되었다.
그램-음성 및 그램-양성 박테리아에 대한 펩티도글리칸 분해 활성은 당해 기술 분야에서 충분히 공지된 분석법으로, 예를 들어 그램-음성 박테리아의 외측 막이 투과되거나 제거되어(예를 들어 클로로포름으로) 추정되는 효소가 펩티도글리칸 층에 접근하는 것을 허용하는 뮤라밀용해 분석법(muralytic assay)으로 측정될 수 있다. 효소가 활성인 경우, 펩티도글리칸 층의 분해가 탁도의 강하를 야기할 수 있고, 이는 광도측정으로 측정될 수 있다(예를 들어 Briers et al., J. Biochem. Biophys Methods 70: 531-533, (2007) or Schmelcher et al., Bacteriophage endolysins as novel antimicrobials. Schmelcher M, Donovan DM, Loessner MJ. Future Microbiol. 2012 Oct;7(10):1147-7 참조).
본 발명에 따른 융합 단백질은 바람직하게는 마찬가지로 펩티도글리칸 분해 효소의 활성을 나타낸다. 즉 박테리아 펩티도글리칸을 분해할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 융합 단백질은 폐렴간균, 대장균 또는 녹농균 등과 같은 그램-음성 박테리아의 박테리아의 펩티도글리칸을 분해할 수 있을 것이다.
본 발명의 시퀀스 모티브를 포함하는 펩티드 시퀀스는 바람직하게는 펩티도글리칸 가수분해효소 시퀀스에 대하여 이종이다. 따라서 본 발명의 시퀀스 모티브를 포함하는 펩티드 시퀀스와 펩티도글리칸 가수분해효소 시퀀스는 바람직하게는 자연적으로 발생하는 폴리펩티드 쇄 내에서 함께 발생하지 않는다. 심지어 보다 바람직하게는, 시퀀스 모티브와 펩티도글리칸 가수분해효소 시퀀스는 자연적으로 발생하는 폴리펩티드 쇄 내에서 함께 발생하지 않는다.
본 발명의 융합 단백질에 있어서, 본 발명의 시퀀스 모티브를 포함하는 펩티드 시퀀스는 바람직하게는 자연에서 발생하지 않는 인공 펩티드 시퀀스이다. 본 발명에 따른 시퀀스 모티브를 포함하는 이종 펩티드의 특히 바람직한 예는 시퀀스 동정 번호: 11, 시퀀스 동정 번호: 12, 시퀀스 동정 번호: 13, 시퀀스 동정 번호: 14, 시퀀스 동정 번호: 15, 시퀀스 동정 번호: 16, 시퀀스 동정 번호: 17, 시퀀스 동정 번호: 18, 시퀀스 동정 번호: 19, 시퀀스 동정 번호: 20, 시퀀스 동정 번호: 21, 시퀀스 동정 번호: 22, 시퀀스 동정 번호: 23, 시퀀스 동정 번호: 71, 시퀀스 동정 번호: 72, 시퀀스 동정 번호: 73 및 시퀀스 동정 번호: 74이다.
본 발명의 융합 단백질의 바람직한 구현예들에 있어서, (이종) 펩티드 시퀀스(또는 시퀀스 모티브)가 아미노산 잔기들 글리신, 세린 및 세린(Gly-Ser-Ser), 글리신, 알라닌, 글리신 및 알라닌(Gly-Ala-Gly-Ala; 시퀀스 동정 번호: 28), 글리신, 알라닌, 글리신, 알라닌, 글리신, 알라닌, 글리신 및 알라닌(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala; 시퀀스 동정 번호: 29) 또는 글리신, 알라닌, 글리신, 알라닌, 글리신, 알라닌, 글리신, 알라닌, 글리신, 알라닌, 글리신 및 알라닌(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala; 시퀀스 동정 번호: 30) 등과 같은 추가의 개재 아미노산 잔기들(intervening amino acid residues ; 링커(linker))에 의해 펩티도글리칸 가수분해효소 시퀀스에 결합된다.
본 발명의 폴리펩티드, 그리고 특히 본 발명의 융합 단백질은 당연히 추가의 아미노산 시퀀스 요소들, 예를 들어 하나 이상의 태그(tag), 예를 들어 His-태그(His-tag), Strep-태그, Avi-태그, Myc-태그, Gst-태그, JS-태그, 시스테인-태그(cystein-tag), FLAG-태그 또는 당해 기술분야에서 공지된 다른 태그, 티오레독신, 말토스 결합 단백질(MBP) 등을 포함할 수 있다.
이러한 정황에서, 발명의 폴리펩티드는 추가로 예를 들어 정제를 위한 태그를 포함할 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 C-말단 및/또는 N-말단에서의 His6-태그(시퀀스 동정 번호: 31)가 바람직하다. 상기 태그는 예를 들어 복제 이유들로 인하여 추가의 아미노산 잔기들로 폴리펩티드에 결합될 수 있다. 바람직하게는 상기 태그는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 추가 아미노산 잔기들로 단백질에 결합될 수 있다. 일부 구현예들에 있어서 상기 추가의 아미노산 잔기들은 단백질분해효소들에 의해 인식되고/되거나 개열되지 않을 수 있다. 다른 구현예들에 있어서 상기 추가의 아미노산 잔기들은 단백질분해효소들에 의해 인식되고/되거나 개열된다. 바람직한 구현예에 있어서 발명의 폴리펩티드는 추가의 아미노산 잔기들 라이신 및 글리신(Lys-Gly) 또는 로이신 및 글루탐산(Leu-Glu)으로 그의 C-말단에서 폴리펩티드에 결합된 His6-태그를 포함한다. 다른 바람직한 구현예에 있어서 발명의 폴리펩티드는 추가의 아미노산 잔기들 라이신 및 글리신(Lys-Gly) 또는 로이신 및 글루탐산(Leu-Glu)으로 그의 N-말단에서 폴리펩티드에 결합된 His6-태그를 포함한다. 다른 바람직한 구현예에 있어서 폴리펩티드는 추가의 아미노산 잔기들 라이신 및 글리신(Lys-Gly) 또는 로이신 및 글루탐산(Leu-Glu)으로 그의 N-말단 및 C-말단에서 폴리펩티드에 결합된 His6-태그를 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 융합 단백질은 시퀀스 동정 번호: 32, 시퀀스 동정 번호: 33, 시퀀스 동정 번호: 34, 시퀀스 동정 번호: 35, 시퀀스 동정 번호: 36, 시퀀스 동정 번호: 37, 시퀀스 동정 번호: 38, 시퀀스 동정 번호: 39, 시퀀스 동정 번호: 40, 시퀀스 동정 번호: 41, 시퀀스 동정 번호: 42 및 시퀀스 동정 번호: 43의 시퀀스를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 융합 단백질의 다른 군은 시퀀스 동정 번호: 75, 시퀀스 동정 번호: 76, 시퀀스 동정 번호: 77 또는 시퀀스 동정 번호: 78을 포함한다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 당해 기술 분야에서 공지된 표준 수단들로, 예를 들어 적절한 숙주 세포 내에서 개개 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 재조합 발현으로 제조될 수 있다. 발명의 폴리펩티드가 예를 들어 추가로 아미노산 시퀀스 스트레치(stretch) 또는 태그 등을 포함하는 경우, 이러한 융합 단백질은 예를 들어 Sambrook et al. 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual로 기술된 바와 같은 표준 복제 기술을 사용하여 소정의 개별 핵산 시퀀스를 결합하는 것에 의하여 제조될 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 유사하게 당해 기술 분야에서 공지된 방법들로, 예를 들어, 재조합 DNA 발현 시스템에서 제조될 수 있다. 예를 들어 50개의 아미노산 길이까지의 상대적으로 짧은 본 발명에 따른 폴리펩티드는 또한 예를 들어 합성 수단에 의해 제조될 수 있다.
III. 핵산, 벡터, 박테리오파지 및 숙주 세포
본 발명은 또한 하나 이상의 본 발명의 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 발명의 핵산은 핵산에 대하여 가능한 모든 형태를 취할 수 있다. 특히 본 발명에 따른 핵산은 RNA, DNA 또는 이들의 하이브리드일 수 있다. 이들은 단일-가닥이거나 이중-가닥일 수 있다. 이들은 작은 전사물(transcript) 또는 박테리오파지 게놈 등과 같은 전체 게놈의 크기를 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 본 발명의 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 센스 가닥(sense strand)을 반영하는 핵산일 수 있다. 유사하게, 안티센스 가닥이 또한 고려된다. 핵산은 발명의 폴리펩티드의 발현을 위한 이종 프로모터(heterologous promotor)를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 융합 단백질을 인코딩하는 핵산이 특히 바람직하다.
추가의 양태에 있어서 본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 이러한 벡터는 예를 들어 발명의 폴리펩티드의 발현을 허용하는 발현 벡터일 수 있다. 상기 발현은 구성적 발현이거나 유도적 발현일 수 있다. 벡터는 또한 복제 목적을 위한 본 발명의 핵산 시퀀스를 포함하는 클론 벡터일 수 있다.
본 발명은 또한 발명의 핵산을 포함하는, 특히 본 발명에 따른 융합 단백질을 인코딩하는 발명의 핵산을 포함하는 박테리오파지에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드, 핵산, 벡터 또는 박테리오파지를 포함하는 (단리된) 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 특히 박테리아 세포 및 효모 세포로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 적절한 경우, 다른 적절한 숙주 세포는 예를 들어 포유 동물(특히 인간) 유래의 불멸화된 세포주일 수 있다. 특히 바람직한 숙주 세포는 본 발명에 따른 융합 단백질을 포함한다.
IV. 조성물
추가의 양태에 있어서 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 박테리오파지 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
특히 바람직한 본 발명의 조성물은 본 발명에 따른 융합 단백질을 포함한다. 다른 바람직한 조성물은 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 펩티도글리칸 가수분해효소를 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제, 부형제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물일 수 있다.
심지어 추가의 양태에 있어서 본 발명에 따른 조성물은 화장 조성물이다. 여러 박테리아 종들이 피부 등과 같은 환자의 신체의 환경에 노출된 표면들에 자극을 야기할 수 있다. 이러한 자극을 방지하기 위하여 또는 상기 박테리아 병원체의 작은 발현을 제거하기 위하여, 코메돈용해 효과(comedolytic effect)를 달성하기에 충분한 양의 발명의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 숙주 세포 및/또는 조성물을 포함하는 특별한 화장용 제제가 채용될 수 있다.
V. 키트
추가의 양태에 있어서 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 박테리오파지 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포를 포함하고 추가로 펩티도글리칸 가수분해효소 또는 각각 이러한 펩티도글리칸 가수분해효소를 인코딩하거나 포함하는 핵산, 벡터, 박테리오파지 및/또는 숙주 세포를 포함하는 키트에 관한 것이다. 바람직하게는, 키트는 본 발명에 따른 폴리펩티드 및/또는 펩티도글리칸 가수분해효소를 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 일 키트는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하나 본 발명의 융합 단백질을 포함하지 않는다. 즉 키트 중의 폴리펩티드는 펩티도글리칸 가수분해효소를 포함하지 않는다.
추가의 구현예에 있어서, 본 발명의 키트는 항생 또는 항균 펩티드 등과 같은 적어도 하나의 추가의 항균제를 포함한다.
VI. 용도
추가의 양태에 있어서 본 발명은 수술 또는 치료에 의하여 인체 또는 동물체의 치료의 방법에서 또는 인체 또는 동물체에 시행되는 진단 방법에서의 본 발명에 따른 폴리펩티드, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 박테리오파지, 본 발명에 따른 숙주 세포 및/또는 본 발명에 따른 조성물의 용도에 관한 것이다. 이러한 상황에서 본 발명의 폴리펩티드의 항균 활성은 특히 본 발명의 융합 단백질이 사용되는 경우에 활용될 수 있다.
이러한 방법은 전형적으로 충분한 양의 발명의 폴리펩티드(예를 들어 본 발명의 융합 단백질), 핵산, 벡터, 박테리오파지, 숙주 세포 또는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 대상체는 예를 들어 인간 또는 동물일 수 있고 인간 대상체가 보다 바람직하다. 특히, 발명의 폴리펩티드, 발명의 핵산, 발명의 벡터, 발명의 박테리오파지, 발명의 숙주 세포 및/또는 발명의 조성물은 그램-음성 박테리아 감염 등과 같은 박테리아성 감염의 치료 또는 방지를 위한 방법에서 사용될 수 있다. 이로 제한 됨이 없이, 치료의 방법은 피부, 연조직, 호흡기계, 폐, 소화관, 눈, 귀, 치아, 인후, 구강, 골, 질의 감염, 균혈증 및/또는 심내막염의 치료 및/또는 방지를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 치료의 방법에서 사용되는 투여량(dosage) 및 투여의 경로는 치료되어야 할 감염의 질환/위치에 의존적이다. 투여의 경로는 예를 들어 경구, 국소, 비인두, 비경구, 정맥내, 직장 또는 임의의 다른 경로의 투여일 수 있다.
감염의 장소에의 발명의 폴리펩티드(예를 들어 본 발명의 융합 단백질), 핵산, 벡터, 박테리오파지, 숙주 세포 또는 조성물의 적용을 위하여는 제형이 감염의 위치(또는 감염될 위험에 있는 위치)에 도달할 때까지 단백질분해효소, 산화, 면역 반응 등과 같은 환경 영향으로부터 활성 화합물을 보호하는 제형이 사용될 수 있다. 따라서, 제형은 캡슐, 드라지(dragee), 알약, 좌약, 주사액 또는 임의의 다른 의학적으로 타당한 한약 제형(medical reasonable galenic formulation)일 수 있다. 바람직하게는, 한약 제형은 적절한 담체, 안정화제, 향미제, 완충제 또는 다른 적절한 약제들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 국소 적용을 위하여는 제형은 로션 또는 일회용 반창고(plaster)일 수 있고, 비인두 적용을 위하여는 제형은 코로의 분무를 통하여 적용되어야 할 염수일 수 있다.
바람직하게는, 발명의 폴리펩티드(예를 들어 융합 단백질), 핵산, 벡터, 박테리오파지, 숙주 세포 또는 조성물이 항생제, 랜티바이오틱스(lantibiotics), 박테리오신 또는 엔도라이신 등과 같은 다른 통상적인 항균제와의 조합으로 사용된다. 통상적인 항균제의 투여는 발명의 폴리펩티드(예를 들어 융합 단백질), 핵산, 벡터, 박테리오파지, 숙주 세포 또는 조성물의 투여 이전, 동시 또는 이후에 일어날 수 있다.
추가의 양태에 있어서 본 발명은 의료적 진단, 식품 진단, 사료 진단 또는 환경 진단에서의 진단 수단, 특히 박테리아 감염, 특히 그램-음성 박테리아에 의해 야기되는 박테리아 감염의 진단을 위한 진단 수단으로서 사용하기 위한 발명의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 박테리오파지, 숙주 세포 또는 조성물에 관한 것이다. 이 점에 있어서 발명의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물은 병원성 박테리아, 특히 그램-음성 병원성 박테리아의 펩티도글리칸을 특이적으로 분해하기 위한 도구로서 사용될 수 있다. 발명의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물에 의한 박테리아 세포의 분해는 폴리믹신 비(polymyxin B) 같은 박테리아 세포 외피를 약화시키는 Triton X-100 또는 다른 첨가제의 첨가에 의해 지원될 수 있다. PCR, 핵산 하이브리드화 또는 NASBA(핵산 시퀀스 기반 증폭), IMS 같은 면역학적 방법, 면역형광법 또는 ELISA 기술 등과 같은 방법들 또는 구별되는 박테리아 군 또는 종에 대하여 특이적인 단백질(예를 들어 엔테로박테리아에 대한 β-갈락토시다아제, 응고효소 양성 균주에 대한 응고효소(coagulase))을 사용하는 효소적 분석법과 같이 박테리아 세포의 세포 내용물에 의존하는 다른 방법들에 기반하는 핵산을 사용하는 박테리아의 특이적인 검출 이전의 초기 단계로서 특정한 세포 분해가 요구된다.
추가의 양태에 있어서 본 발명은 식품, 사료 또는 화장품에서의 항균제로서의 발명의 폴리펩티드, 발명의 핵산, 발명의 벡터, 발명의 박테리오파지, 발명의 숙주 세포 및/또는 발명의 조성물의 용도 또는 소독작용제(disinfecting agent)로서의 용도에 관한 것이다. 이들은 특히 식품, 식품 가공 설비, 식품 가공 공장, 식품과 접촉하게 되는 (무생물의) 표면(선반 및 식품 저장소 등과 같은), 사료, 사료 가공 설비, 사료 가공 공장, 사료와 접촉하게 되는 (무생물의) 표면(선반 및 사료 저장소 등과 같은), 의료 기구 또는 병원, 의사의 사무실 및 다른 의료 시설의 (무생물의) 표면의 그램-음성 박테리아 오염의 치료 또는 방지를 위하여 사용될 수 있다.
실시예
하기에서 본 발명의 여러 구현예들 및 양태들을 설명하는 특정한 실시예들이 제공된다. 그러나, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 특정한 구현예들로 범위가 한정되어서는 안될 것이다. 결국, 본 명세서에서 기술된 것들에 더하여 본 발명의 여러 변형들은 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 앞서의 상세한 설명, 첨부되는 도면 및 하기 실시예들로부터 용이하게 이해될 것이다. 이러한 변형들 모두는 첨부된 특허청구범위의 범위 내에 속한다.
실시예 1: 본 발명의 시퀀스 모티브에의 항균 펩티드 세크로핀 에이(이집트숲모기)의 적용이 항균 활성을 증가시킴
항균 펩티드 세크로핀 에이(Cecropin A)(이집트숲모기(A. aegypti))(GGLKKLGKKLEGAGKRVFNAAEKALPVVAGAKALRK; 시퀀스 동정 번호: 44)가 당해 기술분야에서 예를 들어 엔도라이신과의 융합을 위한 후보로서 제안되었다(WO 2010/149792 참조). 그러나, 세크로핀 에이(이집트숲모기)와 KZ144 엔도라이신의 융합은 SMAP-29 펩티드와 KZ144의 융합인 것과 같이 녹농균 및 대장균 박테리아에 대하여 효과적이지 않다. 더욱이, 세크로핀 에이(이집트숲모기)가 제1 군으로부터의 아미노산 적어도 40%가 존재하여야만 한다는 요건에 순응하는 시퀀스 모티브를 나타내지 않기 때문에, 세크로핀 에이(이집트숲모기)는 본 발명의 시퀀스 모티브와 순응하지 않는다. 따라서 본 발명자는 상기 군의 추가의 아미노산의 도입이 항균 활성을 증가시킬 수 있을 것으로 추리하였다.
이러한 가설을 시험하기 위하여, 본 발명자는 세크로핀 에이(이집트숲모기)를 Lys394 엔도라이신에 융합시켜 시퀀스 동정 번호: 45의 시퀀스를 포함하는 융합 단백질을 수득하였다. 병행하여, 세크로핀 에이(이집트숲모기) 펩티드 시퀀스가 여러 포지션들에서 C-말단으로 끝이 절단되고 돌연변이되고(펩티드: GGLKKLGKKLKKAGKRVFKAAKKAL; 시퀀스 동정 번호: 11) Lys394 엔도라이신에 융합된 유사한 융합 단백질이 제조되었다. 그 결과의 융합 단백질은 시퀀스 동정 번호: 32의 시퀀스를 포함한다. 추가의 라이신 잔기의 도입으로 인하여, 변성된 세크로핀 에이(이집트숲모기) 시퀀스가 이제 본 발명의 시퀀스 모티브에 순응하게 되었다. 두 융합 단백질들이 폐렴간균 박테리아(K. pneumoniae bacteria)에 대한 이들의 항균 활성에 대하여 시험되었다.
박테리아를 (Luria-Bertani) 배지에서 성장시키고 Mueller-Hinton 배지 중에 1:10으로 희석시켰다. 약 0.6의 광학 밀도 OD600에서 박테리아를 동일한 배지 중에 1:10으로 그리고 후속하여 1:500의 희석으로 희석시켰다. 서로 다른 농도의 단백질을 사용하여 단백질 완충제(20 mM HEPES, 500 mM NaCl, pH 7.4) 및 단백질을 96 웰 플레이트 내로 피펫팅하고 500 μM EDTA 최종 농도, 180 ㎕의 박테리아 세포 또는 배지(Mueller-Hinton)를 포함하는 20 ㎕의 최종 용적의 대조가 96 웰 플레이트에 주어지고 혼합되었다. 플레이트를 18 내지 22 시간 동안 37℃에서 배양시키고 박테리아 성장을 웰의 OD600 값을 측정하여 결정하였다. 무-박테리아 대조와 동일한 OD600 값을 나타낸 웰의 단백질 농도인 MIC가 결정되었다.
표 1: 시험된 융합 단백질의 최소 억제 농도
Lys394 엔도라이신(시퀀스 동정 번호: 45)에의 세크로핀 에이(이집트숲모기)의 융합은 25 ㎍/㎖의 MIC로 항균 활성을 나타내었다. 돌연변이된 세크로핀 에이(이집트숲모기) 시퀀스(시퀀스 동정 번호: 32)와의 융합으로 MIC가 훨씬 낮아졌다. ≤ 5 ㎍/㎖는 이미 (가장 낮은) 출발 농도에서 박테리아 성장이 관찰될 수 있다는 것을 의미한다. 더 낮은 농도는 시험되지 않았다. 즉 실제 MIC는 심지어 5 ㎍/㎖ 보다 더 낮을 수 있다. 따라서 본 발명의 시퀀스 모티브에 상응하는 세크로핀 에이(이집트숲모기)의 설계가 원래의 항균 펩티드의 항균 활성을 개선시켰다.
실시예 2: 항균 활성에서의 개선은 엔도라이신 부분과 독립적임
항균 활성에서의 증가가 실시예 1에서 활용된 펩티드와 엔도라이신의 조합에 대하여 독특한 것인지의 여부를 시험하기 위하여, 본 발명자는 융합에서 동일한 펩티드(즉 시퀀스 동정 번호: 11 및 시퀀스 동정 번호: 44)를 다른 엔도라이신 OBPgpLys에 대하여 시험하였다. 그 결과의 폴리펩티드들(시퀀스 동정 번호: 46 및 시퀀스 동정 번호: 33)을 근본적으로 실시예 1에서 기술된 바와 같이 그러나 녹농균 PAO1 박테리아(P. aeruginosa PAO1 bacteria)에 대하여 시험하였다.
표 2: 시험된 융합 단백질들의 최소 억제 농도
OBPgpLys 엔도라이신(시퀀스 동정 번호: 46)에의 세크로핀 에이(이집트숲모기)의 융합은 17.5 ㎍/㎖의 MIC로 항균 활성을 나타내었다. 돌연변이된 세크로핀 에이(이집트숲모기) 시퀀스(시퀀스 동정 번호: 33)와의 융합으로 MIC가 유의미하게 낮아졌다(12.5 ㎍/㎖). 따라서, 항균 활성에서의 개선은 사용된 엔도라이신의 시퀀스에 의존적이지 않다.
본 발명의 시퀀스 모티브에의 펩티드 BMAP -28의 적용이 항균 활성을 증가시킴
소의 카텔리시딘 족의 펩티드(GGLRSLGRKILRAWKKYGPIIVPIIRIG; 시퀀스 동정 번호: 47)인 BMAP-28을 KZ144 엔도라이신의 유도체(시퀀스 동정 번호: 25)에 융합시켜 시퀀스 동정 번호: 48을 포함하는 융합 단백질을 수득하였다. 병행하여, BMAP-28의 펩티드 시퀀스가 2개의 포지션들에서 돌연변이되고(펩티드: RGLRRLGRKILRAWKKYGPIIVPIIRIG; 시퀀스 동정 번호: 12) 동일한 KZ144 엔도라이신의 유도체에 융합된 유사한 융합 단백질(융합 단백질: 시퀀스 동정 번호: 34)이 제조되었다. BMAP-28 펩티드의 N-말단 영역 내에서의 2개의 아르기닌 아미노산의 도입으로 인하여, 상기 시퀀스는 이제 본 발명의 시퀀스 모티브에 순응하게 되었다. 두 융합 단백질들이 대장균 박테리아(E. coli bacteria)에 대한 이들의 항균 활성에 대하여 시험되었다.
박테리아를 (Luria-Bertani) 배지에서 성장시키고 Mueller-Hinton 배지 중에 1:10으로 희석시켰다. 약 0.6의 광학 밀도 OD600에서 박테리아를 동일한 배지 중에 1:10으로 그리고 후속하여 1:500의 희석으로 희석시켰다. 서로 다른 농도의 단백질을 사용하여 단백질 완충제(20 mM HEPES, 500 mM NaCl, pH 7.4) 및 단백질을 96 웰 플레이트 내로 피펫팅하고 500 μM EDTA 최종 농도, 180 ㎕의 박테리아 세포 또는 배지(Mueller-Hinton)를 포함하는 20 ㎕의 최종 용적의 대조가 96 웰 플레이트에 주어지고 혼합되었다. 플레이트를 18 내지 22 시간 동안 37℃에서 배양시키고 박테리아 성장을 웰의 OD600 값을 측정하여 결정하였다. 무-박테리아 대조와 동일한 OD600 값을 나타낸 웰의 단백질 농도인 MIC가 결정되었다.
표 3: 시험된 융합 단백질들의 최소 억제 농도
"＞30 ㎍/㎖"는 원래의 BMAP-28 펩티드(시퀀스 동정 번호: 48)로의 비-돌연변이된 융합 단백질에 대하여는 항균 활성이 30 ㎍/㎖의 농도까지 관찰되지 않았다는 것을 의미한다. 더 높은 농도에서의 항균 활성이 가능하나, 실험적으로 검증되지는 않았다. 대조적으로, 돌연변이된 BMAP-28 펩티드 단편으로의 융합 단백질에 대하여는 10 ㎍/㎖의 MIC로 유의미한 항균 활성이 관찰되었다. 이러한 결과는 본 발명자에 의하여 확인된 시퀀스 모티브의 중요성을 강조하고 개개 폴리펩티드의 설계가 신규한 항균제의 제조를 용이하게 할 수 있음을 나타내고 있다.
실시예 4: 시퀀스 모티브 중의 양으로 하전된 아미노산의 형태(type)의 유의미한 영향이 거의 없음
추가의 실험에서, 본 발명자는 MSI 78(4-20) 단편(KFLKKAKKFGKAFVKIL; 시퀀스 동정 번호: 49)과 Lys394 엔도라이신(시퀀스 동정 번호: 50를 수반하는 융합 단백질)로 이루어진 융합 단백질을 변성된 MSI 78(4-20) 펩티드(RFLRRARRFGRAFVRIL; 시퀀스 동정 번호: 13)이 Lys394 엔도라이신에 융합된 유사한 융합 단백질(융합 단백질: 시퀀스 동정 번호: 35)과 비교하였다. 변성된 MSI 78(4-20) 펩티드(시퀀스 동정 번호: 13)에서 MSI 78(4-20) 펩티드의 라이신 잔기가 아르기닌 잔기로 치환되었다. 두 융합 단백질들이 대장균 박테리아(E. coli bacteria)에 대한 이들의 항균 활성에 대하여 시험되었다.
박테리아를 (Luria-Bertani) 배지에서 성장시키고 Mueller-Hinton 배지 중에 1:10으로 희석시켰다. 약 0.6의 광학 밀도 OD600에서 박테리아를 동일한 배지 중에 1:10으로 그리고 후속하여 1:500의 희석으로 희석시켰다. 서로 다른 농도의 단백질을 사용하여 단백질 완충제(20 mM HEPES, 500 mM NaCl, pH 7.4) 및 단백질을 96 웰 플레이트 내로 피펫팅하고 500 μM EDTA 최종 농도, 180 ㎕의 박테리아 세포 또는 배지(Mueller-Hinton)를 포함하는 20 ㎕의 최종 용적의 대조가 96 웰 플레이트에 주어지고 혼합되었다. 플레이트를 18 내지 22 시간 동안 37℃에서 배양시키고 박테리아 성장을 웰의 OD600 값을 측정하여 결정하였다. 무-박테리아 대조와 동일한 OD600 값을 나타낸 웰의 단백질 농도인 MIC가 결정되었다.
표 4: 시험된 융합 단백질들의 최소 억제 농도
두 융합 단백질들이 근본적으로 동일한 범위에서 항균 활성을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 시퀀스 모티브 중에 제1 군으로부터 선택된 양으로 하전된 아미노산(예를 들어 K 또는 R)의 형태는 중요성이 덜 하다.
실시예 5: 본 발명의 시퀀스 모티브에의 펩티드 마가이닌의 적용이 항균 활성을 증가시킴
남아프리카발톱개구리(Xenopus laevis)(GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS; 시퀀스 동정 번호: 51)로부터의 항균 펩티드인 마가이닌을 Lys394 엔도라이신(시퀀스 동정 번호: 24)에 융합시켜 시퀀스 동정 번호: 52를 포함하는 융합 단백질을 수득하였다. 병행하여, 유사한 융합 단백질이 제조되었다. 마가이닌의 펩티드 시퀀스가 끝이 절단되고 링커(펩티드: GIKKFLKSAKKFGKAFKKVIRGGGGS; 시퀀스 동정 번호: 14)와 결합되었다. 상기 펩티드 시퀀스가 Lys394 엔도라이신에 융합되었다(융합 단백질: 시퀀스 동정 번호: 36). 두 융합 단백질들을 실시예 2에서 기술된 바와 같은 녹농균 PAO1 박테리아(P.　aeruginosa PAO1 bacteria)에 대한 항균 활성에 대하여 시험하였다.
표 5: 시험된 융합 단백질들의 최소 억제 농도
"＞30 ㎍/㎖"는 원래의 마가이닌 펩티드(시퀀스 동정 번호: 52)로의 비-돌연변이된 융합 단백질에 대하여는 항균 활성이 30 ㎍/㎖의 농도까지 관찰되지 않았다는 것을 의미한다. 더 높은 농도에서의 항균 활성이 가능하나, 실험적으로 검증되지는 않았다. 대조적으로, 돌연변이된 마가이닌 펩티드 단편으로의 융합 단백질에 대하여는 ≤5 ㎍/㎖의 MIC로 유의미한 항균 활성이 관찰되었다.
실시예 6: 본 발명의 시퀀스 모티브에의 펩티드 HPA-NT3의 적용이 항균 활성을 증가시킴
헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)-유도 펩티드(FKRLKKLFKKIWNWK; 시퀀스 동정 번호: 53)인 HPA-NT3을 KZ144 엔도라이신의 유도체(시퀀스 동정 번호: 25)에 융합시켜 시퀀스 동정 번호: 54를 포함하는 융합 단백질을 수득하였다. 병행하여, HPA-NT3의 펩티드 시퀀스가 본 발명의 시퀀스 모티브(펩티드: KRLKKLAKKIWKWGRRGPGS; 시퀀스 동정 번호: 15)에 적용되고 KZ144 엔도라이신의 동일한 유도체에 융합된 유사한 융합 단백질(융합 단백질: 시퀀스 동정 번호: 37)을 생성하였다. 두 융합 단백질들을 실시예 2에서 기술된 바와 같은 녹농균 PAO1 박테리아에 대한 이들의 항균 활성에 대하여 시험하였다.
표 6: 시험된 융합 단백질들의 최소 억제 농도
"＞18 ㎍/㎖"는 원래의 HPA-NT3 펩티드(시퀀스 동정 번호: 54)로의 비-돌연변이된 융합 단백질에 대하여는 항균 활성이 18 ㎍/㎖의 농도까지 관찰되지 않았다는 것을 의미한다. 더 높은 농도에서의 항균 활성이 가능하나, 실험적으로 검증되지는 않았다. 대조적으로, 돌연변이된 HPA-NT3 펩티드(시퀀스 동정 번호: 15)로의 융합 단백질에 대하여는 12.5 ㎍/㎖의 MIC로 항균 활성이 관찰되었다. 따라서 본 발명의 모티브에의 항균 펩티드의 적용이 융합 단백질의 항균 활성을 증가시켰다.
실시예 7: 스토뉴스톡신의 시퀀스 모티브로부터 출발하는 인공 항균 펩티드의 신규한 생성
동정된 시퀀스 모티브의 적합성을 추가로 입증하기 위한 시도에서, 본 발명자는 엔도라이신으로의 융합을 위한 유용한 펩티드 시퀀스 내로 이전에 어떠한 항균 활성도 공지되지 않은 펩티드 시퀀스를 부여하고자 시도하였다. 이러한 목적을 위하여, 본 발명자는 스토뉴스톡신(stonustoxin)의 알파 서브유닛(alpha subunit)의 아미노산 298-326(IPLIHDKISNFQQIFQDY㎖TVQKKIAEK; 시퀀스 동정 번호: 55)에 의존하였다. 스토뉴스톡신은 리프 스톤피시(reef stonefish) 독소의 한 성분이다. 독소의 영향에는 중증의 통증, 쇼크, 마비 및 조직 괴사가 포함된다. 그러나 항균 활성은 공지되지 않았다.
시퀀스 동정 번호: 55를 KZ144 엔도라이신의 유도체에 융합시켜 시퀀스 동정 번호: 56을 포함하는 융합 단백질을 수득하였다. 병행하여, 스톤피시 시퀀스가 여러 포지션들에서 돌연변이되고(펩티드: IKLIKRVIKKFKKIFRKYPLTVKKGIAVG; 시퀀스 동정 번호: 16) KZ144 엔도라이신의 동일한 유도체에 융합되어 유사한 융합 단백질(융합 단백질: 시퀀스 동정 번호: 38)이 제조되었다. 스톤피시 시퀀스에서의 여러 아미노산들의 변경으로 인하여, 상기 시퀀스의 처음 18개의 아미노산들이 이제 본 발명의 시퀀스 모티브에 순응하게 되었다. 특히, 상기 시퀀스 모티브 내의 양으로 하전된 아미노산들의 백분율이 증가되었고(라이신 및 아르기닌 잔기로) 프롤린 잔기가 제거되었다. 두 융합 단백질들을 녹농균 박테리아에 대한 이들의 항균 활성에 대하여 시험하였다.
박테리아를 (Luria-Bertani) 배지에서 성장시키고 Mueller-Hinton 배지 중에 1:10으로 희석시켰다. 약 0.6의 광학 밀도 OD600에서 박테리아를 동일한 배지 중에 1:10으로 그리고 후속하여 1:500의 희석으로 희석시켰다. 서로 다른 농도의 단백질을 사용하여 단백질 완충제(20 mM HEPES, 500 mM NaCl, pH 7.4) 및 단백질을 96 웰 플레이트 내로 피펫팅하고 500 μM EDTA 최종 농도, 180 ㎕의 박테리아 세포 또는 배지(Mueller-Hinton)를 포함하는 20 ㎕의 최종 용적의 대조가 96 웰 플레이트에 주어지고 혼합되었다. 플레이트를 18 내지 22 시간 동안 37℃에서 배양시키고 박테리아 성장을 웰의 OD600 값을 측정하여 결정하였다. 무-박테리아 대조와 동일한 OD600 값을 나타낸 웰의 단백질 농도인 MIC가 결정되었다.
표 7: 시험된 융합 단백질들의 최소 억제 농도
＞91 ㎍/㎖는 원래의 스토뉴스톡신 펩티드(시퀀스 동정 번호: 55)로의 비-돌연변이된 융합 단백질(시퀀스 동정 번호: 56)에 대하여는 항균 활성이 91 ㎍/㎖의 농도까지 관찰되지 않았다는 것을 의미한다. 더 높은 농도에서의 항균 활성을 배제할 수 없으나, 시험되지는 않았다. 이는 기대된 바와 같이 상기 융합에서 사용된 스토뉴스톡신 단편이 어떠한 항균 활성에 대하여도 공지되지 않았고 KZ144 엔도라이신 단독은 원래 녹농균에 대하여 비활성이기 때문이다. 대조적으로, 돌연변이된 스토뉴스톡신 펩티드 단편을 수반하는 융합 단백질에 대하여는 17까지의 MIC로 예기치 못한 신규한 항균 활성이 관찰되었다. 이러한 결과는 본 발명자에 의하여 확인된 시퀀스 모티브의 중요성을 강조하고 개개 폴리펩티드의 설계가 신규한 항균제의 제조를 용이하게 할 수 있음을 나타내고 있다.
실시예 8: CagL 단백질의 시퀀스 모티브로부터 출발하는 인공 항균 펩티드의 신규한 생성
본 발명자는 헬리코박터 파이로리의 CagL 단백질의 아미노산 26-48(GLKQLDSTYQETNQQVLKNLDE; 시퀀스 동정 번호: 57)을 기반으로 2개의 추가의 신규한 항균 펩티드를 제조하였다. CagL 단백질은 선모 표면에 대하여 표적화된 헬리코박터 파이로리의 특화된 부착소(specialized adhesin)이며 여기에서 이는 인테그린 α5β1에 결합되고 CagA 단백질의 위의 상피 세포 내로의 수용기-의존성 전달을 매개한다. 항균 활성은 보고되지 않았다.
시퀀스 동정 번호: 57을 KZ144 엔도라이신의 유도체에 융합시켜 시퀀스 동정 번호: 58을 포함하는 융합 단백질을 수득하였다. 병행하여, CagL 시퀀스가 여러 포지션들에서 돌연변이된 2개의 유사한 융합 단백질이 제조되어(펩티드1: GLKKLKRVYRKWVKAVKKVLKLGGGGS; 시퀀스 동정 번호: 17, C-말단 링커를 포함; 펩티드2: GLKVLKKAYRRIRKAVRKILKA; 시퀀스 동정 번호: 18) 본 발명의 모티브와 일치하였다. 펩티드들이 KZ144 엔도라이신의 동일한 유도체에 융합되었다(융합 단백질: 시퀀스 동정 번호: 39 및 시퀀스 동정 번호: 40). 두 융합 단백질들을 실시예 2에서 기술된 바와 같은 녹농균 박테리아에 대한 이들의 항균 활성에 대하여 시험하였다.
표 8: 시험된 융합 단백질들의 최소 억제 농도
＞90 ㎍/㎖는 원래의 CagL 펩티드(시퀀스 동정 번호: 57)로의 비-돌연변이된 융합 단백질(시퀀스 동정 번호: 58)에 대하여는 항균 활성이 90 ㎍/㎖의 농도까지 관찰되지 않았다는 것을 의미한다. 이는 기대된 바와 같이 상기 융합에서 사용된 CagL 단편이 어떠한 항균 활성에 대하여도 공지되지 않았고 KZ144 엔도라이신 단독은 원래 녹농균에 대하여 비활성이기 때문이다. 대조적으로, 돌연변이된 CagL 펩티드 단편을 수반하는 융합 단백질 둘 다에 대하여는 12.5 및 15 ㎍/㎖ 까지의 MIC로 예기치 못한 신규한 항균 활성이 관찰되었다.
실시예 9: IE1 단백질의 시퀀스 모티브로부터 출발하는 인공 항균 펩티드의 신규한 생성
IE1 단백질의 아미노산 178-198에 기반하여 다음의 신규한 항균 펩티드(YKEKFMVCLKQIVQYAVNS; 시퀀스 동정 번호:59)가 제조되었다. IE1은 인간 거대세포바이러스에서 파생되었고 항균 활성이 알려지지 않았다.
시퀀스 동정 번호: 59를 KZ144 엔도라이신의 유도체에 융합시켜 시퀀스 동정 번호: 60을 포함하는 융합 단백질을 수득하였다. 병행하여, IE1 시퀀스가 여러 포지션들에서 돌연변이되고(펩티드: YKRAFKKVLKRIRRYAKRS; 시퀀스 동정 번호: 19) KZ144 엔도라이신의 동일한 유도체에 융합되었다(융합 단백질: 시퀀스 동정 번호: 41). 두 융합 단백질들을 실시예 2에서 기술된 바와 같은 녹농균 박테리아에 대한 이들의 항균 활성에 대하여 시험하였다.
표 9: 시험된 융합 단백질들의 최소 억제 농도
＞30은 원래의 IE1 펩티드(시퀀스 동정 번호: 59)로의 비-돌연변이된 융합 단백질(시퀀스 동정 번호: 60)에 대하여는 항균 활성이 30 ㎍/㎖의 농도까지 관찰되지 않았다는 것을 의미한다. 더 높은 농도에서의 항균 활성을 배제할 수 없으나, 시험되지는 않았으며 상기 융합에서 사용된 IE1 단편이 어떠한 항균 활성에 대하여도 공지되지 않았기 때문에 기대되지 않았다. 대조적으로, 돌연변이된 IE1 펩티드 단편을 수반하는 융합 단백질에 대하여는 15 및 20 ㎍/㎖까지의 MIC로 예기치 못한 신규한 항균 활성이 관찰되었다.
실시예 10: 본 발명의 시퀀스 모티브를 수반하는 펩티드를 포함하는 추가의 융합 단백질의 생성
본 발명자는 또한 시퀀스 동정 번호: 42의 시퀀스를 포함하는 추가의 융합 단백질을 제조하였다. 상기 융합 단백질은 본 발명에 순응하는 펩티드를 포함한다(시퀀스 동정 번호: 20). 융합 단백질들을 실시예 2에서 보고된 바와 같은 녹농균 박테리아에 대한 이들의 항균 활성에 대하여 시험하였다.
표 10: 시험된 융합 단백질들의 최소 억제 농도
신규한 펩티드를 수반하는 융합 단백질에 대하여 ≤5 ㎍/㎖로 유의미한 항균 활성이 관찰되었다.
실시예 11: 본 발명의 시퀀스 모티브를 수반하는 펩티드를 포함하는 융합 단백질의 여러 변형들의 제조
본 발명자는 본 발명의 모티브에 순응하는 펩티드를 포함하는 추가의 융합 단백질들을 제조하였다(시퀀스 동정 번호: 61, 시퀀스 동정 번호: 62, 시퀀스 동정 번호: 63, 시퀀스 동정 번호: 64, 시퀀스 동정 번호: 65, 시퀀스 동정 번호: 66, 시퀀스 동정 번호: 67, 시퀀스 동정 번호: 68). 융합 단백질들이 대장균 박테리아에 대한 항균 활성에 대하여 시험되었다.
표 11: 시험된 융합 단백질들의 최소 억제 농도
모든 융합 단백질들에 대하여 항균 활성이 관찰되었다.
실시예 12: 본 발명의 시퀀스 모티브에의 Briers et al.의 펩티드 MW2의 적용
Briers et al. (MBio. 2014;5(4):e01379-14)은 여러 융합 단백질들 그 중에서도 펩티드 MW2(시퀀스 동정 번호: 69)의 제조를 보고하였다. 상기 펩티드는 본 발명의 시퀀스 모티브에 순응하지 않는다. 이 펩티드로부터 출발하여 본 발명자는 상기 펩티드와 KZ144 엔도라이신의 유도체(시퀀스 동정 번호: 25)를 포함하는 융합 단백질을 제조하여 시퀀스 동정 번호: 70에 따른 융합 단백질의 결과를 가져왔다. 게다가, 본 발명자는 시퀀스 동정 번호: 69의 펩티드의 여러 유도체들을 제조하였다(시퀀스 동정 번호: 71, 시퀀스 동정 번호: 72, 시퀀스 동정 번호: 73 및 시퀀스 동정 번호: 74). 이들 유도체들은 본 발명의 시퀀스 모티브와 매칭되는 반면에 MW2는 그렇지 않다. 그 결과의 융합 단백질들이 시퀀스 동정 번호: 75, 시퀀스 동정 번호: 76, 시퀀스 동정 번호: 77 및 시퀀스 동정 번호: 78에 제공되었다. 융합 단백질들을 실시예 2에서 기술된 바와 같은 녹농균 PAO1 박테리아에 대한 항균 활성에 대하여 시험하였다.
표 12: 시험된 융합 단백질들의 최소 억제 농도
모든 융합 단백질들에 대하여 항균 활성이 관찰되었다. 주목할 만하게, MW2 펩티드의 4개의 유도체들에 기반하는 융합 단백질들(즉 본 발명의 시퀀스 모티브에 적용된)이 "야생형" MW2 펩티드를 수반하는 융합 단백질과 비교하여 개선된 항균 활성을 수득하였다.
실시예 13: 추가의 펩티도글리칸 가수분해효소와의 조합으로의 펩티드 마가 이닌의 용도
본 발명자는 또한 실시예 5의 2개의 펩티드들을 추가의 펩티도글리칸 가수분해효소, 즉 비브리오 파지(Vibrio phage)ICP1 (시퀀스 동정 번호: 27)와 조합하였다. 그 결과로 생긴 융합 단백질들은 시퀀스 동정 번호: 79 및 시퀀스 동정 번호: 43의 시퀀스들을 포함한다. 융합 단백질들이 대장균 박테리아에 대한 항균 활성에 대하여 시험되었다.
표 13: 시험된 융합 단백질들의 최소 억제 농도
그 결과의 융합 단백질들이 둘 다 항균 활성을 나타내었다. 본 발명의 시퀀스 모티브에 순응하는 펩티드(시퀀스 동정 번호: 14)는 다시 야생형 펩티드(시퀀스 동정 번호: 51)에 비하여 더 나은 활성을 제공하였다.
실시예 14: 추가의 펩티드들
최종 세트의 실험에서 본 발명자는 각각이 엔도라이신 시퀀스 및 본 발명에 따른 시퀀스 모티브에 순응하는 펩티드를 포함하는 3가지 추가의 융합 단백질들을 제조하였다. 3가지 펩티드들은 시퀀스 동정 번호: 21, 시퀀스 동정 번호: 22 및 시퀀스 동정 번호: 23이었다. 그 결과의 3가지 융합 단백질들 모두는 우수한 항균 활성을 나타내었다.
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for N-terminal triplet block of amino acids of the first group <400> 5 Lys Arg Lys Glu 1 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example for C-terminal triplet block of amino acids of the first group <400> 6 Leu Lys Arg Lys 1 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of a sequence precluded from the sequence motif, if a triplet of amnio acids of the first group is present <400> 7 Arg Arg Arg Gly Leu Arg His 1 5 <210> 8 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of sequence not allowable within the sequence motif <400> 8 Lys Arg Lys Lys 1 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of sequence not allowable within the sequence motif <400> 9 Arg Arg Arg Arg 1 <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> SMAP-29 sheep;aa1-18 <400> 10 Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys Lys 1 5 10 15 Tyr Gly <210> 11 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 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291 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mutated peptide deriving from amino acids 298-326 of the alpha subunit of stonustoxin linked to mutated KZ144 with C14S, C23S and C50S <400> 38 Met Ile Lys Leu Ile Lys Arg Val Ile Lys Lys Phe Lys Lys Ile Phe 1 5 10 15 Arg Lys Tyr Pro Leu Thr Val Lys Lys Gly Ile Ala Val Gly Gly Ser 20 25 30 Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln 35 40 45 Thr Leu Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile 50 55 60 Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn 65 70 75 80 Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu 85 90 95 Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro 100 105 110 Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val 115 120 125 Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser 130 135 140 Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala 145 150 155 160 Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr 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<210> 55 <211> 29 <212> PRT <213> Synanceia verrucosa <400> 55 Ile Pro Leu Ile His Asp Lys Ile Ser Asn Phe Gln Gln Ile Phe Gln 1 5 10 15 Asp Tyr Met Leu Thr Val Gln Lys Lys Ile Ala Glu Lys 20 25 <210> 56 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acids 298-326 of the alpha subunit of stonustoxin linked to mutated KZ144 with C14S, C23S and C50S <400> 56 Met Ile Pro Leu Ile His Asp Lys Ile Ser Asn Phe Gln Gln Ile Phe 1 5 10 15 Gln Asp Tyr Met Leu Thr Val Gln Lys Lys Ile Ala Glu Lys Gly Ser 20 25 30 Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln 35 40 45 Thr Leu Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile 50 55 60 Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn 65 70 75 80 Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu 85 90 95 Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro 100 105 110 Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val 115 120 125 Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg 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26-48 of CagL protein linked to mutated KZ144 with C14S, C23S and C50S <400> 58 Met Gly Leu Lys Gln Leu Asp Ser Thr Tyr Gln Glu Thr Asn Gln Gln 1 5 10 15 Val Leu Lys Asn Leu Asp Glu Gly Ser Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp 20 25 30 Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ser Gly 35 40 45 Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn 50 55 60 Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile 65 70 75 80 Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro 85 90 95 Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala 100 105 110 Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg 115 120 125 Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr 130 135 140 Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu 145 150 155 160 Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly 165 170 175 Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser 180 185 190 Ala Leu Met Gly 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Gly Asp Arg Gly Asp Glu 20 25 30 Val Ser Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly 35 40 45 Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys 50 55 60 Phe Gln Lys Asp Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn 65 70 75 80 Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys 85 90 95 Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro 100 105 110 Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu 115 120 125 Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala 130 135 140 Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp 145 150 155 160 Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp 165 170 175 Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly 180 185 190 Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys 195 200 205 Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro 210 215 220 Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala 225 230 235 240 Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn 245 250 255 Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp 260 265 270 Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys 275 280 <210> 66 <211> 284 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 66 Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys 1 5 10 15 Lys Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp 20 25 30 Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ser Gly 35 40 45 Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn 50 55 60 Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile 65 70 75 80 Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro 85 90 95 Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala 100 105 110 Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg 115 120 125 Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr 130 135 140 Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu 145 150 155 160 Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly 165 170 175 Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser 180 185 190 Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg 195 200 205 Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His 210 215 220 Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn 225 230 235 240 Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser 245 250 255 Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr 260 265 270 Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys 275 280 <210> 67 <211> 280 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 67 Met Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys Lys Tyr Gly Arg Gly Leu 1 5 10 15 Arg Arg Leu Gly Ser Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu 20 25 30 Val Ser Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly 35 40 45 Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys 50 55 60 Phe Gln Lys Asp Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn 65 70 75 80 Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys 85 90 95 Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro 100 105 110 Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu 115 120 125 Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala 130 135 140 Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp 145 150 155 160 Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp 165 170 175 Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly 180 185 190 Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys 195 200 205 Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro 210 215 220 Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala 225 230 235 240 Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn 245 250 255 Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp 260 265 270 Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys 275 280 <210> 68 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 68 Met Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys Lys Tyr Gly Arg Gly Leu 1 5 10 15 Arg Arg Leu Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser 20 25 30 Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln 35 40 45 Thr Leu Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile 50 55 60 Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn 65 70 75 80 Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu 85 90 95 Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro 100 105 110 Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val 115 120 125 Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser 130 135 140 Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala 145 150 155 160 Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu 165 170 175 Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu 180 185 190 Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys 195 200 205 Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp 210 215 220 Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg 225 230 235 240 Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys 245 250 255 Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro 260 265 270 Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala 275 280 285 His Arg Lys 290 <210> 69 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence; MW2 <400> 69 Gly Lys Pro Gly Trp Leu Ile Lys Val Ala Leu Lys Phe Lys Lys Leu 1 5 10 15 Ile Arg Arg Pro Leu Lys Arg Leu Ala 20 25 <210> 70 <211> 295 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> MW2 peptide linked to mutated KZ144 with C14S, C23S and C50S <400> 70 Met Gly Lys Pro Gly Trp Leu Ile Lys Val Ala Leu Lys Phe Lys Lys 1 5 10 15 Leu Ile Arg Arg Pro Leu Lys Arg Leu Ala Gly Ser Lys Val Leu Arg 20 25 30 Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn 35 40 45 Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn 50 55 60 Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser Leu Asp Ser 65 70 75 80 Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr 85 90 95 Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys 100 105 110 Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr 115 120 125 Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala 130 135 140 Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe 145 150 155 160 Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met 165 170 175 Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro 180 185 190 Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn 195 200 205 Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr 210 215 220 Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr 225 230 235 240 Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala 245 250 255 Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln 260 265 270 Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys Leu 275 280 285 Glu His His His His His His 290 295 <210> 71 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence; MW2 mut (I7R;L11R;P20G) <400> 71 Gly Lys Pro Gly Trp Leu Arg Lys Val Ala Arg Lys Phe Lys Lys Leu 1 5 10 15 Ile Arg Arg Gly Leu Lys Arg Leu Ala 20 25 <210> 72 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence; MW2 mut (P3V;I7R;L11R) <400> 72 Gly Lys Val Gly Trp Leu Arg Lys Val Ala Arg Lys Phe Lys Lys Leu 1 5 10 15 Ile Arg Arg Pro Leu Lys Arg Leu Ala 20 25 <210> 73 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence; MW2 mut (I7R) <400> 73 Gly Lys Pro Gly Trp Leu Arg Lys Val Ala Leu Lys Phe Lys Lys Leu 1 5 10 15 Ile Arg Arg Pro Leu Lys Arg Leu Ala 20 25 <210> 74 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence; MW2 mut (L11R) <400> 74 Gly Lys Pro Gly Trp Leu Ile Lys Val Ala Arg Lys Phe Lys Lys Leu 1 5 10 15 Ile Arg Arg Pro Leu Lys Arg Leu Ala 20 25 <210> 75 <211> 295 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mutated peptide deriving from MW2 peptide linked to mutated KZ144 with C14S, C23S and C50S <400> 75 Met Gly Lys Pro Gly Trp Leu Arg Lys Val Ala Arg Lys Phe Lys Lys 1 5 10 15 Leu Ile Arg Arg Gly Leu Lys Arg Leu Ala Gly Ser Lys Val Leu Arg 20 25 30 Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn 35 40 45 Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn 50 55 60 Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser Leu Asp Ser 65 70 75 80 Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr 85 90 95 Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys 100 105 110 Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr 115 120 125 Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala 130 135 140 Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe 145 150 155 160 Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met 165 170 175 Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro 180 185 190 Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn 195 200 205 Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr 210 215 220 Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr 225 230 235 240 Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala 245 250 255 Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln 260 265 270 Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys Leu 275 280 285 Glu His His His His His His 290 295 <210> 76 <211> 295 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mutated peptide deriving from MW2 peptide linked to mutated KZ144 with C14S, C23S and C50S <400> 76 Met Gly Lys Val Gly Trp Leu Arg Lys Val Ala Arg Lys Phe Lys Lys 1 5 10 15 Leu Ile Arg Arg Pro Leu Lys Arg Leu Ala Gly Ser Lys Val Leu Arg 20 25 30 Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn 35 40 45 Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn 50 55 60 Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser Leu Asp Ser 65 70 75 80 Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr 85 90 95 Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys 100 105 110 Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr 115 120 125 Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala 130 135 140 Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe 145 150 155 160 Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met 165 170 175 Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro 180 185 190 Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn 195 200 205 Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr 210 215 220 Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr 225 230 235 240 Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala 245 250 255 Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln 260 265 270 Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys Leu 275 280 285 Glu His His His His His His 290 295 <210> 77 <211> 295 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mutated peptide deriving from MW2 peptide linked to mutated KZ144 with C14S, C23S and C50S <400> 77 Met Gly Lys Pro Gly Trp Leu Arg Lys Val Ala Leu Lys Phe Lys Lys 1 5 10 15 Leu Ile Arg Arg Pro Leu Lys Arg Leu Ala Gly Ser Lys Val Leu Arg 20 25 30 Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn 35 40 45 Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn 50 55 60 Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser Leu Asp Ser 65 70 75 80 Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr 85 90 95 Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys 100 105 110 Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr 115 120 125 Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala 130 135 140 Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe 145 150 155 160 Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met 165 170 175 Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro 180 185 190 Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn 195 200 205 Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr 210 215 220 Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr 225 230 235 240 Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala 245 250 255 Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln 260 265 270 Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys Leu 275 280 285 Glu His His His His His His 290 295 <210> 78 <211> 295 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mutated peptide deriving from MW2 peptide linked to mutated KZ144 with C14S, C23S and C50S <400> 78 Met Gly Lys Pro Gly Trp Leu Ile Lys Val Ala Arg Lys Phe Lys Lys 1 5 10 15 Leu Ile Arg Arg Pro Leu Lys Arg Leu Ala Gly Ser Lys Val Leu Arg 20 25 30 Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr Leu Leu Asn 35 40 45 Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe Gly Asn Asn 50 55 60 Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser Leu Asp Ser 65 70 75 80 Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr 85 90 95 Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys 100 105 110 Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr 115 120 125 Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala 130 135 140 Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe 145 150 155 160 Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met 165 170 175 Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro 180 185 190 Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn 195 200 205 Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr 210 215 220 Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr 225 230 235 240 Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala 245 250 255 Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln 260 265 270 Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys Leu 275 280 285 Glu His His His His His His 290 295 <210> 79 <211> 264 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Magainin peptide linked to tail baseplate protein of Vibrio phage ICP1 <400> 79 Met Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala 1 5 10 15 Phe Val Gly Glu Ile Met Asn Ser Gly Ser Met Ile Leu Lys Arg Gly 20 25 30 Ser Ser Gly Ala Asp Val Lys Asn Met Gln Glu Tyr Leu Thr Ala Leu 35 40 45 Gly Tyr Asp Thr Lys Gly Val Glu Gly Thr Phe Glu Gly Gly Thr Glu 50 55 60 Ser Ala Val Lys Ala Phe Gln Lys Asp Met Ser Phe Thr Val Val Asp 65 70 75 80 Gly Ile Ile Gly Asn Gln Thr Ala Lys His Leu Val Asp Met Tyr Tyr 85 90 95 Gly Lys Val Val Pro Phe Gly Tyr Val Thr Asn Thr Pro Trp Val Ser 100 105 110 Glu Ala Ile Glu Asp Tyr Phe Val Ser Glu Ile Lys Gly Glu Lys His 115 120 125 Asn Pro Arg Val Val Gln Tyr Phe Lys Asp Ala His Ser Ser Trp Phe 130 135 140 Thr Asp Asp Glu Thr Pro Trp Cys Ala Ala Ala Val Ser Ser Trp Leu 145 150 155 160 Glu Arg Ala Gly Ile Arg Ser Val Arg Ser Ala Arg Ala Arg Asp His 165 170 175 Ile Asn Phe Gly Thr Lys Leu Leu Glu Pro Arg Phe Gly Ala Ile Val 180 185 190 Val Leu Glu Arg Gly Ala Asn Ser Gly His Val Gly Phe Val Asn Gly 195 200 205 Val Thr Ala Asp Gly Lys Gln Ile Lys Val Leu Gly Gly Asn Gln Ser 210 215 220 Asp Ser Val Asn Glu Arg Met Phe Gln Val Thr Arg Val Leu Gly Tyr 225 230 235 240 Arg Gln Pro Glu Gly Phe Val Leu Pro Pro Cys Pro Ile Val Gly Lys 245 250 255 Gly Glu Leu Ser Lys Ser Glu Ala 260

Claims (28)

  1. 하기를 포함하는 융합 단백질:
    a) 펩티도글리칸 가수분해효소의 시퀀스, 및
    b) 펩티도글리칸 가수분해효소에 대하여 이종인 펩티드 시퀀스, 상기 이종인 펩티드 시퀀스는 하기의 시퀀스 모티프를 포함함:
    i) 16, 17, 18, 19 또는 20 개의 아미노산의 길이이고;
    ii) 라이신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어지는 아미노산의 제1 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 40% 그리고 최대 60% 포함하고,
    각각의 아미노산은 상기 제1 군으로부터 독립적으로 선택되고,
    제1 군으로부터 선택되는 각각의 아미노산은 단독으로, 제1 군으로부터 선택되는 추가의 아미노산과 쌍으로 함께, 또는 제1 군으로부터 선택되는 추가의 2개의 아미노산과 블록으로 상기 시퀀스 모티브 내에 배열되나, 하나의 블록 내에 제1 군으로부터 선택되는 3개 또는 그 이상의 아미노산이 발생하지 않으며, 제1 군으로부터 선택되는 적어도 2 쌍의 아미노산들이 상기 시퀀스 모티브 내에 존재하며, 및 제1 군으로부터의 3개의 아미노산을 수반하는 이러한 블록이 상기 시퀀스 모티브 내에 존재하는 경우의 추가적인 가정을 수반하여 제1 군으로부터 선택되는 아미노산 3개를 일렬로 수반하는 최대 하나의 블록이 상기 시퀀스 모티브 내에 존재하고, 이때 상기 시퀀스 모티브 내에서 발견될 수 있는 개개의 포지션으로 제공되는, 3개의 아미노산 블록의 제1 아미노산에 대한 포지션 -12, -11, -8, -5, -4, +6, +7, +10, +13 및 +14에서의 아미노산은, 상기 제1 군으로부터 선택되지 않으며,
    iii) 알라닌, 글리신, 이소로이신(isoleucine), 로이신(leucine), 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어지는 아미노산의 제2 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 40% 그리고 최대 60% 포함하고,
    각 아미노산은 상기 제2 군으로부터 독립적으로 선택되고,
    제1 군으로부터 그리고 제2 군으로부터 선택되는 아미노산들의 합이 시퀀스 모티브의 100%가 되는 경우, 적어도 3개의 서로 다른 아미노산들이 이 제2 군으로부터 선택되며;
    상기 시퀀스 모티브는 적어도 2개의 단일의, 비-인접하는 페닐알라닌 잔기를 포함하고 이들 페닐알라닌 잔기들 중의 적어도 하나가 직접적으로 라이신 잔기에 선행하는 경우, 시퀀스 모티브가 시퀀스 AFV를 포함하지 않으며,
    상기 시퀀스 모티브가 적어도 3개의 단일의, 비-인접하는 히스티딘 잔기를 포함하는 경우, 시퀀스 모티브가 시퀀스 AALTH (시퀀스 동정 번호: 2)를 포함하지 않으며,
    iv) 상기 시퀀스 모티브의 잔여의 아미노산들은, 상기 모티브 내에 존재하는 것인 경우, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민, 글루탐산, 메티오닌 또는 시스테인으로 이루어지는 제3 군으로부터 선택되고, 상기 아미노산 각각은 상기 제3 군으로부터 독립적으로 선택되며 상기 글루타민은 단지 한 번만 선택될 수 있고, 상기 선택은 추가로 글루타민과 글루탐산의 조합을 포함하지 않을 수 있음, 및
    상기 융합 단백질은 시퀀스 동정 번호: 1의 시퀀스를 포함하지 않음.
  2. 제1항에 있어서, 상기 시퀀스 모티브가 하기 표:

    에 묘사된 시퀀스 모티브들 중의 하나에 따르고, 상기 표에서 "X"는 시퀀스 모티브가 개개의 포지션에서 제1 군으로부터 선택되는 아미노산을 나타내지 않는, 융합 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 상기 "X"는 상기 포지션에서 제2 군으로부터 선택되는 아미노산을 나타내는 것을 의미하는 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 시퀀스 모티브는 17, 18 또는 19개의 아미노산의 길이인 융합 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 제3 군으로부터 선택되는 아미노산이 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민 및 글루탐산으로부터 선택되는, 융합 단백질.
  6. 제1항에 있어서, 시퀀스 모티브가 제3 군으로부터 선택되는 하나 초과의 아미노산을 포함하지 않는, 융합 단백질.
  7. 제1항에 있어서, 시퀀스 모티브가 제1 군의 3개의 아미노산들로 이루어지는 블록을 포함하지 않는 융합 단백질.
  8. 제1항에 있어서, 펩티드 시퀀스가 자연에서 발생하지 않는 인공의 펩티드 시퀀스인, 융합 단백질.
  9. 제1항에 있어서, 펩티도글리칸 가수분해효소가 Lys394, KZ144, OBPgpLys 엔도라이신 또는 비브리오 파지 ICP1의 테일 베이스플레이트 단백질(tail baseplate protein)인, 융합 단백질.
  10. 제1항에 있어서, 상기 시퀀스 모티브가 헬리컬(helical)인 융합 단백질.
  11. 제1항에 있어서, 프롤린 잔기가 시퀀스 모티브의 1 내지 5개의 아미노산 잔기 N-말단 또는 C-말단 내에 위치되는, 융합 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 상기 프롤린 잔기가 펩티도글리칸 가수분해효소의 시퀀스와 시퀀스 모티브 사이에 위치되는, 융합 단백질.
  13. 제1항에 있어서, 상기 시퀀스 모티브가 펩티도글리칸 가수분해효소의 시퀀스의 N-말단에 위치되는, 융합 단백질.
  14. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 시퀀스 동정 번호: 11, 시퀀스 동정 번호: 12, 시퀀스 동정 번호: 13, 시퀀스 동정 번호: 14, 시퀀스 동정 번호: 15, 시퀀스 동정 번호: 16, 시퀀스 동정 번호: 17, 시퀀스 동정 번호: 18, 시퀀스 동정 번호: 19, 시퀀스 동정 번호: 20, 시퀀스 동정 번호: 21, 시퀀스 동정 번호: 22, 시퀀스 동정 번호: 23, 시퀀스 동정 번호: 32, 시퀀스 동정 번호: 33, 시퀀스 동정 번호: 34, 시퀀스 동정 번호: 35, 시퀀스 동정 번호: 36, 시퀀스 동정 번호: 37, 시퀀스 동정 번호: 38, 시퀀스 동정 번호: 39, 시퀀스 동정 번호: 40, 시퀀스 동정 번호: 41 시퀀스 동정 번호: 42 및 시퀀스 동정 번호: 43으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시퀀스를 포함하는, 융합 단백질.
  15. 시퀀스 동정 번호: 11, 시퀀스 동정 번호: 12, 시퀀스 동정 번호: 13, 시퀀스 동정 번호: 14, 시퀀스 동정 번호: 15, 시퀀스 동정 번호: 16, 시퀀스 동정 번호: 17, 시퀀스 동정 번호: 18, 시퀀스 동정 번호: 19, 시퀀스 동정 번호: 20, 시퀀스 동정 번호: 22 또는 시퀀스 동정 번호: 23의 시퀀스를 포함하는 폴리펩티드.
  16. 제1항에 따른 융합 단백질을 인코딩하는 핵산.
  17. 제16항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  18. 제16항에 따른 핵산을 포함하는 박테리오파지.
  19. 제1항에 따른 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 인코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 핵산을 포함하는 박테리오파지, 또는 이들의 조합을 포함하는, 숙주 세포.
  20. i) 제1항에 따른 융합 단백질; 상기 융합 단백질을 인코딩하는 핵산; 상기 핵산을 포함하는 벡터; 상기 핵산을 포함하는 박테리오파지; 상기 융합 단백질 또는 상기 핵산 또는 상기 벡터 또는 상기 박테리오파지를 포함하는 숙주 세포; 또는 상기 융합 단백질 또는 상기 핵산 또는 상기 벡터 또는 상기 박테리오파지 또는 상기 숙주 세포를 포함하는 조성물을 포함하고, 추가로 ii) 펩티도글리칸 가수분해효소 또는 개별적으로 상기 펩티도글리칸 가수분해효소를 인코딩하거나 포함하는 핵산, 벡터, 박테리오파지 또는 숙주 세포를 포함하는, 키트.
  21. 제15항에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산.
  22. 제21항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  23. 제21항에 따른 핵산을 포함하는 박테리오파지.
  24. 제15항에 따른 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 핵산을 포함하는 박테리오파지, 또는 이들의 조합을 포함하는, 숙주 세포.
  25. i) 제15항에 따른 폴리펩티드; 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산; 상기 핵산을 포함하는 벡터; 상기 핵산을 포함하는 박테리오파지; 상기 폴리펩티드 또는 상기 핵산 또는 상기 벡터 또는 상기 박테리오파지를 포함하는 숙주 세포; 또는 상기 폴리펩티드 또는 상기 핵산 또는 상기 벡터 또는 상기 박테리오파지 또는 상기 숙주 세포를 포함하는 조성물을 포함하고, 추가로 ii) 펩티도글리칸 가수분해효소 또는 개별적으로 상기 펩티도글리칸 가수분해효소를 인코딩하거나 포함하는 핵산, 벡터, 박테리오파지 또는 숙주 세포를 포함하는, 키트.
  26. 제1항에 있어서, 수술 또는 치료에 의한 인체 또는 동물체의 치료의 방법에서 사용하기 위한, 또는 인체 또는 동물체에 시행되는 진단 방법에서 사용하기 위한, 융합 단백질.
  27. 제1항에 있어서, 식품, 사료 또는 화장품에서 항균제로서 또는 소독작용제로서 사용하기 위한, 융합 단백질.
  28. 제1항에 있어서, 식품, 식품 가공 설비, 식품 가공 공장, 식품과 접촉하게 되는 표면, 사료, 사료 가공 설비, 사료 가공 공장, 사료와 접촉하게 되는 표면, 의료 기구 또는 병원, 의사의 사무실 및 다른 의료 시설의 무생물의 표면의 그램-음성 박테리아 오염의 처치(treatment) 또는 방지(prevention)를 위한 융합 단백질.
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