CN105647893A - 一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacD基因及应用 - Google Patents

一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacD基因及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105647893A
CN105647893A CN201610124282.5A CN201610124282A CN105647893A CN 105647893 A CN105647893 A CN 105647893A CN 201610124282 A CN201610124282 A CN 201610124282A CN 105647893 A CN105647893 A CN 105647893A
Authority
CN
China
Prior art keywords
alanyl
dacd
alanine carboxypeptidase
gene
alanine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610124282.5A
Other languages
English (en)
Inventor
许菲
杨海泉
胡金远
强书敏
沈微
陈献忠
郑虹宁
宁璐璐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201610124282.5A priority Critical patent/CN105647893A/zh
Publication of CN105647893A publication Critical patent/CN105647893A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/485—Exopeptidases (3.4.11-3.4.19)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/16—Serine-type carboxypeptidases (3.4.16)
    • C12Y304/16004—Serine-type D-Ala-D-Ala carboxypeptidase (3.4.16.4)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacD基因及应用。本发明提供了一种来源于大肠杆菌(Escherichia？coli)BL21(DE3)的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacD，其氨基酸序列如序列1所示，且本发明提供了编码上述dacD的编码基因dacD。本发明的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶能够从肽聚糖五肽上移除最后一个末端D-丙氨酸(D-Ala)，导致转肽反应中供体不可用，从而控制肽聚糖的网状交联水平，可以提高E.coli蛋白胞外分泌水平。

Description

一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacD基因及应用
技术领域
发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacD及其基因和应用。
背景技术
肽聚糖是由双糖单位，四肽尾还有肽桥聚合而成得多层网状大分子结构。肽聚糖层的骨架由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通过β-1,4糖苷键连接而成，糖链间由肽链交联，构成稳定的网状结构，这样构成了整个细菌表面的细胞壁。作为细胞壁的主要成分，肽聚糖的组成与细胞结构的完整性、外膜的通透性的维持、个细菌的抗干燥能力和耐热性等均密切相关。dacD基因表达的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶能够从肽聚糖五肽上移除最后一个末端D-Ala，导致转肽反应中供体不可用，可以控制肽聚糖的网状交联水平，从而改变细胞的通透性。
大肠杆菌(Escherichiacoli)表达系统是目前基因工程中最常用的蛋白表达系统，有操作简单、成本低廉等优点，可以快速大规模地生产目的蛋白。但是在E.coli的表达过程中，大部分蛋白在信号肽的引导下分泌到周质空间，会导致中间体大量积聚，对蛋白质的生产造成阻碍。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以提高E.coli胞外分泌水平的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶、其氨基酸序列、编码该D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的基因、含有该基因的重组质粒、含有该重组载体的重组菌株、该D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的应用。
具体包括：
本发明提供了一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacD，其氨基酸序列如序列1所示。
序列1：
MKRRLIIAASLFVFNLSSGFAAENIPFSPQPPEIHAGSWVLMDYTTGQILTAGNEHQQRNPASLTKLMTGYVVDRAIDSHRITPDDIVTVGRDAWAKDNPVFVGSSLMFLKEGDRVSVRDLSRGLIVDSGNDACVALADYIAGGQRQFVEMMNNYAEKLHLKDTHFETVHGLDAPGQHSSAYDLAVLSRAIIHGEPEFYHMYSEKSLTWNGITQQNRNGLLWDKTMNVDGLKTGHTSGAGFNLIASAVDGQRRLIAVVMGADSAKGREEEAKKLLRWGQQNFTTVQILHRRKKVGTERIWYGDKENIALGTEQEFWMVLPKAEIPHIKAKYTLNGKELTAPISAHQRVGEIELYDRDKQVAHWPLVTLESVGEGSMFSRLSDYFHHKA
其中，该酶基因编码388个氨基酸，其理论分子量为43.33kDa。
本发明提供了编码上述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的基因dacD，具体的，该酶的基因序列如序列2所示。
序列2：
TTGAAACGCCGTCTTATTATTGCTGCTTCTTTGTTCGTTTTTAATTTATCGTCTGGTTTTGCGGCGGAAAACATTCCTTTTTCACCTCAGCCTCCAGAGATTCATGCCGGGTCCTGGGTATTGATGGATTACACCACCGGTCAGATTCTCACCGCGGGTAATGAGCATCAACAGCGCAATCCCGCCAGCCTGACAAAGCTGATGACGGGCTATGTCGTGGATCGCGCTATCGATAGTCATCGCATTACGCCAGACGATATTGTCACCGTGGGGCGTGATGCGTGGGCGAAAGATAATCCGGTGTTTGTCGGTTCTTCACTGATGTTTTTGAAAGAGGGCGATCGCGTATCGGTACGTGATTTAAGCCGAGGTTTAATTGTGGATTCCGGAAATGACGCGTGTGTTGCTCTGGCTGACTATATTGCCGGTGGGCAACGGCAGTTTGTTGAAATGATGAACAACTATGCCGAGAAGCTGCATCTCAAGGATACGCATTTTGAAACAGTGCATGGTCTGGATGCACCTGGCCAGCATAGCTCGGCTTATGATTTAGCCGTGCTTTCTCGCGCTATCATCCACGGCGAGCCCGAGTTTTATCATATGTACAGTGAGAAAAGCCTCACCTGGAACGGTATCACCCAGCAAAACCGTAACGGGTTATTGTGGGATAAGACCATGAATGTTGACGGCCTGAAAACGGGCCATACTTCTGGTGCCGGGTTTAATCTTATTGCTTCGGCTGTAGACGGGCAGCGTCGCCTCATTGCAGTGGTAATGGGTGCTGACAGCGCAAAAGGTCGTGAGGAAGAGGCAAAAAAATTACTGCGTTGGGGGCAACAAAACTTTACTACGGTGCAAATTTTGCACCGTAGGAAAAAGGTCGGTACGGAACGCATCTGGTATGGTGATAAAGAAAATATCGCCCTGGGAACGGAACAAGAGTTCTGGATGGTGCTACCGAAAGCCGAAATTCCACATATCAAAGCCAAATATACCCTTAATGGTAAAGAGCTCACCGCGCCAATTAGCGCCCATCAGCGGGTAGGGGAAATTGAACTTTACGACCGTGATAAACAGGTGGCGCACTGGCCGCTGGTTACCCTGGAATCTGTCGGGGAAGGCAGCATGTTTTCTCGCCTGAGTGATTATTTCCACCATAAGGCCTGA
本发明通过PCR方法克隆了D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因dacD，DNA全序列分析结果表明，D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的编码基因dacD全长1167bp。
将上述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因dacD序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于E.colistr.K-12substr.MG1655的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶序列相似性最高(98％)。
本发明还提供了包含上述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因dacD的重组质粒，为pRSFDuet-dacD。将本发明的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因插入至表达载体相应的限制酶切位点，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接，作为本发明的一个最优选实验方案，优选D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因插入到质粒pRSFDuet，使该核苷酸序列位于T7lac启动子的下游并受其调控，得到重组E.coli表达质粒pRSFDuet-dacD。
本发明还提供了上述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因dacD的应用菌株，优选所述菌株为E.coli。
本发明能够增强E.coli胞内蛋白到达胞外，促进其分泌，降低其在胞内积累，提供一种可提高E.coli蛋白胞外分泌水平的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶、及其氨基酸序列、基因序列。
附图说明
图1为D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶重组质粒pRSFDuet-dacD图谱。
图2为D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的过量表达
图3为过量表达D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶对E.coli胞外分泌淀粉酶的影响。
具体实施方式
实施例1：E.coliBL21(DE3)D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因dacD的克隆
基于PCR获得D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacD的DNA序列，将D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的基因片段与表达载体pRSFDuet连接，获得重组质粒pRSFDuet-dacD(图1)。然后转化到E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，获得重组菌株E.coliBL21(DE3)/dacD。
实施例2：D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶酶活
将已构建的重组菌，接种250mL摇瓶培养，经诱导剂(IPTG)诱导后，收集E.coli细胞，采用超声破碎法破壁细胞。高速离心后，收集破壁上清，取样测定破壁上清中的羧肽酶酶活力。通过测定酶活力计算出过量表达后，羧肽酶dacD-Δp在胞内的比酶活力为8.10U/g(图2)，对照组羧肽酶比酶活力仅为1.51U/g。
实施例3：过量表达dacD对E.coli胞外分泌淀粉酶的影响
将构建成功的重组质粒pRSFDuet-dacD，转化到含有淀粉酶重组质粒pETDuet-AmyK的E.coliBL21(DE3)中后，诱导发酵24h时，过量表达羧肽酶dacD的E.coli胞外分泌重组淀粉酶的水平显著提高，胞外淀粉酶酶活力达到5.87U/mL(图3)。但没有过量表达任何羧肽酶的对照菌株诱导发酵24h后，在E.coli胞外测得的重组淀粉酶的酶活力仅为1.74U/mL。

Claims (5)

1.一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacD，其特征在于：由序列1所示氨基酸序列组成的蛋白质。
2.一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因dacD，其特征在于，编码权利要求1所述的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacD。
3.根据权利要求2所述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因dacD，其特征在于：其DNA序列如序列2所示。
4.包含权利要求2或3所述的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因dacD的重组质粒。
5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述载体为pRSFDuet。
CN201610124282.5A 2016-03-04 2016-03-04 一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacD基因及应用 Pending CN105647893A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610124282.5A CN105647893A (zh) 2016-03-04 2016-03-04 一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacD基因及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610124282.5A CN105647893A (zh) 2016-03-04 2016-03-04 一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacD基因及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105647893A true CN105647893A (zh) 2016-06-08

Family

ID=56493074

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610124282.5A Pending CN105647893A (zh) 2016-03-04 2016-03-04 一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacD基因及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105647893A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102186878A (zh) * 2008-08-19 2011-09-14 拜奥默里克斯公司 人工肽聚糖裂解酶和肽聚糖结合蛋白
CN102906245A (zh) * 2009-09-28 2013-01-30 全球健康诺华疫苗学院有限公司 高起泡性志贺氏菌菌株

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102186878A (zh) * 2008-08-19 2011-09-14 拜奥默里克斯公司 人工肽聚糖裂解酶和肽聚糖结合蛋白
CN102906245A (zh) * 2009-09-28 2013-01-30 全球健康诺华疫苗学院有限公司 高起泡性志贺氏菌菌株

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI: "WP_001320295", 《GENBANK》 *
朱竟赫等: "革兰阳性菌青霉素结合蛋白研究进展", 《动物医学进展》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2006038128A3 (en) Citrobacter freundii phytase and homologues
NZ602351A (en) Axmi-115, axmi-113, axmi-005, axmi-163 and axmi-184 : vip3a insecticidal proteins from bacillus thuringiensis and methods for their use
WO2003106684A3 (en) PROCESS FOR THE SIMULTANEOUS PRODUCTION OF SEVERAL PROTEINS; VECTORS AND CELLS USED IN THIS PROCESS
CN101519446A (zh) 一种重组人胰岛素及其类似物的制备方法
CN102839165A (zh) 基因突变型重组蛋白酶k及其工业化生产方法
Hayes et al. Molecular evolution of pentatricopeptide repeat genes reveals truncation in species lacking an editing target and structural domains under distinct selective pressures
CN105274134A (zh) 拟穴青蟹抗菌肽scy2的制备方法与应用
CN104611317A (zh) 一种提高l-天冬酰胺酶分泌表达的方法
WO2006042719A3 (de) Polypeptid mit phytaseaktivität und dieses codierende nucleotidsequenz
CN101392249A (zh) 一种抗菌肽基因及其制备方法和该基因在毕赤酵母载体中的表达质粒的构建
CN110684736A (zh) 一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除鸡Shp-2基因的细胞系及其构建方法
CN105647892A (zh) 一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacA基因及应用
Ghovvati et al. In silico analysis of different signal peptides to discover a panel of appropriate signal peptides for secretory production of Interferon-beta 1b in Escherichia coli
CN106519023A (zh) 一种嗜冷酵母金属硫蛋白的基因克隆、表达方法及应用
JP2013526840A5 (zh)
CN105647893A (zh) 一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacD基因及应用
CN107868799A (zh) 表达载体及其构建方法和应用
CN107686518B (zh) 一种抗大肠杆菌k88ac的单链抗体及其编码基因与应用
CN103602684B (zh) 提高外源蛋白表达的增强子样基因及其应用
Curtis Structure, organization and expression of cyanobacterial ATP synthase genes
CN105671025A (zh) 一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacB基因及应用
CN101948890A (zh) 一种鸡α干扰素的生产方法及构建的工程菌
CN104087563A (zh) 提高微生物转谷氨酰胺酶在大肠杆菌中可溶性表达的方法
CN103130879B (zh) 跨膜转运蛋白及其编码基因和它们的应用
CN116286905B (zh) 牛源化CRISPR/boCas9基因编辑系统、方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160608

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication