JP2007082429A - コムギに導入されたコムギ近縁種由来の外来染色体を検出する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 オオムギEST配列に基づいて開発されたプライマー対の中から、コムギ連に属する10近縁種由来の外来染色体を検出し得る多数のプライマー対を見出した。本発明の外来染色体を検出する方法は、プライマー対としてオオムギEST配列に基づいて設計されたプライマー対を用い、鋳型DNAとして被検コムギ個体のゲノムDNAを用いてDNA断片を増幅する増幅工程と、増幅工程によって増幅されるDNA断片を確認するための増幅断片確認工程と、を含む。
【選択図】 なし
Description
本発明は、コムギに導入されたコムギ近縁種由来の外来染色体を検出する方法を提供する。
増幅工程とは、プライマー対としてオオムギEST配列に基づいて設計されたプライマー対を用い、鋳型DNAとして被検コムギ個体のゲノムDNAを用いてDNA断片を増幅する工程である。
増幅断片確認工程とは、上記増幅工程によって増幅されるDNA断片を確認するための工程である。
1)コムギのゲノムDNA由来のDNA断片。
2)コムギ近縁種のゲノムDNA由来のDNA断片。
3)コムギおよびコムギ近縁種のゲノムDNA由来のDNA断片の混合物。
本発明の外来染色体を検出する方法は、以下に示す器具およびキットを用いることによって実施することができる。上記外来染色体検出器具は、特に限定されるものではないが、例えば、アレイ形態の外来染色体検出器具を挙げることができる。例えば、以下の(I)または(II)の形態の外来染色体検出器具を提供することが可能となる。
ここに示す外来染色体検出器具は、支持体上にオオムギEST配列に基づいて作製された1対以上のプライマー対が、上記プライマー対の各々によって認識される被検コムギ個体由来のゲノムDNA中の特定の領域を増幅可能であるように固定化されているものであればよい。
ここに示す外来染色体検出器具は、コムギに導入されたコムギ近縁種由来の外来染色体を検出するための器具であって、オオムギEST配列に基づいて作製された1対以上のプライマー対によって増幅されるコムギまたはコムギ近縁種のゲノムDNA断片またはcDNA断片が固定化されているものであればよい。
ここに示す外来染色体検出キットは、コムギに導入されたコムギ近縁種由来の外来染色体を検出するためのキットである。
コムギに導入されたコムギ近縁種由来の外来染色体を検出する方法は、本発明の方法の増幅工程において増幅されるDNA断片、またはプライマー対を設計するために用いるオオムギEST配列をプローブとして用いたFISH法(fluorescent in situ hybridization法)(Kishii M. et al. Chromosome Res. (1999) 7, 519-529.参照)によって行うことも可能である。なお、本明細書中で「プローブ」とは、相補的なポリヌクレオチドに結合し得る検出可能なポリヌクレオチドを意図する。
表1に示すように、本実施例では、コムギ連に属する12種について、検討を行った。上記12種とは、Hordeum vulgare cv. 'Betzes'、H. bulbosum、H. chilense、H. bogdanii、Dasypyrum villosum、Elymus ciliaris、Psathyrostachys huashanica、Leymus racemosus、L. mollis、Secale cereale strain 'IR90'、 Thinopyrum elongatumおよびTriticum aestivum cv. 'Chinese Spring'であった。
本実施例においては、4種類のオオムギESTプライマーシリーズを用いて検討を行った。以下、それぞれのESTプライマーシリーズを、第1プライマーシリーズ、第2プライマーシリーズ、第3プライマーシリーズおよび第4プライマーシリーズと呼ぶ。なお、上記第1〜第4プライマーシリーズは、オオムギEST配列に基づいてSato等によって作製されたオオムギESTプライマー対から選抜されたプライマー対からなる(Sato K, Nankaku N, Yano K, Takeda K (2003) Large scale development of barley EST markers. Ikushugaku Kenkyu, 5 (suppl. 1): 93.参照)。
上記植物材料の全ゲノムDNAは、各植物材料の葉からCTAB法(Murray HG et al. Nuc Acid Res (1980) 8: 4321-4325.参照)にしたがって精製された。
図1に、24種類のプライマー対と、鋳型としてコムギ連に属する12種由来のゲノムDNAとを用いたPCRを行い、その後PCR産物を電気泳動して解析した結果を示す。
Claims (11)
- コムギに導入されたコムギ近縁種由来の外来染色体を検出する方法であって、
プライマー対としてオオムギEST配列に基づいて設計されたプライマー対を用い、鋳型DNAとして被検コムギ個体のゲノムDNAを用いてDNA断片を増幅する増幅工程と、
該増幅工程によって増幅される該DNA断片を確認するための増幅断片確認工程と、を含み、
該コムギ近縁種にはHordeum vulgareは含まれないことを特徴とする外来染色体を検出する方法。 - 前記オオムギEST配列が、配列番号1〜984に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記コムギ近縁種が、Hordeum bulbosum、Hordeum chilense、Hordeum bogdanii、Dasypyrum villosum、Elymus ciliaris、Psathyrostachys huashanica、Leymus racemosus、Leymus mollis、Secale cereale、およびThinopyrum elongatumからなる群より選択される少なくとも1種であることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
- 前記プライマー対は、コムギのゲノムDNAを鋳型として用いた場合にはDNA断片が増幅されず、前記コムギ近縁種の少なくともいずれか1種のゲノムDNAを鋳型として用いた場合にはDNA断片が増幅されるものであることを特徴とする請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プライマー対は、配列番号985〜2294に示される塩基配列のうち、配列番号n(nは奇数)に示されるプライマーおよび配列番号n+1に示されるプライマーからなる複数のプライマー対の中から選択される1対以上のプライマー対であることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 前記プライマー対は、コムギのゲノムDNAを鋳型として用いた場合にはDNA断片が増幅され、前記コムギ近縁種のゲノムDNAを鋳型として用いた場合にはDNA断片が増幅されないものであることを特徴とする請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プライマー対は、配列番号2295〜2298に示される塩基配列のうち、配列番号n(nは奇数)に示されるプライマーおよび配列番号n+1に示されるプライマーからなる複数のプライマー対の中から選択される1対以上のプライマー対であることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 前記プライマー対は、コムギのゲノムDNAを鋳型として用いた場合にはDNA断片が増幅され、前記コムギ近縁種の少なくともいずれか1種のゲノムDNAを鋳型として用いた場合にもDNA断片が増幅されるものであることを特徴とする請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プライマー対は、配列番号2300〜2952に示される塩基配列のうち、配列番号n(nは奇数)に示されるプライマーおよび配列番号n+1に示されるプライマーからなる複数のプライマー対の中から選択される1対以上のプライマー対であることを特徴とする請求項8に記載の方法。
- コムギのゲノムDNAを鋳型として用いた場合に増幅される前記DNA断片と、前記コムギ近縁種の少なくともいずれか1種のゲノムDNAを鋳型として用いた場合に増幅される前記DNA断片とが、区別可能な長さのものであることを特徴とする請求項8に記載の方法。
- コムギのゲノムDNAを鋳型として用いた場合に増幅される前記DNA断片と、前記コムギ近縁種の少なくともいずれか1種のゲノムDNAを鋳型として用いた場合に増幅される前記DNA断片とが、区別不可能な長さのものであることを特徴とする請求項8に記載の方法。
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