CN106417345B - 防治植物线虫的伴胞晶体蛋白组合物及其应用 - Google Patents

防治植物线虫的伴胞晶体蛋白组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种防治植物线虫的伴胞晶体蛋白组合物及其应用，其中伴胞晶体蛋白组合物包括苏云金芽孢杆菌伴胞晶体蛋白Cry1Ia和Cry1Ac，Cry1Ia的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示，Cry1Ac的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。本发明的防治植物线虫蛋白组合物具有低毒、生态环保，能延缓线虫抗药性的产生等优势，可应用于防治植物寄生线虫。

Description

防治植物线虫的伴胞晶体蛋白组合物及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种防治植物寄生线虫的伴胞晶体蛋白组合物及其应用。
背景技术
植物寄生线虫病是农作物的重要病害之一。全球每年由植物寄生线虫所造成的作物损失超过千亿美元(Chiwold，2003)，线虫病害已成为农业生产上的一个突出问题。目前，农业生产上常采用化学杀线虫剂来防治植物寄生线虫病害，但现今市场上杀线虫剂的品种有限，大部分为高毒、高残留农药，长期单一地使用高毒、高残留的化学杀线虫剂，不仅对环境造成了严重的污染，也引发了农产品中农药残留超标、线虫抗药性日益突出等系列环境和社会问题。近年来，随着人们对农产品安全的日益关注，化学农药的使用越来越受到限制，因此，研发有效的杀线虫微生物以补充或替代化学杀线虫剂就显得日益迫切。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是目前世界上应用最广泛、最成功的微生物杀虫剂，被广泛应用于农业、林业、贮藏以及卫生等领域的害虫防治。自从1961年Ciordia等首次发现Bt对牛肠道蛇形毛圆线虫(thichostrongylus colubriformis)卵和幼虫有杀灭作用以来，Bt的杀线虫作用才逐渐引起人们的关注。1985年Bone等首次证实了Bt伴胞晶体蛋白(δ-内毒素)对线虫的作用活性，2003年Wei等研究了不同基因产生的伴胞晶体蛋白对几种自由生活线虫的毒性，从两个主要的Bt晶体蛋白亚家族中表达出了7种不同的晶体毒素蛋白，通过测试这些晶体毒素蛋白对自由生活的线虫毒性，证实了其中4种晶体毒素蛋白(Cry5B、Cry6A、Cryl4A、Cry21A)对多种线虫种类均有活性，所测试的线虫至少对一种晶体毒素蛋白敏感，从而明确提出Bt晶体毒素蛋白具有杀线虫能力(Wei JZ,2003)。随着研究的深入，Bt及其伴胞晶体蛋白防治植物线虫病害的效果不断得到肯定。美国Mycogen公司筛选到多株对植物病原线虫具有作用活性的Bt菌株和伴胞晶体蛋白，并申请了多项专利。目前发现的具有杀线虫作用的Bt伴胞晶体蛋白主要有Cry 5、Cry 6、Cry12、Cry 13、Cry 14以及Cry 21等几大类。
本申请人所在研究团队长期从事植物线虫生防菌株的筛选与开发利用研究工作，筛选获得了高毒力杀线虫Bt菌株YC-10，其对南方根结线虫、大豆孢囊线虫和咖啡短体线虫等具有很好的毒杀作用(已获得国家发明专利，ZL 201110261675.8)。随后对该菌株进行了全基因组测序，序列登录号为CP011349，从基因组序列信息中获得伴胞晶体蛋白cry基因序列，并对该菌株的cry基因进行了克隆与原核表达，利用纯化的表达蛋白进行了室内活性测定，表明Cry1Ia蛋白对南方根结线虫J2、大豆孢囊线虫J2具有很好的杀线虫作用活性(已申请国家发明专利，申请号：201510367317.3)。
有研究表明使用两种或多种不同类型的杀虫晶体蛋白进行复配，可以提高杀虫活性，扩大杀虫谱，有效延缓或克服害虫抗药性的产生。1985年，Wu和Chang等发现Bt以色列亚种(B.thuringiensis subsp.israelensis)中26kD与65、130kD蛋白组合均有增效作用。1996年Lee等发现Cry1Aa与Cry1Ac组合，增强了对舞毒蛾的作用活性。Vadim等(2003)测定了蛋白P20、Cyt1Aa、Cry4Aa以及Cry11Aa之间不同组合对登革热蚊子毒性，结果表明蛋白P20和Cyt1Aa对Cry4Aa及Cry11Aa都存在协同增效作用。Xue等(2005)研究了杀虫蛋白Cry1Aa与Cry1c组合物对甜菜夜蛾的毒性，表明两者以1:1比例混合比单独的毒力有很大的提高。蔡吉林等(2013)报道了Cry1Ea和Cry9Aa蛋白以及Cry1Ai和Cry9Aa蛋白在1:1混配时，对小菜蛾(Plutella xylostella(Linnaeus))表现出了显著的增效作用。但还未见有关于Cry1Ia和Cry1Ac Bt蛋白组合物在植物线虫防治上的协同增效作用的相关研究报道。而发现新的杀线虫蛋白以及协同增效蛋白组合物在防治植物线虫病害上将具有重要意义，是保障农业可持续安全生产的重要手段。
湖南省植物保护研究所利用本单位分离获的Bt菌株中相关Bt伴胞晶体蛋白基因进行克隆表达获得的不同Bt伴胞晶体蛋白，在对单个Bt伴胞晶体蛋白进行了杀线虫活性测试的基础上，对Bt伴胞晶体蛋白进行组合混配，研究其蛋白间的协同增效作用，以期获得对线虫作用效果好的Bt蛋白组合物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种低毒、生态环保，能延缓线虫抗药性的产生等优势的防治植物线虫蛋白组合物，还提供了该杀线虫蛋白组合物在防治植物寄生线虫中的应用。
为解决上述技术问题，提供了一种防治植物线虫的伴胞晶体蛋白组合物，包括苏云金芽孢杆菌伴胞晶体蛋白Cry1Ia和Cry1Ac，所述Cry1Ia的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示，所述Cry1Ac的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。
上述的防治植物线虫的伴胞晶体蛋白组合物，优选的，所述Cry1Ia和Cry1Ac的质量比为1∶3～3∶1。进一步优选的，所述Cry1Ia和Cry1Ac的质量比为1∶1。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的防治线虫的伴胞晶体蛋白组合物在防治植物寄生线虫中的应用。
上述的应用，优选的，所述防治线虫的伴胞晶体蛋白组合物的浓度为20.0mg/L～40.0mg/L。
上述的应用，优选的，所述植物寄生线虫为根结属线虫。
上述的应用，优选的，所述植物寄生线虫为孢囊属线虫。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明针对目前Bt蛋白在线虫防治应用上的不足，利用已有的Bt Cry蛋白资源，将其进行不同组合，以期获得具有较好杀线虫作用效果的Cry蛋白组合物，为杀线虫制剂的开发利用打下基础。本发明提供一组来自Bt菌株的蛋白组合物Cry1Ia和Cry1Ac，该组合物对植物线虫具有显著的协同增效作用，组合物比单个蛋白作用活性更强，防治效果得到显著提高，可以达到高效防治植物线虫病害的目的。同时组合物低毒、生态环保，能延缓线虫抗药性的产生等优势，可做为新型的生物农药。
(2)本发明提供了该蛋白组合物中活性蛋白的有效组合比例，当Cry1Ia蛋白和Cry1Ac蛋白按照质量比为1∶1混合时，协同增效作用最显著，对南方根结线虫J2作用活性共毒系数达到了445。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为克隆表达Cry1Ia蛋白及纯化后的PAGE检测图(泳道M为蛋白Marker，泳道1-5分别为未经诱导的工程菌菌株抽提的蛋白，0.5M IPTG诱导抽提蛋白、转空载体的工程菌菌株抽提的蛋白、亲和层析纯化Cry1Ia蛋白、脱盐浓缩后的Cry1Ia蛋白)。
图2为克隆表达Cry1Ac蛋白及纯化后的PAGE检测图(泳道M为蛋白Marker，泳道1-5分别为未经诱导的工程菌菌株抽提的蛋白，0.5M IPTG诱导抽提蛋白、转空载体的工程菌菌株抽提的蛋白、亲和层析纯化Cry1Ac蛋白、脱盐浓缩后的Cry1Ac蛋白)。
图3为Cry1Ia与Cry1Ac蛋白组合物处理南方根结线虫J2室内生测图(a为对照，b为蛋白组合物处理)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1：
一种本发明的Cry1Ia蛋白，其序列为：
MKLKNQDKHQSFSSNAKVDKISTDSLKNETDIELQNINHEDCLKMSEYENVEPFVSASTIQTGIGIAGKILGTLGVPFAGQVASLYSFILGELWPKGKNQWEIFMEHVEEIINQKISTYARNKALTDLKGLGDALAVYHDSLESWVGNRNNTRARSVVKSQYIALELMFVQKLPSFAVSGEEVPLLPIYAQAANLHLLLLRDASIFGKEWGLSSSEISTFYNRQVERAGDYSDHCVKWYSTGLNNLRGTNAESWVRYNQFRRDMTLMVLDLVALFPSYDTQMYPIKTTAQLTREVYTDAIGTVHPHPSFTSTTWYNNNAPSFSAIEAAVVRNPHLLDFLEQVTIYSLLSRWSNTQYMNMWGGHKLEFRTIGGTLNISTQGSTNTSINPVTLPFTSRDVYRTESLAGLNLFLTQPVNGVPRVDFHWKFVTHPIASDNFYYPGYAGIGTQLQDSENELPPEATGQPNYESYSHRLSHIGLISASHVKALVYSWTHRSADRTNTIEPNSITQIPLVKAFNLSSGAAVVRGPGFTGGDILRRTNTGTFGDIRVNINPPFAQRYRVRIRYASTTDLQFHTSINGKAINQGNFSATMNRGEDLDYKTFRTVGFTTPFSFLDVQSTFTIGAWNFSSGNEVYIDRIEFVPVEVTYEAEYDFEKAQEKVTALFTSTNPRGLKTDVKDYHIDQVSNLVESLSDEFYLDEKRELFEIVKYAKQLHIERNM。
一种本发明的Cry1Ac蛋白，其序列为：
MDNNPNINECIPYNCLSNPEVEVLGGERIETGYTPIDISLSLTQFLLSEFVPGAGFVLGLVDIIWGIFGPSQWDAFLVQIEQLINQRIEEFARNQAISRLEGLSNLYQIYAESFREWEADPTNPALREEMRIQFNDMNSALTTAIPLLAVQNYQVPLLSVYVQAANLHLSVLRDVSVFGQRWGFDAATINSRYNDLTRLIGNYTDYAVRWYNTGLERVWGPDSRDWVRYNQFRRELTLTVLDIVALFPNYDSRRYPIRTVSQLTREIYTNPVLENFDGSFRGSAQGIERSIRSPHLMDILNSITIYTDAHRGYYYWSGHQIMASPVGFSGPEFTFPLYGTMGNAAPQQRIVAQLGQGVYRTLSSTFYRRPFNIGINNQQLSVLDGTEFAYGTSSNLPSAVYRKSGTVDSLDEIPPQNNNVPPRQGFSHRLSHVSMFRSGSSSSVSIIRAPMFSWIHRSAEFNNIIASDSITQIPAVKGNFLFNGSVISGPGFTGGDLVRLNSSGNNIQNRGYIEVPIHFPSTSTRYRVRVRYASVTPIHLNVNWGNSSIFSNTVPATATSLDNLQSSDFGYFESANAFTSSLGNIVGVRNFSGTAGVIIDRFEFIPVTATLEAEYNLERAQKAVNALFTSTNQLGLKTNVTDYHIDQVSNLVTYLSDEFCLDEKRELSEKVKHAKRLSDERNLLQDSNFKDINRQPERGWGGSTGITIQGGDDVFKENYVTLSGTFDECYPTYLYQKIDESKLKAFTRYQLRGYIEDSQDLEIYLIRYNAKHETVNVPGTGSLWPLSAQSPIGKCGEPNRCAPHLEWNPDLDCSCRDGEKCAHHSHHFSLDIDVGCTDLNEDLGVWVIFKIKTQDGHARLGNLEFLEEKPLVGEALARVKRAEKKWRDKREKLEWETNIVYKEAKESVDALFVNSQYDQLQADTNIAMIHAADKRVHSIREAYLPELSVIPGVNAAIFEELEGRIFTAFSLYDARNVIKNGDFNNGLSCWNVKGHVDVEEQNNQRSVLVVPEWEAEVSQEVRVCPGRGYILRVTAYKEGYGEGCVTIHEIENNTDELKFSNCVEEEIYPNNTVTCNDYTVNQEEYGGAYTSRNRGYNEAPSVPADYASVYEEKSYTDGRRENPCEFNRGYRDYTPLPVGYVTKELEYFPETDKVWIEIGETEGTFIVDSVELLLMEE。
本实施例1中cry1Ia和Cry1Ac基因来自于苏云金芽孢杆菌YC-10，苏云金芽孢杆菌YC-10菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期2010年1月21日，保藏名称为苏云金芽孢杆菌YC-10，保藏号为CCTCC NO：M 2010023(已获得国家发明专利，ZL 201110261675.8)。工程菌菌株cry1Ia-pET-BL21和cry1Ac-pET-BL21是申请人所在课题组所构建的能有效表达伴胞晶体蛋白Cry1Ia(81kDa)和Cry1Ac(133kDa)的重组菌株。为了得到纯化的Cry1Ia和Cry1Ac蛋白以及后续的生物测定和复配活性研究，申请人以工程菌菌株cry1Ia-pET-BL21和cry1Ac-pET-BL21为出发菌株，对两个菌株进行诱导表达目的蛋白，并通过蛋白纯化处理系统，利用亲和层析法对表达的蛋白进行纯化，利用PAGE电泳检测蛋白纯度，酶标仪测量蛋白浓度。
具体蛋白诱导纯化步骤如下：
(1)将甘油保存的工程菌菌株cry1Ia-pET-BL21和cry1Ac-pET-BL21利用LB固体培养基进行活化。挑取单胞利用LB液体培养基37℃，200rmp摇瓶培养8h作为放大培养种子。以2％(v/v)比例接种种子液到LB液体培养基中，37℃，200rmp培养12h，加入0.5M IPTG，20℃，200rmp诱导培养96h。
(2)离心收集菌体，加入0.01M PBS缓冲液(pH7.2)洗涤3次，菌体悬浮在50mLPBS缓冲液中。利用超声波破碎菌体，离心收集含有表达蛋白的上清液。
(3)将收集的上清液进行冷冻干燥浓缩，并利用蛋白纯化仪对浓缩液进行亲和层析(His层析柱)分离，获得纯化的表达蛋白Cry1Ia和Cry1Ac。
(4)将纯化的Cry1Ia和Cry1Ac蛋白分别利用蛋白纯化仪进行脱盐处理，并将蛋白溶解在0.05M Tirs-Hcl(pH9.0)中。
(5)将纯化的Cry1Ia和Cry1Ac蛋白分别进行PAGE电泳检测，观察蛋白纯度。同时利用酶标仪对纯化蛋白进行定量，-80℃分小管保存备用。
图1为克隆表达Cry1Ia蛋白及纯化后的PAGE检测图，泳道M为蛋白Marker，泳道1～5分别为未经诱导的工程菌菌株抽提的蛋白，0.5M IPTG诱导抽提蛋白、转空载体的工程菌菌株抽提的蛋白、亲和层析纯化Cry1Ia蛋白、脱盐浓缩后的Cry1Ia蛋白。图2为克隆表达Cry1Ac蛋白及纯化后的PAGE检测图，泳道M为蛋白Marker，泳道1～5分别为未经诱导的工程菌菌株抽提的蛋白，0.5M IPTG诱导抽提蛋白、转空载体的工程菌菌株抽提的蛋白、亲和层析纯化Cry1Ac蛋白、脱盐浓缩后的Cry1Ac蛋白。
实施例2：
一种防治植物线虫的伴胞晶体蛋白组合物，包括实施例1中的Cry1Ia和Cry1Ac，其质量比为1∶1。
本实施例的伴胞晶体蛋白组合物的制备方法为：
(1)将Cry1Ia蛋白溶液分别稀释成浓度分别为：5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L和80.0mg/L。
(2)将实施例1的Cry1Ac蛋白溶液分别稀释成浓度分别为：5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L和80.0mg/L。
(3)将同一浓度步骤(1)中的Cry1Ia蛋白溶液和步骤(2)中的Cry1Ac蛋白溶液，按照质量比为1∶1比例混合得到伴胞晶体蛋白混合物。
实施例3：
一种实施例2的伴胞晶体蛋白组合物在防治南方根结线虫J2中的应用，主要考察其对南方根结线虫J2室内活性的影响，具体的应用方法为：
(1)南方根结线虫J2的收集
南方根结线虫为实验室室内盆栽辣椒扩繁保存种群，当辣椒根系上有大量根结出现时，取出根系，用水轻轻冲洗，取下卵囊，于0.5％次氯酸钠中消毒3min、灭菌水冲洗3次，放入由200目钢丝网做成的孵化池，并置于培养皿中，加入灭菌水，25℃恒温培养，3d后每24h收集新孵化的南方根结线虫J2备用。
(2)对南方根结线虫J2的室内活性测定
将含有根结线虫J2的悬浮液用灭菌水进行稀释并计数，使1mL约含有线虫100条。
实验组：利用24孔生化培养板将线虫悬浮液分别与实施例2中的伴胞晶体蛋白组合物等体积混合，使蛋白混合物浓度分别为2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L和40.0mg/L。每个处理重复4次。
Cry1Ia蛋白组：利用24孔生化培养板将线虫悬浮液分别与实施例2的Cry1Ia蛋白溶液等体积混合，使Cry1Ia蛋白溶液浓度分别为2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L和40.0mg/L。每个处理重复4次。
Cry1Ac蛋白组：利用24孔生化培养板将线虫悬浮液分别与实施例2的Cry1Ac蛋白溶液等体积混合，使Cry1Ac蛋白溶液浓度分别为2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L和40.0mg/L。每个处理重复4次。
空白对照组：以0.01M Tris-Hcl(pH9.0)溶液作为对照。
将24孔板放置于25±2℃的培养箱中进行保湿培养，并分别于24h、48h、72h和96h分别利用显微镜进行观察，计数线虫死亡情况(以针触之线虫不动视为死亡)。其处理结果见表1。
表1：Cry1Ia、Cry1Ac蛋白及蛋白混合液对南方根结线虫J2室内毒力测定结果
从表1中可以看出Cry1Ia蛋白与Cry1Ac蛋白以1∶1混合，对南方根结线虫J2毒杀作用显著高于单一蛋白的作用效果，说明两种蛋白间存在明显的协同增效作用。
图3为Cry1Ia与Cry1Ac的伴胞晶体蛋白组合物处理南方根结线虫J2室内生测图(a为对照，b为蛋白组合物处理)，结果表明伴胞晶体蛋白组合物处理南方根结线虫J2，其24h死亡率达100％。
实施例4：
一种实施例2的伴胞晶体蛋白组合物在防治大豆孢囊线虫J2中的应用，主要考察其对大豆孢囊线虫J2室内活性的影响，具体的应用方法为：
(1)大豆孢囊线虫J2的收集：
大豆孢囊线虫为实验室室内大豆上扩繁保存种群，挑取孢囊于0.5％次氯酸钠中消毒3min、灭菌水冲洗3次，放入由200目钢丝网做成的孵化池，并置于培养皿中，加入灭菌水，25℃恒温培养，5d后每24h收集新孵化的大豆孢囊线虫J2备用。
(1)对大豆孢囊线虫J2幼虫的毒力测定
按照实施例3的方法，检测Cry1Ia、Cry1Ac和蛋白混合液对大豆孢囊线虫J2作用，结果见表2。
表2：Cry1Ia、Cry1Ac蛋白及蛋白混合液对大豆包囊线虫J2室内毒力结果
从表2可以看出，Cry1Ia蛋白与Cry1Ac蛋白以1∶1混合，对大豆孢囊线虫J2毒杀作用显著高于单一蛋白的作用效果，说明两种蛋白间在防治大豆孢囊线虫病上存在明显的协同增效作用。
实施例5：考察Cry1Ia蛋白与Cry1Ac蛋白不同比例混合协同增效作用
以南方根结线虫J2为供试靶标，将Cry1Ia与Cry1Ac蛋白分别以3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3不同比例混合，进行室内毒力测试，方法如前实施例3，48h观察结果，统计线虫死亡率，计算LC50以及不同配比共毒系数。试验结果如表3。
表3：Cry1Ia与Cry1Ac蛋白复配不同配比对南方根结线虫J2室内毒力测定结果
从表3中可以看出两种蛋白混合能有效提高其作用活性，由其以1∶1蛋白混合物杀线虫效果最好，其共毒系数达到445。
实施例6：
一种实施例2的Cry1Ia和Cry1Ac的伴胞晶体蛋白组合物在温室条件下防治作物根结线虫病的应用，具体的应用方法为：
1、供试作物为番茄，品种为湘粉一号(市场购买)。在塑料盆中装入灭菌土(灭菌土的成分为：粘土∶营养土＝2∶1)，播种番茄。番茄苗长出4～5片真叶时移栽于直径15cm小盆钵(盆钵中装灭菌土)，每盆一棵。待移栽苗成活后进行处理。
2、蛋白溶液的配制：
实验组：将Cry1Ia和Cry1Ac蛋白混合，(Cry1Ia蛋白溶液和Cry1Ac蛋白溶液1∶1)，并以0.05M Tris-Hcl溶解，稀释成浓度分别为：10.0mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L。
药剂对照组：1.8％阿维菌素乳油800倍稀释作为对照药剂。
空白对照组：灌水。
3、处理作物：
分别将实验组和药剂对照组的溶液配制成处理液，处理番茄。每组处理10株，每株番茄浇灌100mL处理液，空白对照组灌水100mL。接种根结线虫500条/株。每个处理3次重复，区组随机排列。将经过处理后的番茄置于25℃～27℃的温室中培养，定期浇水，60d后拔取植株进行病情调查，并根据根结数目进行病情分级，计算防效。
病情指数分级标准如下：
0级：无根结。
Ⅰ级：根结占全根系的1％～25％。
Ⅱ级：根结占全根系的26％～50％。
Ⅲ级：根结占全根系的51％～75％。
Ⅳ级：根结占全根系的76％～100％。
病情指数(％)＝Σ(各级植物数×级值)/(调查总株数×最高级值)×100。
防治效果(％)＝(空白对照病情指数－药剂处理后病情指数)/空白对照病情指数×100。
本实施例的试验结果如下表4所示。
表4：Cry1Ia·Cry1Ac蛋白混合液防治番茄根结线虫病温室盆栽试验结果
从表4中可知：利用本发明中复配的Cry1Ia·Cry1Ac蛋白混合液对番茄根结线虫病有明显的防治效果，每株100mL 40mg/L蛋白溶液处理，其防效达到了70.87％，表现出该蛋白组合物在植物寄生线虫生物防治上的巨大应用潜力。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 湖南省植物保护研究所
<120> 防治植物线虫的伴孢晶体蛋白组合物及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 719
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)
<400> 1
Met Lys Leu Lys Asn Gln Asp Lys His Gln Ser Phe Ser Ser Asn Ala
1 5 10 15
Lys Val Asp Lys Ile Ser Thr Asp Ser Leu Lys Asn Glu Thr Asp Ile
20 25 30
Glu Leu Gln Asn Ile Asn His Glu Asp Cys Leu Lys Met Ser Glu Tyr
35 40 45
Glu Asn Val Glu Pro Phe Val Ser Ala Ser Thr Ile Gln Thr Gly Ile
50 55 60
Gly Ile Ala Gly Lys Ile Leu Gly Thr Leu Gly Val Pro Phe Ala Gly
65 70 75 80
Gln Val Ala Ser Leu Tyr Ser Phe Ile Leu Gly Glu Leu Trp Pro Lys
85 90 95
Gly Lys Asn Gln Trp Glu Ile Phe Met Glu His Val Glu Glu Ile Ile
100 105 110
Asn Gln Lys Ile Ser Thr Tyr Ala Arg Asn Lys Ala Leu Thr Asp Leu
115 120 125
Lys Gly Leu Gly Asp Ala Leu Ala Val Tyr His Asp Ser Leu Glu Ser
130 135 140
Trp Val Gly Asn Arg Asn Asn Thr Arg Ala Arg Ser Val Val Lys Ser
145 150 155 160
Gln Tyr Ile Ala Leu Glu Leu Met Phe Val Gln Lys Leu Pro Ser Phe
165 170 175
Ala Val Ser Gly Glu Glu Val Pro Leu Leu Pro Ile Tyr Ala Gln Ala
180 185 190
Ala Asn Leu His Leu Leu Leu Leu Arg Asp Ala Ser Ile Phe Gly Lys
195 200 205
Glu Trp Gly Leu Ser Ser Ser Glu Ile Ser Thr Phe Tyr Asn Arg Gln
210 215 220
Val Glu Arg Ala Gly Asp Tyr Ser Asp His Cys Val Lys Trp Tyr Ser
225 230 235 240
Thr Gly Leu Asn Asn Leu Arg Gly Thr Asn Ala Glu Ser Trp Val Arg
245 250 255
Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Asp Met Thr Leu Met Val Leu Asp Leu Val
260 265 270
Ala Leu Phe Pro Ser Tyr Asp Thr Gln Met Tyr Pro Ile Lys Thr Thr
275 280 285
Ala Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Ala Ile Gly Thr Val His
290 295 300
Pro His Pro Ser Phe Thr Ser Thr Thr Trp Tyr Asn Asn Asn Ala Pro
305 310 315 320
Ser Phe Ser Ala Ile Glu Ala Ala Val Val Arg Asn Pro His Leu Leu
325 330 335
Asp Phe Leu Glu Gln Val Thr Ile Tyr Ser Leu Leu Ser Arg Trp Ser
340 345 350
Asn Thr Gln Tyr Met Asn Met Trp Gly Gly His Lys Leu Glu Phe Arg
355 360 365
Thr Ile Gly Gly Thr Leu Asn Ile Ser Thr Gln Gly Ser Thr Asn Thr
370 375 380
Ser Ile Asn Pro Val Thr Leu Pro Phe Thr Ser Arg Asp Val Tyr Arg
385 390 395 400
Thr Glu Ser Leu Ala Gly Leu Asn Leu Phe Leu Thr Gln Pro Val Asn
405 410 415
Gly Val Pro Arg Val Asp Phe His Trp Lys Phe Val Thr His Pro Ile
420 425 430
Ala Ser Asp Asn Phe Tyr Tyr Pro Gly Tyr Ala Gly Ile Gly Thr Gln
435 440 445
Leu Gln Asp Ser Glu Asn Glu Leu Pro Pro Glu Ala Thr Gly Gln Pro
450 455 460
Asn Tyr Glu Ser Tyr Ser His Arg Leu Ser His Ile Gly Leu Ile Ser
465 470 475 480
Ala Ser His Val Lys Ala Leu Val Tyr Ser Trp Thr His Arg Ser Ala
485 490 495
Asp Arg Thr Asn Thr Ile Glu Pro Asn Ser Ile Thr Gln Ile Pro Leu
500 505 510
Val Lys Ala Phe Asn Leu Ser Ser Gly Ala Ala Val Val Arg Gly Pro
515 520 525
Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Asn Thr Gly Thr Phe
530 535 540
Gly Asp Ile Arg Val Asn Ile Asn Pro Pro Phe Ala Gln Arg Tyr Arg
545 550 555 560
Val Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asp Leu Gln Phe His Thr Ser
565 570 575
Ile Asn Gly Lys Ala Ile Asn Gln Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met Asn
580 585 590
Arg Gly Glu Asp Leu Asp Tyr Lys Thr Phe Arg Thr Val Gly Phe Thr
595 600 605
Thr Pro Phe Ser Phe Leu Asp Val Gln Ser Thr Phe Thr Ile Gly Ala
610 615 620
Trp Asn Phe Ser Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe
625 630 635 640
Val Pro Val Glu Val Thr Tyr Glu Ala Glu Tyr Asp Phe Glu Lys Ala
645 650 655
Gln Glu Lys Val Thr Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn Pro Arg Gly Leu
660 665 670
Lys Thr Asp Val Lys Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val
675 680 685
Glu Ser Leu Ser Asp Glu Phe Tyr Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Phe
690 695 700
Glu Ile Val Lys Tyr Ala Lys Gln Leu His Ile Glu Arg Asn Met
705 710 715
<210> 2
<211> 1177
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)
<400> 2
Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu
1 5 10 15
Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly
20 25 30
Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser
35 40 45
Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile
50 55 60
Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile
65 70 75 80
Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala
85 90 95
Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu
100 105 110
Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu
115 120 125
Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala
130 135 140
Ile Pro Leu Leu Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val
145 150 155 160
Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser
165 170 175
Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg
180 185 190
Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp Tyr Ala Val
195 200 205
Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg
210 215 220
Asp Trp Val Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val
225 230 235 240
Leu Asp Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Arg Tyr Pro
245 250 255
Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val
260 265 270
Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu
275 280 285
Arg Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr
290 295 300
Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Tyr Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln
305 310 315 320
Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro
325 330 335
Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala
340 345 350
Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Phe Tyr Arg
355 360 365
Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val
385 390 395 400
Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln
405 410 415
Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His
420 425 430
Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Ser Ser Ser Ser Val Ser Ile Ile Arg
435 440 445
Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn Ile
450 455 460
Ile Ala Ser Asp Ser Ile Thr Gln Ile Pro Ala Val Lys Gly Asn Phe
465 470 475 480
Leu Phe Asn Gly Ser Val Ile Ser Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp
485 490 495
Leu Val Arg Leu Asn Ser Ser Gly Asn Asn Ile Gln Asn Arg Gly Tyr
500 505 510
Ile Glu Val Pro Ile His Phe Pro Ser Thr Ser Thr Arg Tyr Arg Val
515 520 525
Arg Val Arg Tyr Ala Ser Val Thr Pro Ile His Leu Asn Val Asn Trp
530 535 540
Gly Asn Ser Ser Ile Phe Ser Asn Thr Val Pro Ala Thr Ala Thr Ser
545 550 555 560
Leu Asp Asn Leu Gln Ser Ser Asp Phe Gly Tyr Phe Glu Ser Ala Asn
565 570 575
Ala Phe Thr Ser Ser Leu Gly Asn Ile Val Gly Val Arg Asn Phe Ser
580 585 590
Gly Thr Ala Gly Val Ile Ile Asp Arg Phe Glu Phe Ile Pro Val Thr
595 600 605
Ala Thr Leu Glu Ala Glu Tyr Asn Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val
610 615 620
Asn Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn Gln Leu Gly Leu Lys Thr Asn Val
625 630 635 640
Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Thr Tyr Leu Ser
645 650 655
Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys
660 665 670
His Ala Lys Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Ser Asn
675 680 685
Phe Lys Asp Ile Asn Arg Gln Pro Glu Arg Gly Trp Gly Gly Ser Thr
690 695 700
Gly Ile Thr Ile Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val
705 710 715 720
Thr Leu Ser Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln
725 730 735
Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Phe Thr Arg Tyr Gln Leu Arg
740 745 750
Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr
755 760 765
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770 775 780
Pro Leu Ser Ala Gln Ser Pro Ile Gly Lys Cys Gly Glu Pro Asn Arg
785 790 795 800
Cys Ala Pro His Leu Glu Trp Asn Pro Asp Leu Asp Cys Ser Cys Arg
805 810 815
Asp Gly Glu Lys Cys Ala His His Ser His His Phe Ser Leu Asp Ile
820 825 830
Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn Glu Asp Leu Gly Val Trp Val Ile
835 840 845
Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp Gly His Ala Arg Leu Gly Asn Leu Glu
850 855 860
Phe Leu Glu Glu Lys Pro Leu Val Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys
865 870 875 880
Arg Ala Glu Lys Lys Trp Arg Asp Lys Arg Glu Lys Leu Glu Trp Glu
885 890 895
Thr Asn Ile Val Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Ser Val Asp Ala Leu Phe
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965 970 975
Val Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp Asn Val
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Lys Gly His Val Asp Val Glu Glu Gln Asn Asn Gln Arg Ser Val Leu
995 1000 1005
Val Val Pro Glu Trp Glu Ala Glu Val Ser Gln Glu Val Arg Val Cys
1010 1015 1020
Pro Gly Arg Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys Glu Gly Tyr
1025 1030 1035 1040
Gly Glu Gly Cys Val Thr Ile His Glu Ile Glu Asn Asn Thr Asp Glu
1045 1050 1055
Leu Lys Phe Ser Asn Cys Val Glu Glu Glu Ile Tyr Pro Asn Asn Thr
1060 1065 1070
Val Thr Cys Asn Asp Tyr Thr Val Asn Gln Glu Glu Tyr Gly Gly Ala
1075 1080 1085
Tyr Thr Ser Arg Asn Arg Gly Tyr Asn Glu Ala Pro Ser Val Pro Ala
1090 1095 1100
Asp Tyr Ala Ser Val Tyr Glu Glu Lys Ser Tyr Thr Asp Gly Arg Arg
1105 1110 1115 1120
Glu Asn Pro Cys Glu Phe Asn Arg Gly Tyr Arg Asp Tyr Thr Pro Leu
1125 1130 1135
Pro Val Gly Tyr Val Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr Asp
1140 1145 1150
Lys Val Trp Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile Val Asp
1155 1160 1165
Ser Val Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu
1170 1175

Claims (6)

1.一种防治植物线虫的伴胞晶体蛋白组合物，其特征在于，包括苏云金芽孢杆菌伴胞晶体蛋白Cry1Ia和Cry1Ac，所述Cry1Ia的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示，所述Cry1Ac的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示；所述Cry1Ia和Cry1Ac的质量比为1∶3～3∶1。
2.根据权利要求1所述的伴胞晶体蛋白组合物，其特征在于，所述Cry1Ia和Cry1Ac的质量比为1∶1。
3.一种权利要求1至2中任一项所述的伴胞晶体蛋白组合物在防治植物寄生线虫中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述伴胞晶体蛋白组合物的浓度为20.0mg/L～40.0mg/L。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物寄生线虫为根结属线虫。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物寄生线虫为孢囊属线虫。
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