CN105925552A - 一种杜仲抗烟草白粉病的几丁质酶(EuCHIT2)及编码基因与应用 - Google Patents

一种杜仲抗烟草白粉病的几丁质酶(EuCHIT2)及编码基因与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105925552A
CN105925552A CN201610532888.2A CN201610532888A CN105925552A CN 105925552 A CN105925552 A CN 105925552A CN 201610532888 A CN201610532888 A CN 201610532888A CN 105925552 A CN105925552 A CN 105925552A
Authority
CN
China
Prior art keywords
chitinase
euchit2
tobacco
gene
eucommia
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610532888.2A
Other languages
English (en)
Inventor
赵德刚
董璇
李岩
郭林霞
冉新
丁延庆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guizhou University
Original Assignee
Guizhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guizhou University filed Critical Guizhou University
Priority to CN201610532888.2A priority Critical patent/CN105925552A/zh
Publication of CN105925552A publication Critical patent/CN105925552A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2442—Chitinase (3.2.1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01014—Chitinase (3.2.1.14)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明涉及一种杜仲抗烟草白粉病的几丁质酶(EuCHIT2)及编码基因与应用，属于生物技术领域。杜仲几丁质酶(EuCHIT2)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述编码杜仲几丁质酶的基因，其序列如SEQ ID NO：1所示。本发明从杜仲中克隆了一个几丁质酶基因，通过遗传转化该基因能够提高烟草对烟草白粉病的抗性，同时提高了植物防御相关基因的表达、保护性酶酶活、降低逆境对细胞膜的伤害、提高植物游离脯氨酸的含量，从而增强植物的抗病能力。

Description

一种杜仲抗烟草白粉病的几丁质酶(EuCHIT2)及编码基因与 应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,尤其关于杜仲抗烟草白粉病几丁质酶(EuCHIT2)及编码基因与应用。
背景技术
杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)是中国传统中草药，其明显的抗菌作用在长期临床运用中得到了很好的验证。化学分离提取的杜仲总蛋白物对多种植物病原真菌和细菌的生长具有明显的抑制作用，从中纯化获得的EAFP1，EAFP2，并对马铃薯疫病菌(P.infestans)、串珠镰刀菌(F.moniliforme)、棉花炭疽病菌(C.gossypii)和番茄枯萎病菌(A.lycopersici)的生长抑制作用，对这两个蛋白的结构分析发现他们具有几丁质结合结构。几丁质酶广泛的存在于动植物和微生物的组织和细胞中，它能以真菌细胞壁的重要组成成分——几丁质为底物，将其水解成为N－乙酰氨基葡萄糖，当植物受到生物和非生物因素胁迫时，植物几丁质酶的转录表达量会迅速提高。因此普遍认为几丁质酶是植物重要的病程相关蛋白(Pathogenesis-related protein，PR)。全球每年由于烟草白粉病害在田间所造成的损失介于30％-80％不等，贵州省是中国的烟草种植大省，气候湿润白粉病害严重，每年烟草白粉病害给本省的烟草产业造成巨大损失。目前对烟草白粉病的防治方式主要以化学防治方式为主，但使用遗传转化杜仲几丁质酶基因以提高烟草对烟草白粉病的抗性的研究未见报导。
发明内容
针对上述领域中的空白，本发明提供一种杜仲几丁质酶(EuCHIT2)，对烟草白粉病的防治有明显的作用。
本发明的目的之一是提供一种杜仲几丁质酶。
本发明另一目的是提供编码上述杜仲几丁质酶的基因序列。
本发明另一目的是提供上述杜仲几丁质酶的编码基因在植物基因工程中的应用。
杜仲几丁质酶(EuCHIT2)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
所述编码杜仲几丁质酶的基因。
所述基因序列如SEQ ID NO：1所示。
杜仲几丁质酶的表达载体，含有编码上述杜仲几丁质酶的基因。
所述表达载体的骨架载体为pSH-35S。
杜仲几丁质酶的编码基因在植物基因工程中的应用。
所述应用为将编码杜仲几丁质酶的基因转化植物，使植物增强植物的抗病能力；或者所述应用为将杜仲几丁质酶作为药效成分制成药剂用于增强植物的抗病能力。
所述应用为将上述表达载体转化根瘤农杆菌LBA4404，遗传转化烟草，使其增强抗病能力。
所述抗病能力为抗真菌感染的能力。
所述真菌为白粉病。
本发明提供一种杜仲几丁质酶及其编码基因与应用，根据已经构建的杜仲转录组注释的几丁质酶基因部分序列,设计RACE扩增引物，提取杜仲的总mRNA反转cDNA为模板，扩增基因的5’端和3’端序列，经过overlap拼接获得全基因序列，根据拼接结果设计开放阅扩增引物。EuCHIT2的开放阅读框及其编码的氨基酸进行了NCBI blastp和blastn分析。ScanProsite(http://prosite.expasy.org/scanprosite/)对它的结构域modif进行分析后发现在33-52个氨基酸处找到一个几丁质的连接区序列为ccsnfgwcgntpeyc，在95-117个氨基酸处fytydafisaarsfagfa，221-231个氨基酸处isfrtaiwfwm分别找到了两处几丁质酶19家族的开放阅读框编码的氨基酸序列，在对几丁质酶基因进行生物信息学分析基础上，构建植物表达载体遗传转化烟草。转基因烟草与野生型烟草相比，该转基因烟草对烟草白粉病这一植物真菌病害有一定的抗性，通过qRT-PCR检测技术发现该基因的转入对烟草的系统获得性抗性(SAR)的标志基因PR-1a的表达量在接种白粉病后大幅度提高，对植物诱导系统抗性(ISR)的标志基因COI1的表达量在植物健康状态有所提高。对转基因烟草和野生型烟草的保护性酶活检测结果表明，该基因的转入在接种白粉病后能够提高烟草中的POD酶的酶活和游离脯氨酸的含量，除48h检测结果，转基因烟草中MDA含量在接菌前和接菌后均低于野生型烟草，对抗病性相关基因表达量分析的结果和保护性酶活的测定结果表明该基因可以用于对植物真菌病害的防治。
附图说明
图1是本发明实施例1中杜仲几丁质酶基因5’-RACE和3’-RACE PCR产物电泳图和EuCHIT2开放阅读框扩增；
图2植物表达载体pSH-35s-EuCHIT2；
图3是本发明实施例1中杜仲几丁质酶几丁质结合和催化位点预测图；
图4是本发明实施例1中杜仲几丁质酶进化树分析图；
图5是本发明实施例1中构建植物表达载体pSH-35S-EuCHIT2验证图；
图6是本发明实施例1中杜仲几丁质酶遗传转化烟草过程和转基因烟草验证图；
图7是本发明实施例1中转杜仲几丁质酶基因烟草抑菌试验图(白粉病)；
图8是本发明实施例1中转杜仲几丁质酶基因烟草抗病相关基因表达量分析；
图9是本发明实施例1中转杜仲几丁质酶基因烟草抗病相关生理生化指标分析；
具体实施方式
为了更为清楚的解释本发明的目的和技术方案以及优点，结合附图对本发明进一步详细的说明。此处描述的具体的实施方法仅用以解释本发明。
实验中用到的引物序列见下表。
实验步骤：
1)本实验使用贵州农业生物工程重点实验室试验示范基地种植10余年生杜仲为材料，采集雌雄株幼芽、叶片、幼枝、树皮及雌株幼果提取总RNA，反转cDNA。总RNA的提取采用omega公司的Plant RNA Kit的说明进行称取50mg样品液氮充分研后放入1.5ml的离心管中，加入500ul的RCL和10ul的β-巯基乙醇充分震荡，55℃静置1-5min，14，000g离心5min，将上清转移至gDNA FilterColmn的过滤柱中，室温14，000g离心2min，滤液中加入等体积的RCB液混匀，将混匀液转移至HiBind RNA Mini Column吸附柱中10，000g1min弃液,400ul的RWC加入吸附柱中10，000g 1min弃液，更换收集管，在吸附柱子加入500ul的RNA Wash bufferII 10，000g 1min弃液,重复步骤8，将500ul的无水乙醇加入吸附柱中洗涤2次去除多余的盐分，空管离心2min，将吸附株转移到新的1.5ml的离心管中并加入40ul Rnase-free水10，000g 1min洗脱样品，-80℃保存。5’-和3’-RACE-Ready cDNA的制备方法参照SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit说明书制备。用于RT-PCR分析的烟草的RNA的提取使用以下方法，100mg的杜仲植物组织，液氮充分研磨后加入1ml的Fruit-mateTMfor RNA Purification室温溶化以后，转移至新的1.5ml的离心管中12，000g 4℃离心5分钟，小心吸取上清液，平均分至2个新的1.5ml离心管中，分别加入等体积的RNAisoPlus(Takara，Dalian,China)充分震荡混匀，室温放置10min，分别加入1/5体积的氯仿，充分震荡后室温放置15min，12，000g 4℃离心15min将上清液移至新的离心管中，并加入等体积的异丙醇轻轻混匀,-20℃的放置15min、12，000g 4℃离心10min、去上清沉淀中加入1ml75％的乙醇清洗沉淀并且剧烈震荡让沉淀漂浮起来后静置2min，7500g 4℃离心5min，弃上清保留沉淀。干燥后溶解于30ul的DEPC处理水中。所有的RNA样品均通过260/280nm的吸收光度的检测其提取质量，并通过1.2％的琼脂糖凝胶电泳，GelRed(biotium，gelrel10000x in water)染色检测其完整性。检测合格的RNA-80℃保存备用。
2)5’/3’-RACE-Ready cDNA的合成
根据Clontech公司的SMARTer RACE cDNA Amplification Kit对扩增引物的要求和杜仲转录组中的部分已知基因片段设计RACE扩增引物EuCHIT2-GSP1和EuCHIT2-GSP2，委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。使用质量检测合格的RNA用于合成RACE-ReadyFirst-Strand cDNA。合成的步骤根据SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(ClontechLaboratories,USA)提供的步骤进行。在PCR管中建立10μl反应体系，准备Buffer Mix：依次加入下列成分:2.0μl 5X First-Strand Buffer，1.0μl DTT(20mM)，1.0μl dNTP Mix(10mM)，混匀室温放置备用。2.75μl RNA样品，1μl 5’/3’-CDS primerA，混均后瞬时离心。72℃孵育3min，42℃冷却2min,最后14,000rpm离心10sec。仅向5’RACE反应管中加入1μlSMARTerIIA oligo，混匀后瞬时离心。室温下按顺序加入以下试剂：4.0μl Buffer Mix，0.25μl RNase Inhibitor(40U/μl)，1.0μl SMARTScribeTMReverse Transcriptase(100U)定容至最终体积10ul，轻柔的混匀瞬时离心。42℃孵育90min,70℃加热10min终止反应。100μl Tricine-EDTA Buffer稀释反应产物-20℃保存。
3)EuCHIT2基因的5’/3’的扩增
第一轮的PCR使用酶2Polymerase Mix(Clontech Laboratories,USA)反应体系为50ul，其中包含了2.5μl的first-strand cDNA(50ng/μl)。反应体系和反应程序如下34.5μl PCR-Grade Water；5.0μl 10×Advantage 2PCR Buffer；1.0μl dNTP Mix(10mM)；1.0μl 50×Advantage 2Polymerase Mix混匀切勿产生气泡。继续加入2.5μl 5’(3’)-RACE-Ready cDNA，5μl 10×UPM，1μl GSP2(GSP1)，终体积50μl。混匀后按下列程序进行PCR扩增:94℃、30s；72℃、2min、5cycles；94℃、30s；70℃、30s；72℃、2min，5cycles；94℃，30s，68℃，30s，72℃，2min，25cycles。取5μL产物1％(BIOWEST REGULAR AGAROSE G-10)凝胶电泳检测(图1)。
4)扩增片段的克隆及序列分析
40uL PCR产物1％的琼脂糖凝胶电泳。E.Z.N.A.Gel Extraction Kit(Omega Bio-Tek.USA)切胶回收纯化，获得片段连接pGEM-T Easy Vector(Promega Corporation)载体，转化大肠杆菌感受态细胞(DH5a)。氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)(sigma)、X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，5-Bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galactopyranoside)(sigma)、IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside)(sigma)作为筛选标记筛选阳性单菌落，经酶切和PCR鉴定后送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。测序结果SERIAL CLONER2.1(Version 2.6.1)和BioX(Version 1.5.1(25))分析拼接，确定开放阅读框。根据开放阅读框设计带限制性内切酶酶切位点的引物EuCHIT2XbaI-F和EuCHIT2EcoRI-R，克隆基因开放阅读框并连接植物表达载体pSH-35S载体送测序，测序结果与预测结果一致说明成功获得了EuCHIT2全长序列，并成功构建了pSH-35S-EuCHIT2(图2，7)用于转化根瘤农杆菌LBA4404遗传转化烟草。
5)EuCHIT2生物信息学分析
EuCHIT2的核酸和氨基酸序列的相似性分析使用BLASTn和BLASTp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。开放阅读框编码氨基酸序列和分子量的推断使用(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)。等电点和稳定系数的分析用ExPASyTool ProtParam来计算(http://web.expasy.org/protparam/)。保守区的推断和保守序列的定义使用CDD Tool CD-Search(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html)(图3)。蛋白二级结构用Pole Bioinformatique Lyonnaise(https://npsa-prabi.ibcp.fr)进行分析。跨膜区域和信号肽分析使用SignalP 4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/).。几丁质酶的亚细胞定位预测使用TargetP1.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)。几丁质酶的结构域modif分析使用ScanProsite(http://prosite.expasy.org/scanprosite/)。EuCHIT2编码的氨基酸序列与其他组织的几丁质酶用MEGA5.2.2(5130611)进行系统发生学分析，构建系统进化树使用程序中的Test Neighbor-Joining Tree,系统发生测试使用Bootstrap method，No.ofBootstrap replications为1000。生物信息学的分析结果表明该基因编码分子量为34.7KD的蛋白，等电点(PI)为6.06、稳定指数为39.85、亲水性的评估为-0.294说明该蛋白可能是一个亲水的稳定蛋白，该蛋白属于糖苷水解酶19家族与大麦的几丁质酶同源建模以后发现7个几丁质的结合区和催化区完全相同(图3)。Pole Bioinformatique Lyonnaise(https://npsa-prabi.ibcp.fr)对蛋白的二级结构进行分析的结果发现，该基因编码的蛋白是由a-螺旋(Alpha helix)、随机卷曲(Ramdom coil)和延伸链(Extended Strand)三种蛋白的二级结构构成，并且a-螺旋和随机卷曲之间通过延伸链连接。NetPhOS2.oserver(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分析表明该蛋白可能含有8个丝氨酸磷酸化位点,6个苏氨酸磷酸化位点和3处酪氨酸磷酸化位点。SignalP 4.1Server分析发现该蛋白含有信号肽的片段，推断该蛋白是一个胞外分泌蛋白。TargetP 1.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)对几丁质酶基因进行亚细胞定位预测，该基因编码蛋白定位于线粒体的可能性为0.039，分泌型蛋白的可能性为0.888，其他位置的定位可能为0.037该结构进一步证明该蛋白为分泌型蛋白。根据以上的分析结果，推断该基因编码的蛋白是一个糖苷水解酶19家族的亲水性稳定蛋白，含有信号肽由三种蛋白质的二级结构构成的胞外分泌型蛋白ScanProsite(http://prosite.expasy.org/scanprosite/)对它的结构域modif进行分析后发现在该基因编码的第21个氨基酸到第63个氨基酸为保守的几丁质绑定区并且在其中找到了8个保守的构成二硫键的半胱氨酸。和用星号标出的几丁质绑定区的模式位置(position of the pattern)。同时在33-52个氨基酸处找到一个几丁质的连接区序列为ccsnfgwcgntpeyc，在95-117个氨基酸处fytydafisaarsfagfa221-231个氨基酸处isfrtaiwfwm分别找到了两处几丁质酶19家族的特征序列。对EuCHIT2开放阅读框所编码的氨基酸序列进化树分析发现与来源于其它植物、动物、真菌和细菌的几丁质酶序列进行遗传多样性分析，发现杜仲几丁质酶2与其他植物的几丁质酶具有同一个进化祖先，并且杜仲的几丁质酶与烟草的几丁质酶(gi640900)和马铃薯的几丁质酶(gi467820)具有较高的同源性(图4)。
6)载体的验证和转基因植株的验证
植物表达载体pSH-35S-EuCHIT2,包含了花椰菜花叶病毒启动子35S和目的基因EuCHIT2,β-D-葡糖醛酸酶(GUS)和卡那霉素抗性筛选基因。目的基因长度为996bp，用PCR验证为阳性的质粒，再用限制性内切酶HindIII和EcoRI酶切后通过1％凝胶电泳均验证均获得大小为1771bp和13979bp了大小相符的片段，经过验证的植物表达载体送北京诺塞测序。测序结果与预测的开放阅读框的进行序列对比后与开放阅读框的大小一致，说明我们成功的将目的基因构建安到了植物表达载体上。经过验证的植物表达载体遗传转化LBA4404,用卡那霉素和利福平作为筛选，阳性菌落通过PCR验证后，通过农杆菌介导法遗传转化三星烟草(图5)。无病虫害的烟草叶片经酒精消毒30S，升汞消毒8min后将叶片切割成大小约为1cm2的，在农杆菌菌液中侵染8分钟后置于烟草(4.43g·L-1MS+30g·L-1蔗糖+1.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+8g·L-1琼脂粉pH 5.8)中培养48小时，将烟草叶片移到筛选分化培养基(4.43g·L-1MS+30g·L-1蔗糖+1.0mg·L-1 6-BA+0.1mg·L-1NAA+8g·L-1琼脂粉pH 5.8)中，每隔12天更换培养基直至烟草叶片周围的愈伤分化成结构完整的抗性苗后将抗性苗切下来移栽到(2.22g·L-1MS+30g·L-1蔗糖+6.5g·L-1琼脂粉pH 5.8)中培养，当植株长到3-5cm时将其移栽到营养土中，并对移栽的植株进行Gus免疫组织化学染色，Gus阳性的植株染色后呈现蓝色，Gus染色阴性的植株呈现黄色。对Gus免疫组织化学染色阳性的植株进一步的进行pCR验证引物分别位于35S启动子和目的基因上含有启动子的片段大小为448bp目的基因的片段为330bp。应获得的扩增片段的大小为778bp(图6)。通过以上验证说明成功的将杜仲的EuCHIT2基因整合到了烟草的基因组中。最终获得免疫组织化学染色为阳性的植株39株，将阳性植株进行PCR验证后获得阳性植株36株，常规种植管理，开花前套袋收取种子，收取的种子36度烘干后用于后续抑菌试验。
7)转基因烟草对白粉病的抗性研究。
处于快速生长期、较为幼嫩的植物组织更容易感染白粉病病害故选取T0代转基因烟草的三个株系EuCHIT2-1，EuCHIT2-2,EuCHIT2-15和野生型烟草种子3％H2O2消毒30分钟，无菌水漂洗数次，置于MS培养基(30g·L-1MS+30g·L-1蔗糖+琼脂粉7g·L-1)中，光照周期为16h光照/8h黑暗循环温度25℃培养，萌发的T1代烟草经GUS验证阳性后移栽至直径为5.5cm高12cm的含有50mlMS培养基的玻璃培养罐中培养，待烟草幼苗长至6-8叶期(约5周)每个株系选取PCR验证阳性植株生理状态相似的叶片9片，置于直径为9cm含有15ml的1％的水琼脂培养基上，叶柄以湿润的无菌脱脂棉保湿用于接种(Miclot,Wiedemann-Merdinoglu etal.2012)。接种方式参照(Miclot，2012)的方法略有修改。15ml无菌水中加入1滴Tween-20反复洗涤6-7片严重感染白粉病的烟草叶片后。5层细密纱布过滤，收集孢子悬浮液，离心后将用血球计数板进行计数，将孢子悬浮液浓度调整到每毫升1×106，10滴5μl的孢子悬液被接种到烟草叶片的上表面，并且用玻璃棒将孢子悬液涂抹到整个叶片的表面，室温下干燥25分钟后，将接种好的烟草叶片封闭于培养皿中25℃16h光照/8h黑暗循环。接种后每天观察记录，在接种后1、2天均未见病斑形成，第3天野生型和转基因株系EuCHIT2-2上出现病斑，其他两个株系的转基因烟草叶片上未见病斑，但是野生型烟草上的病斑的大小明显大于转基因烟草上的白粉病病斑，病斑随着时间的延长而增大。接种12天后野生型烟草的表面完全布满了白粉菌菌丝和孢子，在转基因烟草的表面并未完全布满菌丝和孢子，以该时间的孢子计数作为衡量抗病性的指标。每片叶片截取两块1cm2患病部位的叶片，用2ml的0.85％NaCl溶液反复洗脱叶片上的孢子，取20μl充分重悬的孢子悬液用于血球细胞板计数，重复计数4次取平均值。用于表达量和生理指标分析的烟草采用活体接菌的方式，方法同上接种于相同生理状态和相同位置的叶片上，每株烟草接种倒数的第三和第四片，含有Tween-20的无菌水接种作为对照，接种后0h、6h、12h、24h、48h、72h取接种叶片及同侧以上的叶片，去除菌丝和坏死的植物组织液氮速冻，-80℃保存备用，所有试验重复了三次。接菌后12天单位面积病叶上的孢子数量分别为Wt：327778个/cm2；EuCHIT2-1:69444个/cm2；EuCHIT2-2:186111个/cm2和EuCHIT2-15:33333个/cm2，单位面积转基烟草叶片上的白粉菌孢子的数量均显著低于野生型烟草上的孢子的数量(图7)。
8)烟草抗病相关基因表达量分析
对植物系统获得抗性标志基因PR-1a和植物诱导系统抗性的关键基因冠菌素不敏感基因(coronatine insensitive，COI1)在转基因烟草和野生型烟草感染白粉病前后的相对表达量进行分析，结果显示接菌前三个转基因烟草株系的COI1基因的平均相对表达量是野生型的相对表达量的1.54倍。接种白粉病后野生型烟草的COI1基因随接种时间的变化呈现表达量先上升后下降的趋势，并且在接菌后24h达到峰值，平均相对表达量为接菌前的2.74倍。转基因烟草在接种白粉病后COI1基因的相对表达量没有出现上升趋势，相反株系EuCHIT2-2和EuCHIT2-15在接种白粉病菌后COI1基因的相对表达量均低于接种前。说明烟草中转入EuCHIT2基因能够提高健康状况下烟草的COI1基因的相对表达量，从而延缓白粉病菌对烟草的感染。PR-1a的相对表达量分析结果表明，健康状态下转基因烟草中PR-1a的相对表达量是野生型烟草的2.2倍，其中株系EuCHIT2-2在接菌前野生型烟草和转基因烟草之间没有差异。接菌后24h、48h和72h转基因烟草中PR-1a的相对表达量分别是接菌前的3.1倍、13.25倍和92倍，接菌后转基因烟草中PR-1a的相对表达量明显高于野生型烟草中PR-1a的相对表达量。野生型烟草中的PR-1a的相对表达量在接菌后48小时达到最大值，但在该时间点转基因烟草的相对表达量也是野生型烟草的13.5倍。说明杜仲EuCHIT2基因的转入能够提高烟草在健康状态下的相对表达量，并且能够大幅度提高烟草在受到白粉病感染后的PR-1a的相对表达量，说明转入EuCHIT2可以通过激活“植物系统获得性抗性”(SAR，systemic acquired resistance)，而提高烟草对白粉病的抗性(图8)。所用引物序列见序列表，具体操作步骤如下分别提取接菌前和接菌后6h、12h、24h、48h、72h烟草叶片的总RNA，反转cDNA方法如下使用Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(Takara,China),RNA摸版50ng，Oligo(dT)12-18Primer(50uM)1ul,RNase free dH2O至6ul，70℃保温10min后迅速冰上急冷2min以上。在上述反应管中加入5xM-MLV buffer 2ul，dNTP Mixture(10mM)0.5ul、RNase Inhibitor(40U/ul)0.25ul,RTase M-MLV(RNase H-)(200U/ul)0.25ul,加RNase free dH2O至10ul，42℃保温1h，70℃保温15min，冰上冷却。Real-time PCR体系为，Power SYBR Green PCR Master(2×)10μl；forward primer,1.0μl Reverse primer,1.0μL；cDNA,2μL；ddH2O,6μl。每个样本3个重复。使用的程序如下，50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，1min40个循环，；95℃15s；60℃，1min，95℃，15s。
9)接种烟草白粉病对转基因烟草的理化指标的影响
植物防御酶的活性以及一些重要的理化指标常与植物抗病性之间关系密切，本发明对转基因烟草和野生型烟草接菌前后的过氧化物酶(peroxidase，POD)和过氧化氢酶(catalase，CAT)的酶活；丙二醛(malondialdehyde，MDA)和游离脯氨酸(proline，Pro)的含量进行测定。结果发现接菌前和接菌后6h、12h和24h转基因烟草的POD酶活均高于野生型烟草的酶活，分别为5158U/g和3425U/g；8625U/g和4716U/g；10816U/g和3450U/g，而在其他时间点转基因和野生型烟草的POD酶活没有显著差异。说明POD酶参与了由EuCHIT2介导的对抗烟草灰霉菌的过程中。而接菌前野生型烟草的CAT的酶活为转基因烟草CAT酶活的1.76倍分别为67.32U/g；38.25U/g。接菌后72h转基因烟草CAT酶活是野生型酶活的1.94倍分别为107.10U/g和55.08U/g。说明过氧化氢酶CAT也可能参与了EuCHIT2介导的对烟草白粉病的抗性。植物在衰老和逆境环境下，常常会发生膜脂过氧化作用而丙二醛(Malondialdehyde，MDA)是其重要产物之一，本发明中对MDA的测定结果表明在接菌前和接菌后24h这段时间内转基因烟草中的MDA含量均低于野生型。在接菌后6h和12h野生型烟草中MDA含量分别为转基因烟草的1.6倍和1.9倍，分别为13.1580nmol/g和8.6688nmol/g；15.8584nmol/g和8.4194nmol/g。说明转入EuCHIT2基因能够降低感染白粉病早期对细胞膜的破坏作用，从而延缓白粉病菌对转基因烟草的侵害。对游离脯氨酸的测定结果表明在接种白粉病菌之前野生型烟草和转基因烟草中的游离脯氨酸的浓度没有差别，但是在接种白粉病菌之后6小时野生型烟草中的游离脯氨酸的浓度达到249.74μg/g，转基因烟草在接菌后6h和48h游离脯氨酸的浓度分别达到319.8μg/g和330.7μg/g均高于野生型烟草接菌后的最大值。说明烟草中转入EuCHIT2基因能够增加烟草中接菌后的游离脯氨酸的浓度，从而增加了植物的抗逆性(图9)。所有生理生化指标的测定均使用苏州科铭生物技术有限公司试剂盒。
本发明具有以下有有利优势:本发明从杜仲中克隆了一个几丁质酶基因，并对其进行生物信息学分析，为杜仲几丁质酶和抗菌蛋白及相关研究提供基础。通过遗传转化该基因能够提高烟草对烟草白粉病的抗性，同时提高了植物防御相关基因的表达、保护性酶酶活、降低逆境对细胞膜的伤害、提高植物游离脯氨酸的含量，从而增强植物的抗病能力。该蛋白为植物几丁质酶，可以利用微生物或植物生物反应器生产该种抗真菌蛋白，加以应用。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.杜仲几丁质酶(EuCHIT2)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.编码权利要求1所述的杜仲几丁质酶(EuCHIT2)的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4.一种表达载体，含有权利要求1或2所示的基因。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其骨架载体为pSH-35S。
6.杜仲几丁质酶(EuCHIT2)在植物基因工程中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，为将权利要求1或2所述的基因转化植物，使植物增强植物的抗病能力；或者为将权利要求1所述的杜仲几丁质酶(EuCHIT2)作为药效成分制成药剂用于增强植物的抗病能力。
8.根据权利要求7所述的应用，为将权利要求4或5所述的表达载体转化根瘤农杆菌LBA4404，遗传转化烟草，使其增强抗病能力。
9.根据权利要求8所述的应用，所述抗病能力为抗真菌感染的能力。
10.根据权利要求9所述的应用，所述真菌为白粉病。
CN201610532888.2A 2016-07-08 2016-07-08 一种杜仲抗烟草白粉病的几丁质酶(EuCHIT2)及编码基因与应用 Pending CN105925552A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610532888.2A CN105925552A (zh) 2016-07-08 2016-07-08 一种杜仲抗烟草白粉病的几丁质酶(EuCHIT2)及编码基因与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610532888.2A CN105925552A (zh) 2016-07-08 2016-07-08 一种杜仲抗烟草白粉病的几丁质酶(EuCHIT2)及编码基因与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105925552A true CN105925552A (zh) 2016-09-07

Family

ID=56827508

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610532888.2A Pending CN105925552A (zh) 2016-07-08 2016-07-08 一种杜仲抗烟草白粉病的几丁质酶(EuCHIT2)及编码基因与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105925552A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114317467A (zh) * 2020-09-30 2022-04-12 贵州大学 杜仲漆酶EuLAC1基因及其用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105349509A (zh) * 2015-12-01 2016-02-24 贵州大学 一种杜仲几丁质酶编码基因（EuCHIT1）及其应用
CN105602984A (zh) * 2016-04-05 2016-05-25 贵州大学 一种快速高效的农杆菌介导的小麦茎尖遗传转化方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105349509A (zh) * 2015-12-01 2016-02-24 贵州大学 一种杜仲几丁质酶编码基因（EuCHIT1）及其应用
CN105734033A (zh) * 2015-12-01 2016-07-06 贵州大学 一种杜仲几丁质酶编码基因（EuCHIT1）及其应用
CN105602984A (zh) * 2016-04-05 2016-05-25 贵州大学 一种快速高效的农杆菌介导的小麦茎尖遗传转化方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHAO, D., ET AL.: "Genbank accession number:AHX74093.1", 《GENBANK》 *
李新玲 等: "转几丁质酶基因的小麦后代遗传分析和抗病性鉴定", 《植物生理学通讯》 *
牛吉山 等: "转水稻几丁质酶基因小麦的获得和白粉病抗性鉴定", 《河南农业大学学报》 *
郭林霞 等: "转杜仲几丁质酶基因EuCHIT1番茄提高对灰霉病的抗性", 《植物生理学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114317467A (zh) * 2020-09-30 2022-04-12 贵州大学 杜仲漆酶EuLAC1基因及其用途
CN114317467B (zh) * 2020-09-30 2023-05-16 贵州大学 杜仲漆酶EuLAC1基因及其用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. A threshold level of oxalate oxidase transgene expression reduces Cryphonectria parasitica-induced necrosis in a transgenic American chestnut (Castanea dentata) leaf bioassay
Tariq et al. Antifungal activity of chitinase II against Colletotrichum falcatum Went. causing red rot disease in transgenic sugarcane
CN110734482B (zh) 一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY4及应用
CN109628465B (zh) SlNAC29基因在提高番茄细菌性叶斑病抗性和耐旱性中的应用
CN105861517A (zh) 一种三七抗菌肽基因PnSN1及其应用
CN116970054B (zh) 一种感溃疡病转录因子AcWRKY76及其应用
CN104450740A (zh) 一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子及其编码蛋白、制备方法和应用
CN106244599A (zh) 一种三七病程相关蛋白1家族基因PnPR1‑2及应用
CN105755020A (zh) 三七丝裂原活化蛋白激酶激酶基因PnMAPKK1及其应用
CN105838726B (zh) 一种紫花苜蓿耐盐基因MsCDPK及其编码蛋白与应用
Kong et al. Transgenic tobacco and tomato plants expressing Wasabi defensin genes driven by root-specific LjNRT2 and AtNRT2. 1 promoters confer resistance against Fusarium oxysporum
CN112359049B (zh) 一种岷江百合几丁质酶基因LrCHI2及其应用
CN109825513B (zh) 大豆病程相关蛋白基因、重组载体、重组细胞、重组体系及应用
CN105925552A (zh) 一种杜仲抗烟草白粉病的几丁质酶(EuCHIT2)及编码基因与应用
CN102242134B (zh) 大豆GmSGT基因和其5’UTR的克隆及其应用
CN105177001B (zh) 与大麦抗白粉病相关的miR167d及其应用
CN106191001A (zh) 磷脂酶PLDζ1基因在提高植物耐盐性中的应用
CN104178495A (zh) 耐盐抗旱基因及其编码的蛋白和应用
CN105177002A (zh) 与大麦抗白粉病相关的miR159a及其应用
CN105524934A (zh) 一种新的β-1,6-葡聚糖酶及其编码基因和应用
CN103436527A (zh) 一种获取辣椒抗根结线虫基因的方法
CN103589735B (zh) 野生茄子StoWRKY6基因及其表达载体和应用
CN109295068B (zh) 一种三七类甜蛋白基因PnTLP2及应用
CN103088053B (zh) 高效RNA干扰联合Bt基因双重防治番茄根结线虫的方法
CN101921776B (zh) 甘蓝型油菜抗病相关基因BnERF56及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Zhao Degang

Inventor after: Dong Xuan

Inventor after: Li Yan

Inventor after: Guo Linxia

Inventor after: Ran Xin

Inventor after: Ding Yanqing

Inventor before: Zhao Degang

Inventor before: Dong Xuan

Inventor before: Li Yan

Inventor before: Guo Linxia

Inventor before: Ran Xin

Inventor before: Ding Yanqing

RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160907