CN105734033A - 一种杜仲几丁质酶编码基因（EuCHIT1）及其应用 - Google Patents

一种杜仲几丁质酶编码基因（EuCHIT1）及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种杜仲几丁质酶编码基因(EuCHIT1)及其应用，属于生物工程技术领域。根据杜仲转录组数据库注释几丁质酶基因部分片段，通过SMART RACE技术，从杜仲中克隆丁质酶基因如SEQ ID NO:1所示，其基因序列和翻译氨基酸如SEQIDNO:2所示。在对几丁质酶基因进行生物信息学分析基础上,遗传转化烟草，通过对烟草总蛋白的提取进行体外抑菌试验发现，其对镰刀菌和灰霉菌有明显的抑制效果。本发明为进一步利用生物工程技术将外源几丁质酶基因转入各种植物中，从而提高植物抗真菌能力，培育抗病品种提供基础。

Description

一种杜仲几丁质酶编码基因（EuCHIT1）及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域,主要关于杜仲抗真菌几丁质酶(EuCHIT1)及编码基因与应用。
背景技术
杜仲(EucommiaulmoidesOliver)是杜仲科杜仲属植物雌雄异株，在我国被利用的历史可以追溯到公元二世纪的《神农本草经》，具有双向调节血压、抑菌和抗菌效用，具有重要的药用价值。鉴于其起源古老，在科学上具有重要的研究价值，目前对杜仲的研究主要集中在血压调节物质，杜仲胶合成途径相关基因的克隆和抗菌物质的化学分离方面。早期研究表明从杜仲中提取的总蛋白对多种植物病源真菌的生长具有明显的抑制作用，并且从中分离到的杜仲抗菌肽EAFP1和EAFP2含有几丁质结合结构。几丁质酶广泛的存在于动植物及微生物的细胞和组织中，以几丁质为底物将其水解成寡聚糖再进一步水解为N－乙酰氨基葡萄糖，高等植物不含作为真菌细胞壁组分之一的几丁质，但当植物受到真菌、细菌和病毒等感染时，植物几丁质酶的转录表达量迅速提高。因此普遍认为几丁质酶是植物重要的病程相关蛋白(pathogenesis-relatedprotein，PR)。目前多种植物的几丁质酶基因序列被克隆，如白杨、蚕豆、小麦、水稻、甜菜、烟草、马铃薯、棉花等，但对杜仲几丁质酶基因的研究尚未见报导
发明内容
针对上述领域中的空白，本发明提供一种杜仲几丁质酶，对植物真菌病害的防治有明显的作用。
本发明的目的之一是提供一种杜仲几丁质酶。
本发明另一目的是提供编码上述杜仲几丁质酶的基因序列。
本发明另一目的是提供上述杜仲几丁质酶的编码基因在植物基因工程中的应用。
杜仲几丁质酶(EuCHIT1)，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。
编码上述杜仲几丁质酶的基因。
所述编码杜仲几丁质酶的基因序列如SEQIDNO：1所示。
杜仲几丁质酶的表达载体，含有编码上述杜仲几丁质酶的基因。
所述表达载体的骨架载体为pSH-35S。
杜仲几丁质酶的生产方法，将编码杜仲几丁质酶的基因转化植物，使其表达杜仲几丁质酶，利用生物反应器生产杜仲几丁质酶，再提取得到。
所述转化为将上述表达载体转化根瘤农杆菌LBA4404，遗传转化烟草。
杜仲几丁质酶的编码基因在植物基因工程中的应用。
所述应用为将编码杜仲几丁质酶的基因转化植物，使植物表达对真菌病害的抗性；或者所述应用为将杜仲几丁质酶作为药效成分制成药剂用于防治真菌病害。
所述真菌为镰刀菌或灰霉菌。
本发明提供一种杜仲几丁质酶及其编码基因与应用，根据已经构建的杜仲转录组注释的几丁质酶基因部分序列,设计RACE扩增引物，提取杜仲的总mRNA反转cDNA为模板，扩增基因的5’端和3’端序列，经过overlap拼接获得全基因序列，根据拼接结果设计开放阅扩增引物。开放阅读框编码的氨基酸序列，经过NCBI同源比对后发现与刺槐的几丁质酶的同源性为84％。在对几丁质酶基因进行生物信息学分析基础上，构建植物表达载体遗传转化烟草。提取烟草总蛋白进行抑菌试验发现与野生型烟草相比，该转基因烟草对镰刀菌这一植物病原真菌的生长具有抑制作用，故该基因可以用于对植物真菌病害的防治中。
附图说明
图1是本发明实施例1中杜仲几丁质酶基因5’-RACE和3’-RACEPCR产物电泳图；
图2是本发明实施例1中杜仲几丁质酶几丁质结合和催化位点预测图；
图3是本发明实施例1中杜仲几丁质酶磷酸化位点预测图；
图4是本发明实施例1中杜仲几丁质酶信号肽预测图；
图5是本发明实施例1中杜仲几丁质酶进化树分析图；
图6是本发明实施例1中杜仲几丁质酶基因开放阅读框PCR扩增图；
图7是本发明实施例1中杜仲几丁质酶遗传转化烟草过程图；
图8是本发明实施例1中转杜仲几丁质酶烟草蛋白提取物体外抑菌试验图(镰刀菌)；
图9是本发明实施例1中转杜仲几丁质酶烟草蛋白提取物体外抑菌试验图(灰霉菌)。
具体实施方式
为了更为清楚的解释本发明的目的和技术方案以及优点，结合附图对本发明进一步详细的说明。此处描述的具体的实施方法仅仅用以解释本发明。
本实验使用贵州农业生物工程重点实验室试验示范基地种植10余年生杜仲为材料，采集雌雄株幼芽、叶片、幼枝、树皮及雌株幼果提取总RNA，反转cDNA。
总RNA的提取采用omega公司的PlantRNAKit的困难样本说明进行，提取样本经无水乙醇洗涤2次去除多余的盐分，最終提取产物溶于适量的40ulRnase-free水中，-80℃保存。5’-和3’-RACE-ReadycDNA的制备方法参照SMARTerTMRACEcDNAAmplificationKit说明书制备。
1)3’端和5’端RACE扩增
根据己构建的杜仲转录组文库中已有的杜仲几丁质酶的部分序列，经过NCBI数据库blastp比对后选取与其它植物几丁质酶同源性较高的序列作为overlap，设计5’-和3’-RACE扩增的引物，引物的各项参数符合SMARTerTMRACEcDNAAmplificationKit的各项要求，引物质量评估使用DNAStar7.10，引物序列为：
EuCHIT1GSP1:5’CCTGGATTCGGTACCACTATGAATGTCCC3’；
EuCHIT1GSP2:5’GCTTGGGTTGAAAGGAAGCTGCTCG3’
几丁质酶基因RACEPCR扩增体系及程序:
PCR管中建立50μL反应体系，依次加入下列成分:34.5μLPCR-GradeWater；5.0μL10×Advantage2PCRBuffer；1.0μldNTPMix(10mM)；1.0μl50XAdvantage2PolymeraseMix混匀切勿产生气泡。继续加入2.5μL5’(3’)-RACE-ReadycDNA，5μL10×UPM，1μLGSP2(GSP1)，终体积50μL。混匀后按下列程序进行PCR扩增:94℃、30s；72℃、2min、5cycles；94℃、30s；70℃、30s；72℃、2min，5cycles；94℃，30s，68℃，30s，72℃，2min，25cycles。取4μL产物凝胶电泳检测，扩增结果如图1所示。开放阅读框预测及序列分析。
50ulPCR产物1％的琼脂糖凝胶(BIOWESTREGULARAGAROSEG-10)电泳。E.Z.N.A.GelExtractionKit切胶回收纯化，获得片段连接至pGEM-TEasyVector(PromegaCorporation)载体上，转化大肠杆菌感受态细胞(DH5α)。以氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galactopyranoside，X-Gal)、异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)作为筛选标记筛选阳性单菌落，经酶切和PCR鉴定后送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。RACE扩增获得大小分别为1076bp和512bp的5’-RACE和3’-RACE扩增产物，测序结果SERIALCLONER2.1分析，通过overlap拼接获得全长1402bp杜仲几丁质酶基因1(EuCHIT1)，138-140bp处为ATG起始密码子，1104-1107bp为TGA终止密码子，开放阅读框长(OpenReadingFrameFinder，ORF)969bp，编码322个氨基酸。开放阅读框编码的氨基酸序列NCBIblastp分析发现，EuCHIT1编码的是植物几丁质酶属于糖苷水解酶19家族，含有该家族的7个保守几丁质结合和催化位点，故推断该基因编码的蛋白可能具有几丁质酶的活性(图2)
2)生物信息学分析
ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)对该基因编码蛋白的理化性质进行预测发现该蛋白的分子量为35.3KD，等电点(PI)6.64、稳定指数为34.57、亲水性的评估为-0.242可知该基因编码的是一个亲水的稳定性蛋白。NetPhOS2.oserver(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分析表明该蛋白可能含有5个丝氨酸磷酸化位点,7个苏氨酸磷酸化位点和6处酪氨酸磷酸化位点如图3所示。PoleBioinformatiqueLyonnaise(https://npsa-prabi.ibcp.fr)对蛋白的二级结构进行分析的结果发现，该基因编码的蛋白是由a-螺旋(Alphahelix)、随机卷曲(Ramdomcoil)和延伸链(ExtendedStrand)三种蛋白的二级结构构成，并且a-螺旋和随机卷曲之间是通过延伸链连接。SignalP4.1Server分析发现该蛋白含有信号肽的片段，故推断该蛋白是一个胞外分泌型蛋白(图4)。TargetP1.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)对几丁质酶基因进行亚细胞定位预测，该基因编码蛋白定位于叶绿体的可能性为0.017，线粒体的可能性为0.076，分泌型蛋白的可能性为0.970，该结构再次证明该蛋白为分泌型蛋白。根据以上的分析结果，推断该基因编码的蛋白是一个糖苷水解酶19家族的亲水性稳定蛋白，含有信号肽由三种蛋白质的二级结构构成的胞外分泌型蛋白。
几丁质酶基因编码氨基酸序列系统进化树分析利用MEGA5.2.2对EuCHIT1编码氨基酸与植物、动物、细菌和真菌的几丁质酶氨基酸进行进化树分析发现，该基因编码的几丁质酶和其他植物几丁质酶具有共同的进化起源，并且与合欢树、葡萄和蓖麻的几丁质酶具有较高的同源性(图5)。
3)基因开放阅读框克隆，植物表达载体的构建
根据拼接的开放阅读框(ORF)，设计扩增完整ORF的引物并在引物的两端添加相应的酶切位点EcoRI和BamHI引物序列为：
EuCHIT1-BamHI-F:CGGGATCCCGATGGCGAAGACTAGTAGAAACGCAC
EuCHIT1-EcoRI-R:CGGAATTCCGTATGGAACCCATAAATCTCAGGAAG
PCR管中建立50μL反应体系，依次加入下列成分:31μlPCR-GradeWater；5.0μl10×PCRBufferforKOD-Plus-Neo；5.0μl2mMdNTPs；3.0μl25mMMgSO4混匀切勿产生气泡。继续加入2μl5’-RACE-ReadycDNA，1.5μl引物，终体积50μl。混匀后按下列程序进行PCR扩增:94℃、2mins；98℃、10s、60℃30s、68℃30s，35cycles。取4μL产物凝胶电泳检测，扩增结果如图6所示。50μl目的基因PCR扩增产物1％的琼脂糖凝胶电泳，参照GelExtractionKit胶回收试剂盒说明操作。对回收PCR产物和pSH-35S植物表达载体同时进行BamHI和EcoRI双酶切。酶切产物参照OMEGAbio-tekcycle-pureKit产物纯化试剂盒说明纯化。PromegaCorporation的T4DNALigase4℃过夜连接。连接产物转化E.coliDH5α，菌落PCR验证，阳性菌落过夜摇菌提取质粒酶切验证，结果显示成功将杜仲几丁质酶基因EuCHIT1构建到pSH-35S植物表达载体上，pSH-35S-EuCHIT1转化根瘤农杆菌LBA4404。
4)遗传转化烟草，提取转基因烟草
选取生长良好、没有病虫害的植株，剪取没有损伤的健壮叶片，流水冲洗，75％乙醇消毒30s，无菌水洗涤3次以上，0.1％HgCl2消毒10min，无菌水洗涤4次以上；将烟草边缘切除，余下烟草叶片切成约0.5cm×0.5cm的小块，去除叶脉部分。100mg·L-1Kan和20mg·L-1Rif的YEP培养包含pSH-35S-EuCHIT1植物表达载体的LBA4404菌株至OD值0.6，5000g4℃离心10min，等体积农杆菌重悬培养基(MS+蔗糖(Sucrose)30g/L+AS100umol/L，PH5.2)重悬用于烟草的侵染，侵染时间8分钟。侵染结束的烟草叶片，无菌纸吸干菌液，转移至共培培养基(MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Sucrose30g/L+AS100umol/L+Agar8g/L，PH5.2)，暗培48h后移到筛选培养基(MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Sucrose30g/L+Kan50mg/L+Tim100mg/L+Agar8g/L)，PH5.8中培养，每15天更换一次培养基。待分化的再生芽长到约1.5cm高，且结构完整，将其转接到培养罐中的生根培养基(MS+Sucrose30g/L+Agar8g/L，PH5.8)培养，直到植株长到5-8cm，具有发达的根系后，炼苗2天后移到营养土中培养。抗性苗提取总DNA进行PCR和GUS染色验证如图7所示。
5)转基因烟草粗蛋白体外抑菌实验
采集转基因烟草和野生型烟草完全展开的从下至上数第5片完整，无病虫害的健康叶片。液氮研磨至粉末，每1g叶片对应加入1ml含有50mM苯甲基磺酰氟、1mMN-乙基马来酰亚胺、5mMEDTA和0.02mM胃蛋白酶抑制剂、50mM的2-吗啉乙磺酸的植物总蛋白提取缓冲液。充分混合以后10,000g室温离心10min，取上清-80摄氏度保存备用。用于体外测试转基因烟草总蛋白提取物体外活性的植物病源真菌为镰刀菌(Fusariumoxysporum)该菌可以引起多种植物真菌病害例如：小麦赤霉、辣椒枯萎、杜仲根腐和烟草枯萎等病害。该菌株由贵州大学精细化工研究中心馈赠，可以对公众发放。真菌培养用直径为90mm的培养皿，20ml的土豆培养基(PDA)培养5天后6mm的打孔器按圆周取菌饼。体外抑菌实验用90mm的培养皿9ml的PDA和500ul(110mg/ml)的植物总蛋白提取液混匀后倒板，硫酸链霉素按终浓度100mg/ml添加。蛋白提取缓冲液作为对照，直径为6mm的菌饼置于培养基的中心，26℃倒置培养6天。十字交叉法测量真菌生长的直径取平均值进行计算。结果表明转基因烟草的蛋白提取物相对野生型烟草的蛋白提取物的抑菌效果有明显差别，使用浓度为5mg/ml，10mg/ml、15mg/ml和20mg/ml的转基因烟草和野生型烟草的总蛋白提物进行抑菌试验，抑菌结果使用IBMSPSSstatistics和exel进行T检验分析发现在15mg/L时P＝0.046<0.05说明与野生型相比转基因烟草提取物对镰刀菌的菌丝生长的抑制效果要更好。将用添加野生型烟草和转基因烟草粗蛋白取物处理的镰刀菌菌丝在40倍显微镜下观察，发现转基因烟草提取物处理的菌丝失去菌丝的尖端生长优势，菌丝呈现串珠样改变如图8所示。
6)转基因烟草对烟草灰霉菌抗性实验
灰霉病人工接种参照Cheetlat等(2002)方法并略加改进。待培养基菌丝变成暗灰黑色，用含有0.05％Wteen的灭菌水冲洗，过滤后离心(8min.800rpm)，然后用灭菌水冲洗2次后，最后悬浮在含有25％的土豆培养基，室温静置2-3小时后，将孢子浓度调整为1×105/ml悬浮液，然后用于接种。人工接种采用点涂法接种离体的叶片。将来自每一单株从下至上数第五片叶片放置在白色瓷盘中。在相同叶龄的相同部位避开叶脉部分用移液器加10ul菌液(室温条件下自然干燥30mni.),将上述接种的材料放置在以湿润滤纸保湿的盒内,保鲜膜封口。在16小时光照和8小时黑暗。IBMSPSSstatistics进行分析T检验P＝0.003<0.01说明转基因植株与野生型植株在对烟草灰霉菌抗性上有明显差异如图9所示。
本发明具有以下有利优势:本发明从杜仲中克隆得到几丁质酶基因，并对其进行生物信息学分析，为杜仲几丁质酶和抗菌蛋白及相关研究提供基础，填补了杜仲几丁质酶的研究空白。该基因编码的蛋白能抑制真菌菌丝的生长。通过遗传转化该基因能够提高植物的抗真菌病害能力。该蛋白为植物几丁质酶，可以利用微生物或植物生物反应器生产该种抗真菌蛋白，并且加以应用。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.杜仲几丁质酶，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。
2.编码权利要求1所述的杜仲几丁质酶的基因。
3.权利要求2所述的编码杜仲几丁质酶的基因序列如SEQIDNO：1所示。
4.杜仲几丁质酶的表达载体，含有权利要求2或3所述的编码杜仲几丁质酶的基因。
5.权利要求4所述的杜仲几丁质酶的表达载体，所述表达载体的骨架载体为pSH-35S，所述的编码杜仲几丁质酶的基因序列如SEQIDNO：1所示。
6.杜仲几丁质酶的生产方法，将权利要求2或3所述的编码杜仲几丁质酶的基因转化植物，使其表达杜仲几丁质酶，利用生物反应器生产杜仲几丁质酶，再提取得到。
7.根据权利要求6所述的生产方法，所述转化为将权利要求4或5所述的杜仲几丁质酶的表达载体转化根瘤农杆菌LBA4404，遗传转化烟草。
8.权利要求2或3编码杜仲几丁质酶的基因在植物基因工程中的应用。
9.权利要求8所述应用，为将权编码杜仲几丁质酶的基因转化植物，使植物表达对真菌病害的抗性；或者为将杜仲几丁质酶作为药效成分制成药剂用于防治真菌病害。
10.权利要求9所述应用，所述真菌为镰刀菌或灰霉菌。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105925552A (zh) * 2016-07-08 2016-09-07 贵州大学 一种杜仲抗烟草白粉病的几丁质酶(EuCHIT2)及编码基因与应用
CN107365794A (zh) * 2017-07-05 2017-11-21 昆明理工大学 三七几丁质酶基因PnCHI1的应用

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1485425A (zh) * 2002-09-23 2004-03-31 清华大学 棉花几丁质酶及其编码基因与应用
CN104878028A (zh) * 2015-05-14 2015-09-02 昆明理工大学 漾濞大泡核桃几丁质酶基因JsCHI1及应用
CN105349509A (zh) * 2015-12-01 2016-02-24 贵州大学 一种杜仲几丁质酶编码基因（EuCHIT1）及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1485425A (zh) * 2002-09-23 2004-03-31 清华大学 棉花几丁质酶及其编码基因与应用
CN104878028A (zh) * 2015-05-14 2015-09-02 昆明理工大学 漾濞大泡核桃几丁质酶基因JsCHI1及应用
CN105349509A (zh) * 2015-12-01 2016-02-24 贵州大学 一种杜仲几丁质酶编码基因（EuCHIT1）及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHAO，D.等: "GenBank：KJ413008", 《NCBI》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105925552A (zh) * 2016-07-08 2016-09-07 贵州大学 一种杜仲抗烟草白粉病的几丁质酶(EuCHIT2)及编码基因与应用
CN107365794A (zh) * 2017-07-05 2017-11-21 昆明理工大学 三七几丁质酶基因PnCHI1的应用
CN107365794B (zh) * 2017-07-05 2020-07-10 昆明理工大学 三七几丁质酶基因PnCHI1的应用

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