CN115349444A - 一种利用多倍体水稻为变异载体选育二倍体水稻的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种利用多倍体水稻为变异载体选育二倍体水稻的方法及其应用，利用多倍体水稻对不同亚种或物种异源基因组共存造成的不稳定性具有高度兼容性的特点，克服远缘杂种不育；同时利用远缘杂种多倍体基因组内或异源基因组间广泛的重组，将其作为促进基因重组的载体，使染色体结构和组成发生改变，创造出丰富的变异；而后，经染色体减倍获得兼有不同亚种或物种遗传成分且不同遗传成分相互融合的系列回复二倍体水稻。这些回复二倍体水稻具有广泛的遗传基础和丰富的遗传多样性，较二倍体回交育种更好地解决了水稻育种亲本遗传基础狭窄的问题，对高产、优质、多抗、广适水稻新品种的选育具有重要意义，也为水稻育种提供了一种新思路和新途径。
Description
技术领域
本发明属于现代农业的水稻育种技术领域，尤其涉及一种利用多倍体水稻为变异载体选育二倍体水稻的方法及其应用。
背景技术
水稻是世界三大粮食作物之一，为全世界半数以上人口提供稳定的食物来源。据估计世界人口在2050年将达到90亿，届时要满足全球人口的食物和营养需求，水稻产量至少要提高60％。但水稻产量在经历高秆变矮秆、常规稻变杂交稻两次巨大飞跃后，长期未能取得重大突破，主要原因之一在于育种亲本的遗传基础狭窄(孙传清等2000)。稻属(Oryza)内物种丰富，有亚洲栽培稻(O.sativa)和非洲栽培稻(O.glaberrima)两个栽培种，亚洲栽培稻又有籼稻(O.sativa ssp.indica)和粳稻(O.sativa ssp.japonica)两个遗传基础差异很大的亚种；除此之外，稻属还包括20多个野生稻种(Ge et al.1999)。野生稻长期生存于各种恶劣自然环境条件下，在生存竞争和自然选择过程中，形成了极其丰富的遗传多样性，保存了栽培稻不具有或已消失的许多优良基因，如抗病、抗虫、抗逆、细胞质雄性不育、高生物量、高蛋白含量等(何光存1998；邓化冰2006)。稻属内丰富的物种资源为水稻遗传改良提供了材料基础，是解决水稻育种亲本遗传基础狭窄问题的基因宝库。但目前对这些物种资源的利用都局限于二倍体水平，即二倍体水平上栽培稻籼粳亚种间或栽培稻与野生稻种间杂交获得杂种后，杂种再与籼稻或粳稻亲本(籼粳杂交时)或栽培稻亲本(栽野杂交时)经过连续多代回交和选择，最终选育出能够稳定遗传且具有目标性状的水稻新品种。其缺点和局限性在于：1)二倍体亚种间或种间杂种育性低甚至不育，产生可育配子的几率低，从而造成回交效率低；2)通过回交育种往往只能获得个别性状得到改良的新品种。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用多倍体水稻为变异载体选育二倍体水稻的方法及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明充分利用多倍体水稻对不同亚种或物种异源基因组的共存造成的不稳定性具有高度兼容的能力，通过多倍体化提高籼粳亚种间杂种或栽培稻与野生稻种间杂种的育性，从而产生更多的可育配子；同时，充分利用籼粳亚种间杂种多倍体或栽培稻与野生稻种间杂种多倍体基因组内或异源基因组间广泛的重组，将其作为促进不同亚种或物种间染色体交换、易位、基因转换、转座等重组过程的载体，使染色体的结构和组成发生改变，从而创造出丰富的变异；而后，经染色体减倍获得兼有不同亚种或物种遗传成分且不同遗传成分相互融合的回复二倍体水稻。这些回复二倍体水稻经历了不同亚种或物种间染色体的重组，具有更加广泛的遗传基础和更加丰富的遗传多样性，更好地解决了水稻育种亲本遗传基础狭窄的问题，对高产、优质、多抗、广适水稻新品种的选育具有重要意义，也为水稻育种提供了一种新的思路和途径。
本发明是这样实现的，一种利用多倍体水稻为变异载体选育二倍体水稻的方法，包括以下步骤：
a.亲本选择
包括栽培稻籼粳亚种间杂交亲本的选择，或栽培稻与野生稻种间杂交亲本的选择；
b.亲本杂交
栽培稻籼稻亚种与粳稻亚种间进行亚远缘杂交；栽培稻与野生稻间进行远缘杂交；
c.杂种鉴定
将步骤b中获得的杂交种子或杂种试管苗种植后，通过形态和/或育性、和/或基因组原位杂交方法鉴定杂种的真实性；
d.杂种染色体加倍形成多倍体
将经过鉴定的籼粳亚种间杂种或栽培稻与野生稻种间杂种通过活体或离体染色体加倍获得杂种多倍体；
e.杂种多倍体的鉴定
通过形态和/或育性、和/或流式细胞分析、和/或根尖染色体数目鉴定加倍后植株的倍性，确保获得杂种多倍体；
f.杂种多倍体通过染色体减倍获得回复二倍体
通过未受精子房培养或花药培养实现染色体减倍，获得回复二倍体；
g.回复二倍体自交成稳定品系
回复二倍体植株自交多代(一般7-8代)至稳定遗传，每代都对植株的综合性状进行选择，并通过基因芯片或分子标记对优良基因进行鉴定，最终选育获得具有至少一种优良基因且综合性状优良的系列回复二倍体水稻新品系。
进一步地，步骤a中，栽培稻籼粳亚种间杂交亲本包括亚洲栽培稻(Oryza sativa)中的籼稻亚种(O.sativa ssp.indica)和粳稻亚种(O.sativa ssp.japonica)；
栽培稻与野生稻种间杂交亲本包括：亚洲栽培稻(O.sativa)，野生稻包括普通野生稻(O.rufipogon)、尼瓦拉野生稻(O.nivara)、巴蒂野生稻(O.barthii)、长雄蕊野生稻(O.longistaminata)、展颖野生稻(O.glumaepatula)、南方野生稻(O.meridionalis)、斑点野生稻(O.punctata)、药用野生稻(O.officinalis)、根茎野生稻(O.rhizamatis)、澳洲野生稻(O.australiensis)和短药野生稻(O.brachyantha)中的任一种野生稻。
进一步地，步骤b中，栽培稻籼稻亚种与粳稻亚种间的杂交通过常规有性杂交方法完成；栽培稻与野生稻间的杂交通过激素处理与重复授粉、及胚挽救方法完成。
进一步地，步骤c中，杂种的育性降低或不育。
进一步地，步骤e中，形态上，杂种多倍体与二倍体相比，植株变矮，茎秆变粗，叶片变厚，叶色变深，穗子变长，籽粒增大，芒性状由无芒变为有芒或芒变长；育性上，杂种多倍体与二倍体相比，育性提高。
进一步地，步骤g中，植株的综合性状包括株叶型、生育期、穗数、总粒数、结实率、千粒重。
进一步地，步骤g中，优良基因包括抗病、抗虫、抗逆、优质基因中的至少一种。
进一步地，步骤g中，优良基因包括产量基因Gn1a和/或OsSPL16、高蛋白含量基因OsAAP6、耐寒基因qLTG3-1、抗黄色斑驳病基因Rymv1、高支链淀粉含量基因Waxy、褐飞虱抗性基因Bph18和/或Bph26、稻瘟病抗性基因Pia和/或Pi2和/或Pi3和/或Pi5和/或Pi63、白叶枯抗性基因Xa21、耐盐基因SKC1、抗条叶枯病毒基因STV11中的至少一种。
本发明还提供了如上述的一种利用多倍体水稻为变异载体选育二倍体水稻的方法在二倍体水稻选育中的应用。
本发明中，首先充分利用多倍体水稻对不同亚种或物种异源基因组的共存造成的不稳定性具有高度兼容的能力，通过多倍体化提高籼粳亚种间杂种或栽培稻与野生稻种间杂种的育性，从而产生更多的可育配子，为未受精子房培养或花药培养创造了条件。同时，充分利用籼粳亚种间杂种多倍体或栽培稻与野生稻种间杂种多倍体基因组内或异源基因组间广泛的重组，将其作为促进不同亚种或物种间染色体交换、易位、基因转换、转座等重组过程的载体，使染色体的结构和组成发生改变，从而创造出丰富的变异。而后，充分利用杂种多倍体产生的具有丰富变异的雌、雄配子，通过未受精子房培养或花药培养获得兼有不同亚种或物种遗传成分且不同遗传成分相互融合的系列回复二倍体水稻，这些回复二倍体水稻经历了不同亚种或物种染色体间的重组，具有更加广泛的遗传基础和更加丰富的遗传多样性。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明克服了目前二倍体水平通过回交育种对野生稻物种资源利用的缺点和局限性，即通过多倍体化明显提高了籼粳亚种间杂种或栽培稻与野生稻种间杂种的育性，产生更多的具有丰富变异的可育配子，进而通过未受精子房培养或花药培养选育出多个性状同时得到改良的系列水稻新品种，充分创造和利用了远缘杂交产生的变异，更好地解决了水稻育种亲本遗传基础狭窄的问题，对高产、优质、多抗、广适水稻新品种的选育具有重要意义，为水稻育种提供了一种新的思路和途径。
附图说明
图1是利用多倍体水稻为变异载体选育二倍体水稻的流程图；
图2是籼粳亚种间杂种二倍体和四倍体的细胞核DNA含量检测图；
图3是籼粳亚种间杂种二倍体和四倍体的根尖染色体图(左图：杂种二倍体，2n＝2x＝24；右图：杂种四倍体，2n＝4x＝48)；
图4是籼粳亚种间杂种稳定回复二倍体品系的功能基因鉴定结果；
图5是籼粳亚种间杂种稳定回复二倍体品系的抗性基因鉴定结果；
图6是栽培稻与长雄蕊野生稻种间杂种植株(左：杂种二倍体；右：杂种四倍体)；
图7是栽培稻与长雄蕊野生稻种间杂种稻穗和籽粒；
图8是栽培稻与长雄蕊野生稻种间杂种稳定回复二倍体品系的功能基因和抗性基因鉴定结果；
图9是回交遗传效应示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明披露了一种利用多倍体水稻为变异载体选育二倍体水稻的方法及其应用，包括以下步骤：
a.亲本选择
分为栽培稻籼稻与粳稻亚种间杂交及栽培稻与野生稻种间杂交两种情况：
栽培稻籼粳亚种间杂交亲本：亚洲栽培稻(Oryza sativa)中的籼稻亚种(O.sativa ssp.indica)和粳稻亚种(O.sativa ssp.japonica)。
栽培稻与野生稻种间杂交亲本：亚洲栽培稻(O.sativa)，野生稻包括普通野生稻(O.rufipogon)、尼瓦拉野生稻(O.nivara)、巴蒂野生稻(O.barthii)、长雄蕊野生稻(O.longistaminata)、展颖野生稻(O.glumaepatula)、南方野生稻(O.meridionalis)、斑点野生稻(O.punctata)、药用野生稻(O.officinalis)、根茎野生稻(O.rhizamatis)、澳洲野生稻(O.australiensis)、短药野生稻(O.brachyantha)；
b.栽培稻籼粳亚种间或栽培稻与野生稻种间杂交
栽培稻籼稻亚种与粳稻亚种间的杂交属于亚远缘杂交，通过常规有性杂交方法完成。
栽培稻与野生稻间的杂交属于远缘杂交，需要克服不同物种间的生殖隔离作用，杂交难度大。具体操作过程如下：
(1)激素处理与重复授粉：第1天下午通过剪颖法去除栽培稻的花药，去雄后向柱头喷洒混合激素溶液(2,4-D 20-50mg/L+GA3 50-100mg/L)，套袋隔离。第2天父本开花时，剪取父本野生稻稻穗置于去雄后的母本栽培稻稻穗上方，轻轻抖动使花粉散落到母本柱头上。第3天、第4天再各重复授粉1次，授粉前一天下午同样需要各喷洒混合激素1次；
(2)胚挽救：授粉后7-10天，将膨大子房(内含杂种幼胚)经消毒处理后接种至幼胚培养基，通过胚挽救培养获得种间杂种试管苗；
c.杂种鉴定
将上步获得的籼粳亚种间杂交种子或栽培稻与野生稻种间杂种试管苗种植后，通过形态、育性、基因组原位杂交(genome in situ hybridization，GISH)鉴定杂种的真实性。
杂种植株在形态上往往介于两亲本之间。由于生殖隔离作用，杂种的育性会明显降低甚至不育，这是非常明显的变化，基本可以判断杂种的真实性。对于栽培稻与野生稻的种间杂种还可以通过基因组原位杂交鉴定杂种的真实性。
d.杂种染色体加倍形成多倍体
将经过鉴定的籼粳亚种间杂种或栽培稻与野生稻种间杂种通过活体或离体染色体加倍获得杂种多倍体。
活体加倍：在20-25℃条件下，用0.1％-0.2％的秋水仙素溶液浸泡分蘖盛期的秧苗24-48h；
离体加倍：取杂种植株二次枝梗原基分化期至雌雄蕊形成期的幼穗，经消毒处理后接种至愈伤组织诱导培养基中，诱导产生愈伤组织，将分裂旺盛的愈伤组织转移至含有0.025％-0.05％秋水仙素的液体加倍培养基中，25℃振荡培养24-48h，经7d恢复培养后转移至分化培养基中分化出苗；
e.杂种多倍体的鉴定
通过形态、育性、流式细胞分析和根尖染色体数目鉴定加倍后植株的倍性，确保获得杂种多倍体。
(1)形态上，杂种多倍体与二倍体相比往往植株变矮，茎秆变粗，叶片变厚，叶色更深，穗子变长，籽粒明显增大，芒性状往往由无芒变为有芒或芒变得更长。
(2)育性上，由于细胞中原本单条存在的不同亚种或物种染色体通过染色体加倍而成对存在，明显改善杂种的减数分裂过程，因此育性会明显提高。
(3)利用倍性检测仪或流式细胞仪检测细胞核DNA含量，杂种多倍体的细胞核DNA含量比杂种二倍体增加一倍。
(4)通过根尖染色体制片观察染色体数目，杂种二倍体的染色体数目为2n＝2x＝24，杂种多倍体的染色体数目为2n＝4x＝48。
f.杂种多倍体通过染色体减倍获得回复二倍体
充分利用杂种多倍体减数分裂时不同亚种或物种染色体间的广泛重组，形成具有丰富变异的雌、雄配子的特点，通过未受精子房培养或花药培养实现染色体减倍，获得回复二倍体。
未受精子房培养：杂种多倍体植株孕穗期，取胚囊发育处于单核期至成熟期的颖花，经消毒处理后，用尖镊子去除外颖、内颖，将保留小穗轴、护颖、雄蕊和雌蕊于一体的颖花接种至液体愈伤组织诱导培养基的液面上进行漂浮培养，静置防止颖花下沉，于25-26℃、黑暗条件下培养至愈伤组织出现，再通过愈伤组织分化获得回复二倍体植株。
花药培养：杂种多倍体植株孕穗期，选取花粉发育处于单核靠边期的幼穗，置于8-10℃条件下低温预处理7-10d，经消毒处理后，挑出颖花中的花药接种至愈伤组织诱导培养基中，置于26-28℃、黑暗条件下培养至愈伤组织形成，再通过愈伤组织分化获得回复二倍体植株。
g.回复二倍体自交成稳定品系
回复二倍体植株自交7-8代至稳定遗传，每代都对植株的株叶型、生育期、产量相关性状进行选择，并通过基因芯片或分子标记对抗病、抗虫、抗逆、优质等优良基因进行鉴定，最终选育获得具有抗病、抗虫、抗逆、优质中的一种或几种特性且综合性状优良的系列回复二倍体水稻新品系。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
a.亲本选择
选择综合性状优良的籼稻品种9311和粳稻品种南粳46为亲本；
b.栽培稻籼粳亚种间杂交
以籼稻品种9311为父本，粳稻品种南粳46为母本进行杂交。第1天下午16：00后，选择合适的母本稻穗，剪颖法去雄，套杂交袋隔离，防止串粉。第2天上午父本开花时，剪取其稻穗，打开杂交袋上口，将父本稻穗在母本稻穗上方轻轻抖动，使花粉散落到母本柱头上，授粉后重新封闭杂交袋。20-25d后收取杂交种子，晒干或烘干后放入-20℃冰箱保存。
c.杂种鉴定
种植杂交种子至长成植株，通过形态、育性表现鉴定杂种的真实性。杂种植株在形态上介于两亲本之间，同时杂种育性降低，结实率仅为12.81％，说明杂种的真实性。
d.杂种染色体加倍形成多倍体
杂种植株孕穗期，取二次枝梗原基分化期至雌雄蕊形成期的幼穗，用75％酒精处理30s、0.1％升汞处理10min，无菌水清洗4次，切碎后接种至愈伤组织诱导培养基中，诱导产生愈伤组织；将分裂旺盛的愈伤组织转移至含有0.05％秋水仙素的液体加倍培养基中，25℃振荡培养48h，经7d恢复培养后转移至分化培养基中分化出苗，生根培养后移栽至温室或大田；
e.杂种多倍体的鉴定
通过形态、育性、流式细胞分析和根尖染色体数目鉴定加倍后植株的倍性，鉴定结果如下：
(1)杂种多倍体与杂种二倍体相比，植株变矮，茎秆变粗，穗子变长，籽粒明显增大，由短芒变为长芒；
(2)杂种多倍体育性明显提高，结实率由二倍体的12.81％提高到63.60％。
(3)利用倍性检测仪检测细胞核DNA含量，杂种多倍体的细胞核DNA含量是杂种二倍体的2倍(如图2)；
(4)杂种二倍体的根尖染色体数目为2n＝2x＝24，杂种多倍体的根尖染色体数目为2n＝4x＝48(如图3)；
以上鉴定结果都表明了杂种多倍体的真实性。
f.杂种多倍体通过染色体减倍获得回复二倍体
杂种多倍体植株孕穗期，选取花粉发育处于单核靠边期的幼穗，置于8℃条件下低温预处理7d，用75％酒精处理30s、0.1％升汞处理10min，无菌水清洗4次，挑出颖花中的花药接种至愈伤组织诱导培养基中，置于26℃、黑暗条件下培养至愈伤组织形成，再通过愈伤组织分化培养、生根培养后获得回复二倍体植株，移栽至温室或大田。
g.回复二倍体自交成稳定品系
考察所有回复二倍体植株的株叶型、生育期、穗数、总粒数、结实率、千粒重等性状，并委托第三方生物技术公司通过基因芯片鉴定优良基因，或者也可以采用本领域中的现有技术对基因进行检测(基因检测方法已经属于当下发展比较成熟的技术，在这里不再赘述)。综合各种性状表现和携带优良基因情况进行选择，收取保留植株的种子继续繁殖，每代同样对综合性状和优良基因进行鉴定和选择，自交7代后获得综合性状好且携带多个优良基因的系列回复二倍体水稻新品系共17个，分别为ST215、ST219、ST220、ST221、ST222、ST223、ST227、ST231、ST243、ST246、ST247、ST250、ST252、ST253、ST255、ST256、ST258。优良基因(分为功能基因和抗性基因两种类型)鉴定结果表明，每个回复二倍体品系都携带多个优良基因，如产量基因Gn1a、高蛋白含量基因OsAAP6、耐寒基因qLTG3-1、抗黄色斑驳病基因Rymv1、高支链淀粉含量基因Waxy、褐飞虱抗性基因Bph18、稻瘟病抗性基因Pia/Pi2/Pi3、白叶枯抗性基因Xa21等等(如图4和图5)。
实施例2
a.亲本选择
选择亚洲栽培稻(O.sativa)品种02428为母本，长雄蕊野生稻(O.longistaminata)为父本；
b.栽培稻与长雄蕊野生稻种间杂交
栽培稻与长雄蕊野生稻是稻属的不同物种，需要克服不同物种间的生殖隔离作用，具体操作过程：
(1)激素处理与重复授粉：第1天下午16：00后，选择合适的母本稻穗，剪颖法去雄，去雄后向柱头喷洒混合激素溶液(2,4-D 30mg/L+GA3 80mg/L)，套袋隔离。第2天父本开花时，剪取其稻穗置于去雄后的母本稻穗上方，轻轻抖动使花粉散落到母本柱头上，授粉后重新封闭杂交袋；第3天、第4天再各重复授粉1次，授粉前一天下午同样需要各喷洒混合激素1次；
(2)胚挽救：第3次授粉后7天，将膨大子房(内含杂种幼胚)用75％酒精处理1min、0.1％升汞处理15min，无菌水清洗4次，接种至幼胚培养基，通过胚挽救培养获得种间杂种试管苗；
c.杂种鉴定
移栽种间杂种试管苗至长成植株，通过形态、育性和基因组原位杂交鉴定杂种的真实性，鉴定结果如下：
(1)杂种植株在形态上介于两亲本之间，而且表现为不育，结实率为0，说明了杂种的真实性。
(2)取杂种植株的根尖进行染色体制片；提取父本长雄蕊野生稻和母本02428的叶片基因组DNA；用缺口平移法标记长雄蕊野生稻基因组DNA作为杂交探针，用02428基因组DNA封阻，与事先做好的杂种根尖染色体进行原位杂交；杂交后于荧光显微镜下观察，发现每个细胞共24条染色体，其中12条染色体上有杂交信号，另外12条染色体上没有杂交信号；有杂交信号的染色体来自父本长雄蕊野生稻，而没有杂交信号的染色体来自母本02428，清晰显示了杂种的真实性。
d.杂种染色体加倍形成多倍体
杂种植株孕穗期，取二次枝梗原基分化期至雌雄蕊形成期的幼穗，用75％酒精处理30s、0.1％升汞处理10min，无菌水清洗4次，切碎后接种至愈伤组织诱导培养基中，诱导产生愈伤组织；将分裂旺盛的愈伤组织转移至含有0.05％秋水仙素的液体加倍培养基中，25℃振荡培养48h，经7d恢复培养后转移至分化培养基中分化出苗，生根培养后移栽至温室或大田；
e.杂种多倍体的鉴定
通过形态、育性、流式细胞分析和根尖染色体数目鉴定加倍后植株的倍性，鉴定结果如下：
(1)杂种多倍体与杂种二倍体相比，植株变矮，茎秆变粗，穗子变长，籽粒明显增大，芒变得更长(如图6和图7)。
(2)杂种多倍体可育，结实率由杂种二倍体的0提高到18.30％。
(3)利用倍性检测仪检测细胞核DNA含量，杂种多倍体的细胞核DNA含量是杂种二倍体的2倍。
(4)杂种二倍体的根尖染色体数目为2n＝2x＝24，杂种多倍体的根尖染色体数目为2n＝4x＝48。
以上鉴定结果都表明了杂种多倍体的真实性。
f.杂种多倍体通过染色体减倍获得回复二倍体
杂种多倍体植株孕穗期，选取花粉发育处于单核靠边期的幼穗，置于8℃条件下低温预处理7d，用75％酒精处理30s、0.1％升汞处理10min，无菌水清洗4次，挑出颖花中的花药接种至愈伤组织诱导培养基中，置于26℃、黑暗条件下培养至愈伤组织形成，再通过愈伤组织分化培养、生根培养后获得回复二倍体植株，移栽至温室或大田。
g.回复二倍体自交成稳定品系
考察所有回复二倍体植株的株叶型、生育期、穗数、总粒数、结实率、千粒重等性状，并通过基因芯片鉴定优良基因。综合各种性状表现和携带优良基因情况进行选择，收取保留植株的种子继续繁殖，每代同样对综合性状和优良基因进行鉴定和选择，自交7代后获得综合性状好且携带多个优良基因的系列回复二倍体水稻新品系共18个，分别为AL2014、AL2015、AL2019、AL2058、AL2061、AL2064、AL2141、AL2148、AL2154、AL2159、AL2169、AL2171、AL2173、AL2175、AL2225、AL2226、AL2227、AL2228。优良基因(分为功能基因和抗性基因两种类型)鉴定结果表明，每个回复二倍体品系都携带多个优良基因，如产量基因Gn1a/OsSPL16、耐盐基因SKC1、高蛋白含量基因OsAAP6、抗黄色斑驳病基因Rymv1、抗条叶枯病毒基因STV11、高支链淀粉含量基因Waxy、褐飞虱抗性基因Bph26、稻瘟病抗性基因Pia/Pi2/Pi3/Pi5/Pi63、白叶枯抗性基因Xa21等等(如图8)。
现有技术中，远缘杂种产生可育配子的几率很低(特别是对亲本亲缘关系较远的远缘杂种来说)，造成回交途径效率很低。如：1)钟代彬等在栽培稻与药用野生稻的远缘杂交及回交研究中，回交结实率仅为0.13％。(钟代彬,罗利军,郭龙彪,应存山.栽野杂交转移药用野生稻抗褐飞虱基因.西南农业学报,1997,10(2):5-9)。2)宋丽双关于栽培稻日本晴与澳洲野生稻远缘杂交和回交的研究中，同样回交效率非常低，用日本晴作为轮回亲本与杂种F1进行大量的回交试验，而且通过胚挽救(解决杂种夭亡的方法)最终才获得6株BC1F1。(宋丽双.澳洲野生稻与亚洲栽培稻种间杂种后代的筛选和鉴定.扬州:扬州大学,2021)。3)李冬波在栽培稻与疣粒野生稻远缘杂交及回交的研究中，回交效率更低，三年(5季)共做了上千个杂交穗子(注：一般每个水稻穗子有200粒左右)，仅得到一个子房膨大、发育较好的种子，经过组织培养后获得1株回交后代。(李冬波.疣粒野生稻与栽培稻远缘杂交及其杂种不育原因的探讨.武汉:华中农业大学,2005)。
而本发明实施例1中，二倍体籼粳亚种间杂种的结实率为12.81％，加倍后籼粳亚种间杂种多倍体的结实率为63.60％，育性明显提高；实施例2中，栽培稻与长雄蕊野生稻二倍体杂种的结实率为0，加倍后杂种多倍体的结实率为18.30％，由不育变成可育。
此外，本发明同时还解决了现有技术中二倍体回交育种“往往只能获得个别性状得到改良的新品种，不能充分创造和利用远缘杂交产生的变异”的缺陷。连续回交的结果会造成杂种后代的遗传成分越来越接近轮回亲本(如图9)，所以通过多代回交和选择后，往往只能得到个别或少量性状得到改良的新品种，个别或少量性状来自于非轮回亲本(野生稻)，而其余性状来自于轮回亲本(栽培稻)。而本发明中的技术方案利用的是远缘杂种多倍体的未受精子房培养或花药培养，由于杂种经过减数分裂后产生的配子类型理论上是无数的，所以获得的植株类型极其丰富，最终选育出远比二倍体回交育种更加丰富多样的水稻新品种。本发明的技术方案产生了非常显著的有益效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种利用多倍体水稻为变异载体选育二倍体水稻的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.亲本选择
包括栽培稻籼粳亚种间杂交亲本的选择，或栽培稻与野生稻种间杂交亲本的选择；
b.亲本杂交
栽培稻籼稻亚种与粳稻亚种间进行亚远缘杂交；栽培稻与野生稻间进行远缘杂交；
c.杂种鉴定
将步骤b中获得的杂交种子或杂种试管苗种植后，通过形态和/或育性、和/或基因组原位杂交方法鉴定杂种的真实性；
d.杂种染色体加倍形成多倍体
将经过鉴定的籼粳亚种间杂种或栽培稻与野生稻种间杂种通过活体或离体染色体加倍获得杂种多倍体；
e.杂种多倍体的鉴定
通过形态和/或育性、和/或流式细胞分析、和/或根尖染色体数目鉴定加倍后植株的倍性，确保获得杂种多倍体；
f.杂种多倍体通过染色体减倍获得回复二倍体
通过未受精子房培养或花药培养实现染色体减倍，获得回复二倍体；
g.回复二倍体自交成稳定品系
回复二倍体植株自交多代至稳定遗传，每代都对植株的综合性状进行选择，并通过基因芯片或分子标记对优良基因进行鉴定，最终选育获得具有至少一种优良基因且综合性状优良的系列回复二倍体水稻新品系。
2.根据权利要求1所述的一种利用多倍体水稻为变异载体选育二倍体水稻的方法，其特征在于：步骤a中，栽培稻籼粳亚种间杂交亲本包括亚洲栽培稻(Oryza sativa)中的籼稻亚种(O.sativa ssp.indica)和粳稻亚种(O.sativa ssp.japonica)；
栽培稻与野生稻种间杂交亲本包括：亚洲栽培稻(O.sativa)，野生稻包括普通野生稻(O.rufipogon)、尼瓦拉野生稻(O.nivara)、巴蒂野生稻(O.barthii)、长雄蕊野生稻(O.longistaminata)、展颖野生稻(O.glumaepatula)、南方野生稻(O.meridionalis)、斑点野生稻(O.punctata)、药用野生稻(O.officinalis)、根茎野生稻(O.rhizamatis)、澳洲野生稻(O.australiensis)和短药野生稻(O.brachyantha)中的任一种野生稻。
3.根据权利要求1所述的一种利用多倍体水稻为变异载体选育二倍体水稻的方法，其特征在于：步骤b中，栽培稻籼稻亚种与粳稻亚种间的杂交通过常规有性杂交方法完成；栽培稻与野生稻间的杂交通过激素处理与重复授粉、及胚挽救方法完成。
4.根据权利要求1所述的一种利用多倍体水稻为变异载体选育二倍体水稻的方法，其特征在于：步骤c中，杂种的育性降低或不育。
5.根据权利要求1所述的一种利用多倍体水稻为变异载体选育二倍体水稻的方法，其特征在于：步骤e中，形态上，杂种多倍体与二倍体相比，植株变矮，茎秆变粗，叶片变厚，叶色变深，穗子变长，籽粒增大，芒性状由无芒变为有芒或芒变长；育性上，杂种多倍体与二倍体相比，育性提高。
6.根据权利要求1所述的一种利用多倍体水稻为变异载体选育二倍体水稻的方法，其特征在于：步骤g中，植株的综合性状包括株叶型、生育期、穗数、总粒数、结实率、千粒重。
7.根据权利要求1所述的一种利用多倍体水稻为变异载体选育二倍体水稻的方法，其特征在于：步骤g中，优良基因包括抗病、抗虫、抗逆、优质基因中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的一种利用多倍体水稻为变异载体选育二倍体水稻的方法，其特征在于：步骤g中，优良基因包括产量基因Gn1a和/或OsSPL16、高蛋白含量基因OsAAP6、耐寒基因qLTG3-1、抗黄色斑驳病基因Rymv1、高支链淀粉含量基因Waxy、褐飞虱抗性基因Bph18和/或Bph26、稻瘟病抗性基因Pia和/或Pi2和/或Pi3和/或Pi5和/或Pi63、白叶枯抗性基因Xa21、耐盐基因SKC1、抗条叶枯病毒基因STV11中的至少一种。
9.如权利要求1-8任一所述的一种利用多倍体水稻为变异载体选育二倍体水稻的方法在二倍体水稻选育中的应用。
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Also Published As
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