CN113699264A - 一种识别普通小麦b组染色体的荧光原位杂交探针及其设计方法和应用 - Google Patents

一种识别普通小麦b组染色体的荧光原位杂交探针及其设计方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子细胞遗传学领域，具体涉及一种识别普通小麦B组染色体的荧光原位杂交探针及其设计方法和应用；基于普通小麦基因组SSR序列设计了一种寡核苷酸探针，相对于多种探针组成的探针套，使用该探针进行荧光原位杂交(FISH)可以获得B组染色体的清晰核型，不但减少实验投入成本，而且节约时间，因此提高了实验效率。本发明的探针能快速、准确地鉴定小麦遗传背景中的B组染色体，在小麦遗传育种领域具有良好的应用前景。

Description

一种识别普通小麦B组染色体的荧光原位杂交探针及其设计 方法和应用
技术领域
本发明属于分子细胞遗传学领域，具体涉及一种识别普通小麦B组染色体的荧光原位杂交探针及其设计方法和应用。
背景技术
普通小麦(学名：Triticum aestivum L)，禾本科小麦属，是世界上最重要的粮食作物之一，然而由于在长期进化过程中，大量有利性状的控制基因丢失或失效，因此需要一种高效、准确的方法对小麦的遗传物质进行鉴定。
荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization，FISH)是以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。目前在普通小麦分子细胞遗传学研究中，采用现有荧光原位杂交技术进行分析时，探针准备时通常需要使用多种探针，成本较高，步骤繁琐。
现有申请号为CN201710380883.7的专利文件公开了一种花生寡核苷酸探针及其设计方法和使用方法，共有八种寡核苷酸探针，具体是利用微卫星和端粒序列进行开发，构建花生栽培种及野生种寡核苷酸型，解决花生栽培种与野生种基因组、染色体及染色体结构变异鉴定和识别困难的问题。
申请号为CN201710664797.9的专利文件公开了一种快速分析和检测小麦族植物染色体构型的多色原位杂交方法，其是将mc-GISH应用到花粉母细胞减数分裂过程中染色体配对行为的分析中。
申请号为CN201810399771.0的专利文件公开了一种十倍体长穗偃麦草蓝粒性状专化分子标记和荧光原位杂交探针的开发及应用，其是利用特异性位点扩增片段测序技术对普通小麦、蓝粒小麦和长穗偃麦草进行测序，通过序列数据比对分析获得长穗偃麦草染色体特异DNA序列，以此为基础，开发出来源于长穗偃麦草4Ag染色体的蓝粒性状的专化分子标记和专化荧光探针。
文献《基于寡核苷酸探针套painting的小麦“中国春”非整倍体高清核型及应用》中开发了5个探针，还构建了基于寡核苷酸探针套涂染的、能准确识别3个基因组和7个部分同源群染色体的高清核型。证实了可以有效用于小麦及亲缘物种染色体鉴定。但其所开发的探针为探针套，需要使用多种探针，所需合成的序列长度较长，成本较高，步骤繁琐。
文献《普通小麦贵紫麦1号染色体的FISH核型分析》中利用pAs1与pSc119 2-1两种具不同颜色的重复序列探针对普通小麦贵紫麦1号的根尖细胞染色体开展一次荧光原位杂交并建立其FISH核型。结果表明，以上2种探针基本上可以对A、B基因组及D基因组完成准确辨别。此研究虽然在B组染色体上也只用了一种探针鉴别，但从信号照片可以看出信号微乎其微，信号不够明显、清晰，很可能会导致鉴别错误或不准确的情况。
发明内容
本发明为解决上述问题，提供了一种识别普通小麦B组染色体的荧光原位杂交探针及其设计方法和应用。
具体是通过以下技术方案来实现的：
1、一种识别普通小麦B组染色体的荧光原位杂交探针，所述的探针是由1个寡核苷酸ATGTTG重复4次得到。
进一步，所述探针的序列特征如下：。
Figure BDA0003209440250000021
2、上述识别普通小麦B组染色体的荧光原位杂交探针的设计方法，包括以下步骤：
(1)寡核苷酸探针开发
从NCBI数据库下载小麦基因组数据，利用MISA软件对上述数据进行SSR重复序列分析，得到不同类型的小麦SSR重复序列；
按照重复次数由高到低排序，筛选排在前面的作为候选序列，选择重复次数最高的40个SSR作为候选序列，对得到的候选SSR序列进行比对，并利用在线可视化比对网站B2DSC(http://mcgb.uestc.edu.cn/b2dsc)进行验证，选取小麦片段大小为20-60bp的SSR序列，得到核苷酸序列表中所示的SSR序列。
(2)探针制备
将步骤(1)设计的SSR序列送Thermo Fisher Scientific(上海)公司合成寡核苷酸探针，并在其5’端用绿色6-羧基荧光素进行荧光标记。
3、上述识别普通小麦B组染色体的荧光原位杂交探针的应用，具体是用于鉴定普通小麦B组染色体，或用于制备鉴定或辅助鉴定普通小麦B组染色体的产品。
进一步，所述鉴定普通小麦B组染色体的具体方法包括以下步骤：
(1)制备小麦根尖有丝分裂中期染色体；
⑧将普通小麦种子放入培养皿用蒸馏水浸泡6h后置于滤纸上发芽，每天用蒸馏水冲洗两次。
⑨待根长至1.5～2cm时倒掉培养皿中多余水分，剪下根尖放入预先在盖子上打孔并用蒸馏水喷湿管壁的0.5mL离心管中，再将离心管放入充有N2O气体的密闭金属罐中处理2h。
⑩将离心管取出，加入90％乙酸固定5min，用蒸馏水冲洗3遍。
Figure BDA0003209440250000031
将蒸馏水清洗干净的根切取根尖分生区部分置入复合酶液中，放到37℃水浴锅中酶解50min。
进一步，所述的复合酶液含有1％的果胶酶和2％的纤维素酶，具体配制方法为：称取0.1g果胶酶和0.2g纤维素酶，加入9.7g柠檬酸缓冲液于装了冰块的泡沫盒内混合均匀，保证低温，避免酶降解失活。
Figure BDA0003209440250000032
酶解好的根尖用70％乙醇清洗两次，用解剖针将根尖捣碎，6000rpm离心1min。小心倒去离心管中的乙醇。
Figure BDA0003209440250000033
向晾干的离心管中按照1个根尖加入10μL浓度为100％的乙酸的比例混合均匀。
Figure BDA0003209440250000034
吸取6μL悬浮液迅速滴在置于湿盒内的载玻片上，选择分裂相好的玻片进行下一步试验。
(2)试剂配制
20×SSC(pH 7.0)溶液：称取175.5g氯化钠，88.2g柠檬酸钠·2H2O，溶于800mL超纯水中，用稀HCL调pH至7.0，再用超纯水定容至1000mL，分装后高压灭菌。
0.5M EDTA(PH 8.0)溶液：186.1g EDTA-Na2溶于800mL超纯水中，加NaOH至完全溶解，调PH为8.0后定容至1000mL，分装后高压灭菌。
1M Tris-HCl(PH 8.0)溶液：121.1g Tris碱溶于800mL超纯水中，加热溶解，冷却后用稀HCl调PH至8.0，定容至1000mL，分装后高压灭菌。
2×SSC+1×TE溶液：50mL 20×SSC(PH 7.0)，1mL 0.5EDTA(PH8.0)，5mL 1M Tris-HCl(pH8.0)，用超纯水定容至500mL。
ssDNA(Sigma D1626)溶液：将ssDNA溶于pH5.2的5×TAE缓冲液，终浓度为140ng/uL。
1×TE溶液：0.2mL 0.5M EDTA(pH 8.0)，1mL 1M Tris-HCl(pH8.0)，用超纯水定容至100mL，高压灭菌。
探针溶液：1OD的探针干粉中加入960μL1×TE混匀，分装后-20℃保存。
杂交混合液：每张玻片(10μL反应体系)含上述探针0.8μL、ssDNA 4μL、2×SSC+1×TE 5.2μL。
1×PBS(PH7.4)溶液：8g氯化钠，0.2g氯化钾，1.44g磷酸氢二钠，0.24g磷酸二氢钾，溶于800mL超纯水中，用氢氧化钠溶液调PH至7.4，再用超纯水定容至1L，分装后高压灭菌。
(3)FISH试验；
⑥配制杂交液试剂：每张玻片(10μL反应体系)含探针0.8μL、ssDNA 4μL、2×SSC+1×TE 5.2μL。
进一步，所述的杂交液试剂是在低温、避光条件下将各组分混合后得到。
进一步，所述探针浓度为34.375ng/μL。
⑦将具有清晰染色体的玻片放入紫外交联仪中交联2～3次。
⑧每张玻片滴10μL杂交液，盖上盖玻片放入湿润铝盒中42℃下杂交2h。
⑨用2×SSC冲洗盖玻片后晾干，每张玻片滴加20μL DAPI，盖上盖玻片。
进一步，所述的DAPI溶液是用1×PBS将DAPI原液(美国VECTOR公司)稀释3倍后得到。
⑩玻片置于Olympus BX60荧光显微镜下，用Cellsens Standard摄像系统拍照。
(4)结果鉴定；
先用探针(ATGTTG)4做第一次FISH，并观察照相，如图1所示；接着信号洗脱后在同一玻片上采用现有探针套pSc119.2-1和(GAA)10再做第二次FISH，结果如图2所示。根据探针套FISH信号可以命名B组每对染色体，通过与现有探针套信号进行对比，可以发现(ATGTTG)4与pSc119.2-1和(GAA)10在B组染色体上的绿色信号分布特点基本一致。(ATGTTG)4在普通小麦B组染色体上的信号分布特点如下：
1B：着丝点处信号最强，长臂中部到端部分布着点状信号。
2B：信号主要分布在短臂近着丝点处，长臂上有点状信号。
3B：信号主要分布在着丝点处，且长臂、短臂上均有弱的点状信号。
4B：近着丝点处有强烈信号，长臂中部有清晰信号。
5B：信号主要分布在着丝点处，且长臂中部、短臂端部有点状信号。
6B：染色体近着丝点处有团状强烈信号，短臂近端部有弱信号。
7B：染色体近着丝点处及长臂中部信号强，染色体端部无信号。
进一步，所述鉴定或辅助鉴定普通小麦B组染色体的产品，具体为试剂、试剂盒，制备方法为本领域常规方法。
综上所述，本发明的有益效果在于：本发明基于普通小麦基因组SSR序列设计了一种寡核苷酸探针，相对于多种探针组成的探针套，使用该探针进行荧光原位杂交(FISH)可以获得B组染色体的清晰核型，不但减少实验投入成本，而且节约时间，因此提高了实验效率。本发明的探针能快速、准确地鉴定小麦遗传背景中的B组染色体，在小麦遗传育种领域具有良好的应用前景。
通过本发明探针(ATGTTG)4的FISH试验可鉴定出小麦42条染色体中有7对(14条)上产生了强烈清晰的信号，并且其在不同染色体上信号特点不同，便于辨别区分染色体。
附图说明
图1为采用探针(ATGTTG)4做FISH试验的结果图。
图2为加入探针套pSc119.2-1和(GAA)10做第二次FISH试验的结果图。
图3为探针套pSc119.2-1和(GAA)10中B组染色体信号分布图。
图4为探针(ATGTTG)4中B组染色体信号分布。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
实施例1
1、寡核苷酸探针开发
(1)从NCBI数据库下载小麦基因组数据，利用MISA软件对上述数据进行SSR重复序列分析，得到不同类型的小麦SSR重复序列。
(2)选择重复次数多的SSR作为候选序列。对得到的候选SSR序列进行比对，并利用在线可视化比对网站B2DSC(http://mcgb.uestc.edu.cn/b2dsc)进行验证，选取小麦片段大小合适(20～60bp)的SSR序列。
(3)得到序列表中所示的SSR序列。
2.探针制备
将1设计的SSR序列送Thermo Fisher Scientific(上海)公司合成寡核苷酸探针，在它的5’端用6-FAM进行荧光标记。
实施例2
1、小麦根尖染色体制片
(1)将普通小麦种子放入培养皿用蒸馏水浸泡6h后置于滤纸上发芽，每天用蒸馏水冲洗两次。
(2)待根长至1.5～2cm时倒掉培养皿中多余水分，剪下根尖放入预先在盖子上打孔并用蒸馏水喷湿管壁的0.5mL离心管中，再将离心管放入充有N2O气体的密闭金属罐中处理2h。
(3)将离心管取出，加入90％乙酸固定5min，用蒸馏水冲洗3遍。
(4)将蒸馏水清洗干净的根切取根尖分生区部分置入1％果胶酶和2％纤维素酶液中，放到37℃水浴锅中酶解50min。
(5)酶解好的根尖用70％乙醇清洗两次，用解剖针将根尖捣碎，6000rpm离心1min。小心倒去离心管中的乙醇。
(6)向晾干的离心管中按照1个根尖加入10μL浓度为100％的乙酸的比例混合均匀。
(7)吸取6μL悬浮液迅速滴在置于湿盒内的载玻片上，选择分裂相好的玻片。
实施例3
1、FISH试验
(1)配制杂交液体系，每张玻片含探针0.8μL、ssDNA 4μL、2×SSC+1×TE5.2μL。
(2)将具有清晰染色体的玻片放入紫外交联仪中交联2～3次。
(3)每张玻片滴10μL杂交液，盖上盖玻片放入湿润铝盒中42℃下杂交2h。
(4)用2×SSC冲洗盖玻片后晾干，每张玻片滴加20μL DAPI，盖上盖玻片。
进一步，所述的DAPI溶液是用1×PBS将DAPI原液(美国VECTOR公司)稀释3倍后得到。
(5)玻片置于Olympus BX60荧光显微镜下，用Cellsens Standard摄像系统拍照。
2、结果鉴定
先用探针(ATGTTG)4做第一次FISH，并观察照相，如图1所示；接着信号洗脱后在同一玻片上采用现有探针套pSc119.2-1和(GAA)10再做第二次FISH，结果如图2所示。根据探针套FISH信号可以命名B组每对染色体，通过与现有探针套信号进行对比，可以发现(ATGTTG)4与pSc119.2-1和(GAA)10在B组染色体上的绿色信号分布特点基本一致。(ATGTTG)4在普通小麦B组染色体上的信号分布特点如下：
1B：着丝点处信号最强，长臂中部到端部分布着点状信号。
2B：信号主要分布在短臂近着丝点处，长臂上有点状信号。
3B：信号主要分布在着丝点处，且长臂、短臂上均有弱的点状信号。
4B：近着丝点处有强烈信号，长臂中部有清晰信号。
5B：信号主要分布在着丝点处，且长臂中部、短臂端部有点状信号。
6B：染色体近着丝点处有团状强烈信号，短臂近端部有弱信号。
7B：染色体近着丝点处及长臂中部信号强，染色体端部无信号。
Figure BDA0003209440250000091

Claims (9)

1.一种识别普通小麦B组染色体的荧光原位杂交探针，其特征在于，所述的探针是由1个寡核苷酸ATGTTG重复4次得到。
2.如权利要求1所述的一种识别普通小麦B组染色体的荧光原位杂交探针，其特征在于，所述探针的序列特征为：6-FAM-5’-ATGTTGATGTTGATGTTGATGTTG-3’。
3.一种识别普通小麦B组染色体的荧光原位杂交探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)寡核苷酸探针开发
从NCBI数据库下载小麦基因组数据，利用MISA软件对上述数据进行SSR重复序列分析，得到不同类型的小麦SSR重复序列；
按照重复次数由高到低排序，选择重复次数最高的40个SSR作为候选序列，对得到的候选SSR序列进行比对，选取片段大小为20-60bp的小麦SSR序列；
(2)探针制备
将步骤(1)设计的SSR序列合成寡核苷酸探针，并在其5’端用绿色6-羧基荧光素进行荧光标记。
4.一种识别普通小麦B组染色体的荧光原位杂交探针的应用，其特征在于，用于鉴定普通小麦B组染色体，或用于制备鉴定或辅助鉴定普通小麦B组染色体的产品。
5.如权利要求4所述的一种识别普通小麦B组染色体的荧光原位杂交探针的应用，其特征在于，所述鉴定普通小麦B组染色体的方法，包括以下步骤：
(1)制备小麦根尖有丝分裂中期染色体：
将普通小麦种子培养发芽，待根长至1.5-2cm时剪下根尖，放入离心管中，于密闭金属罐中处理2h；用90％乙酸固定后切取根尖分生区进行酶解，用乙醇清洗后捣碎，离心后去掉上清液晾干，混合乙酸，滴在置于湿盒内的载玻片上；
(2)FISH试验：
配制杂交液试剂，将具有清晰染色体的玻片放入紫外交联仪中交联2-3次，每张玻片滴10μL杂交液，盖上盖玻片放入湿润铝盒中42℃下杂交2h，用2×SSC冲洗盖玻片后晾干，每张玻片滴加20μL DAPI，盖上盖玻片，置于荧光显微镜下进行拍照；
(3)结果鉴定：
先用探针(ATGTTG)4做第一次FISH，并观察照相，接着信号洗脱后在同一玻片上采用现有探针套pSc119.2-1和(GAA)10再做第二次FISH，根据探针套FISH信号命名B组每对染色体，将探针(ATGTTG)4在B组染色体上的绿色信号分布特点与现有探针套信号进行对比。
6.如权利要求5所述的一种识别普通小麦B组染色体的荧光原位杂交探针的应用，其特征在于，所述的酶解，是将切取的根尖分生区部分置入复合酶液中，放到37℃水浴锅中酶解50min；所述的复合酶液含有1％的果胶酶和2％的纤维素酶。
7.如权利要求5所述的一种识别普通小麦B组染色体的荧光原位杂交探针的应用，其特征在于，所述的杂交液试剂，每张玻片含探针0.8μL、ssDNA 4μL、2×SSC+1×TE 5.2μL；所述的探针，是在1OD的探针干粉中加入960μL1×TE混匀得到。
8.如权利要求5所述的一种识别普通小麦B组染色体的荧光原位杂交探针的应用，其特征在于，所述的鉴定普通小麦B组染色体的方法，具体步骤为：
(1)制备小麦根尖有丝分裂中期染色体；
①将普通小麦种子放入培养皿用蒸馏水浸泡6h后置于滤纸上发芽，每天用蒸馏水冲洗两次。
②待根长至1.5～2cm时倒掉培养皿中多余水分，剪下根尖放入预先在盖子上打孔并用蒸馏水喷湿管壁的0.5mL离心管中，再将离心管放入充有N2O气体的密闭金属罐中处理2h。
③将离心管取出，加入90％乙酸固定5min，用蒸馏水冲洗3遍。
④将蒸馏水清洗干净的根切取根尖分生区部分置入复合酶液中，放到37℃水浴锅中酶解50min。
进一步，所述的复合酶液含有1％的果胶酶和2％的纤维素酶，具体配制方法为：称取0.1g果胶酶和0.2g纤维素酶，加入9.7g柠檬酸缓冲液于冰盒上混合均匀。
⑤酶解好的根尖用70％乙醇清洗两次，用解剖针将根尖捣碎，6000rpm离心1min。小心倒去离心管中的乙醇。
⑥向晾干的离心管中按照1个根尖加入10μL浓度为100％的乙酸的比例混合均匀。
⑦吸取6μL悬浮液迅速滴在置于湿盒内的载玻片上，选择分裂相好的玻片进行下一步试验。
(2)FISH试验；
①配制杂交液试剂：每张玻片(10μL反应体系)含探针0.8μL、ssDNA 4μL、2×SSC+1×TE5.2μL。
进一步，所述的杂交液试剂是在低温、避光条件下将各组分混合后得到。
进一步，所述探针浓度为34.375ng/μL。
②将具有清晰染色体的玻片放入紫外交联仪中交联2～3次。
③每张玻片滴10μL杂交液，盖上盖玻片放入湿润铝盒中42℃下杂交2h。
④用2×SSC冲洗盖玻片后晾干，每张玻片滴加20μL DAPI，盖上盖玻片。
进一步，所述的DAPI溶液是用1×PBS将DAPI原液(美国VECTOR公司)稀释3倍后得到。
⑤玻片置于Olympus BX60荧光显微镜下，用Cellsens Standard摄像系统拍照。
(3)结果鉴定：
先用探针(ATGTTG)4做第一次FISH，并观察照相，接着信号洗脱后在同一玻片上采用现有探针套pSc119.2-1和(GAA)10再做第二次FISH，根据探针套FISH信号命名B组每对染色体，将探针(ATGTTG)4在B组染色体上的绿色信号分布特点与现有探针套信号进行对比。
9.如权利要求4所述的一种识别普通小麦B组染色体的荧光原位杂交探针的应用，其特征在于，所述鉴定或辅助鉴定普通小麦B组染色体的产品，具体为试剂、试剂盒。
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