CN115537426A - 一种培育水稻两系不育系的育种方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物育种和生物技术领域，具体涉及培育水稻两系不育系的育种方法。本发明将基于单倍体诱导系的加倍单倍体技术与水稻两系不育系选育结合，简化杂交过程，实现规模化杂交制种。单倍体诱导系与水稻两系不育系杂交，诱导出双单倍体的比例较高，能达到4%以上，可省去单倍体加倍过程。利用本发明提供的方法可在1年内获得一个纯合稳定的两系不育系材料，相对于已有技术可大大缩短育种年限。

Description

一种培育水稻两系不育系的育种方法
技术领域
本发明属于植物育种和生物技术领域，具体涉及培育水稻两系不育系的育种方法。
背景技术
水稻是我国最主要的粮食作物，按类型可分为常规稻和杂交稻。其中，杂交稻包括三系杂交稻（不育系、保持系和恢复系）和两系杂交稻（两系不育系和恢复系）。传统培育一个优良稳定的水稻育种材料（包括常规稻，三系杂交稻的不育系、保持系和恢复系，以及两系杂交稻的两系不育系和恢复系），需要先将具有优良性状且优势互补的亲本材料进行杂交，然后将后代不断地自交使其遗传稳定，再从中选择优良自交系。由于品种审定时需要到达“特异性、一致性和稳定性”的缘故，这种基于遗传分离重组的传统育种方式，培育一个遗传稳定的品种并将其推广上市需要8-10年甚至更长的时间。
加倍单倍体技术能够快速培育遗传稳定的新材料。该技术主要是通过自然或人工方法先获得单倍体，再使其染色体组加倍获得双单倍体的方法。相比传统育种方法，加倍单倍体技术具有如下优势：1）、明显缩短育种年限，在一年内可获得纯系材料；2）、有利于遗传获得，避免育种材料同质化；3）、双单倍体无剩余杂合体，遗传完全纯合，不存在表型分离，便于品种审定登记；4）、田间工作量相对较少等。以上优势使得加倍单倍体技术在现代水稻育种中展现出巨大的应用前景。
目前，基于单倍体诱导系的加倍单倍体技术在植物中应用最广泛，以玉米作物最为成熟。该技术早在1959年便在玉米中进行育种应用，主要得益于高诱导率单倍体诱导系Stock6的培育。近年来，该技术的遗传基础先后被解析，主要由两个调控基因ZmMTL和ZmDMP控制，分别于2017年和2019年在玉米中被克隆。其中，ZmMTL基因是决定单倍体诱导系的诱导能力主要遗传调控因子，ZmDMP基因是对ZmMTL诱导能力具有增强作用。ZmMTL基因在谷物作物中高度保守，其在水稻中的同源基因为OsMTL，2018年研究报道，敲除水稻该基因的株系可作为诱导系诱导单倍体的产生，但ZmDMP在水稻中无高度同源基因。
虽然水稻Osmtl突变株系可作为单倍体诱导系，为水稻加倍单倍体技术奠定了基础。但是该技术在水稻新品种培育中应用仍然很困难，至今未有利用该技术培育水稻新品种的报道，这与加倍单倍体技术体系特征以及水稻和玉米作物的特性不同有关。基于单倍体诱导系的加倍单倍体育种技术可细分为以下技术环节：1）大量杂交，诱导产生单倍体；2）从杂交种或杂交种发芽成的植株中筛选单倍体；3）室内培养单倍体；4）化学试剂处理或自发染色体加倍；5）单倍体自交结实获得双单倍体种子。
从加倍单倍体具体的技术环节来看，水稻无法做到与玉米一样，实现加倍单倍体技术培育新品种，其主要原因是：一、培育新品种需要非常庞大的群体基础，进而从中选育优良株系，因此应用加倍单倍体技术时，必需大量杂交，诱导足够数量的单倍体供后期表型筛选。但单倍体诱导系与其它植株（需要培育的纯合育种材料）杂交时，获得杂交种的概率低（5~20%），且获得的杂交种中仅有5~10%种子为单倍体或双单倍体，这种情况背景下，需要更多量的杂交工作，以确保获得足够量的单倍体或者双单倍体供育种选择。但是，玉米为异交作物，在这方面具有优势，雌雄分离，雄蕊在玉米顶端，雌蕊在茎节处，应用加倍单倍体技术时，将顶端雄蕊花药提前剪切掉，再授单倍体诱导系花粉即可，杂交工作操作方便，杂交种纯度高；但是水稻为自交植株，雌雄均在同一个颖壳内，非常不利于杂交工作。无论是人工去雄，还是温汤去雄，不仅工作量非常大、耗时，无法保证一定数量的杂交数目，而且存在去雄不彻底风险。以上这些限制了加倍单倍体技术在水稻育种中应用。二、水稻筛选单倍体以及将单倍体加倍成可以育种应用的双单倍体目前技术体系还不成熟，同样限制了加倍单倍体技术在水稻育种中应用。由于玉米的种子比较大，胚和胚乳易于区分且能携带各种表型标记，在筛选单倍体技术环节，玉米加倍单倍体技术非常成熟，筛选出来的单倍体种子可直接在含有秋水仙素的培养基上萌发，加倍成双单倍体；但是水稻种子较小，胚比较小，还存在颖壳，筛选单倍体只能在种子萌发后，且暂时还未有成熟的筛选标记，此外，利用秋水仙素将单倍体幼苗加倍成双单倍体效率低。
因此，如何将加倍单倍体技术有效应用于水稻育种，至今仍是难题。目前，选育两系不育系主要采用的是传统育种方法，即在低温条件下，将两个两系不育系之间相互杂交，再不断自交6~8代，进而选育出新的两系不育系；或者利用优良的可育材料与两系不育系进行杂交，从后代中先选出具有两系不育系特性的材料，再不断自交，进而选育出遗传稳定的优异两系不育系。
因此，基于单倍诱导系的加倍单倍体技术虽然可以缩短育种年限，但是由于该技术特征以及水稻自交特性，水稻加倍单倍体技术无法像玉米加倍单倍体技术一样，在育种过程中发挥作用，其主要受限因素是水稻自花授粉导致无法进行大量杂交获得足够量的杂交种，以及水稻单倍体加倍技术体系不成熟，包括单倍体或双单倍体快速筛选和高效地对水稻单倍体进行加倍。此外，目前选育两系不育系技术方法主要依赖于传统育种方式，表现育种年限长，工作量大，效率低等问题。如何将加倍单倍体技术有效应用于水稻育种，至今仍是难题。
发明内容
考虑到加倍单倍体的技术体系特征，以及两系不育系在培育两系法杂交稻品种的重要性和两系不育系在低温下表现雄性可育，而高温下表现雄性不育的特点，加倍单倍体技术可能在培育水稻两系新材料方面具有前景性。在低温条件下，利用两系不育系低温可育特性，将不同两系不育系杂交相互杂交，创制杂合的两系不育系材料；在高温条件下，利用两系不育系高温不育特性，与单倍体诱导系大量杂交，这样大大简化了杂交工作，可获得足够量的杂交种，为诱导创制新的两系不育系稳定材料提供可能。本发明研究还发现，利用单倍体诱导系与两系不育系杂交时，获得双单倍体的比例较高，超过50%以上。双单倍体不需要加倍，直接可以用作选育品种材料。
本发明将加倍单倍体技术应用于培育两系不育系育种材料时，可以在1年内创制一个优良两系不育系育种材料，相对于传统的选育两系不育系的方法而言具有明显的优势。
因此，本发明的目的是结合加倍单倍体技术特征和水稻两系不育系特性，将基于单倍体诱导系的加倍单倍体技术有效应用于培育水稻两系不育系育种材料，快速培育水稻优良两系不育系育种材料（如图1所示本发明培育方法的技术流程图）。
本发明提供一种培育水稻两系不育系的育种方法，其包括如下步骤：
1) 水稻单倍体诱导系的选育：将纯合的突变OsMTL基因的突变水稻材料形成的单倍体诱导系与其它品种杂交，从其后代中分离获得不同遗传背景的单倍体诱导系，构建表型优良的单倍体诱导系种质资源材料；
2) 两系不育系间配组：将多个不同两系不育系两两之间杂交相互杂交，获得杂合的两系不育系材料；
3) 杂交诱导单倍体：选择抽穗期一致的杂合两系不育系材料和单倍体诱导系组合，将杂合的两系不育系材料与单倍体诱导系间隔种植，外围做好隔离工作；花期时进行赶粉，成熟时收获杂合的两系不育系材料结实的种子；
4) 鉴定单倍体或双单倍体，选育优良两系不育系：将杂合的两系不育系材料结实的种子萌发，从萌发的种子中快速筛选单倍体或双单倍体，其中双倍体可直接用于选育两系不育系材料。
优选地，第1）步中利用诱变技术、基因编辑技术在水稻品种中突变OsMTL基因。
更优选地，第1）步中将形态标记（例如苗期带有颜色的材料）、分子标记（例如突变MTL时选用长片段插入、缺失材料）整合到单倍体诱导系中，相应在第4)步中利用单倍体诱导系携带特异分子标记或形态标记，从萌发的种子中快速筛选单倍体或双单倍体。
具体地，第1）步中所述构建表型优良的单倍体诱导系种质资源材料的表型包括株高、抽穗期、花粉量、单倍体诱导能力，具体从中选择株高偏高（例如100~120 cm）、花粉量好、单倍体诱导率高（例如大于8%）、抽穗期不同的单倍体诱导系。
另外优选地，第2）步中低温条件进行多个不同两系不育系两两之间杂交相互杂交，具体在花期时温度低于23.5℃。更具体地，第2）步中多个不同两系不育系是选择优缺点互补的两系不育系间杂交。
进一步优选地，第3）步中是在在高温条件下将杂合的两系不育系材料与单倍体诱导系间隔种植，外围做好隔离工作；具体地是指花期时温度高于23.5℃。具体操作时，第3）步中是在花期时，利用竹竿或绳线进行赶粉，成熟时收获杂合的两系不育系材料结实的种子。
在一个具体实施方式中，第4）步中选用单倍体诱导率大于8%的单倍体诱导系，获得双单倍体的比例超过4%。
本发明的优点在于：将基于单倍体诱导系的加倍单倍体技术与水稻两系不育系选育结合，简化杂交过程，实现规模化杂交制种。单倍体诱导系与水稻两系不育系杂交，诱导出双单倍体的比例较高，能达到4%以上，可省去单倍体加倍过程。利用本发明提供的方法可在2年内获得一个纯合稳定的两系不育系材料，相对于已有技术可大大缩短育种年限。此外，通过在杂交稻背景或者杂交方式分离，选育高诱导率、抽穗期多样化以及整合分子标记、形态标记单倍体诱导系。
附图说明
图1、本发明培育方法的技术流程图。
图2、本发明选育单倍体诱导系技术流程图。
图3、本发明创制的携带特异分子标记单倍体诱导系。
图4、本发明验证特异性分子标记。
图5、本发明利用的紫色茎秆形态标记。
图6、本发明诱导的单倍体植株照片及流式细胞术验证。
图7、本发明单倍体诱导系和杂合两系不育系配组制种田间实图。
图8、本发明快速筛选单倍体/双单倍体及其比例。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步阐述本发明，但并不构成对本发明的限制。
实施例一：水稻单倍体诱导系的选育
构建不同单倍体诱导系时，参照图2选育水稻单倍体诱导系。
主要步骤如下（具体操作也可参照论文Wang J, Cao Y, Wang K, Liu C.Development of Multiple-Heading-Date mtl Haploid Inducer Lines in Rice.Agriculture. 2022; 12(6):806中记载的方法进行，这里有修改变动）：
1) SK-gRNA的构建
选择以下两个个位点作为CRISPR-Cas9基因编辑系统敲除MTL的位点(图3，下划线表示的PAM序列):
MTL基因敲除靶位点1：CGTTGCTGGCGATCGACGG
MTL基因敲除靶位点2：CAACGTCGAGACCGGCAGG。
设计两个互补DNA序列分别为：在正向序列前加GGCA，在反向互补序列前加AAAC。
SK-gRNA上有两个AarI酶切位点，用AarI酶切后，形成带有粘性末端的载体；将设计的靶序列正向及反向引物变性退火后，T4连接酶连入之前构建的中间载体SK-gRNA，形成单个目的gRNA。
2) 最终双元表达载体的构建
SK-gRNA MTL1和SK-gRNA MTL2分别用KpnI和BglII进行酶切并回收片段，连接到表达Cas9蛋白的双元载体pC1300-Cas9中（KpnI和BamHI位点间），最终分别获得敲除REC8、OSD1和PAIR1基因敲除载体pC1300-Cas9-gRNA MTL1和pC1300-Cas9-gRNA MTL2用于转基因制备水稻多突变体。
3) 遗传转化获得转基因植株
分别将表达载体pC1300-Cas9-gRNA MTL1和pC1300-Cas9-gRNA MTL2通过电击的方法转入农杆菌（AgroBacteriumtumefaciens）株系EHA105中，利用农杆菌介导法将此双元表达载体转入水稻甬优1540的愈伤中。转化的具体方法是将杂交稻甬优1540种子的胚灭菌后，接种到诱导愈伤组织的培养基中。培养1周后，挑选生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤组织，用作转化的受体。用含有pC1300-Cas9-gRNA MTL1和pC1300-Cas9-gRNA MTL2质粒的EHA105菌株分别侵染水稻愈伤组织，在黑暗处25℃培养3天后，在含有50 mg/l潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤组织和转基因植株。挑选在潮霉素选择培养基上正常生长的转基因植株。
4) 转基因基因型鉴定
利用分子生物学手段鉴定目的基因突变情况。CTAB法单株提取转基因植物基因组DNA，PCR扩增目的条带。所用引物对：
MTL1-F：CTCCATCCACAAACCCTCCT
MTL1-R：TTCCTGATCTTCCCCTGCAG
MTL2-F：CGCCAACAACCCGGTAACTA
MTL2-R：CCCCATGTCCGCTAGAAAGG。
得到的PCR产物送测序公司，分别用MTL1-R和MTL2-F作为测序引物测序。所得结果与野生型序列进行比对。筛选纯合突变类型株系，获得单倍体诱导系。
5）引入特异分子标记，建立携带特异分子标记单倍体诱导系
从上述单倍体诱导系材料中，有目标地筛选MTL基因长片段缺失或者插入材料，获得MTL基因具有长片段缺失或者插入突变株系。具体地，在MTL靶位点1处，获得43 bp缺失的单倍体诱导系；在MTL靶位点2处，分别获得26 bp插入，29 bp、22bp、34 bp和13 bp缺失的单倍体诱导系(图3)。然后，设计特异性分子标记InDel1和InDel2分别扩增MTL位点1和靶位点2，PCR产物片段大小为132 bp和100 bp。InDel1和InDel2序列如下：
InDel1-F：TGCAGCACGAGGGCGATG
InDel1-R：GAGGAAGGCGAGGATGGTG
InDel2-F：CAGGGACAACATGCGGGC
InDel2-R：GGGCACCTCGACGTACCT。
先检测分子标记InDel1和InDel2扩增单倍体诱导系和正常材料MTL基因未突变是否具有多态性。见图3，使用InDel1标记扩增MTL靶位点1处片段时，单倍体诱导系#1由于片段缺失出现比野生型（WT）小的条带；使用InDel1标记扩增MTL靶位点2处片段时，单倍体诱导系#2由于插入突变出现比野生型（WT）大的条带，其它单倍体诱导系#3、#4、#5和#6由于片段缺失出现比野生型小的不同条带。这些结果证明了在单倍体诱导系中成功引入了特异性分子标记。
由于单倍体诱导系（携带MTL长片段插入或缺失基因等位型）与其它杂合育种材料（MTL野生型）杂交诱导单倍体时，诱导形成的单倍体或者双单倍体，其基因组不含有来源单倍体诱导系基因组，使用分子标记InDel1和InDel2仅能扩增野生型条带，而不能育种使用的其它杂交种材料扩增时含有野生型和突变体两种等位型产物。电泳时，前者仅有一条野生型带型，而后者可见两条带型（图4）。
6）引入形态标记，建立携带特异形态标记单倍体诱导系
由于单倍体诱导系与其它杂合育种材料杂交诱导单倍体时，诱导形成的单倍体或者双单倍体含有来源单倍体诱导系基因组，而不能育种使用的其它杂交种材料含有单倍诱导系基因组。因此，将显性形态标记导入单倍体诱导系，可以用于区分单倍体或者双单倍体：含有形态标记为不能育种使用的杂种材料，不含形态标记的为单倍体或者双单倍体。为引入形态标记，将单倍体诱导系#1与显性紫色茎秆材料（图5）杂交，从杂交后代中分离紫色茎秆且MTL基因靶位点1为43 bp材料，进而将紫色茎秆形态标记引入单倍体诱导系。
7）建立不同遗传背景单倍体诱导系群体
由于单倍体诱导系#1-#6是在杂交稻甬优1540杂交品种中建立，因此采用单株收种单株传法，在杭州-海南两地连续自交5-6代，获得了遗传背景不同但稳定的单倍体诱导系群体。同时，将携带紫色茎秆形态标记的单倍体诱导系也不断自交4-5代，获得了遗传稳定且携带紫色茎秆形态标记的单倍体诱导系。此外，将单倍体诱导系#1或#5和与93-11、华占、菜园种等特异种质资源杂交，从杂交后代中先筛选43 bp和34 bp缺失的株系材料，再采用单株收种单株传法，连续自交4-5代，获得了遗传背景不同但稳定的单倍体诱导系群体。总计，获得了274个单倍体诱导系。
8）选育优良单倍体诱导系
由于实际操作时，并不需要274个庞大的单倍体诱导系，浪费土地、人力、物力等资源，且其中很多单倍体诱导率比较低，农艺性状也不利于田间操作，例如抽穗较长、种子携带较长的芒不便杂交等。因此，调查统计了诱导率、抽穗期、株高、花粉量情况，从中选择12个单倍体诱导率高，株高偏高，抽穗期不同进而同一时间播种不同时间均可提供诱导率花粉，花粉量优或良好的材料。将单倍体诱导系与其它材料杂交，可以成功诱导单倍体。相比二倍体，单倍体植株表现植株矮小、穗短、粒小等特点。流式细胞术进一步验证了单倍体可信性（图6）。
表1
编号 单倍体诱导率 株高 (cm) 抽穗期 (d) 花粉量
#1 15/137 98.5 85 优
#2 14/130 106.5 87 优
#3 16/129 105 90 优
#4 18/148 111 93 良
#5 11/125 108.5 96 优
#6 12/111 110 99 优
#7 17/134 115 101 优
#8 15/126 118 103 优
#9 12/141 102 105 优
#10 10/121 106.5 108 良
#11 19/150 113 110 优
#12 17/144 119 112 优
实施例二：两系不育系间配组
两系不育系间杂交配组参照《水稻两用核不育系C815S的选育与利用》论文中方法(唐文邦, 陈立云, 肖应辉, 等. 水稻两用核不育系C815S的选育与利用[J]. 湖南农业大学学报: 自然科学版, 2007 (S1): 26-31.)。本实施例中，选用培矮64S作为父本，以中智2S作为母本，在海南陵水低温条件下，杂交获得培矮64S*中智2S的F1代种子，备用。
实施例三：杂交诱导单倍体
少量F1代种子杭州播种，调查抽穗期，播种后93天抽穗，与单倍体诱导系编号#4花期相遇。参照图 1中方法，将培矮64S和中智2S杂交获得的F1代种子与单倍体诱导系编号#4间隔种植：单倍体诱导系种植1行，杂交种种植6行，外围做好隔离工作（图7）。抽穗时，人工赶粉，将单倍体诱导花粉授到杂合两系不育系植株上。种子成熟后，收获两系不育系上结实的种子，备用。
实施例四：鉴定单倍体或双单倍体而选育优良两系不育系
在实验室内，将杂合两系不育系植株上结实的种子萌发，取样快速提取DNA，采用分子标记鉴定。如图 8所示，双条带均为杂合体，单条带为单倍体或双倍体。总共检测了3568个单株，其中获得单倍体211个，双单倍体239个。将双单倍体种植田间，从中筛选表型优良的株系，可作为育种材料，进行杂交配组实验。相比论文《水稻两用核不育系C815S的选育与利用》选育C815S耗时5年，利用本发明提供的方法可在1年内获得一个纯合稳定的两系不育系材料。

Claims (10)

1.一种培育水稻两系不育系的育种方法，其特征在于，包括如下步骤：
1) 水稻单倍体诱导系的选育：将纯合的突变OsMTL基因的突变水稻材料形成的单倍体诱导系与其它品种杂交，从其后代中分离获得不同遗传背景的单倍体诱导系，构建表型优良的单倍体诱导系种质资源材料；
2) 两系不育系间配组：将多个不同两系不育系两两之间杂交相互杂交，获得杂合的两系不育系材料；
3) 杂交诱导单倍体：选择抽穗期一致的杂合两系不育系材料和单倍体诱导系组合，将杂合的两系不育系材料与单倍体诱导系间隔种植，外围做好隔离工作；花期时进行赶粉，成熟时收获杂合的两系不育系材料结实的种子；
4) 鉴定单倍体或双单倍体，选育优良两系不育系：将杂合的两系不育系材料结实的种子萌发，从萌发的种子中快速筛选单倍体或双单倍体，其中双倍体可直接用于选育两系不育系材料。
2.如权利要求1所述的培育水稻两系不育系的育种方法，其特征在于，第1）步中利用诱变技术、基因编辑技术在水稻品种中突变OsMTL基因。
3.如权利要求1所述的培育水稻两系不育系的育种方法，其特征在于，第1）步中将形态标记（例如苗期带有颜色的材料）、分子标记（例如突变MTL时选用长片段插入、缺失材料）整合到单倍体诱导系中。
4.如权利要求3所述的培育水稻两系不育系的育种方法，其特征在于，相应在第4)步中利用单倍体诱导系携带特异分子标记或形态标记，从萌发的种子中快速筛选单倍体或双单倍体。
5.如权利要求1所述的培育水稻两系不育系的育种方法，其特征在于，第1）步中所述构建表型优良的单倍体诱导系种质资源材料的表型包括株高、抽穗期、花粉量、单倍体诱导能力，具体从中选择株高偏高（例如100~120 cm）、花粉量好、单倍体诱导率高（例如大于8%）、抽穗期不同的单倍体诱导系。
6.如权利要求1所述的培育水稻两系不育系的育种方法，其特征在于，第2）步中低温条件进行多个不同两系不育系两两之间杂交相互杂交，具体在花期时温度低于23.5℃。
7.如权利要求1所述的培育水稻两系不育系的育种方法，其特征在于，第2）步中多个不同两系不育系是选择优缺点互补的两系不育系间杂交。
8.如权利要求1所述的培育水稻两系不育系的育种方法，其特征在于，第3）步中是在在高温条件下将杂合的两系不育系材料与单倍体诱导系间隔种植，外围做好隔离工作；具体地是指花期时温度高于23.5℃。
9.如权利要求1所述的培育水稻两系不育系的育种方法，其特征在于，第3）步中是在花期时，利用竹竿或绳线进行赶粉，成熟时收获杂合的两系不育系材料结实的种子。
10.如权利要求1所述的培育水稻两系不育系的育种方法，其特征在于，第4）步中选用单倍体诱导率大于8%的单倍体诱导系，获得双单倍体的比例超过4%。
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