CN110004064B

CN110004064B - 一株新的球孢白僵菌及其应用

Info

Publication number: CN110004064B
Application number: CN201910272583.6A
Authority: CN
Inventors: 何刚; 李永川; 肖禾; 刘文武
Original assignee: Sichuan Guangyuan Minjiang Chinese Herbal Medicine Planting Co ltd
Current assignee: Sichuan Guangyuan Minjiang Chinese Herbal Medicine Planting Co ltd
Priority date: 2019-01-30
Filing date: 2019-04-04
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2039-04-04
Also published as: CN110004064A

Abstract

本发明公开了一株新的球孢白僵菌，它是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号：CGMCC NO.14637的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。本发明还公开了利用新球孢白僵菌制备僵蚕的方法。本发明的球孢白僵菌，感染家蚕的僵化率高，可以有效生产僵蚕，所得僵蚕的品质优，应用前景良好。

Description

一株新的球孢白僵菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株球孢白僵菌及其应用。

背景技术

僵蚕，中药名。为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx mori Linnaeus 4～5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌Beauveria bassiana(Bals.)Vuillant而致死的干燥体。分布于江苏、浙江、四川、广东等地。具有息风止痉，祛风止痛，化痰散结之功效。常用于肝风夹痰，惊痫抽搐，小儿急惊，破伤风，中风口

，风热头痛，目赤咽痛，风疹瘙痒，发颐痄腮。

目前缺乏优良的白僵菌菌株，造成家蚕感染僵化率低，僵蚕的规模化生产未能达到预期的效益。

发明内容

本发明提供了一株新的球孢白僵菌及其的应用。

本发明球孢白僵菌，它是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号：CGMCC NO.14637的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。

本发明球孢白僵菌(Beauveria bassiana)，于2017年11月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.14637。

本发明还提供了一种利用前述球孢白僵菌制备僵蚕的方法，它包括如下步骤：

1)取前述球孢白僵菌，用含吐温-80的无菌水配置成菌悬液；

2)将菌悬液喷洒于健康家蚕，1小时后饲喂桑叶，控制蚕室温度，湿度，待家蚕死亡立即拣出；

3)充分僵化后，灭活菌株，再烘干，即得。

进一步地，步骤1)所述无菌水中每1ml含2μl吐温-80。

进一步地，步骤1)所述菌悬液的浓度为1×10⁵cfu/ml～1×10⁷cfu/ml，优选1×10⁷cfu/ml。

进一步地，步骤2)所述健康家蚕为5龄起蚕。

进一步地，步骤2)所述蚕室温度为25～30℃，湿度不低于75％

进一步地，步骤2)所述饲喂桑叶为新采桑叶。

进一步地，步骤3)所述灭活温度100℃，时间0.5h。

进一步地，步骤3)所述烘干至水分低于13％。

本发明球孢白僵菌，感染家蚕的僵化率高，可以有效生产僵蚕，所得僵蚕空心少，品质优，应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1本发明球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的鉴定特征

1、菌株来源

本发明菌株是从中药僵蚕中分离纯化得到。

2、生理生化鉴定

2.1实验材料与试剂

2.1.1主要试剂

无水乙醇、H₂O₂、浓盐酸、冰醋酸等，以上试剂均为分析纯，葡萄糖、琼脂、牛肉膏、蛋白胨、NaCl、磷酸氢二钾、乙醚、尿素、可溶性淀粉、对二氨基苯甲醛、甲基红、α-萘酚、KOH、碘、KI、α-萘胺、对氨基苯磺蒸馏水、蒸馏水等。

2.1.2主要仪器与设备

高压灭菌锅、超净工作台、电子显微镜、0.22μm有机滤膜、5ml针筒等。

2.1.3培养基的制备

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：称取去皮的马铃薯200g，切块，加适量蒸馏水煮沸25min，8层纱布过滤去渣；葡萄糖20g、琼脂粉20g加于滤液中，蒸馏水定容至1000mL。高温高压灭菌30min后待温度降至45℃左右时，在无菌条件下加入80U/mL的青霉素钠和硫酸链霉素，用于抑制细菌的生长，制作平板。

Dunham氏蛋白胨培养基：蛋白胨1g，氯化钠0.5g，蒸馏水100ml。上述成分混合后加热融化，调pH为7.5。120℃高压蒸汽灭菌20min。

葡萄糖蛋白胨水培养基：磷酸氢二钾0.5g，蛋白胨0.7g，葡萄糖0.5g，蒸馏水100ml，pH7.0。120℃高压蒸汽灭菌20min。

Christensen氏培养基：蛋白胨1g，葡萄糖0.1g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.2g，0.4％酚红溶液0.3ml，琼脂2g，20％尿素100ml，蒸馏水90ml。除尿素溶液外，将上述成分依次加入蒸馏水中，加热溶解，调pH至7.2，120℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却至50～55℃左右加入已过滤除菌的尿素溶液，混匀，放置成斜面冷却备用。

3％可溶性淀粉琼脂平板：可溶性淀粉溶液0.3ml，牛肉膏0.45g，蛋白胨0.9g，氯化钠0.45g，磷酸氢二钾0.09g，蒸馏水100ml，调pH为7.4～7.6。120℃高压蒸汽灭菌20min。

硝酸盐培养基：蛋白胨1g，硝酸钾0.1～0.2g，蒸馏水100ml，调pH至7.4，分装于6支试管，每管约3ml。120℃高压蒸汽灭菌20min。

2.2、实验方法

2.2.1吲哚实验

配置Ehrlich氏试剂：对位氨基苯甲醛1g，无水乙醇95ml，浓盐酸20ml。

配置Dunham氏蛋白胨培养基100ml，分装到6支小试管中，每管约3ml。6支试管分为两组，3支对照(不接种)，3支加入待测真菌，27℃恒温培养2-5天。取出试管，加入1ml乙醚，摇匀，静置1min，沿试管壁缓慢加入Ehrlich氏试剂5-10滴，观察，若乙醚层出现玫瑰红，则为阳性。

2.2.2 MR与VP实验

配置甲基红试剂：甲基红0.02g，95％乙醇60ml，蒸馏水40ml。

配置VP试剂：甲液：α-萘酚酒精溶液(α-萘酚0.5g，无水乙醇10ml)；乙液：40％KOH(KOH4g，水10ml)。

配置葡萄糖蛋白胨水培养基100ml，分装到12支小试管中，每管约3ml。将试管分为两组，6支对照(不接种)，6支加入待测真菌。27℃恒温培养2～5天。

MR实验：取3支对照组和3支对照组。加入甲基红试剂3～5滴，观察。培养液出现红色为阳性，橙色为可疑，黄色为阴性。

VP实验：取3支对照组和3支对照组。取出后先加入VP试剂，甲液0.6ml，再加入乙液0.2ml，充分混匀，静置，15min观察。培养液红色为阳性，不变色为阴性。(1h后可出现假阳性)

2.2.3触酶试验

取纯化后培养基，用接种环将一菌落放于载玻片中央，加1滴3％H₂O₂于菌落上，立即观察有无气泡产生。

2.2.4脲酶实验

配置Christensen氏培养基100ml，制成3支斜面培养基。用接种环将待检菌培养物接种于琼脂斜面，不要穿刺到底，下部留做对照。27℃培养2～5天。若为阳性反应，则琼脂斜面由粉红到紫红。

2.2.5淀粉水解实验

配置革兰氏碘液：碘0.1g，KI0.2g，蒸馏水30ml。先用3～5ml溶解KI，再投入碘片，待碘全溶后，加水稀释至30ml。

配置3％可溶性淀粉琼脂培养液100ml，分装与3个无菌培养皿中。将待测菌划线接种于3％可溶性淀粉琼脂平板上，27℃培养2～5天。

取出平板，在菌落处滴加碘液少许，观察。培养基呈深蓝色，说明淀粉未被水解，即淀粉酶阴性。能水解淀粉的细菌其菌落周围有透明的环，即淀粉酶阳性。

2.2.6硝酸盐还原实验

配置Gress试剂(现配现用)：甲液：甲基α-萘胺0.6g，28ml冰醋酸，蒸馏水72ml，稍加热溶解。乙液：对氨基苯磺酸0.8g，28ml冰醋酸，蒸馏水72ml。

配置硝酸盐培养基100ml，分装于6支试管，每管约3ml。6支试管分成两组，3支对照(不接种)，3支加入待测真菌，27℃恒温培养2～5天。

取出试管，再加入Gress试剂甲、乙试剂各3～5滴，在30s内出现红色即为阳性。若无颜色出现，加入2～3滴二苯胺试剂，如果溶液出现蓝色，则表明仍有硝酸盐存在，则为真阴性；如果溶液没有变蓝，说明硝酸盐还原成了氨和氮，则该反应认为阳性。

2.3、实验结果及分析

2.3.1生理生化实验结果

2.3.2实验结果分析

2.3.2.1吲哚实验：有的微生物含有色氨酸酶，能分解蛋白质中的色氨酸产生吲哚，吲哚与对二氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而显红色。实验结果为阳性,说明该真菌不含有色氨酸酶。

2.3.2.2 MR实验：微生物分解培养基中的葡萄糖产酸，当产酸量大，使培养基的pH降低至4.5以下，加入甲基红试剂而变红，pH4.4(红色)-pH6.2(黄色)。实验结果为阳性，说明真菌能分解培养基中的葡萄糖。

2.3.2.3 VP实验：当微生物发酵葡萄糖产生丙酮酸，→丙酮酸→乙酰甲基甲醇→2,3-丁二烯醇。二乙酰(碱性条件下氧化)，二乙酰和蛋白胨中的精氨酸胍基反应产生粉红色化合物。实验结果为阴性，说明该真菌能分解葡萄糖产酸，但不产生丙酮酸。

2.3.2.4触媒实验：过氧化氢的形成可看做是糖需氧分解的氧化终末产物，其存在对微生物是有毒性的，微生物产生酶将其分解，这些酶为触媒(过氧化氢酶)和过氧化物酶。实验结果为阴性，说明该真菌无过氧化氢酶和过氧化物酶。

2.3.2.5脲酶实验：微生物分解尿素产生两分子氨，使培养基pH升高，指示剂粉红显示出红色，即证明该微生物含有脲酶。实验结果为阴性，说明该真菌无脲酶。

2.3.2.6淀粉水解实验：有些微生物具有淀粉酶，能水解培养基中的淀粉成麦芽糖，淀粉水解后遇碘液不在显蓝紫色。实验结果为阴性，说明该真菌无淀粉酶。

2.3.2.7硝酸盐还原实验：有些微生物能从硝酸盐提出氧而将其还原成亚硝酸盐(偶尔还会形成NH₃、N₂、NO、NO₂等)，若向培养物中加入对氨基苯磺酸和α-萘胺，会形成红色的重氮染料对磺胺苯-偶氮-α-萘胺(二苯胺也可还原硝酸盐为亚硝酸盐，可用于区别假阴性和真阴性反7应)。实验结果为阴性，说明该真菌不能还原硝酸盐。

2.4结论该真菌不含有色氨酸酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、淀粉酶；分解葡萄糖产酸而不产生丙酮酸；不能还原硝酸盐。

3、分子生物学鉴定

将本发明菌株送成都罗宁生物科技有限公司完成分子测序，将测序结果与NCBI数据库进行Blast比对，选择比对结果中得分最高的菌种进行展示，并给出序列长度(Length)、得分(Score)、E值(E value)、一致度(Identity)和空位(Gaps)进行参考。同时使用RDP数据库(原核生物)或UNITE数据库(真菌)进行核对。结果所列出的是数据库中相似度最高的序列所属的类群信息，并给出了比对结果。鉴定结果如下：

558 bpTCCGTAGGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTTCAACTCCCTAACCCTTCTGTGAACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGCGGACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTCTGAATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTTGGGGAGGTCGGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCCCGTCCGCGGCGACCTCTGCGCAGTAATACAGCTCGCACCGGGACCCCGACGCGGCCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTTGACCTCGAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCA(SEQ ID NO.1)

结果显示本发明分离菌株与球孢白僵菌菌(Beauveria bassiana)聚成一支，两者亲缘关系最近。

结合生理生化特征和分子生物学鉴定结果，将本发明分离菌株鉴定为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)，并于2017年11月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC NO.14637。

实施例2采用本发明球孢白僵菌(Beauveria bassiana)制备僵蚕

1、实验材料

本发明白僵菌、市售白僵菌、僵蚕药材、健康家蚕

2、实验方法

将健康家蚕按2000条一组分成3组，每组3个平行，分别使用本白僵菌、市售白僵菌和僵蚕药材分别对健康家蚕进行接种实验，对比不同来源白僵菌对家蚕的致死率、致死时间和药材空心率。

具体操作步骤如下：

1)取菌株，用含0.2％吐温-80的无菌水配置成1×10⁷cfu/ml菌悬液；

2)将菌悬液喷洒于5龄起蚕，1小时后饲喂新采桑叶，控制蚕室温度25～30℃，湿度85％，每日统计家蚕死亡率，待家蚕死亡立即拣出；

3)充分僵化后，100℃处理30min使菌株灭活，再烘干至水分低于13％，即得，统计僵蚕空心率。

3、实验结果及分析

	致死率	致死时间	药材空心率
				本发明白僵菌	99.4％	6天	＜1％
市售白僵菌	76.6％	8天	13.4％
				僵蚕药材	48.7％	10天	37.6％

本发明菌株感染家蚕致死率高，家蚕僵死时间集中，所得僵蚕空心少，品质优。市售白僵菌和僵蚕药材致死率较低，家蚕多集中僵死在蚕茧中，且所得药材空心率较高。

综上，本发明球孢白僵菌，感染家蚕的僵化率高，可以有效生产僵蚕，所得僵蚕的品质优，应用前景良好。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都岷江源药业股份有限公司

<120> 一株新的球孢白僵菌及其应用

<130> GY101-2018P012688CC

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 558

<212> DNA

<213> Beauveria bassiana

<400> 1

tccgtagggt gaacctgcgg agggatcatt accgagtttt caactcccta acccttctgt 60

gaacctacct atcgttgctt cggcggactc gccccagccc ggacgcggac tggaccagcg 120

gcccgccggg gacctcaaac tcttgtattc cagcatcttc tgaatacgcc gcaaggcaaa 180

acaaatgaat caaaactttc aacaacggat ctcttggctc tggcatcgat gaagaacgca 240

gcgaaacgcg ataagtaatg tgaattgcag aatccagtga atcatcgaat ctttgaacgc 300

acattgcgcc cgccagcatt ctggcgggca tgcctgttcg agcgtcattt caaccctcga 360

cctccccttg gggaggtcgg cgttggggac cggcagcaca ccgccggccc tgaaatggag 420

tggcggcccg tccgcggcga cctctgcgca gtaatacagc tcgcaccggg accccgacgc 480

ggccacgccg taaaacaccc aacttctgaa cgttgacctc gaatcaggta ggactacccg 540

ctgaacttaa gcatatca 558

Claims

1.一种利用球孢白僵菌制备僵蚕的方法，其特征在于：所述球孢白僵菌是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号：CGMCC No.14637的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)；利用球孢白僵菌制备僵蚕的方法包括如下步骤：

1）取菌株，用含吐温-80的无菌水配置成菌悬液；所述无菌水中每1ml含2μl吐温-80；

2）将菌悬液喷洒于健康家蚕，1小时后饲喂桑叶，控制蚕室温度，湿度，待家蚕死亡立即拣出；所述蚕室温度为25~30℃，湿度不低于75%；所述健康家蚕为5龄起蚕；

3）充分僵化后，灭活菌株，再烘干，即得；所述灭活温度100℃，时间0.5h。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述菌悬液的浓度为1×10⁵ cfu/ml~1×10⁷ cfu/ml。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）所述菌悬液的浓度为1×10⁷cfu/ml。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）所述饲喂桑叶为新采桑叶。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）所述烘干至水分低于13%。