CN110128519B - 一种重组荞麦防御素蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术和医药保健品领域，提供了一种重组荞麦防御素蛋白及其制备方法和应用，所示重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，其氨基酸分子量为6.3kDa，等电点8.5；该重组荞麦防御素蛋白具有抗真菌作用，在医疗保健，食品开发和化妆品研发等方面具有实用价值。

Description

一种重组荞麦防御素蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术和医药保健品领域，具体涉及一种重组荞麦防御素(recombinant buckwheat defensin)蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

真菌型疾病对植物，动物和人类产生巨大影响。它们会破坏农作物，威胁野生动物的灭绝并且可以杀死更容易受到真菌感染的免疫功能低下的人群。所有生物在进化过程中都有相应策略来逃避病原体的感染。植物具有许多独特的防御机制，包括病原体入侵的物理屏障以及广泛的次级代谢产物和抗菌肽(antimicrobial peptides，简称AMP)。植物AMP包括硫素，脂质转移蛋白，橡胶素，打结素，富含甘氨酸的肽，MBP-1(来自玉米的AMP)的同源物，蜕皮素，环肽，蛋白酶抑制剂(PI)和防御素。植物中的AMP通常在种子和生殖组织中表达，并且还受到干旱，盐，冷，病原体入侵或伤害诱导的应激的上调，可抑制杀死多种病原真菌，因此可用来研制新型的杀菌剂或新型的抗生素类药物。

植物防御素是植物先天免疫系统的主要成分。通常，它们对哺乳动物或植物细胞无毒。然而，它们对植物和人类的真菌病原体具有极高的活性。植物防御素是在种子中常见的小的阳离子蛋白质，但也位于植物的其他部分，包括叶，根，树皮，豆荚，块茎，果实和花器官。它们集中在表皮细胞和气孔细胞中，产生于可能是与病原体接触的初始点。植物防御素由45-54个氨基酸残基组成，并通过四个二硫键保持在一起。这些二硫键使得分子对蛋白酶和极端的pH和温度高度稳定。八个高度保守的半胱氨酸的间距和连接性定义了植物防御素家族。

基于以上研究背景，由于真菌防御素具有高度稳定性，良好的水溶性、安全无毒、且抑菌谱广、具备保健作用的特点，但在生物体中含量低，难以天然提取，而化学合成方法成本高，无法满足工业化生产的需求，因此，借助于基因工程与蛋白质工程手段是大规模生产防御素的一条经济有效的途径。

发明内容

基于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种重组荞麦防御素蛋白及其制备方法和应用，通过构建荞麦防御素蛋白的重组表达载体，利用重组表达技术获得重组荞麦防御素蛋白，该蛋白对真菌有抑菌活性，生产及纯化方法简单，在医疗保健、食品开发和化妆品研发等方面具有实用价值。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一方面，本发明提供的一种重组荞麦防御素蛋白，该蛋白含有75个氨基酸，预测的信号肽序列为前端18个氨基酸残基，理论分子量为6.3kDa，等电点为8.5。所述重组荞麦防御素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；其中，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列如下：

MEKKVLGLLL FIIVFASGIG THMVEVEGKT CTKPSKYYHG WCVAGCGGAC KKEN WPQGDCEGYGFKSHCV CKRPC。

去除前端18个氨基酸后的重组荞麦防御素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；其中，SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列如下：

IGTHMVEVEG KTCTKPSKYY HGWCVAGCGG ACKKENWPQG DCEGYGFKSH CVCK RPC。

另一方面，本发明还提供了一种DNA片段，其包含编码如上所述的重组荞麦防御素蛋白的核苷酸序列。

根据本发明，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述SEQ ID NO.3表示的核苷酸序列如下：

ATGGAGAAAAAAGTTTTGGGTCTTCTTCTCTTCATCATCGTGTTTGCTTCAGGGATAGGAACACATATGGTAGAGGTGGAGGGGAAAACATGCACAAAGCCAAGCAAGTACTACCACGGATGGTGTGTTGCAGGCTGCGGCGGAGCTTGCAAGAAGGAGAATTGGCCTCAGGGCGATTGCGAAGGCTACGGCTTCAAGTCCCATTGTGTTTGCAAAAGGCCGTGT。

去除前端18个氨基酸后，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述SEQID NO.4表示的核苷酸序列为：

ATAGGAACACATATGGTAGAGGTGGAGGGGAAAACATGCACAAAGCCAAGCAAGTACTACCACGGATGGTGTGTTGCAGGCTGCGGCGGAGCTTGCAAGAAGGAGAATTGGCCTCAGGGCGATTGCGAAGGCTACGGCTTCAAGTCCCATTGTGTTTGCAAAAGGCCGTGT。

进一步的，本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的如上所述的DNA片段。

进一步的，本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的表达载体。

进一步的，本发明还提供了一种如上所述的重组荞麦防御素蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1)通过分析荞麦全基因序列筛选获得荞麦防御素蛋白的编码基因；

2)根据荞麦防御素蛋白编码基因设计引物，以合成的荞麦防御素蛋白编码基因为模版进行扩增；

3)将步骤2)中扩增得到的基因片段克隆到表达载体中，构建重组质粒；

4)将步骤3)中得到的重组质粒转化入大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌，然后对重组大肠杆菌诱导表达，超声破碎收获重组荞麦防御素蛋白，利用亲和层析柱纯化后得到具有抗菌活性的重组荞麦防御素蛋白。

优选的，所述步骤2)中所述引物包括上游引物F和下游引物R，所述上游引物F如SEQ ID NO.5所示，所述下游引物R如SEQ ID NO.6所示，具体如下：

上游引物F：5’-GGATCCATAGGAACACATATG-3’,(SEQ ID NO.5)；

下游引物R：5’-CTCGAGACACGGCCTTTTGCAAACAC-3’,(SEQ ID NO.6)。

优选的，所述步骤2)中的具体扩增反应条件为：首先94℃预变性10分钟，再94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行32个循环，最后72℃延伸10分钟，反应结束后4℃保存。

优选地，所述步骤3)所述基因片段克隆到表达载体中连接到BamHI和XhoI克隆位点。

其中，所述的表达载体和宿主大肠杆菌都采用本领域常规的载体和宿主细胞，本领域技术人员可以根据需要选择不同的载体和宿主细胞，在此不做特殊限定，本发明采用pGEX6p-1表达载体和BL21(DE3)-plysS表达菌株。

其中，诱导表达、超声破碎、亲和层析纯化等操作手段本领域技术人员都可以根据需要采用本领域公知的技术进行，在此不做特殊限定。

进一步的，本发明还提供了一种如上所述的重组荞麦防御素蛋白、如上所述的DNA片段、如上所述的表达载体、如上所述的宿主细胞在制备抗真菌的药物、保健品、食品、化妆品和添加剂中的至少一种中的应用。

优选的，所述真菌为黑曲霉、白腐霉或尖孢镰刀菌中的任一种。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过构建荞麦防御素蛋白的重组表达载体，利用原核重组表达技术获得GST融合的荞麦防御素蛋白，相较于表达包涵体再进行变性与复性的技术方案，本发明的重组表达技术方案简捷有效，且蛋白表达量相对较大，纯度较高(蛋白纯度达98％以上)，简单的生产及纯化方法为后续工业化生产及应用提供了保障。该蛋白对真菌有抑菌活性，在医疗保健，食品开发，化妆品研发等方面具有实用价值。

附图说明

图1为重组荞麦防御素的氨基酸序列信号肽的预测结果；

图2为本发明重组荞麦防御素蛋白SDS-PAGE的电泳结果图；其中，M为蛋白质分子量marker；1为诱导重组蛋白表达并破菌后沉淀蛋白；2为诱导重组蛋白表达并破菌后上清蛋白；3为上清蛋白挂GST柱材料后，GST柱上蛋白；4为GST柱上蛋白经酶切后的蛋白；5为酶切后收集的重组荞麦防御素蛋白；

图3为重组荞麦防御素蛋白抗白腐霉活性的实验效果图；

图4为重组荞麦防御素蛋白抗黑曲霉活性的实验效果图；

图5为重组荞麦防御素蛋白抗尖孢镰刀菌活性的实验效果图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买获得的常规产品。

实验材料

实验所用pGEX-6P-1质粒由Invitrogen公司提供；

实验中的全基因合成和测序验证均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

荞麦种子由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所提供，品种名为云荞一号。

实施例1：制备重组蛋白

本发明的重组荞麦防御素蛋白原核重组表达，包括下列步骤：

1)目的蛋白氨基酸序列信号肽的预测

通过信号肽在线预测网站SignalP-5.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对荞麦防御素蛋白的氨基酸序列预测。

结果如图1所示，荞麦防御素蛋白的氨基酸序列的前18个氨基酸为信号肽。

2)重组载体的构建

2.1)通过分析荞麦全基因序列筛选获得荞麦防御素蛋白的编码基因；

在该步骤中，所述荞麦防御素蛋白基因通过密码子优化编码荞麦防御素蛋白的编码区密码子，采用的密码子优化的方法本领域技术人员可以根据需要采用本领域公知的技术进行，在此不做特殊限定，将优化后的荞麦防御素蛋白质编码区密码子发送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成。

2.2)根据合成的荞麦防御素蛋白的编码基因设计特异性引物；在本实施例中：

上游引物F(SEQ ID NO.5)为：

5’-GGATCCATAGGAACACATATG-3’，其中下划线部分为BamHI酶切位点；

下游引物R(SEQ ID NO.6)为：

5’-CTCGAGACACGGCCTTTTGCAAAC-3’，其中下划线部分为XhoI酶切位点；

以全合成的荞麦防御素蛋白的基因为模版，进行PCR扩增。

PCR扩增反应体系如下：

PCR扩增程序：首先94℃预变性10分钟，再94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行32个循环，最后72℃延伸10分钟，反应结束后4℃保存。

所获得PCR产物进行1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒回收纯化，得到的重组荞麦防御素蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其两端序列含有BamHI和XhoI酶切位点。

2.3)用BamHI和XhoI双酶切pGEX-6P-1表达载体和荞麦防御素蛋白的基因片段，进行连接，得到重组表达载体；

2.4)将重组表达载体转化TOP10感受态细胞，挑选阳性克隆进行测序验证。

2.5)提取序列正确的重组表达载体质粒，转化到表达菌BL21(DE3)-plysS大肠杆菌中，得到含有所述重组表达载体质粒的阳性表达菌；

3)重组蛋白的表达

具体地，本发明使用构建好的重组表达载体转化入表达宿主菌，并筛选阳性克隆，测序确认表达框的正确性。挑选单克隆，先接种于5mL的LB培养基于37℃过夜培养，12小时后，转接到1000mL的LB培养基中扩大培养，37℃下在摇瓶中培养至OD为0.6左右，降低培养温度至16℃，然后加入终浓度为0.2mM的IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)进行诱导表达，大约16-20小时后离心收菌。用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH 8.4，含150mM NaCl)悬浮菌体，使用低温超高压细胞破碎仪裂解细胞，通过离心分离出不溶性沉淀，将高速离心(约13,000rmp)后获得的上清，上清液通过Glutathione-sepharose亲和柱来初步分离纯化GST融合蛋白。含有GST标签的蛋白可以结合GST亲和柱，使用50mM Tris-HCl(pH8.4)，500mM NaCl与150mM NaCl缓冲液交替将杂蛋白洗净后，使用ProScission蛋白酶酶切结合在亲和柱上的GST融合蛋白，此过程大约20小时，然后将酶切下来的重组荞麦防御素蛋白使用阴离子交换柱与凝胶柱进一步纯化出重组荞麦防御素蛋白，SDS-PAGE电泳检测表达产物。

结果如图2所示，从蛋白电泳结果图可以确定重组荞麦防御素蛋白分子量在6.3kDa左右，蛋白纯度达98％以上，结果表明，利用本发明所实施的技术方案，可以简洁快速的得到重组荞麦防御素蛋白，后续纯化方法简单，成本低廉，且得到的蛋白纯度高，有利于向工业化制备应用等方面发展。

实施例2：重组荞麦防御素蛋白的抗白腐霉活性

将白腐霉接种在1.2％马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基PDA上，28℃下生长2-3天。当菌落直径生长到1-2cm时，将牛津杯按所需置于菌落四周。然后，将50mM Tris-HCl(pH8.4)阴性对照缓冲液，80μM重组荞麦防御素蛋白，80μM GST对照分别加入牛津杯中。马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基PDA在4℃下进行与扩散2h，然后将培养基转移至28℃孵育24h，随后观察菌落生长情况。

结果如图3所示，从白腐霉在平板上的生长状况可以看出，50mM Tris-HCl(pH8.4)阴性对照缓冲液与GST对照对白腐霉的生长没有抑制作用，而加入了重组荞麦防御素蛋白的牛津杯边缘的菌丝体形成了弦状抑制区，结果表明：重组荞麦防御素蛋白对白腐霉有抑菌效果，重组荞麦防御素蛋白可作为一种无毒副作用的抑菌剂应用到农业生产中，在食品防腐剂的开发，医药防腐剂，保健品添加剂和化妆品添加剂等方面都有广阔前景。

实施例3：重组荞麦防御素蛋白的抗黑曲霉活性

将黑曲霉接种在1.2％马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基PDA上，28℃下生长,1-2天。当菌落直径生长到1-2cm时，将牛津杯按所需置于菌落四周。然后，将50mM Tris-HCl(pH8.4)阴性对照缓冲液，80μM重组荞麦防御素蛋白，40μM重组荞麦防御素蛋白，80μM GST对照分别加入牛津杯中。马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基PDA在4℃下进行与扩散2h，然后将培养基转移至28℃孵育24h，随后观察菌落生长情况。

结果如图4所示，从黑曲霉在平板上的生长状况可以看出，50mM Tris-HCl(pH8.4)阴性对照缓冲液与GST对照对黑曲霉的生长没有抑制作用，而加入了重组荞麦防御素蛋白的牛津杯边缘的菌丝体形成了弦状抑制区，结果表明：重组荞麦防御素蛋白对黑曲霉有抑菌效果，重组荞麦防御素蛋白可作为一种无毒副作用的抑菌剂应用到农业生产中，在食品防腐剂的开发，医药防腐剂，保健品添加剂和化妆品添加剂等方面都有广阔前景。

实施例4：重组荞麦防御素蛋白的抗尖孢镰刀菌活性

将尖孢镰刀菌接种在1.2％马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基PDA上，28℃下生长2-3天。当菌落直径生长到1-2cm时，将牛津杯按所需置于菌落四周。然后，将50mM Tris-HCl(pH8.4)阴性对照缓冲液，80μM重组荞麦防御素蛋白，80μM GST对照分别加入牛津杯中。马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基PDA在4℃下进行与扩散2h，然后将培养基转移至28℃孵育24h，随后观察菌落生长情况。

结果如图5所示，从尖孢镰刀菌在平板上的生长状况可以看出，50mM Tris-HCl(pH8.4)阴性对照缓冲液与GST对照对尖孢镰刀菌的生长没有抑制作用，而加入了重组荞麦防御素蛋白的牛津杯边缘的菌丝体形成了弦状抑制区，结果表明：重组荞麦防御素蛋白对尖孢镰刀菌有抑菌效果，重组荞麦防御素蛋白可作为一种无毒副作用的抑菌剂应用到农业生产中，在食品防腐剂的开发，医药防腐剂，保健品添加剂和化妆品添加剂等方面都有广阔前景。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

序列表

<110> 山西大学

<120> 一种重组荞麦防御素蛋白及其制备方法和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 75

<212> PRT

<213> 荞麦(Fagopyrum esculentum Moench)

<400> 1

Met Glu Lys Lys Val Leu Gly Leu Leu Leu Phe Ile Ile Val Phe Ala

1 5 10 15

Ser Gly Ile Gly Thr His Met Val Glu Val Glu Gly Lys Thr Cys Thr

20 25 30

Lys Pro Ser Lys Tyr Tyr His Gly Trp Cys Val Ala Gly Cys Gly Gly

35 40 45

Ala Cys Lys Lys Glu Asn Trp Pro Gln Gly Asp Cys Glu Gly Tyr Gly

50 55 60

Phe Lys Ser His Cys Val Cys Lys Arg Pro Cys

65 70 75

<210> 2

<211> 57

<212> PRT

<213> 荞麦(Fagopyrum esculentum Moench)

<400> 2

Ile Gly Thr His Met Val Glu Val Glu Gly Lys Thr Cys Thr Lys Pro

1 5 10 15

Ser Lys Tyr Tyr His Gly Trp Cys Val Ala Gly Cys Gly Gly Ala Cys

20 25 30

Lys Lys Glu Asn Trp Pro Gln Gly Asp Cys Glu Gly Tyr Gly Phe Lys

35 40 45

Ser His Cys Val Cys Lys Arg Pro Cys

50 55

<210> 3

<211> 225

<212> DNA

<213> 荞麦(Fagopyrum esculentum Moench)

<400> 3

atggagaaaa aagttttggg tcttcttctc ttcatcatcg tgtttgcttc agggatagga 60

acacatatgg tagaggtgga ggggaaaaca tgcacaaagc caagcaagta ctaccacgga 120

tggtgtgttg caggctgcgg cggagcttgc aagaaggaga attggcctca gggcgattgc 180

gaaggctacg gcttcaagtc ccattgtgtt tgcaaaaggc cgtgt 225

<210> 4

<211> 171

<212> DNA

<213> 荞麦(Fagopyrum esculentum Moench)

<400> 4

ataggaacac atatggtaga ggtggagggg aaaacatgca caaagccaag caagtactac 60

cacggatggt gtgttgcagg ctgcggcgga gcttgcaaga aggagaattg gcctcagggc 120

gattgcgaag gctacggctt caagtcccat tgtgtttgca aaaggccgtg t 171

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 荞麦(Fagopyrum esculentum Moench)

<400> 5

ggatccatag gaacacatat g 21

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 荞麦(Fagopyrum esculentum Moench)

<400> 6

ctcgagacac ggccttttgc aaacac 26

Claims (10)

1.一种重组荞麦防御素蛋白，其特征在于，所述重组荞麦防御素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.一种DNA片段，其特征在于，所述DNA片段的序列为编码权利要求1所述的重组荞麦防御素蛋白的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4所示。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求2或3所述的DNA片段。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求4所述的表达载体。

6.一种如权利要求1所述的重组荞麦防御素蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)通过分析荞麦全基因序列筛选获得荞麦防御素蛋白的编码基因；

2)根据荞麦防御素蛋白编码基因设计引物，以全合成的荞麦防御素蛋白编码基因为模板进行扩增；

3)将步骤2)扩增得到的基因片段克隆到表达载体中，构建重组质粒；

4)将步骤3)中得到的重组质粒转化入大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌，然后对重组大肠杆菌诱导表达，分离得到重组荞麦防御素蛋白。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述引物为SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示的序列。

8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述基因片段克隆到载体中连接到BamH I和XhoI克隆位点。

9.如权利要求1所述的重组荞麦防御素蛋白、如权利要求2或3所述的DNA片段、如权利要求4所述的表达载体或如权利要求5所述的宿主细胞在制备抗真菌药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述真菌为黑曲霉、白腐霉或尖孢镰刀菌。

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