CN110144339A - 一种新型无花果植物来源的溶菌酶及其发酵生产工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新型无花果植物来源的溶菌酶及其发酵生产工艺，所述溶菌酶包括重组后的表达序列、宿主菌株、表达载体、发酵工艺，所述重组后的表达序列为无花果溶菌酶的N‑端序列1‑129氨基酸，根据蛋清溶菌酶活性位点Glu35和Asp52的位置，通过基因序列改变将无花果溶菌酶的第35和52位置的氨基酸变成谷氨酸和天冬氨酸；所述发酵生产工艺步骤包括表达序列的获取、质粒的提取、设计特性引物、基因的扩增、重组质粒的构建、重组子的鉴定、菌株的构建、植物源重组溶菌酶的高效表达；经过杀菌检测，本方法制备的无花果溶菌酶具有很强的杀菌能力，可应用于抗菌产品领域，如消毒类产品、伤口敷料等。

Description

一种新型无花果植物来源的溶菌酶及其发酵生产工艺
技术领域
本发明涉及生物溶菌酶技术领域，具体为一种新型无花果植物来源的溶菌酶及其发酵生产工艺。
背景技术
溶菌酶,是一种碱性蛋白酶,专门作用于细菌的细胞壁,使细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1,4糖苷键断裂,导致细菌细胞发生裂解,产生溶菌现象,从而起到杀死细菌的作用。它广泛存在于动植物和微生物的组织、体液及分泌物中,在生物机体的免疫防御系统中发挥重要作用。目前，溶菌酶主要来自于蛋清，动物，植物，微生物等，其溶菌活性以蛋清来源的最高。植物来源的溶菌酶主要存在于萝卜、无花果等植物中，但其溶菌活性比动物来源的低；动物来源的溶菌酶因其纯化工艺复杂，常常有热源物质的引入，所以开发一种植物来源的具有高效溶菌活性的溶菌酶非常必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型无花果植物来源的溶菌酶及其发酵生产工艺，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种新型无花果植物来源的溶菌酶，包括重组后的表达序列、宿主菌株、表达载体、发酵工艺，所述重组后的表达序列为无花果溶菌酶的N-端序列1-129氨基酸，根据蛋清溶菌酶活性位点Glu35和Asp52的位置，通过基因序列改变将无花果溶菌酶的第35和52位置的氨基酸变成谷氨酸和天冬氨酸。
作为本发明一种优选的技术方案，一种新型无花果植物来源的溶菌酶的发酵生产工艺，包括以下几个步骤：
S1、表达序列的获取：根据蛋清溶菌酶活性位点Glu35和Asp52的位置，通过基因序列改变将无花果溶菌酶的第35和52位置的氨基酸变成谷氨酸和天冬氨酸；
S2、质粒的提取：从实验室构建好的毕赤酵母菌株中提取质粒；
S3、设计特性引物：以基因序列改变后的无花果溶菌酶的N-端序列1-129氨基酸序列为模板，设计用于真核细胞表达系统的特性引物R1和R2；
S4、基因的扩增：以基因序列改变后的无花果溶菌酶的N-端序列1-129氨基酸序列为模板，用引物R1和R2进行PCR扩增；
S5、重组质粒的构建：PCR产物纯化后，用酶切连接的方法将目的基因与表达载体相连，得到重组表达载体；
S6、重组子的鉴定：用菌落PCR方法进一步筛选，并进行双酶切验证以及测序验证：
S7、菌株的构建：将上述验证正确的重组表达载体转化宿主菌株中，得到含有重组质粒的菌株：
S8：植物源重组溶菌酶的高效表达：利用甲醇诱导重组毕赤酵母高效表达植物源重组溶菌酶。
作为本发明一种优选的技术方案，其特征在于：所述步骤S3中，
R1为GCGTGAATTCGTGATGGGAGGTCGACTG，
R2为GCGGCCGCCGCCATTCGGGTCCGG。
作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤S5中，所述的表达载体为细胞外表达载体，包括但不限于pPIC9K、pPICZα、pCMVp-NEO-BAN。
作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤S7中，所述的宿主菌株为毕赤酵母菌株，包含但不限于以下型号：GS115、KM71、MC100-3、SMD1168。
作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤S8中，利用甲醇的类型为甲醇利用正表型、甲醇利用缓慢表型、甲醇利用负表型中任意一种。
作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤S8中，采用甲醇诱导中，甲醇浓度为0.1%~5%，发酵时间为24~72h。
作为本发明一种优选的技术方案，所用的内切酶为EcoR I和Not I。。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明一种新型无花果植物来源的溶菌酶及其发酵生产工艺，将无花果溶菌酶的第35和52位置的氨基酸变成谷氨酸和天冬氨酸，使无花果溶菌酶的基因序列发生改变，再经过酶切、连接等操作后将基因导入到真核表达载体中，经过一系列的验证鉴定后，转化到毕赤酵母中，经过甲醇诱导实现植物源重组溶菌酶在胞外的高效表达；经过杀菌检测，本方法制备的无花果溶菌酶具有很强的杀菌能力，可应用于抗菌产品领域，如消毒类产品、伤口敷料等。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：植物源溶菌酶的制备，包括如下几个步骤：
S1：表达序列的获取：基因序列改变的无花果溶菌酶来源于实验室。
S2：质粒的提取：利用小提试剂盒提取pPIC9K质粒。
S3：设计特性引物：以无花果溶菌酶1-129多肽基因为模版，利用软件，设计用于真核细胞表达系统的特异性引物GCGTGAATTCGTGATGGGAGGTCGACTG,GCGGCCGCCGCCATTCGGGTCCGG序列。
S4：基因的扩增：PCR条件为：95℃、50s预变性模板DNA，然后95℃、30s，50℃、50s，70℃、50s，5个循环后改为95℃、30s，55℃、50s，70℃、50s，25个循环后再在70℃延伸反应5-10min；扩增后的基因通过普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收。
S5：重组质粒的构建：根据pPIC9K质粒载体，操作步骤如下：
1.在体积200μL的离心管中配置如下DNA溶液，总体积为10μL，pPIC9K质粒载体 2μL，重组后的无花果溶菌酶基因8μL；
2.在上述离心管中加入5μL的高效连接液Solution I；
3.将200μL的离心管放入PCR仪中，反应30min；
4.加入100μL毕赤酵母感受态细胞中，在冰中反应30min；
5.在42℃下热激活50s，在将其置于冰中反应1min；
6.加入到培养基中，摇床培养1h；
7.进行单菌落培养。
S6：PCR鉴定与双酶切鉴定：用无菌牙签挑选取适量白色单菌落，将其溶解于无菌水中，沸水煮20min，离心；采用PCR体系进行PCR反应后，利用琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR反应效果；采用双酶切反应体系进行双酶切验证，将PCR和双酶切验证均阳性的菌株，送测序公司测序。
S7、菌株的构建：采用的宿主毕赤酵母菌株型号为MC100-3。
S8：植物源重组溶菌酶的高效表达：将测序正确的菌落接到BMGY液体培养基中发酵，利用1.0%甲醇诱导进行发酵，将发酵产物离心，取上清液，纯化后即得溶菌酶。
实施例二：植物源溶菌酶的杀菌检测，包括如下几个步骤：
S1：细菌平板准备：在LB培养基中分别培养金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌，将两种菌在LB培养基中培养至OD620为0.6，将培养至特定浓度的菌种与含有1%（质量百分比）琼脂的LB混合。将混合液导入到培养皿，每个培养皿中倒入15mL，凝固后即为细菌平板。
S2：植物源溶菌酶的杀菌活性。首先将经过高温高压灭菌处理过的滤纸片（10mm）置于细菌平板上，然后将制备的溶菌酶在PBS溶液中稀释至1mg/mL，取10uL溶菌酶溶液和10uLPBS溶液分别加至细菌平板上的滤纸片上，涂抹均匀；最后将平板置于37℃恒温恒湿培养箱中培养24~36小时，观察滤纸片边缘的抑菌圈发现，含有溶菌酶的滤纸片周围出现20~30mm直径的抑菌圈，而含有PBS溶液的滤纸片周围无抑菌圈。
结果：观察结果表面本发明的植物源溶菌酶具有较强的杀菌效果，可用于抗菌产品领域。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种新型无花果植物来源的溶菌酶，其特征在于：包括重组后的表达序列、宿主菌株、表达载体、发酵工艺，重组后的表达序列为无花果溶菌酶的N-端序列1-129氨基酸，根据蛋清溶菌酶活性位点Glu35和Asp52的位置，通过基因序列改变将无花果溶菌酶的第35和52位置的氨基酸变成谷氨酸和天冬氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种新型无花果植物来源的溶菌酶的发酵生产工艺，其特征在于，包括以下几个步骤：
S1、表达序列的获取：根据蛋清溶菌酶活性位点Glu35和Asp52的位置，通过基因序列改变将无花果溶菌酶的第35和52位置的氨基酸变成谷氨酸和天冬氨酸；
S2、质粒的提取：从实验室构建好的毕赤酵母菌株中提取质粒；
S3、设计特性引物：以基因序列改变后的无花果溶菌酶的N-端序列1-129氨基酸序列为模板，设计用于真核细胞表达系统的特性引物R1和R2；
S4、基因的扩增：以基因序列改变后的无花果溶菌酶的N-端序列1-129氨基酸序列为模板，用引物R1和R2进行PCR扩增；
S5、重组质粒的构建：PCR产物纯化后，用酶切连接的方法将目的基因与表达载体相连，得到重组表达载体；
S6、重组子的鉴定：用菌落PCR方法进一步筛选，并进行双酶切验证以及测序验证：
S7、菌株的构建：将上述验证正确的重组表达载体转化宿主菌株中，得到含有重组质粒的菌株：
S8：植物源重组溶菌酶的高效表达：利用甲醇诱导重组毕赤酵母高效表达植物源重组溶菌酶。
3.根据权利要求2所述的一种新型无花果植物来源的溶菌酶及其发酵生产工艺，其特征在于：所述步骤S3中，R1为GCGTGAATTCGTGATGGGAGGTCGACTG，R2为GCGGCCGCCGCCATTCGGGTCCGG。
4.根据权利要求2所述的一种新型无花果植物来源的溶菌酶及其发酵生产工艺，其特征在于：所述步骤S5中，所述的表达载体为细胞外表达载体，包括但不限于pPIC9K、pPICZα、pCMVp-NEO-BAN。
5.根据权利要求2所述的一种新型无花果植物来源的溶菌酶及其发酵生产工艺，其特征在于：所述步骤S7中，所述的宿主菌株为毕赤酵母菌株，包含但不限于以下型号：GS115、KM71、MC100-3、SMD1168。
6.根据权利要求2所述的一种新型无花果植物来源的溶菌酶及其发酵生产工艺，其特征在于：所述步骤S8中，利用甲醇的类型为甲醇利用正表型、甲醇利用缓慢表型、甲醇利用负表型中任意一种。
7.根据权利要求2所述的一种新型无花果植物来源的溶菌酶及其发酵生产工艺，其特征在于：所述步骤S8中，采用甲醇诱导中，甲醇浓度为0.1%~5%，发酵时间为24~72h。
8.根据权利要求2所述的一种新型无花果植物来源的溶菌酶及其发酵生产工艺，其特征在于：所用的内切酶为EcoR I和Not I。
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