PL229262B1 - Polipeptyd zdolny do trawienia peptydoglikanu, jego zastosowania oraz kodujący go polinukleotyd - Google Patents

Description

Ujawniona została lizyna bakteriofaga Enterococcus faecalis Ef12c29-ami, o wysokiej aktywności litycznej w stosunku do komórek Enterococcus oraz sekwencja kodującego ją genu, sposób modyfikacji tego genu i jego produktu pozwalający na nadprodukcję zmodyfikowanej lizyny w formie aktywnej w komórkach bakteryjnych oraz zastosowanie zmodyfikowanej lizyny do trawienia peptydoglikanu lub destrukcji komórek Enterococcus lub innych bakterii, w celach preparatyki biochemicznej w badaniach, biotechnologii i przemyśle oraz jako czynnika przeciwbakteryjnego.

Głównym problemem w zwalczaniu niepożądanych bakterii oraz pozyskiwaniu zawartości bakterii w preparatyce biochemicznej, biotechnologii i przemyśle jest spowodowanie destrukcji komórek bakteryjnych.

Elementem ochronnym komórek bakteryjnych, przeciwdziałającym wewnątrzkomórkowemu ciśnieniu osmotycznemu, jest otaczająca cytoplazmę, zbudowana z peptydoglikanu, sztywna ściana komórkowa (Silhavy i in., 2010). Jest ona oddzielona od cytoplazmy błoną cytoplazmatyczną. Uszkodzenie ściany prowadzi do śmierci komórki i uwolnienia jej zawartości na skutek tzw. lizy osmotycznej rozerwania rozdętej przez ciśnienie wewnątrzkomórkowe błony cytoplazmatycznej. Dlatego wiele enzymów zdolnych do uszkadzania ściany przez trawienia wiązań chemicznych w peptydoglikanie, w tym znany powszechnie lizozym, ma działanie bakteriobójcze. Wykorzystuje się je również do pozyskiwania zawartości komórek bakteryjnych, np. przy izolacji z bakterii kwasów nukleinowych lub białek (Salazar i Asenjo, 2007).

Zdolność do trawienia peptydoglikanu wykazują m. in. endolizyny - lizyny kodowane przez bakteriofagi (Nelson i in., 2012). Są one gromadzone w komórkach podczas rozwoju litycznego faga. Trawią wiązania pomiędzy elementami strukturalnymi peptydoglikanu ściany powodując liżę komórki i wydostanie się na zewnątrz namnożonych w niej fagów. Ściana komórkowa bakterii Gram-dodatnich jest gruba i ma bezpośredni kontakt z otaczającym środowiskiem. Umożliwia to zewnętrzne stosowanie endolizyn jako środków zabijających te bakterie w terapiach antybakteryjnych i dezynfekcji, a także w preparatyce biochemicznej jako środków wspomagających uwolnienie treści komórkowej. Dzięki aktywności bakteriolitycznej i wąskiej, ograniczonej często do gatunku, specyficzności endolizyn bakteriofagów bakterii Gram-dodatnich, stanowią one również wyjątkowo bezpieczne narzędzia w walce z wielolekoopornymi szczepami bakteryjnych patogenów (Pastagia i in., 2013).

Specyficzność endolizyn fagowych i lizyn innego pochodzenia jest limitowana obecnością w tych enzymach domen mających powinowactwo do ścian komórkowych określonych bakterii lub aktywnością katalityczną ograniczoną do określonych wiązań pomiędzy składnikami peptydoglikanu (Nelson i in., 2012). Składniki te mogą różnić się u bakterii różnych taksonów (Vollmer i in., 2008).

Enterococcus faecalis i Enterococcus faecium są Gram-dodatnimi bakteriami kwasu mlekowego, stanowiącymi naturalny składnik mikroflory bytującej na błonach śluzowych, głównie układu pokarmowego ludzi i zwierząt. Jako typowi przedstawiciele bakterii Gram-dodatnich enterokoki posiadają gruby, wielowarstwowy peptydoglikan złożony z polisacharydów, peptydów i kwasu tejchojowego (Vollmer i in., 2008). Jednak w skład mostka peptydowego sieciującego główne elementy strukturalne ich peptydoglikanu wchodzi nietypowa reszta D-asparaginy. Dodatkowo ich peptydoglikan charakteryzuje się wysokim poziomem O-acetylacji (Pfeffer i in., 2006). Dlatego enzymy lityczne efektywnie trawiące peptydoglikan innych bakterii, takie jak np. lizozym, nie są aktywne lub też wykazują słabą aktywność w stosunku do ścian komórkowych enterokoków. Chociaż kombinacja lizozymu z mutanolizyną stosowana jest do lizy komórek entrokoków, skuteczna liza wymaga wysokich stężeń obu enzymów i długich czasów reakcji (Billot-Klein i in., 1996). Jest to problemem przy stosowaniu ogólnodostępnych preparatów do szybkiej lizy bakterii w odniesieniu do komórek enterokoków lub też w metodach izolacji kwasów nukleinowych lub białek z konsorcjów mikroorganizmów mogących zawierać enterokoki, np. do celów badań metagenomicznych.

Dodatkowo, w ostatnich latach szczepy E. faecalis i E. faecium stały się jedną z głównych przyczyn zakażeń pochodzenia szpitalnego, dzięki nabywaniu lekooporności, w tym oporności na uważaną za antybiotyk ostatniej szansy wankomycynę (Arias i Murray, 2012). Szczególnie u osób z obniżoną odpornością immunologiczną enterokoki mogą powodować poważne schorzenia: bakteriemię, zapalenie wsierdzia czy dróg moczowych. Liczba izolowanych od pacjentów szczepów Enterococcus opornych na antybiotyki beta-laktamowe i uważaną za antybiotyk ostatniej szansy wankomycynę w alarmującym tempie wzrasta. W tym kontekście enzymy lityczne zdolne do efektywnej destrukcji żywych komórek

PL 229 262 B1

Enterococcus, są pożądanymi środkami antybakteryjnymi przeciwko enterokokom, alternatywnymi dla antybiotyków.

Celem prezentowanego wynalazku jest dostarczenie enzymu litycznego, możliwego do nadprodukcji w komórkach bakteryjnych, umożliwiającego wydajną destrukcję ścian komórkowych bakterii Gram-dodatnich, w szczególności rodzaju Enterococcus i charakteryzującego się wysoką aktywnością enzymatyczną szczególnie w stosunku do ściany komórkowej Enterococcus.

Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd zdolny do trawienia peptydoglikanu, zwłaszcza wytwarzanego przez komórki bakterii rodzaju Enterococcus, zawierający domenę enzymatyczną posiadającą sekwencję aminokwasową oznaczoną jako Sekw. Nr 3. Korzystnie, polipeptyd według wynalazku posiada sekwencję aminokwasową wybraną spośród Sekw. Nr 2 lub Sekw. Nr 4.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest polinukleotyd zawierający sekwencję kodującą polipeptyd według wynalazku określony powyżej. Korzystnie, polinukleotyd według wynalazku posiada sekwencję nukleotydową oznaczoną jako Sekw. Nr 1.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polipeptydu według wynalazku określonego powyżej do trawienia peptydoglikanu, zwłaszcza wytwarzanego przez komórki bakterii rodzaju Enterococcus.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest polipeptyd według wynalazku określony powyżej do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu zakażeniom bakteryjnym, zwłaszcza wywołanym przez bakterie rodzaju Enterococcus.

Szczegółowy opis wynalazku

Przedmiotem jednej spośród zaprezentowanych realizacji wynalazku jest lizyna fagowa o cechach sekwencji aminokwasowej odróżniającej ją od znanych lizyn oraz wysokiej aktywności litycznej w stosunku do bakterii, w tym w szczególności do bakterii rodzaju Enterococcus.

Kolejna realizacja wynalazku dotyczy modyfikacji białka w/w lizyny pozwalających na jej nadprodukcję w komórkach bakteryjnych w aktywnej formie.

W ramach poszukiwań genów kodujących potencjalne endolizyny w genomie bakteriofaga Ef12c29 Enterococcus faecalis, autorzy zidentyfikowali gen Ef12c29ORF15 (SEQ ID NO. 1), którego produkt białkowy oznaczony jako Ef12c29-ami (o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO. 2) posiadał cechy charakterystyczne dla enzymów litycznych - amidaz N-acetylmuramoyl-L-alaniny (fig. 1; fig. 2). Niespodziewanie okazało się, że różni się on znacznie od homologów zdeponowanych w bazach danych białkowych obecnością przynajmniej czterech unikalnych reszt aminokwasowych w rejonach przewidzianego centrum aktywnego i przewidzianej domeny wiążącej substrat. Aktywność lityczną tylko jednego z homologów (oznaczonego Gl: 225626379 na fig. 2), częściowo różnego od Ef12c29-ami w przewidzianej części katalitycznej i całkowicie różnego od Ef12c29-ami w przewidzianej części wiążącej substrat, wstępnie wcześniej zweryfikowano (Son i in., 2010). Pozostałe przewidziano jedynie na podstawie sekwencji aminokwasowej przetłumaczonej z sekwencji DNA. Co ciekawe cztery oczyszczone ostatnio białka o aktywności litycznej w stosunku do Enterococcus (Sugahara i in., 2007; Yoong i in., 2004; Zhang i in., 2013; Uchiyama i in., 2011) nie wykazywały żadnych znaczących homologii z Ef12c29-ami.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że próby sklonowania całego genu kodującego białko Ef12c29-ami kończą się niepowodzeniami, prawdopodobnie z powodu lizy komórek zawierających prawidłowe klony. Chociaż większość endolizyn fagowych może być nadprodukowana w komórkach bakteryjnych, gdyż ich sekwencje aminokwasowe nie zawierają sygnałów transportu przez błonę cytoplazmatyczną, istnieją endolizyny posiadające na N-końcu sygnał transportu przez błonę, tzw. sekwencję SAR (Young, 2005). Nadprodukcja tych endolizyn w komórkach bakteryjnych sprawia problemy. Przedostając się przez błonę cytoplazmatyczną uzyskują one dostęp do ściany komórkowej, trawią ją i powodują li zę. Dotąd nie wykryto tzw. sekwencji „consensus” dla rejonów SAR endolizyn. Wiadomo jedynie, że są to rejon y hydrofobowe o sekwencjach mogących przypominać domeny transbłonowe. Przeprowadzona na potrzeby prezentowanego wynalazku analiza sekwencji aminokwasowej białka Ef12c29-ami wykazała, że jego N-koniec zawiera zgrupowania hydrofobowych reszt aminokwasowych podobne do tych występujących w znanych domenach SAR endolizyn fagowych i mógłby potencjalnie pełnić rolę domeny transbłonowej pośredniczącej w transporcie enzymu przez błonę cytoplazmatyczną (fig. 3).

W celu wyeliminowania toksyczności endolizyny Ef12c29-ami dla komórek bakterii, podjęto próbę sklonowania zamplifikowanego genu kodującego Ef12c29-ami, w wersji pozbawionej fragmentu DNA z 5' końca tego genu kodującego 19 reszt aminokwasowych z N-końca białka. Pozbawiony końca 5' gen, kodujący skróconą wersję białka Ef12c29-ami, oznaczoną na potrzeby tego wynalazki jako

PL 229 262 B1

Ef12c29-amiv1 (SEQ ID NO. 3), wklonowano do plazmidu pCOLDIII w taki sposób, żeby usunięty fragment 5' końca zastąpić sekwencją ATGAATCACAAAGTGCATATGGAGCTC z wektora pCOLDIII dołączoną w tej samej ramce odczytu do skróconej sekwencji genu dla białka Ef12c29-ami i kodującą fragment o sekwencji aminokwasowej: MNHKVHMEL. Bez problemu otrzymano transformanty zawierające wstawkę o pożądanej sekwencji, które nadprodukowały białko Ef12c29-ami z sekwencją 19 reszt aminokwasowych z N-końca zastąpioną sekwencją MNHKVHMEL, oznaczone na potrzeby obecnego wynalazku jako Ef12c29-amiv2 (SEQ ID NO. 4) (fig. 4). Białko Ef12c29-amiv2 otrzymano w wersji zawierającej na końcu sześć reszt histydynowych, co pozwoliło na jego oczyszczenie z wykorzystaniem standardowych metod (fig. 5).

Znane sekwencje SAR odgrywają kluczową rolę w procesie aktywacji zawierających je endolizyn (Young, 2014). Nieoczekiwanie w trakcie prac prowadzących do uzyskania niniejszego wynalazku ustalono, że białko Ef12c29-amiv2 jest aktywne litycznie mimo braku w nim oryginalnego fragmentu N-końca Ef12c29-ami.

Wykazano, że białko to jest aktywne zarówno w lizie martwych, jak i żywych komórek bakterii Gram-dodatnich, w tym w szczególności komórek bakterii rodzaju Enterococcus (fig. 5-8). Co więcej specyficzna aktywność Ef12c29-amiv2, mierzona spadkiem gęstości optycznej zawiesiny bakterii rodzaju Enterococcus w czasie, na mg białka, okazała się kilkakrotnie wyższa niż mierzona w równoległych eksperymentach specyficzna aktywność komercyjnie dostępnej i wykorzystywanej dotąd do lizy komórek Enterococcus, mutanolizyny Streptomyces globisporus (Sigma-Aldrich) (fig. 9). Mierzona z komórkami Enterococcus jako substratem okazała się też wyższa od specyficznej aktywności lizostafiny, mierzonej z substratem tego enzymu - komórkami Staphylococcus aureus. Ustalono również, że lizyna Ef12c29-amiv2 jest aktywna w lizie żywych komórek bakterii Gram-dodatnich innych niż bakterie rodzaju Enterococcus, takich jak Staphylococcus aureus, Bacillus subtills i Streptococcus, chociaż jej aktywność w tym wypadku była słabsza niż aktywność z optymalnym substratem - jakim okazały się komórki rodzaju Enterococcus (fig. 8). Nie wyklucza to jednak modyfikacji Ef12c29-amiv2 zmieniających jej specyficzność. Jest więc oczywiste, że Ef12c29-amiv2 może z powodzeniem znaleźć zastosowanie do lizy komórek bakterii lub destrukcji ich izolowanego peptydoglikanu, przy wszelkich możliwych zastosowaniach, w tym pozyskiwaniu zawartości bakterii w procesach izolacji ich składników komórkowych oraz jako środek przeciwbakteryjny w dezynfekcji materiałów i środowiska, a także profilaktyce i leczeniu zakażeń. Optymalne działanie enzymu w warunkach fizjologicznych (pH 7,0, 37°C) czyni go szczególnie przydatnym w zastosowaniach medycznych i weterynaryjnych, przez podanie do organizmu.

Przykład realizacji wynalazku zilustrowano następującymi figurami.

Figura 1 przedstawia sekwencję nukleotydową genu endolizyny faga Ef12c29, oznaczonego jako Ef12c29ORF15 (SEQ ID NO: 1) oraz sekwencję aminokwasową produktu tego genu oznaczonego jako Ef12c29-ami (SEQ ID NO: 2), zgodnie z prezentowanym wynalazkiem.

Figura 2 przedstawia porównanie sekwencji aminokwasowej endolizyny Ef12c29-ami z sekwencjami homologicznych endolizyn z bazy danych białkowych, z zaznaczeniem reszt aminokwasowych unikalnych dla endolizyny Ef12c29-ami (oznaczonych wskaźnikiem ▼). Numery homologów Ef12c29ami z bazy danych białkowych NCBI oznaczają kolejno: Gl:589893026 - lysin IME-IF442 of Enterococcus phage IME-IF4 (przewidziana na podstawie sekwencji DNA: NC023551.1); Gl:601127805 - N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase family protein of Enterococcus phage AUEF3 (przewidziane na podstawie sekwencji DNA: AHN83275); Gl:225626379 - amidaza EFAP1gp02 faga EFAP-1 Enterococcus faecalis; Gl:397134311 - putative endolysin of Enterococcus phage EfaCPTI (przewidziana na podstawie sekwencji DNA: JX193904); Gl:589287202 - lysin, N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase [Enterococcus phage IMEEF3] (przewidziana na podstawie sekwencji DNA: NC023595.2).

Figura 3 przedstawia porównanie sekwencji aminokwasowej N-końca białka Ef12c29-ami z sekwencjami N-końców wybranych endolizyn fagowych zawierających domenę SAR. Flydrofobowe reszty aminokwasowe podświetlono na szaro, reszty naładowane pozytywnie podkreślono. N-końce znanych endolizyn z domeną SAR przedstawiono wg. Young (2005).

Figura 4 przedstawia sekwencje aminokwasowe lizyny Ef12c29-ami zmodyfikowanej przez pozbawienie jej liczącego 19 reszt aminokwasowych fragmentu z N-końca białka i oznaczonej jako Ef12c29-amiv1 (SEQ ID NO. 3), oraz sekwencję aminokwasową lizyny Ef12c29-ami zmodyfikowaną przez zastąpienie 19-tu reszt aminokwasowych z jej N-końca fragmentem o sekwencji MNFIKVFIMEL i oznaczonej jako Ef12c29-amiv2 (SEQ ID NO. 4), zgodnie z prezentowanym wynalazkiem.

Figura 5 przedstawia kolejne etapy oczyszczania białka Ef12c29-amiv2 oraz wstępną weryfikację aktywności litycznej białka Ef12c29-amiv2 metodą zymogramu. Białka rozdzielono elektroforetycznie

PL 229 262 B1 w żelu poliakrylamidowym z SDS-em. Kolejne ścieżki żelu (A) przedstawiają otrzymane po rozdziale w żelu poliakrylamidowym: 1 i 7 - białka markera wielkości (PageRuler Prestained Protein Ladder, Thermo Scientific, Cat. No. 26616; wielkości wybranych białek markera podano w kDa), 2 - białka osadu otrzymanego po lizie i żwirowaniu komórek szczepu BL21 (DE3)-T 1R zawierającego pochodną plazmidu pCOLDIII kodującą białko Ef12c29-amiv2 w warunkach niedenaturujących, 3 - białka lizatu rozpuszczone w buforze z 8 M mocznikiem, 4 - białka lizatu rozpuszczone w buforze z 8 M mocznikiem pozostałe w przesączu z kolumny ze złożem kobaltowym TALON (FT), 5 - białka pierwszej frakcji eluatu z kolumny (E1), 6 - białka drugiej frakcji eluatu z kolumny (E2), 8 - białka frakcji E1 po dializie, białka frakcji E2 po dializie. Strzałką oznaczono Ef12c29-amiv2-6xFlis. Wstępną detekcję aktywności litycznej oczyszczonego białka Ef12c29- amiv2 przeprowadzono metodą zymogramu (B), po rozdziale białek w żelu poliakrylamidowym zawierającym 0,2% zawiesinę zabitych komórek szczepu Enterococcus faecalis Krz (lewy panel) lub Enterococcus faecium 577 (prawy panel). Kolejne ścieżki żelu B przedstawiają: 1 - białka markera wielkości, 2 - białka lizatu komórek BL21/pCOLDIII-Ef12c29-amiv2 rozpuszczone w buforze z 8 M mocznikiem, 3 - białka lizatu rozpuszczone w buforze z 8 M mocznikiem pozostałe w przesączu z kolumny ze złożem kobaltowym TALON (FT), 4 - białka pierwszej frakcji eluatu z kolumny (E1) w 8 M moczniku, 5 i 6 - białka frakcji E1 po dializie. Strzałką zaznaczono przejaśnienia w żelu wskazujące strefy lizy komórek.

Figura 6 przedstawia wykres zależności aktywności litycznej endolizyny Ef12c29-amiv2 względem komórek szczepu Enterococcus faecalis Krz od stężenia białka endolizyny w mieszaninie reakcyjnej. Procesywność enzymu przedstawiono jako spadek gęstości optycznej zawiesiny bakterii w czasie (lewy panel), a wyliczoną na tej podstawie specyficzną aktywność enzymu jako spadek gęstości optycznej zawiesiny bakterii na minutę na mg oczyszczonego białka Ef12c29-amiv2.

Figura 7 przedstawia wykres zależności aktywności litycznej endolizyny Ef12c29-amiv2 od pH mieszaniny reakcyjnej. Pomiary aktywności przeprowadzano w aparacie Bioscreen (patrz przykład 4) po dodaniu do 200 pl zawiesiny komórek 1 pg oczyszczonego białka Ef12c29-amiv2. Aktywność enzymu przedstawiono jako spadek gęstości optycznej zawiesiny bakterii w czasie.

Figura 8 przedstawia porównanie specyficznej aktywności endolizyny EF12c29-amiv2 w stosunku do komórek Enterococus faecalis Krz, Enterococcus faecium 577, Staphylococcus aureus PS80, Bacillus subtilis YB1015, Streptococcus B205 i Escherichia coli DFI5a.

Figura 9 przedstawia porównanie specyficznej aktywności litycznej EF12c29-amiv2 z lizostafiną i mutanolizyną.

Dla lepszego zrozumienia istoty wynalazku został on zilustrowany poniższymi przykładami, które przedstawiają sposób klonowania genu zmodyfikowanej endolizyny Ef12c29-ami, sposób nadekspresji tego genu i oczyszczania jego produktu, oraz określenie aktywności litycznej i specyficzności zmodyfikowanej endolizyny, Ef12c29-amiv2. Wykazują też znacząco wyższą aktywność zmodyfikowanej endolizyny Ef12c29-amiv2 w trawieniu ścian komórkowych komórek Enterococcus, w porównaniu z mutanolizyną. We wszystkich przykładach, o ile nie napisano inaczej, zastosowano standardowe metody biologii molekularnej opisane przez Sambrook i in. (1989).

P r z y k ł a d 1. Identyfikacja w genomie bakteriofaga Ef12c29 Enterococcus faecalis genu (zgodnego z sekwencją SEQ ID NO. 1) kodującego aktywną endolizynę Ef12c29-ami (zgodną z sekwencją SEQ ID NO. 2)

W wyniku analizy bioinformatycznej sekwencji genomu bakteriofaga Ef12c29 zidentyfikowano gen (SEQ ID NO. 1) kodujący białko nazwane zgodnie z prezentowanym wynalazkiem Ef12c29-ami (SEQ ID NO. 2) (fig. 1) o cechach potencjalnej endolizyny wykazującej aktywność amidazy (fig. 2). W rejonach potencjalnych kluczowych domen Ef12c29-ami odpowiedzialnych za aktywność katalityczną lub wiązanie substratu wykryto cztery unikalne reszty aminokwasowe różniące Ef12c29-ami od sekwencji najbliższego białkowego homologu z bazy danych NCBI , przewidzianego na podstawie przetłumaczenia zdeponowanej w bazie GenBank sekwencji DNA. Dodatkowo na N-końcu białka Ef12c29ami wykryto wysoce hydrofobową domenę o cechach sekwencji SAR, podobną do domeny transmembranowej (fig. 3). Gen kodujący pełnej długości białko Ef12c29-ami zamplifikowano ze starterami 5'-CACCATGAAATTAAAAGGTATTTTATTT i 5'-TACTAATGTACCCCACGTGTTGT, produkt amplifikacji zligowano ze zlinearyzowanym DNA wektora pBAD TOPO firmy Invitrogen. Mieszaniną ligacyjną transformowano komórki kompetentne szczepu Escherichia coli GC5™ (F-F80lacZDM15 A[lacZYAargF]U169 endA1 recA1relA1 gyrA96 hsdR17 [rk-,mk+]phoAsupE44 thi-1 I = T1R). Transformanty wysiewano na podłoże pełne z ampicyliną, glukozą i bez arabinozy, w opisanych poprzednio warunkach

PL 229 262 B1 selekcyjnych dla plazmidu pBAD-TOPO, zapewniających maksymalną represję transkrypcji sklonowanego genu z kontrolującego go promotora pBAD (Guzman i in., 1995). Mimo otrzymania licznych kolonii transformantów, nieoczekiwanie okazało się, że ich komórki lizują na szalce, co uniemożliwia izolację plazmidowego DNA. Po zaszczepieniu z nich hodowli płynnych, z powodu lizy nie obserwowano wzrostu. Komórki nielicznych hodowli, które nie zlizowały nie zawierały plazmidu. Otrzymany wynik wskazuje na wysoką aktywność lityczną białka Ef12c29-ami w stosunku do peptydoglikanu bakterii oraz na zdolność tego białka do przedostawania się z cytoplazmy do peryplazmy w nieobecności białek pomocniczych, co jest zgodne z obecnością potencjalnego sygnału transportu przez błonę na N-końcu Ef12c29ami. Próbę sklonowania całego genu kodującego Ef12c29-ami powtórzono w wektorze pCOLDIII (Qing i in. 2004). Fragmenty DNA otrzymane w wyniku amplifikacji całej sekwencji kodującej Ef12c29-ami ze starterami

S'-TAAGAGCTCATGAAATTAAAAGGTATTTTATTTG i

S'-ACATCTAGATTAATGATGATGATGATGATGTACTAATGTACCCCACGTGT, trawiono enzymami restykcyjnymi Sacl i Xbal i wstawiono przez ligację w miejsce fragmentu SaclXbal polilinkera plazmidu pCOLDIII. Otrzymane w ten sposób amplikony zawierały pełnej długości gen endolizyny Ef12c29-ami kodujący białko wzbogacone o znacznik sześciohistydynowy na C-końcu i sekwencję MNHKVHMEL na N-końcu. Mieszaniną ligacyjną transformowano komórki szczepu Escherichia coli DH5a (F^80lacZAM15 A[lacZYA-argF] U169 recA1 endA1 hsdR17[rk-, mk+] gal-phoA supE44 A- thi-1 gyrA96 relA1). Transformanty selekcjonowano na podłożu pełnym z ampicyliną selekcyjną dla plazmidu. Mimo kilkukrotnego powtórzenia eksperymentu otrzymano tylko nieliczne klony transformantów. Zawierały one wstawki amlifikowanego genu Ef12c29-ami, ale wszystkie wstawki niosły mutacje w sekwencji tego genu powodujące przedwczesną terminację translacji, czyli nie kodowały funkcjonalnego białka Ef12c29-ami. Otrzymane wyniki jednoznacznie wskazują na toksyczność endolizyny Ef12c29-ami produkowanej w komórkach Escherichia coli z pełnej długości genu sklonowanego w plazmidzie pCOLDIII, zgodną z zaobserwowaną wcześniej liżą komórek niosących kompletny gen dla tego białka.

P r z y k ł a d 2. Konstrukcja genu zmodyfikowanej endolizyny Ef12c29-ami, kodującego zmodyfikowane białko Ef12c29-amiv2 (zgodne z sekwencją SEQ ID NO 4) nie wykazujące toksyczności dla produkujących je komórek bakteryjnych

W celu uzyskania zmodyfikowanej formy endolizyny Ef12c29-ami możliwej do nadprodukcji w komórkach bakteryjnych gen Ef12c29-ami faga Ef12c29 pozbawiony fragmentu 57 par zasad z końca 5', kodującego potencjalny sygnał transportu przez błonę zamplifikowano ze starterami:

5'-TTGAGCTCATGCAAACAGCTAACGCATATGAAGTTA i

5'-acatctagattaatgatgatgatgatgatgtactaatgtaccccacgtgt tak, że produkt amplifikacji kodował skróconą formę Ef12c29-ami nazwaną w prezentowanym wynalazki Ef12c29-amiv1 (zgodne z sekwencją SEQ ID NO. 3) wzbogaconą o znacznik sześciohistydynowy. Fragmenty DNA otrzymane w wyniku amplifikacji trawiono enzymami restykcyjnymi Sacl i Xbal i wstawiono przez ligację w miejsce fragmentu Sacl-Xbal plazmidu pCOLDIII. Mieszaniną ligacyjną transformowano komórki kompetentne szczepu DH5a. Na podłożu pełnym z ampicyliną otrzymano liczne transformanty Wyizolowane z nich plazmidy zawierały wstawki o niezmienionej sekwencji amplifikowanego fragmentu genu Ef12c29-ami tak. że pochodna plazmidu pCOLDIII ze wstawką kodowała białko Ef12c29-amiv1 wzbogacone na N-końcu o sekwencję MNHKVHMEL i oznaczone w prezentowanym wynalazku nazwą Ef12c29-amiv2 (zgodnie z sekwencją SEQ ID NO. 4) Jeden z otrzymanych plazmidów o prawidłowej sekwencji wstawki służył do dalszych badań. Przeniesiono go metoda transformacji do komórek szczepu E. coli BL21 (DE3)-T1^R (F-ompT hsdSB[rB-mB-]gal dcm l[DE3] tonA). W hodowli komórek otrzymanego transformanta zaindukowano ekspresję sklonowanego genu zgodnie ze standardową procedurą (Qing i in., 2004). Po indukcji wśród białek tego szczepu zaobserwowano białko o masie cząsteczkowej odpowiadającej przewidzianej masie cząsteczkowej białka Ef12c29-amiv2 (-40 kDa) Wysoki wewnątrzkomórkowy poziom białka Ef12c29-amiv2 wskazywał na brak toksyczności Ef12c29-amiv2 dla komórek produkujących to białko bakterii.

P r z y k ł a d 3. Wstępna ocena aktywności litycznej białka Ef12c29-amiv2 w stosunku do ścian komórkowych zabitych komórek szczepów rodzaju Enterococcus

400 ml świeżej pożywki LB z ampicyliną zaszczepiono 1/100 objętości hodowli komórek szczepu E. coli BL21(DE3)-T1^R, zawierających plazmid pCOLDIII-Ef12c29-amiv2 i pobranych z nocnej hodowli w takiej samej pożywce. Hodowlę prowadzono w 37°C do osiągnięcia gęstości optycznej komórek przy długości fali 600 nm (OD600 ) = 0,7-1,0. Następnie, indukowano ekspresję genu kodującego Ef12c29PL 229 262 B1 amiv2 przez przeniesienie hodowli do temperatury w 16°C i dodanie 1mM IPTG. Po 16 godz. hodowlę żwirowano w celu pozyskania osadu bakteryjnego. Dla pełnego odzyskania Ef12c29-amiv2 białko oczyszczano w warunkach denaturujących. Bakterie lizowano w buforze zawierającym 20 mM Tris-HCI pH 7,0, i 500 mM NaCI, poprzez sonikację, otrzymany lizat wirowany, a uzyskany osad rozpuszczano w buforze wiążącym zawierającym 200 mM fosforan sodu pH 7,8; 500 mM NaCI, 8 M mocznik. Rozpuszczone białka wiązano ze złożem TALON Metal Affinity Resin (Clontech) poprzez mieszanie przez noc w 4°C, stosując 1 ml złoża na 10 ml białka rozpuszczonego w buforze wiążącym. Płukania złoża ze związanym białkiem i elucję przeprowadzano za pomocą buforów o obniżonym pH (odpowiednio pH = 6 i 4). Roztwory białek otrzymane po elucji, zamykano w workach dializacyjnych (Sigma, przepuszczalność 14000 Da) i dializowano kolejno po 2-12 godzin na mieszadle magnetycznym w buforach (0,5 M NaCI, 50 mM KiPO4 pH 7,8; 0,4 M arginina) zawierających coraz mniejsze stężenie mocznika (kolejno 4 M, 2 M, 1 M, 0,5 M) i na końcu w buforze bez mocznika. Z 400 ml hodowli zaindukowanych komórek otrzymywano rutynowo 5 mg oczyszczonego białka Ef12c29-amiv2. Oczyszczony enzym przechowywano w porcjach w -80°C w buforze zawierającym 0,5 M NaCI, 50 mM KiPO4 pH 7,8; 0,4 M arginina, 50% glicerol i po rozmrożeniu wykorzystywano do oznaczeń aktywności. Białka otrzymywane w kolejnych etapach oczyszczania Ef12c29-amiv2 oraz wstępną ocenę aktywności litycznej Ef12c29-amiv2 przedstawiono na fig. 5. Aktywność lityczną Ef12c29-amiv2 badano zgrubnie metodą zymogramu, zgodnie ze znaną procedurą (Leclerc i Asselin, 1989). Żel poliakrylamidowy (10%), w którym rozdzielano białka do oszacowania aktywności litycznej zawierał 0,2% objętości autoklawowanych komórek bakterii szczepu Enterococcus faecalis Krz lub Enterococcus feacium z osadu hodowli nocnej, którą po autoklawowaniu żwirowano.

P r z y k ł a d 4. Ocena aktywności litycznej Ef12c29-amiv2 względem żywych komórek szczepu Enterococcus faecalis Krz oraz wyznaczenie optymalnego pH działania enzymu

Aktywność lityczną Ef12s29-amiv2 względem żywych komórek Enterococcus faecalis oraz wpływ różnych czynników na tą aktywność oznaczano z wykorzystaniem aparatu Bioscreen C MBR (Growth Curves USA), w 100-dołkowych płytkach o dołkach przeznaczonych na 20 ppl hodowli bakterii, w 37°C z wytrząsaniem. Żywe komórki bakterii wykorzystywane w testach, pochodziły z hodowli rosnącej wykładniczo w pożywce LB. Hodowlę po osiągnięciu gęstości optycznej OD600 = 0,4 zwirowywano i osad zawieszano w buforze STB: 150 mM NaCI, 10 mM Tris pH 4,5-8,8 tak, aby gęstość optyczna zawiesiny (OD600) wynosiła 1. Zawiesinę (190 pl) dodawano do dołków płytki aparatu Bioscreen, a następnie dodawano roztwór oczyszczonego enzymu (10 pl) do wskazanej ilości i mierzono spadek gęstości optycznej hodowli w czasie. Oczyszczony enzym pochodził z rozmrożonych próbek przechowywanych w -80°C w buforze zawierającym 0,5 M NaCI, 50 mM KiPO4 pH 7,8; 0,4 M argininę i 50% glicerol. Białko Ef12c29amiv2 okazało się aktywne litycznie w stosunku do żywych komórek szczepu E. faecalis Krz, a stężenie enzymu, przy którym charakteryzował sie on najwyższą procesywnością w lizie komórek ustalono na 125 nM (fig. 6). Po dodaniu enzymu do zawiesiny komórek już po 14 minutach obserwowano wyraźny spadek gęstości hodowli. Poprzez testowanie wpływu różnych wartości pH na aktywność lityczną enzymu ustalono, że białko Ef12c29-amiv2 jest najaktywniejsze w warunkach pH 7, a w warunkach pH 6 wykazuje tylko nieco niższą aktywność lityczną (fig. 7).

P r z y k ł a d 5. Ocena zakresu aktywności litycznej Ef12c29-amiv2 względem żywych komórek szczepów bakterii Gram-dodatnich reprezentujących różne rodzaje

Zakres aktywności litycznej Ef12c29 względem żywych komórek reprezentujących szczepy wybranych gatunków bakterii Gram-dodatnich określono z wykorzystaniem komórek szczepów: E. faecium 577, S. aureus PS80, B. subtilis YB1015 oraz Streptococcus B205. Jako kontrolę pozytywna wykorzystano szczep E. faecalis Krz, a jako kontrolę negatywną szczep E. coli DH5a, który reprezentuje bakterię Gram-ujemną. Ściana komórkowa komórek bakterii Gram-ujemnych otoczona jest zewnętrzną błoną komórkową, co chroni je przed aktywnością lityczną podanych z zewnątrz endolizyn. Oznaczenia aktywności litycznej Ef12c29-amiv2 przeprowadzono w aparacie Bioscreen C, analogicznie jak w przykładzie 4. Specyficzną aktywność Ef12c29-amiv2 wyliczano jako spadek gęstości optycznej zawiesiny bakterii (OD600) na minutę na mg białka Ef12c29-amiv2. Niespodziewanie białko Ef12c29-amiv2 wykazywało w oznaczeniach wysoką aktywność lityczną zarówno w stosunku do komórek szczepu E. faecalis Krz, jak i E. faecium 577, przy czym aktywność w przypadku E. faecium 577 była tylko nieco niższa (fig. 8). Aktywność lityczną Ef12c29-amiv2 zaobserwowano również w przypadku komórek S. aureus, B. subtilis i Streptococcus, ale była ona wielokrotnie niższa.

P r z y k ł a d 6. Porównanie specyficznej aktywności lizyny Ef12c29-amiv2 ze specyficzną aktywnością mutanolizyny i lizostafiny

PL 229 262 B1

W celu porównania aktywności litycznej lizyny Ef12c29-amiv2 z mutanolizyną często wykorzystywaną w kombinacji z lizozymem do lizy komórek Entrococcus badano w aparacie Bioscreen C (patrz przykład 4), dynamikę spadku gęstości optycznej zawiesin żywych komórek Enterococcus faecalis Krz po dodaniu lizyny Ef12c29-ami2 lub mutanolizyny (Sigma-Aldrich) (fig. 9). Specyficzna aktywność Ef12c29-amiv2, mierzona jako spadek gęstości optycznej komórek na minutę na mg białka dodanego enzymu, okazała się kilkukrotnie wyższa od specyficznej aktywności mutanolizyny. W podobnym eksperymencie porównano specyficzną aktywność Ef12c29-amiv2 i lizostafiny w stosunku do żywych komórek Staphylococcus aureus jako substratu. Chociaż w tym wypadku lizyna Ef12c29-amiv2 wykazywała ośmiokrotnie niższą aktywność lityczną od lizostafiny, porównanie specyficznych aktywności Ef12c29-amiv2 i lizostafiny z substratami specyficznymi dla każdego z tych białek (odpowiednio E. faecalis Krz i S. aureus PS80) również wypadło na korzyść lizyny Ef12c29-amiv2.

Literatura

Arias C. A., Murray B. E., 2012. The rise of the Enterococcus: beyond vancomycin resistance. Nat. Rev. Microbiol. 10: 266-278.

Billot-Klein D., Shlaes D., Bryant D., Bell D., van Heijenoort J., Gutmann L., 1996. Peptidoglycan structure of Enterococcus faecium expressing vancomycin resistance of the VanB type. Biochem. J. 313: 711-715.

Guzman, L.-M., Belin, D., Carson, M. J. and Beckwith, J. 1995. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter. J. Bacteriol. 177: 4121-4130.

Leclerc, D., A. Asselin. 1989. Detection of bacterial cell wall hydrolysis after denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Can. J. Microbiol. 35: 749-753.

Nelson D., Schmelcher M., Rodriguez-Rubio L, Klumpp J., Pritchard D. G., Dong S., Donovan D. M. 2012. Endolysins as antimicrobials. Adv. Virus. Res. 83: 299-365.

Qing G., Ma L. C., Khorchid A., Swapna G. V., Mal T. K., Takayama M. M., Xia B., Phadtare S., Ke H., Acton T., Montelione G. T., Ikura M., Inouye M., 2004. Cold-shock induced high-yield protein production in Escherichia coli. Nat Biotechnol. 22: 877-82.

Pastagia M., Schuch R., Fischetti V. A., Huang D. B., 2013. Lysins: the arrival of pathogen-directed anti-infectives. J Med Microbiol. 62: 1506-1516.

Pfeffer J. M., Strating H,. Weadge J. T., Clarke A. J., 2006. Peptidoglycan O acetylation and autolysin profile of Enterococcus faecalis in the viable but nonculturable state. J. Bacteriol. 188: 902-908.

Salazar O., Asenjo J. A., 2007. Enzymatic lysis of microbial cells. Biotechnol Lett. 29: 985-994.

Sambrook et al., 1989. Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

Silhavy T. J., Kahne D., Walker S., 2010. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2(5): a000414.

Son J. S., Jun S. Y., Kim E. B., Park J. E., Paik H. R., Yoon S. J., Kang S. H., Choi Y. J., 2010. Complete genome sequence of a newly isolated lytic bacteriophage, EFAP-1 of Enterococcus faecalis, and antibacterial activity of its endolysin EFAL-1. J Appl Microbiol. 108: 1769-1779.

Sugahara K., Yokoi K. J., Nakamura Y., Nishino T., Yamakawa A., Taketo A., Kodaira K., 2007. Mutational and biochemical analyses of the endolysin Lys(gaY) encoded by the Lactobacillus gasseri JCM 1131T phage phi gaY. Gene. 404: 41-52.

Uchiyama J., Takemura I., Hayashi I., Matsuzaki S., Satoh M., Ujihara T., Murakami M., Imajoh M., Sugai M., Daibata M., 2011. Characterization of lytic enzyme open reading frame 9 (ORF9) derived from Enterococcus faecalis bacteriophage phiEF24C. Appl Environ Microbiol. 77: 580-585.

Vollmer W., Blanot D., de Pedro M. A., 2008. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiol Rev. 32: 149-167.

Yoong P., Schuch R., Nelson D., Fischetti V. A., 2004. Identification of a broadly active phage lytic enzyme with lethal activity against antibiotic-resistant Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium. J Bacteriol. 186: 4808-4812.

Young R., 2005. Phage lysis. W: Phages. Their Role in Bacterial Pathogenesis and Biotechnology. Waldor K. M., Friedman D. I., Adhya S. A. (ed.) ASM Press, Washington D.C., 2005; 92-128.

Young R., 2014 Phage lysis: three steps, three choices, one outcome. J Microbiol. 52: 243-258.

Zhang W., Mi Z., Yin X., Fan H., An X., Zhang Z., Chen J., Tong Y., 2013. Characterization of Enterococcus faecalis phage IME-EF1 and its endolysin. PLoS One. 13;8 (11):e80435.

PL 229 262 Β1

Wykaz sekwencji <110> IBB PAN IITD PAN <120> Polipeptyd, kodujLcy go polinukleotyd oraz jego zastosowania <130> PK/2685/RW <160 12 <170 Patentln version 3.5 <210 1 <211> 1098 <212> DNA <213> Bacteriophage Entemcoccus faecalis Efl2c29 Ef12c29_ORF15 gene encoding Ef12c29-amr protein <40 0 1 atgaaattaa aaggtatttt atttggtgca ttagcaacca ttggtttgtt tgctggaatg 60 caaacagcta acgcatatga agttaataac gagttcaatt taagcccttg ggaaggttca 120 ggacaggttg cagtacctaa taagattatc ttacatgaaa ctgccaatga acgtgccaca 180 ggacgaaatg aagcaacgta catgaaaaat aactggttta atgcacatac aacagctatc 240 attggtgacg gtggtattgt ttataagatt gcaccagaag gtaacatttc atggggtgct 300 ggtaatgtaa acccatacgc acctattcaa attgagttgc aacatacgca tgataaagag 360 ttattcaaaa agaactataa agaatacatt gactatacaa gggacatggg taaaaagttt 420 ggtattccta tgacacttga ccaaggttct tctgtttggg aaaaaggtgt tatctctcat 480 aaatgggtat cagattatgt atggggtgac cacacagacc catatggtta cttagcagaa 540 atgggaatca gtaaagcgca acttgctaaa gacttagcta atgggctatc tggtgaatca 600 gtaaaaccaa caccaagcaa accaaagaca ttcaaaaaag gtcaaaacgt ttacatttat 660 aacggtcaca aatcacacaa tggaccagtg gtaccattcg tagctggtgc aagtctttgg 720 acccaagttg gtacaattac agaagtgaaa caaggtacag tcaatccgta taagattgaa 780 aacagtggta aatttgtaac atatgctaac gctggcgact tagaggatct taacactaag 840 ttcccaccaa aaccaagtaa atcagttaat cagtttacaa ttggtgttga tgctattgtt 900 ttacgtagtg gacgaccaag cgtatatgca ccagtatatg gaacatggaa acaaggtgca 960 gtattcaagt atgatgaaat cacagttggt gacggttatg tatggattgg tggaacagac 1020 actaatggta cacgtattta cttaccaatt ggaccaaatg acggagaccc caacaacacg 1080 tggggtacat tagtataa 1098 <210 2 <211> 365 <212> PRT <213> Bacteriophage Enterococcus faecalis Efl2c29-ami <40 0 2

Met Lys Leu Lys Gly Ile Leu Phe Gly Ala Leu Ala Thr Ile Gly Leu

10 15

Phe Ala Gly Met Gin Thr Ala Asn Ala Tyr Glu Val Asn Asn Glu Phe 20 25 30

Asn Leu Ser Pro Trp Glu Gly Ser Gly Gin Val Ala Val Pro Asn Lys 35 40 45

Ile Ile Leu His Glu Thr Ala Asn Glu Arg Ala Thr Gly Arg Asn Glu 50 55 60

Ala Thr Tyr Met Lys Asn Asn Trp Phe Asn Ala His Thr Thr Ala Ile

70 75 80

Ile Gly Asp Gly Gly Ile Val Tyr Lys Ile Ala Pro Glu Gly Asn Ile

90 95

Ser Trp Gly Ala Gly Asn Val Asn Pro Tyr Ala Pro Ile Gin Ile Glu 100 105 110

Leu Gin His Thr His Asp Lys Glu Leu Phe Lys Lys Asn Tyr Lys Ala 115 120 125

Tyr Ile Asp Tyr Thr Arg Asp Met Gly Lys Lys Phe Gly Ile Pro Met 130 135 140

Thr Leu Asp Gin Gly Ser Ser Val Trp Glu Lys Gly Val Ile Ser His

145 150 155 160

Lys Trp Val Ser Asp Tyr Val Trp Gly Asp His Thr Asp Pro Tyr Gly

165 170 175

Tyr Leu Ala Glu Met Gly Ile Ser Lys Ala Gin Leu Ala Lys Asp Leu

PL 229 262 Β1

130

185

190

Ala

Asn

Gly

Leu

Ser

Gly

Glu

Ser

Val

Lys

Pro

Thr

Pro

Ser

Lys

Pro

195

200

205

Lys

Thr

Phe

Lys

Lys

Gly

Gin

Asn

Val

Tyr

Ile

Tyr

Asn

Gly

His

Lys

210

215

220

Ser

His

Asn

Gly

Pro

Val

Val

Pro

Phe

Val

Ala

Gly

Ala

Ser

Leu

Trp

225

230

235

240

Thr

Gin

Val

Gly

Thr

Ile

Thr

Glu

Val

Lys

Gin

Gly

Thr

Val

Asn

Pro

245

250

255

Tyr

Lys

Ile

Glu

Asn

Ser

Gly

Lys

Phe

Val

Thr

Tyr

Ala

Asn

Ala

Gly

260

265

270

Asp

Leu

Glu

Asp

Leu

Asn

Thr

Lys

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Ser

Lys

Ser

275

280

285

Val

Asn

Gin

Phe

Thr

Ile

Gly

Val

Asp

Ala

Ile

Val

Leu

Arg

Ser

Gly

290

295

300

Arg

Pro

Ser

Val

Tyr

Ala

Pro

Val

Tyr

Gly

Thr

Trp

Lys

Gin

Gly

Ala

305

310

315

320

Val

Phe

Lys

Tyr

Asp

Glu

Ile

Thr

Val

Gly

Asp

Gly

Tyr

Val

Trp

Ile

325

330

335

Gly

Gly

Thr

Asp

Thr

Asn

Gly

Thr

Arg

Ile

Tyr

Leu

Pro

Ile

Gly

Pro

340

345

350

Asn

Asp

Gly

Asp

Pro

Asn

Asn

Thr

Trp

Gly

Thr

Leu

Val

355 360 365 <210> 3 <211> 346 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> protein Ef12c29-amivl

<4oo> :

3

Met

Gin

Thr

Ala

Asn

Ala

Tyr

Glu

Val

Asn

Asn

Glu

Phe

Asn

Leu

Ser

1

5

10

15

Pro

Trp

Glu

Gly

Ser

Gly

Gin

Val

Al a

Val

Pro

Asn

Lys

Ile

Ile

Leu

20

25

30

His

Glu

Thr

Ala

Asn

Glu

Arg

Ala

Thr

Gly

Arg

Asn

Glu

Ala

Thr

Tyr

35

40

45

Met

Lys

Asn

Asn

Trp

Phe

Asn

Ala

His

Thr

Thr

Ala

Ile

Ile

Gly

Asp

50

55

60

Gly

Gly

Ile

Val

Tyr

Lys

Ile

Ala

Pro

Glu

Gly

Asn

Ile

Ser

Trp

Gly

65

70

75

80

Ala

Gly

Asn

Val

Asn

Pro

Tyr

Ala

Pro

Ile

Gin

Ile

Glu

Leu

Gin

His

85

90

95

Thr

His

Asp

Lys

Glu

Leu

Phe

Lys

Lys

Asn

Tyr

Lys

Ala

Tyr

Ile

Asp

100

105

110

Tyr

Thr

Arg

Asp

Met

Gly

Lys

Lys

Phe

Gly

Ile

Pro

Met

Thr

Leu

Asp

115

120

125

Gin

Gly

Ser

Ser

Val

Trp

Glu

Lys

Gly

Val

Ile

Ser

His

Lys

Trp

Val

130

135

140

Ser

Asp

Tyr

Val

Trp

Gly

Asp

His

Thr

Asp

Pro

Tyr

Gly

Tyr

Leu

Ala

145

150

155

160

Glu

Met

Gly

Ile

Ser

Lys

Ala

Gin

Leu

Ala

Lys

Asp

Leu

Al a

Asn

Gly

165

170

175

Leu

Ser

Gly

Glu

Ser

Val

Lys

Pro

Thr

Pro

Ser

Lys

Pro

Lys

Thr

Phe

180

185

190

Lys

Lys

Gly

Gin

Asn

Va 1

Tyr

Ile

Tyr

Asn

G1 y

His

Lys

Ser

His

Asn

195

200

205

Gly

Pro

Val

Val

Pro

Phe

Val

Ala

Gly

Ala

Ser

Leu

Trp

Thr

Gin

Val

210

215

220

Gly

Thr

Ile

Thr

Glu

Val

Lys

Gin

Gly

Thr

Val

Asn

Pro

Tyr

Lys

Ile

225

230

235

240

Glu

Asn

Ser

Gly

Lys

Phe

Val

Thr

Tyr

Ala

Asn

Ala

Gly

Asp

Leu

Glu

PL 229 262 Β1

245

250

255

Asp

Leu

Asn

Thr

Lys

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Ser

Lys

Ser

Val

Asn

Gin

260

265

270

Phe

Thr

Ile

Gly

Val

Asp

Ala

Ile

Val

Leu

Arg

Ser

Gly

Arg

Pro

Ser

275

280

285

Val

Tyr

Ala

Pro

Val

Tyr

Gly

Thr

Trp

Lys

Gin

Gly

Ala

Val

Phe

Lys

290

295

300

Tyr

Asp

Glu

Ile

Thr

Val

Gly

Asp

Gly

Tyr

Val

Trp

Ile

Gly

Gly

Thr

305

310

315

320

Asp

Thr

Asn

Gly

Thr

Arg

Ile

Tyr

Leu

Pro

Ile

Gly

Pro

Asn

Asp

Gly

325

330

335

Asp

Pro

Asn

Asn

Thr

Trp

Gly

Thr

Leu

Val

340 345 <210> 4 <211> 355 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> protein Ef12c29-amiv2

<400>

4

Met

Asn

His

Lys

Val

His

Met

Glu

Leu

Met

Gin

Thr

Ala

Asn

Ala

Tyr

1

5

10

15

Glu

Val

Asn

Asn

Glu

Phe

Asn

Leu

Ser

Pro

Trp

Glu

Gly

Ser

Gly

Gin

20

25

30

Val

Ala

Val

Pro

Asn

Lys

Ile

Ile

Leu

His

Glu

Thr

Ala

Asn

Glu

Arg

35

40

45

Ala

Thr

Gly

Arg

Asn

Glu

Ala

Thr

Tyr

Met

Lys

Asn

Asn

Trp

Phe

Asn

50

55

60

Ala

His

Thr

Thr

Ala

Ile

Ile

Gly

Asp

Gly

Gly

Ile

Val

Tyr

Lys

Ile

65

70

75

80

Al a

Pro

Glu

Gly

Asn

Ile

Ser

Trp

Gly

Ala

Gly

Asn

Val

Asn

Pro

Tyr

85

90

95

Ala

Pro

Ile

Gin

Ile

Glu

Leu

Gin

His

Thr

His

Asp

Lys

Glu

Leu

Phe

100

105

110

Lys

Lys

Asn

Tyr

Lys

Ala

Tyr

Ile

Asp

Tyr

Thr

Arg

Asp

Met

Gly

Lys

115

120

125

Lys

Phe

Gly

Ile

Pro

Met

Thr

Leu

Asp

Gin

Gly

Ser

Ser

Val

Trp

Glu

130

135

140

Lys

Gly

Val

Ile

Ser

His

Lys

Trp

Val

Ser

Asp

Tyr

Val

Trp

Gly

Asp

145

150

155

160

His

Thr

Asp

Pro

Tyr

Gly

Tyr

Leu

Ala

Glu

Met

Gly

Ile

Ser

Lys

Ala

165

170

175

Gin

Leu

Ala

Lys

Asp

Leu

Ala

Asn

Gly

Leu

Ser

Gly

Glu

Ser

Val

Lys

180

185

190

Pro

Thr

Pro

Ser

Lys

Pro

Lys

Thr

Phe

Lys

Lys

Gly

Gin

Asn

Val

Tyr

195

200

205

Ile

Tyr

Asn

Gly

His

Lys

Ser

His

Asn

Gly

Pro

Val

Val

Pro

Phe

Val

210

215

220

Ala

Gly

Ala

Ser

Leu

Trp

Thr

Gin

Val

Gly

Thr

Ile

Thr

Glu

Val

Lys

225

230

235

240

Gin

Gly

Thr

Val

Asn

Pro

Tyr

Lys

Ile

Glu

Asn

Ser

Gly

Lys

Phe

Val

245

250

255

Thr

Tyr

Ala

Asn

Ala

Gly

Asp

Leu

Glu

Asp

Leu

Asn

Thr

Lys

Phe

Pro

260

265

270

Pro

Lys

Pro

Ser

Lys

Ser

Val

Asn

Gin

Phe

Thr

Ile

Gly

Val

Asp

Ala

275

280

285

Ile

Val

Leu

Arg

Ser

Gly

Arg

Pro

Ser

Val

Tyr

Ala

Pro

Val

Tyr

Gly

290

295

300

Thr

Trp

Lys

Gin

Gly

Ala

Val

Phe

Lys

Tyr

Asp

Glu

Ile

Thr

Val

Gly

305

310

315

320

Asp

Gly

Tyr

Val

Trp

Ile

Gly

Gly

Thr

Asp

Thr

Asn

Gly

Thr

Arg

Ile

PL 229 262 Β1

325

330

335

Tyr Leu Pro Ile Gly Pro Asn Asp Gly A.sp Pro Asn Asn Thr Trp Gly

Thr Leu Val 355

340

345

350 <210 <211>

<212>

<213>

<220 <223>

<400

DNA artificial seguence alternative 5' atgaatcaca aagtgcatat ggagctc <210 5

PRT artificial <211>

<212>

<213>

<220 <223>

<400 alternative N-sequence 6

Met Asn His Lys Val His Met Glu Leu 1 5 <210 7 <211> 28 <212> DNA <213> artificial <220>

<223>

<400 primer 1 7 caccatgaaa ttaaaaggta ttttattt <210> 8 23 DNA artificial <211>

<212>

<213>

<220 <223> primer 2 <400 8 tactaatgta ccccacgtgt tgt <210 9

DNA artificial <211>

<212>

<213>

<220>

<223>

<400 primer 3 9 taagagctca tgaaattaaa aggtatttta tttg <210 10 50 DNA artificial primer 4 10 <211>

<212>

<213>

<220>

<223>

<400 acatctagat taatgatgat gatgatgatg tactaatgta ccccacgtgt <210 <211>

<212>

<213>

<220 <223>

<400

DNA artificial primer 5

PL 229 262 Β1 ttgagctcat gcaaacagct aacgcatatg aagtta 36 <210> 12 <211> 50 <212> DNA <213> artificial <220>

<223> primer 6 <400> 12 acatctagat taatgatgat gatgatgatg tactaatgta ccccacgtgt 50

Claims (6)

1. Polipeptyd zdolny do trawienia peptydoglikanu, zwłaszcza wytwarzanego przez komórki bakterii rodzaju Enterococcus, zawierający domenę enzymatyczną posiadającą sekwencję aminokwasową oznaczoną jako Sekw. Nr 3.

2. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że posiada sekwencję aminokwasową wybraną spośród Sekw. Nr 2 lub Sekw. Nr 4.

3. Polinukleotyd zawierający sekwencję kodującą polipeptyd określony w zastrz. 1 lub 2.

4. Polinukleotyd według zastrz. 3, znamienny tym, że posiada sekwencję nukleotydową oznaczoną jako Sekw. Nr 1.

5. Zastosowanie polipeptydu określonego w zastrz. 1 lub 2 do trawienia peptydoglikanu, zwłaszcza wytwarzanego przez komórki bakterii rodzaju Enterococcus.

6. Polipeptyd określony w zastrz. 1 lub 2 do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu zakażeniom bakteryjnym, zwłaszcza wywołanym przez bakterie rodzaju Enterococcus.