JP2003189885A - コムギ由来セントロメア局在性反復配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】物理的地図等のマッピング、コムギの品種判別
等のマーカー、育種等に有用な、コムギ由来セントロメ
ア局在性反復配列の単位核酸及び該核酸に特異的に結合
するポリヌクレオチド；有用品種の育種における評価、
セントロメア領域遺伝子の探索、特定染色体の有無の検
定を可能にする、染色体解析方法；並びにコムギ及びそ
の類縁種の品種を判別することができ、かつ簡便な、コ
ムギの品種判別方法の提供。 【解決手段】特定の配列のいずれかの塩基配列又はその
誘導体配列からなり、コムギＡゲノム染色体及びＢゲノ
ム染色体のセントロメアに局在する縦列型反復配列の単
位核酸；該単位核酸に特異的に結合しうる検出用ポリヌ
クレオチド；該ポリヌクレオチドの少なくとも２つを用
いて、被検試料中の該単位核酸を検出することを特徴と
する、染色体解析方法：該単位核酸又は該ポリヌクレオ
チドを用いて、被検試料中の該単位核酸を検出する、コ
ムギの品種判別方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、コムギ由来セント
ロメア局在性反復配列に関する。詳しくは、コムギ及び
その類縁種に特異的なコムギ由来セントロメア局在性反
復配列の単位となる単位核酸、該単位核酸を検出するた
めのプローブ、該単位核酸を増幅するためのプライマ
ー、染色体の解析方法及びコムギの品種判別方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】縦列型反復配列は、広範囲にわたる生物
に存在し、いくつかの種においてゲノム全体の大きな割
合を占めている。チャールスワースら（非特許文献１を
参照のこと）によれば、前記縦列型反復配列は、反復単
位のサイズに基づき、下記３つのクラス：マイクロサテ
ライト（２〜５ｂｐ）、ミニサテライト（約１０ｂｐ）
及び「典型的な」サテライト（約２００ｂｐ）に分類す
ることができる。

【０００３】しかしながら、前記マイクロサテライト、
ミニサテライト及びサテライトの起源（特に、「典型的
な」サテライトの起源）は、不明な点が多いのが現状で
ある。

【０００４】植物、特に、穀類においては、前記縦列型
反復配列が、例えば、パンコムギ、トウモロコシ及びイ
ネならびにトウジンビエにおけるセントロメアＤＮＡの
一部として見出されている（非特許文献２、非特許文献
３、非特許文献４及び非特許文献５を参照のこと）

【０００５】しかしながら、前記縦列型反復配列は、同
じ種内においてさえ、必ずしも保存されていないことが
示されている（非特許文献２及び非特許文献３を参照の
こと）。また、前記縦列型反復配列の機能については、
不明な点が多いのが現状である。

【０００６】

【非特許文献１】チャールスワース(Charlesworth, B.)
ら, Nature, 371, 215-220 (1994)

【非特許文献２】キシイ(Kishii, M) ら、Chromosome.
Res., 9, 417-428 (2001)

【非特許文献３】アナニーブ(Ananiev, E. V.)ら、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 95,13073-13078 (1998)

【非特許文献４】ドン(Dong, F.)ら、Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 95, 8135-8140 (1998)

【非特許文献５】カム(Kamm, A.)ら、Mol. Gen. Gene
t., 244, 420-425 (1994)

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の第１の目的
は、物理的地図等のマッピング、コムギの品種判別等に
おけるマーカー、育種等に有用な、コムギ由来セントロ
メア局在性反復配列の単位となる単位核酸を提供するこ
とにある。また、本発明の第２の目的は、物理的地図等
のマッピング、コムギの品種判別等に用いうるプローブ
又はプライマーとして有用な、前記核酸に特異的に結合
するポリヌクレオチドを提供することにある。さらに、
本発明の第３の目的は、有用品種の育種における評価、
セントロメア領域遺伝子の探索、特定染色体の有無の検
定を可能にする、染色体解析方法を提供することにあ
る。さらに、本発明の第４の目的は、植物体、特に、コ
ムギ及びその類縁種の品種を判別することができ、かつ
簡便である、コムギの品種判別方法を提供することにあ
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明の要旨は、
〔１〕 （ａ）配列番号：２、１４、１５、１６、１
７、１８、１９、及び２０からなる群より選ばれた塩基
配列からなる核酸、（ｂ）核酸多型を介して、前記
（ａ）の核酸の塩基配列とは異なる塩基配列からなる核
酸、（ｃ）前記（ａ）の核酸にストリンジェントな条件
下にハイブリダイズしうる核酸、（ｄ）前記（ａ）の核
酸の塩基配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性
を有する塩基配列からなる核酸、及び（ｅ）前記（ａ）
の核酸の塩基配列において、少なくとも１塩基の欠失、
置換、挿入又は付加を有する塩基配列からなる核酸、か
らなる群より選ばれた核酸であって、コムギＡゲノム染
色体及びＢゲノム染色体のセントロメアに局在する縦列
型反復配列の単位となる単位核酸、〔２〕 該（ａ）〜
（ｅ）いずれかの核酸の塩基配列において、ＣＡＡを１
単位としてなるマイクロサテライト配列が存在してな
る、前記〔１〕記載の単位核酸、〔３〕 前記〔１〕又
は〔２〕記載の単位核酸に特異的に結合しうる、前記
〔１〕又は〔２〕記載の単位核酸を検出するためのポリ
ヌクレオチド、〔４〕 （Ａ）前記〔１〕若しくは
〔２〕記載の単位核酸の塩基配列に相補的な塩基配列、
又は（Ｂ）前記〔１〕若しくは〔２〕記載の単位核酸の
塩基配列中の塩基配列であって、連続した少なくとも１
０ヌクレオチドからなる塩基配列若しくはその相補鎖、
からなるポリヌクレオチド、〔５〕 配列番号：３〜１
３からなる群より選ばれた１つの塩基配列からなる、前
記〔４〕記載のポリヌクレオチド、〔６〕 前記〔１〕
若しくは〔２〕記載の単位核酸又は前記〔３〕〜〔５〕
いずれか１項に記載のポリヌクレオチドを、該単位核酸
を検出するためのプローブとして用いて、被検試料中の
該単位核酸を検出することを特徴とする、染色体解析方
法、〔７〕 前記〔３〕〜〔５〕いずれか１項に記載の
ポリヌクレオチドの少なくとも２つを、前記〔１〕若し
くは〔２〕記載の単位核酸を増幅するためのプライマー
対として用いて、被検試料中の該単位核酸を検出するこ
とを特徴とする、染色体解析方法、〔８〕 前記〔１〕
若しくは〔２〕記載の単位核酸又は前記〔３〕〜〔５〕
いずれか１項に記載のポリヌクレオチドを、該単位核酸
を検出するためのプローブとして用いて、被検試料中の
該単位核酸を検出することを特徴とする、コムギの品種
判別方法、並びに

〔９〕 前記〔３〕〜〔５〕いずれか
１項に記載のポリヌクレオチドの少なくとも２つを、前
記〔１〕若しくは〔２〕記載の単位核酸を増幅するため
のプライマー対として用いて、被検試料中の該単位核酸
を検出することを特徴とする、コムギの品種判別方法、
に関する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の核酸は、コムギ由来セン
トロメア局在性反復配列の単位となる核酸である。本明
細書においては、かかる核酸を、「単位核酸」という。

【００１０】本発明の単位核酸は、コムギ及びその類縁
種のＡゲノム染色体及びＢゲノム染色体のセントロメア
領域に特異的な反復配列の単位核酸であるため、物理的
地図等のマッピング、コムギの品種判別等におけるマー
カー、育種、コムギの進化学的分析等に有用である。

【００１１】具体的には、配列番号：２、１４、１５、
１６、１７、１８、１９、及び２０からなる群より選ば
れた塩基配列からなる核酸であって、コムギＡゲノム染
色体及びＢゲノム染色体のセントロメアに局在する縦列
型反復配列の単位となる単位核酸〔単位核酸（ａ）とい
う〕が挙げられる。

【００１２】本発明は、２種のクサイビコムギ Ａｅｇ
ｉｌｏｐｓ ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓＫＵ５７２７及びＫ
Ｔ１１５−１のいずれかのゲノムＤＮＡと、ライムギ特
異的な配列（例えば、ｐＳｃ７４等）を有する核酸とを
プローブとして、ライコムギ（例えば、Ｙ４６８３等）
に対し、ゲノムｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
を行なうことにより、コムギの特定染色体のセントロメ
ア及びその周辺に強いシグナルが見いだせるという本発
明者らの知見に基づき、得られたものであり、コムギの
Ａゲノム染色体及びＢゲノム染色体のセントロメア領域
において、コムギ及びその類縁種に特異的な反復配列を
含む配列（配列番号：１）が局在するという本発明者ら
の知見に基づく。

【００１３】本発明の単位核酸は、例えば、後述の実施
例におけるハイブリダイゼーションにおいて、イネ、オ
オムギ、アワ（ｍｉｌｌｅｔ）又はエンバクに検出され
ないものである。

【００１４】本明細書において、コムギ及びコムギ類縁
種としては、Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｔ．ｄｕｒｕｍ等
の４倍性コムギ、Ａｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ（ＫＴ１
１５−１）、Ａｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ（ＫＵ５７２
７）、Ｔ．ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ等の６倍性コムギ、Ａ
ｅ．ｓｑｕａｒｒｏｓａ等の２倍性コムギ、Ｓ．ｃｅｒ
ｅａｌｅ等のライムギ等のコムギ等が挙げられる。

【００１５】また、本明細書において、単位核酸とは、
反復配列の最小単位を意味する。

【００１６】「セントロメア」は、真核生物の染色体の
分配を司るものであり、娘細胞が染色体の完全な一組を
確実に受け取るための姉妹染色分体の分離において重要
な役割を果たす。前記セントロメアは、大部分の植物及
び動物において、姉妹染色分体の会合及び紡錘体繊維の
結合が生じる主要な構造体として認められている。

【００１７】本発明の単位核酸は、コムギ及びその類縁
種のＡゲノム染色体及びＢゲノム染色体のセントロメア
に局在するものであれば、核酸多型を介して、前記核酸
多型を介して、前記（ａ）の核酸の塩基配列とは異なる
塩基配列からなる核酸〔単位核酸（ｂ）という〕であっ
てもよい。

【００１８】前記核酸多型は、同じ種の個体間、生物の
同一個体間若しくは生物間において見出される場合があ
る差異又は変化であり、核酸の構造の変化をいう。具体
的には、コムギの種に特異的な多型、個体に特有の多型
等が挙げられる。かかる核酸多型を有する核酸として
は、例えば、ＣＡＡを１単位としたマイクロサテライト
が存在する核酸等が挙げられる。かかるマイクロサイト
におけるＣＡＡ単位の繰り返し数は、コムギ及びその類
縁種により異なるが、例えば、６倍性コムギ〔ＣＳ：(C
hinese spring)〕の場合、２〜１５、Ａｅｇｉｌｏｐｓ
ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓの場合、４〜１６等が挙げられ
る。

【００１９】また、本発明の単位核酸は、コムギ及びそ
の類縁種のＡゲノム染色体及びＢゲノム染色体のセント
ロメアに局在するものであれば、前記（ａ）の核酸にス
トリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸
〔単位核酸（ｃ）という〕であってもよい。

【００２０】前記「ストリンジェントな条件」として
は、モレキュラークローニング アラボラトリー マニ
ュアル第３版 [ザンブルーク(Sambrook)ら、Molecular
Cloning : A Laboratory Manual 3rd ed., コールドス
プリングハーバーラボラトリー(Cold Spring Harbor La
boratory) 発行, (2001)] 等に記載のハイブリダイゼー
ション条件が挙げられる。また、ハイブリダイゼーショ
ンは、前記モレキュラークローニング ア ラボラトリ
ー マニュアル第３版等に記載の方法に従って実施され
うる。例えば、慣用のハイブリダイゼーション緩衝液中
３７℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行ない、そ
の後、２×ＳＳＣと０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０とを含有
した溶液を用いて室温で１５分の洗浄を２回、ついで、
０．１×ＳＳＣと０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０とを含有し
た溶液を用いて６８℃で１５分の洗浄を２回を行なう手
順等が挙げられる。

【００２１】さらに、本発明の単位核酸は、コムギ及び
その類縁種のＡゲノム染色体及びＢゲノム染色体のセン
トロメアに局在するものであれば、前記（ａ）の核酸の
塩基配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは、少
なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の配
列同一性を有する塩基配列からなる核酸〔単位核酸
（ｄ）〕であってもよい。

【００２２】前記配列同一性は、コムギ及びその類縁種
により異なるものである。前記配列同一性は、２つの核
酸における比較対象の配列の領域にわたって、最適な状
態にアラインメントされた２つの配列を比較することに
より決定されうる。ここで、比較対象の核酸は、２つの
配列の最適なアラインメントのための参考配列（例え
ば、コンセンサス配列等）と比べて、付加又は欠失（例
えば、ギャップ等）を有していてもよい。

【００２３】配列同一性の数値（パーセンテージ）は、
両方の配列に存在する同一の残基を決定して、適合部位
の数を決定し、ついで、比較対象の配列領域内の残基の
総数で、前記適合部位の数を割、得られた数値に１００
をかけることにより、算出されうる。最適なアラインメ
ント及びホモロジーを得るためのアルゴリズムとして
は、例えば、スミス(Smith) らの局所ホモロジーアルゴ
リズム[Add. APL. Math., 2, 482 (1981)]、ニードルマ
ン(Needleman) らのホモロジーアラインメントアルゴリ
ズム[J. Mol. Biol., 48, 443(1970)]、パールソン(Pea
rson) らの相同性検索法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
85, 2444 (1988)] が挙げられ、より具体的には、ダイ
ナミックプログラミング法、ギャップペナルテイ法、Sm
ith-Watermanアルゴリズム、Good-Kanehisa アルゴリズ
ム、BLAST アルゴリズム、FASTA アルゴリズム等が挙げ
られる。

【００２４】配列同一性は、例えば、配列解析ソフト、
具体的には、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ、ＢＬＡＳＴＮ、
ＢＬＡＳＴＰ等を用いて測定される。前記ＢＬＡＳＴＮ
及びＢＬＡＳＴＰは、ホームページアドレスｈｔｔｐ：
／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬ
ＡＳＴ／において、一般に利用可能である。

【００２５】さらに、本発明の単位核酸は、コムギ及び
その類縁種のＡゲノム染色体及びＢゲノム染色体のセン
トロメアに局在するものであれば、前記（ａ）の核酸の
塩基配列において、少なくとも１塩基の変異（欠失、置
換、挿入又は付加）を有する塩基配列からなる核酸〔単
位核酸（ｅ）という〕であってもよい。かかる変異の数
は、コムギ及びその類縁種により異なるものであり、単
位核酸がコムギ及びその類縁種のＡゲノム染色体及びＢ
ゲノム染色体のセントロメアに局在する範囲において、
任意の数である。

【００２６】本発明の単位核酸により、物理的地図等の
マッピング、コムギの品種判別、コムギの進化学的分析
等におけるハイブリダイゼーションに基づく解析又はＰ
ＣＲに基づく解析に有用なポリヌクレオチド（プローブ
又はプライマー）が提供される。

【００２７】本発明の「単位核酸を検出するためのポリ
ヌクレオチド」は、前記単位核酸に特異的に結合するこ
とに１つの特徴がある。かかるポリヌクレオチドによれ
ば、物理的地図等のマッピング、コムギの品種判別、コ
ムギの進化学的分析等が可能になる。

【００２８】本発明の「単位核酸を検出するためのポリ
ヌクレオチド」としては、具体的には、前記単位核酸の
塩基配列に相補的な塩基配列〔塩基配列（Ａ）という〕
からなるポリヌクレオチドが挙げられる。

【００２９】また、本発明の「単位核酸を検出するため
のポリヌクレオチド」には、前記単位核酸に特異的に結
合する範囲で、前記単位核酸の塩基配列中の塩基配列で
あって、連続した少なくとも１０ヌクレオチドからなる
塩基配列若しくはその相補鎖〔塩基配列（Ｂ）という〕
からなるポリヌクレオチドも含まれる。

【００３０】なお、前記塩基配列（Ｂ）の長さは、使用
形態〔プローブとしての使用又はプライマーとしての使
用〕により適宜設定され得る。例えば、プローブとして
使用する場合、２００〜３００ヌクレオチド、好ましく
は、２５０〜３００ヌクレオチドであることが望まし
く、プライマーとして使用する場合、１８〜３０ヌクレ
オチド、好ましくは、２０〜３０ヌクレオチドであるこ
とが望ましい。前記塩基配列（Ｂ）からなるポリヌクレ
オチドは、本発明の単位核酸の配列をもとに設計し、化
学的に合成すること等により作製されたものであっても
よく、該単位核酸を、制限酵素処理、エキソ型ヌクレア
ーゼ処理等の酵素的処理、超音波等の物理的処理等によ
り断片化し、得られた断片を、アガロースゲル等に代表
される各種核酸分離法により分離精製することにより得
られたものであってもよい。

【００３１】また、本発明の「単位核酸を検出するため
のポリヌクレオチド」は、前記単位核酸とストリンジェ
ントな条件でハイブリダイズしうるポリヌクレオチドで
あってもよい。

【００３２】前記「ストリンジェントな条件」として
は、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５
％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核
酸を含む溶液中、〔Ｔｍ−２５℃〕の温度で一晩保温す
る条件等が挙げられる。本発明の「単位核酸を検出する
ためのポリヌクレオチド」のＴｍは、６０〜６８、好ま
しくは、６５〜６８であることが望ましい。なお、前記
「単位核酸を検出するためのポリヌクレオチド」のＴｍ
は、１８ヌクレオチド以上の鎖長である場合、例えば、
下記の式（Ｉ）： Ｔm ＝81.5−16.6(log₁₀[Na ⁺ ] ＋ 0.41(%G＋C)−(600/N) （Ｉ） （式中、Ｎはオリゴヌクレオチドプローブの鎖長であ
り、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチドプローブプライマー
中のグアニン及びシトシン残基の含有量である）により
求められる。また、鎖長が１８ヌクレオチドより短い場
合、Ｔｍは、例えば、Ａ＋Ｔ（アデニン＋チミン）残基
の含有量と２℃との積と、Ｇ＋Ｃ残基の含有量と４℃と
の積との和〔(A+T) ×2+(G+C) ×4 〕により推定されう
る。

【００３３】本発明の「単位核酸を検出するためのポリ
ヌクレオチド」としては、特に限定されないが、具体的
には、例えば、配列番号：３〜１３からなる群より選ば
れた塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。

【００３４】本発明の単位核酸又は本発明のポリヌクレ
オチドは、コムギのＡゲノム染色体のセントロメア、Ｂ
ゲノム染色体のセントロメア、又はライムギの染色体の
セントロメアに特異的は配列であるため、ＦＩＳＨ等の
プローブとして他の穀類染色体との識別に利用できる。

【００３５】本発明の単位核酸又は本発明のポリヌクレ
オチドによれば、植物体、特にコムギ及びその類縁種の
染色体の解析が可能になる。本発明には、染色体解析方
法も含まれる。

【００３６】本発明の染色体解析方法は、前記単位核酸
又は前記ポリヌクレオチドを用いることを１つの特徴と
する。

【００３７】本発明の染色体解析方法において、前記単
位核酸を用いる場合、植物体、特にコムギ及びその類縁
種の染色体を被験試料として、該単位核酸をプローブと
して用い、慣用の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼー
ション、サザンブロットハイブリダイゼーションを行な
うことにより、染色体における単位核酸の局在、存在等
を解析することができる。

【００３８】また、本発明の染色体解析方法において、
前記ポリヌクレオチドを用いる場合、該ポリヌクレオチ
ドを、単位核酸を検出するためのプローブとして用いる
こともでき、単位核酸を増幅するためのプライマーとし
て用いることもできる。

【００３９】具体的には、本発明の単位核酸又は本発明
のポリヌクレオチドを、該単位核酸を検出するためのプ
ローブとして用いて、被検試料中の該単位核酸を検出す
ることを特徴とする方法、及び、本発明のポリヌクレオ
チドの少なくとも２つを、本発明の単位核酸を増幅する
ためのプライマー対として用いて、被検試料中の該単位
核酸を検出することを特徴とする方法が挙げられる。

【００４０】より具体的には、本発明の染色体解析方法
としては、コムギの品種判別方法としては、１）被験試
料を、適切な泳動用担体（例えば、アガロースゲル、ポ
リアクリルアミドゲル等）で泳動させるステップ、 ２）前記ステップ１）で得られた泳動後の泳動用担体に
おける被験試料と、本発明の単位核酸又は本発明のポリ
ヌクレオチドからなるプローブとを、ストリンジェント
な条件下にハイブリダイズさせ、ハイブリッドに起因す
るバンドの有無、大きさ及び数を検出するステップ、及
び ３）前記ステップ２）で得られたバンドの有無、大きさ
及び数に基づき、単位核酸の存在量（コピー数等）又は
単位核酸における多型により引き起こされる鎖長の変化
を検出するステップ、を含む方法（方法１）、並びに Ｉ）被験試料を鋳型とし、本発明のポリヌクレオチドか
らなるプライマーの対を用いて核酸増幅を行なうステッ
プ、 II）前記ステップＩ）で得られた増幅産物を、適切な泳
動用担体（例えば、アガロースゲル、ポリアクリルアミ
ドゲル等）で泳動させるステップ、 III)前記ステップII）で得られた泳動後の泳動用担体に
おける増幅産物に起因するバンドの有無、大きさ及び数
を検出するステップ、及び IV）前記ステップIII)で得られたバンドの有無、大きさ
及び数に基づき、単位核酸の存在量又は単位核酸におけ
る多型により引き起こされる鎖長の変化を検出するステ
ップ、を含む方法（方法２）が挙げられる。

【００４１】前記ポリヌクレオチドを、単位核酸を検出
するためのプローブとして用いる場合、植物体、特にコ
ムギ及びその類縁種の染色体を被験試料として、該単位
核酸をプローブとして用い、慣用の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ
ハイブリダイゼーション、サザンブロットハイブリダイ
ゼーションを行なうことにより、染色体における単位核
酸の局在、存在等を解析することができる。

【００４２】前記ポリヌクレオチドをプローブとして用
いる場合、前記プローブと、植物体、特にコムギ及びそ
の類縁種の染色体とのハイブリダイゼーション条件は、
前記「ストリンジェントな条件」が挙げられ、例えば、
６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０
１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、〔Ｔｍ−２５℃〕
の温度で一晩保温する条件が挙げられる。

【００４３】また、かかるストリンジェントな条件下に
おけるハイブリダイゼーションにおいて、より精度を高
める観点から、より低イオン強度、例えば、０. １×Ｓ
ＳＣ、０. ２×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例
えば、用いられる核酸のＴｍ値の２５℃下、好ましく
は、２２℃下、より好ましくは、２０℃下、具体的に
は、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、６０℃以
上、好ましくは、６２℃以上、より好ましくは、６５℃
以上等の条件下でのハイブリダイゼーション；より厳し
い洗浄条件、具体的には、低イオン強度の緩衝液、例え
ば、１×ＳＳＣ、２×ＳＳＣ等を使用し、より高い温
度、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の４０℃下、より
好ましくは、３０℃下、さらに好ましくは、２５℃下、
具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、
３０℃以上、３７℃以上、４２℃以上、４５℃以上等の
条件下での洗浄等を行なうことができる。

【００４４】一方、前記ポリヌクレオチドを、単位核酸
を増幅するためのプライマーとして用いる場合、植物
体、特にコムギ及びその類縁種の染色体を被験試料（鋳
型）として、少なくとも２種の前記ポリヌクレオチドを
用いて、慣用の核酸増幅方法（ＰＣＲ等）を行ない、つ
いで、得られた産物について、慣用の電気泳動法、配列
決定法、制限断片長解析等を行なうことにより、染色体
における単位核酸の存在量（コピー数等）、多型等が解
析されうる。ここで、核酸増幅方法により、単位核酸の
存在量又は多型を解析する場合、対照試料として、例え
ば、該単位核酸の存在量（コピー数等）又は多型が既知
である植物体を標準として用いることができる。

【００４５】なお、プライマーの対は、増幅対象となる
領域を挟む対となる配列からなるプライマー対であれば
よい。

【００４６】核酸増幅方法においては、コムギＡゲノム
染色体及び／又はＢゲノム染色体を鋳型として用い、鋳
型量、マグネシウム濃度、プライマー量、アニーリング
温度及び時間等を適宜調整して、単位核酸のみを増幅す
る条件を予め決定し、決定された条件下で、核酸増幅を
行なってもよい。

【００４７】本発明の染色体解析方法によれば、有用品
種の育種における評価、セントロメア領域遺伝子の探
索、特定染色体の有無の検定等に利用されうる。

【００４８】さらに、本発明の単位核酸又は本発明のポ
リヌクレオチドによれば、植物体、特に、コムギ及びそ
の類縁種の品種の判別が可能になる。本発明には、かか
るコムギの品種判別方法も含まれる。

【００４９】本発明のコムギの品種判別方法は、本発明
の単位核酸又は本発明のポリヌクレオチドを用いること
を１つの特徴とする。本発明のコムギの品種判別方法に
おいては、植物体、特にコムギ及びその類縁種の染色体
を被験試料とし、本発明の単位核酸又は本発明のポリヌ
クレオチドを、単位核酸を検出するためのプローブ又は
単位核酸を増幅するためのプライマーとして用いること
により、単位核酸の存在量（コピー数等）又は単位核酸
における多型により引き起こされる鎖長の変化を検出
し、それにより、品種を判別することができる。

【００５０】具体的には、本発明の単位核酸又は本発明
のポリヌクレオチドを、該単位核酸を検出するためのプ
ローブとして用いて、被検試料中の該単位核酸を検出す
ることを特徴とする品種判別方法、及び本発明のポリヌ
クレオチドの少なくとも２つを、本発明の単位核酸を増
幅するためのプライマー対として用いて、被検試料中の
該単位核酸を検出することを特徴とする品種判別方法が
挙げられる。

【００５１】より具体的には、本発明のコムギの品種判
別方法としては、１）被験試料を、適切な泳動用担体
（例えば、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル
等）で泳動させるステップ、 ２）前記ステップ１）で得られた泳動後の泳動用担体に
おける被験試料と、本発明の単位核酸又は本発明のポリ
ヌクレオチドからなるプローブとを、ストリンジェント
な条件下にハイブリダイズさせ、ハイブリッドに起因す
るバンドの有無、大きさ及び数を検出するステップ、及
び ３）前記ステップ２）で得られたバンドの有無、大きさ
及び数に基づき、単位核酸の存在量（コピー数等）又は
単位核酸における多型により引き起こされる鎖長の変化
を検出するステップ、を含む方法（品種判別方法１）、
並びに Ｉ）被験試料を鋳型とし、本発明のポリヌクレオチドか
らなるプライマーの対を用いて核酸増幅を行なうステッ
プ、 II）前記ステップＩ）で得られた増幅産物を、適切な泳
動用担体（例えば、アガロースゲル、ポリアクリルアミ
ドゲル等）で泳動させるステップ、 III)前記ステップII）で得られた泳動後の泳動用担体に
おける増幅産物に起因するバンドの有無、大きさ及び数
を検出するステップ、及び IV）前記ステップIII)で得られたバンドの有無、大きさ
及び数に基づき、単位核酸の存在量（コピー数等）又は
単位核酸における多型により引き起こされる鎖長の変化
を検出するステップ、 を含む方法（品種判別方法２）が挙げられる。

【００５２】本発明のコムギの品種判別方法において、
本発明の単位核酸又は本発明のポリヌクレオチドをプロ
ーブとして用いる場合、前記プローブと、被験試料との
ハイブリダイゼーション条件としては、前記「ストリン
ジェントな条件」が挙げられる。

【００５３】一方、本発明のポリヌクレオチドを、単位
核酸を増幅するためのプライマーとして用いる場合、被
験試料と、本発明のポリヌクレオチドからなるプライマ
ーの対を用いて、慣用の核酸増幅方法（ＰＣＲ等）を行
ない、ついで、得られた産物について、慣用の電気泳動
法、配列決定法、制限断片長解析等を行なうことによ
り、染色体における単位核酸の存在量（コピー数等）、
多型等の情報が得られる。かかる情報を指標として、品
種を判別できる。

【００５４】なお、プライマーの対は、増幅対象となる
領域を挟む対となる配列からなるプライマー対であれば
よい。

【００５５】核酸増幅方法においては、コムギＡゲノム
染色体及び／又はＢゲノム染色体を鋳型として用い、鋳
型量、マグネシウム濃度、プライマー量、アニーリング
温度及び時間等を適宜調整して、単位核酸のみを増幅す
る条件を予め決定し、決定された条件下で、核酸増幅を
行ないうる。

【００５６】品種の判別においては、予め特定されてい
る品種の染色体における単位核酸の存在量（コピー数
等）又は単位核酸における多型により引き起こされる鎖
長の変化を指標とすればよい。

【００５７】例えば、前記「単位核酸における多型によ
り引き起こされる鎖長の変化」を指標とする場合、ＣＡ
Ａを１単位としたマイクロサテライトにおけるＣＡＡ単
位の繰り返し数を指標としてもよい。この場合、繰り返
し数は、コムギ及びその類縁種により異なるが、例え
ば、６倍性コムギ（ＣＳ）の場合、２〜１５、Ａｅｇｉ
ｌｏｐｓ ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓの場合、４〜１６であ
ることを指標として判別することができる。

【００５８】

【実施例】以下、本発明を実施例等により説明するが、
本発明は、かかる実施例により限定されるものではな
い。なお、本実施例において用いられた植物試料は、以
下の通りである。

【００５９】八倍体ライコムギの改良系統Ｙ４６８３
は、中国生命科学院、育種学研究所にて、程治軍（Ｃｈ
ｉａｎｇ，Ｚ．Ｊ．）が管理している育種群から選択さ
れたものである。

【００６０】２タイプのクサビコムギＡｅｇｉｌｏｐｓ
ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ；アクセション番号ＫＵ５７２
７及びｖａｒ．ＫＴ１１５−１は、遠藤隆博士（京都大
学）及び常脇恒一郎博士（福井県立大学）の厚意によ
り、それぞれ提供されたものである。

【００６１】ライムギＳｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ
ｃｖ． Ｐｅｔｋｕｓ、ヒトツブコムギＴ．ｍｏｎｏｃ
ｏｃｕｍ ｖａｒ． ｖｕｌｇａｒｅ（ＫＴ３−１）、
タルホコムギＡｅ．ｓｑｕａｒｒｏｓａ ｖａｒ．ｓｔ
ｒａｎｇｕｌａｔｅ（ＫＴ１２０−５）、デュラムコム
ギＴ．ｄｕｒｕｍ ｖａｒ．ｒｈｅｉｎｖａｃｈｉｉも
また常脇博士（福井県立大学）から提供されたものであ
る。

【００６２】パンコムギＴ．ａｅｓｔｉｖｕｍ ｃｖ．
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｐｒｉｎｇ（ＣＳ）は、岡山大学資
源生物科学研究所 遺伝情報発現部門 遺伝子解析分野
研究室に保存されていたものである。

【００６３】イネＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｖａｒ．
Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ、オオムギＨｏｌｄｕｍ ｖｕｌ
ｇａｒｅ ｖａｒ．ｉｓｈｕｋｕｓｈｉｒａｚｕ、モロ
コシＳｏｒｇｕｍ ｂｉｃｏｌａｒ ｖａｒ．Ｃｏｍｂ
ｉｎｅ ｋａｆｉｒ３１９７Ａ、及びエンバクＡｖｅｎ
ａ ｓａｔｉｖａ ｖａｒ．Ａｌｂｉｏｎは、斉藤彰博
士（九州農業試験場）の厚意により提供されたものであ
る。

【００６４】実施例１ 縦列型反復配列の検索 ２タイプのＡｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅのゲノムＤＮＡ
を、Ｎｕｃｌｅｏｎ Ｐｈｙｔｏｐｕｒｅ ＤＮＡ抽出
キット（アマシャム社製）を用い、製造者の説明書に従
って幼若実生から、それぞれ単離した。

【００６５】得られたゲノムＤＮＡのそれぞれを、慣用
の方法により、ジゴキシゲニンで標識して、ジゴキシゲ
ニン標識Ａｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅゲノムＤＮＡプロー
ブを得た。また、ライムギ特異的なｐＳｃ７４を、慣用
の方法により、ビオチンで標識し、ビオチン標識ｐＳｃ
７４を得た。

【００６６】８倍体ライコムギの染色体を、以下のよう
に調製した。すなわち、発芽中の種子を、４℃で２４時
間維持して、細胞分裂を同調させた。１．５ｃｍ〜２．
０ｃｍの長さで、根の先端部を集めた。得られた根の先
端を、氷冷水で２４時間にわたり前処理し、エタノール
−酢酸（体積比３：１）で固定して、得られた産物を−
２０℃で保存した。ゲノムｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイ
ゼーション（ＧＩＳＨ）に用いるための染色体は、以下
のように調製した。すなわち、固定した根を水洗し、得
られた根の先端のみをカミソリで切取り、酵素液〔２重
量％ セルラーゼ オノズカＲＩＯ（近畿ヤクルト社
製）〕とペクチナーゼ〔２０％（体積比）（シグマアル
ドリッチ社製）混合液〕に移し、得られた混合物を３７
℃１時間静置した。ついで、得られた混合物を、ペピッ
トマンで懸濁し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１分
間）し、上清を捨て、得られた沈殿物を水洗し、該沈殿
物に、メタノール−酢酸溶液（体積比３：１）を加え、
懸濁した。得られた懸濁物を、スライドガラス上にドロ
ップし、ついで、アルコールランプでメタノールを燃や
し乾燥させて、染色体を調製した。

【００６７】前記ジゴキシゲニン標識Ａｅ．ｓｐｅｌｔ
ｏｉｄｅゲノムＤＮＡの一方と、前記ライムギ特異的な
ｐＳｃ７４（反復配列）とを、８倍体ライコムギ染色体
にハイブリダイズさせることにより、ゲノムｉｎ ｓｉ
ｔｕハイブリダイゼーション（ＧＩＳＨ）を行なった。
具体的には、５０％（体積比）ホルムアミド、１０％デ
キストラン硫酸、２×ＳＳＣ（０．３Ｍ ＮａＣｌ、
０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）混合液中に、１０〜１
００ｎｇの標識ＤＮＡを添加し、得られた混合物２０μ
ｌ（スライドガラス１枚あたり）をスライドガラスにの
せ、カバーガラスをのせた。ついで、スライドガラスに
ついて、ラバーセメントで周りを封じた後、７８℃約１
分３０秒加熱した。その後、得られたスライドガラス
を、３７℃のインキュベータで一晩インキュベートし
た。得られたスライドガラスを、２×ＳＳＣ（３７℃）
で洗浄した。得られたスライドガラスに、ストレプトア
ビジンＣｙ３（赤）又は抗ジゴキシゲニン・フルオレセ
イン（緑）を２×ＳＳＣ中１ｎｇ／μｌになるように混
合して得られた溶液をのせ、ついで、４×ＳＳＣでリン
スし、抗退色剤をのせて、蛍光顕微鏡により検鏡した。

【００６８】その結果、図１のパネルＡに示すように、
Ａｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅゲノムＤＮＡプローブの１つ
であるＡｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅ（ＫＴ１１５−１）
は、８倍体ライコムギへの明かな結合パターンを示し
た。また、セントロメア付近のシグナルが、パンコムギ
染色体だけでなく、ライムギ染色体においても認められ
た。

【００６９】実施例２ 縦列型反復配列のスクリーニン
グ セントロメア領域に選択的にハイブリダイズした反復性
ＤＮＡ配列を同定するために、以下のように、Ａｅ．ｓ
ｐｅｌｔｏｉｄｅ（ＫＴ１１５−１）に由来するゲノム
ＤＮＡライブラリーを、パンコムギ（ＣＳ）のゲノムＤ
ＮＡプローブを用いてスクリーニングした。

【００７０】Ｓａｕ３ＡＩ（０．０２Ｕ）により、３７
℃で、１μｇのＡｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅ（ＫＴ１１５
−１）の核ＤＮＡを部分消化して、約２ｋｂ長の断片を
得た。得られた断片を、ＢａｍＨＩで直鎖状にされたｐ
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩＳＫ＋（ストラタジーン社
製）に連結した。得られた組換えプラスミドを用いて、
大腸菌ＸＬ−１０ Ｇｏｌｄ（ストラタジーン社製）に
形質転換し、形質転換体を得た。ついで、形質転換体の
コロニーをナイロンメンブレン〔Ｈｙｂｏｎｄ ^TM Ｎ
＋、アマシャム社製〕に転写した。また、慣用の方法に
より、ジゴキシゲニンによりパンコムギのゲノムＤＮＡ
プローブを標識して、標識パンコムギゲノムＤＮＡプロ
ーブを得た。得られたメンブレンと、標識パンコムギ
ゲノムＤＮＡプローブとを用いて、ハイブリダイゼーシ
ョンを行なった。ハイブリダイゼーションを、以下のよ
うに行なった。すなわち、ＤＩＧ−ｅａｓｙ−ｈｙｂ液
に、１０〜５０ｎｇ／μｌの熱変性させた標識ＤＮＡを
入れ、３７℃で一晩インキュベートした。ついで、スト
リンジェントな洗浄条件（０．１ｘＳＳＣ、６８℃）に
より洗浄を行なった。抗ジゴキシゲニン−アルカリホス
ファターゼにインキュベートし、化学発光液（ＣＳＰ
Ｄ）で検出した。Ｘ線フィルムに感光し、現像した。

【００７１】その結果、５００クローンのうち１８クロ
ーンが比較的強いシグナルを示した。

【００７２】ついで、前記１８クローンを、蛍光ｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により調
べた。本実施例により単離された種々のクローン及びク
ローンｐＳｃ７４ [ベッドブルーク(Bedbrook)ら、Cell
19:545-560 (1980)] 、Ｔ．ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ ｖ
ａｒ．ＫＴ３−１、Ａｅ．ｓｑｕａｒｒｏｓａ ｖａ
ｒ．ｔｙｐｉｃａ及びＣＳのそれぞれのゲノムＤＮＡ
を、ニックトランスレーションによりビオチン−１４−
ｄＵＴＰ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）又はジゴキシゲニ
ン−１１−ｄＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｒｏｃｈ
ｅ社製）で標識し、ゲノムＤＮＡプローブを得た。得ら
れたゲノムＤＮＡプローブと、コムギ染色体とを用い
て、ＦＩＳＨを行なった。前記コムギ染色体は、以下の
ように調製した。すなわち、植物体の発芽中の種子を、
４℃で２４時間維持して、細胞分裂を同調させた。１．
５ｃｍ〜２．０ｃｍの長さで、根の先端部を集めた。得
られた根の先端を、氷冷水で２４時間にわたり前処理
し、エタノール−酢酸（体積比３：１）で固定して、得
られた産物を−２０℃で保存した。ＦＩＳＨに用いるた
めの染色体は、前記ＧＩＳＨに用い染色体と同様に調製
したものを用いた。なお、ＦＩＳＨにおけるハイブリダ
イゼーション条件はＧＩＳＨと同様である。

【００７３】その結果、１７クローンは、分散したＦＩ
ＳＨシグナルをいくつか示したが、クローン３０７−５
は、前記ＧＩＳＨパターンと類似するＦＩＳＨパターン
を示した。

【００７４】実施例３ 縦列型反復配列の同定 Ｇｅｎｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ３１０（ＡＢＩ社製）を
用いたＢｉｇＤｙｅ^TMターミネーター反応により、クロ
ーン３０７−５の挿入断片の塩基配列を決定した。結果
を、配列番号：１及び図２に示す。

【００７５】その結果、配列番号：１及び図２に示すよ
うに、挿入断片は、１０８３ｂｐ（配列番号：１）の長
さであり、該挿入断片において、配列全体を７８２ｂｐ
領域部分と３０１ｂｐ領域部分との２つの部分に分ける
１つのＳａｕ３ＡＩ認識部位が、該挿入断片の内部に存
在することがわかった。図２に示すように、３０１ｂｐ
領域部分中において、３塩基のＣＡＡマイクロサテライ
トが１６回まで反復していることがわかった。

【００７６】また、クローン３０７−５プローブを用い
たゲノムサザンハイブリダイゼーションにより、Ｓａｕ
３ＡＩにより消化されたＡｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅ（Ｋ
Ｔ１１５−１）のＤＮＡ全体に約２５０ｂｐの反復単位
を有するラダーパターンを示されたため、挿入断片の配
列全体は反復せず、該挿入断片の配列中におけるより小
さい３０１ｂｐ領域部分が反復を引き起こすことが示唆
された。

【００７７】前記クローン３０７−５を、ＳａｃＩ（配
列番号：１において、１箇所に認識部位が存在）で消化
し、ついで、自己連結した。その後、得られた産物を用
いて、大腸菌ＸＬ−１０ Ｇｏｌｄを形質転換した。得
られたクローンをｐＢｓ３０１という。前記ｐＢｓ３０
１は、前記クローン３０７−５の３' 末端から４００ｂ
ｐまでの部分（配列番号：１の塩基番号：６８０〜１０
８７）を含んでいた。なお、前記ｐＢＳ３０１をプロー
ブとして用いたコムギのＦＩＳＨの結果、３０７−５の
パターンと類似したパターンを示した。

【００７８】前記ｐＢｓ３０１をプローブとして用い、
パンコムギ（ＣＳ；Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｃｕｍ）、デュ
ラムコムギＴ．ｄｕｒｕｍ）及び他の５つの二倍体野生
種〔Ｓ．ｃｅｒｅａｌｅ，Ａｅｓｑｕａｒｒｏｓａ，Ａ
ｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ（ＫＴ１１５−１），Ａｅ．
ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ（ＫＵ５７２７），Ｔ．ｍｏｎｏ
ｃｏｃｃｕｍ〕それぞれのＳａｕ３ＡＩ消化ＤＮＡにつ
いて、サザンブロットハイブリダイゼーションを行なっ
た。すなわち、３μｇの各ゲノムＤＮＡを消化して、得
られた産物を１．２％アガロースゲル電気泳動に供し
た。得られたゲル上のＤＮＡを、ナイロンメンブレン
（Ｈｙｂｏｎｄ^TM Ｎ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写し
た。得られたナイロンメンブランと、ジゴキシゲニン標
識プローブ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｒｏｃｈｅ）と、
ハイブリダイゼーション緩衝液〔商品名：ＤＩＧ Ｅａ
ｓｙ Ｈｙｂ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｒｏｃｈｅ社
製）〕中、３７℃１６時間ハイブリダイズさせた。つい
で、２×ＳＳＣ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（室温、
１５分×２回）、０．１ ×ＳＳＣ＋０．１％ Ｔｗｅ
ｅｎ２０（６８℃、１０分間２回）により、メンブラン
を洗浄した。その後、製造者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｒｏｃｈｅ）の説明書に従って、化学発光シグナルによ
り、ハイブリダイズしたプローブに由来するシグナルを
検出した。

【００７９】その結果、図３のパネルＡに示すように、
Ａｅ．ａｑｕａｒｒｏｓａを除いて、他のすべての種に
おいて、約２５０ｂｐの反復単位を有するラダーパター
ンが検出された。Ｓ．ｃｅｒｅａｌｅにおいて、シグナ
ルは弱いものの、類似したシグナルパターンが検出され
た。Ｔ．ｍｏｎｏｃｏｃｕｍにおいて、２５０ｂｐ単位
の二量体に相当すると考えられる５００ｂｐバンドの強
いシグナルが検出された。なお、図３のパネルＡに示す
ように、２つのＡｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ系統におい
て、スメアパターンが検出されたが、感光時間を短くす
ることにより、明瞭なラダーパターンが検出された。

【００８０】クローンｐＢｓ３０１は、中央部に１６回
反復したＣＡＡマイクロサテライトを含んでいるので、
Ａｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓのサザンブロットハイブリ
ダイゼーション解析において観察されたスメアパターン
は、マイクロサテライトにより生成したと思われる。ま
た、ｐＢｓ３０１のサイズは、マイクロサテライトの反
復（４８ｂｐ）を除くことにより約２５０ｂｐであるた
め、２５０ｂｐのタンデムリピートパターンは、マイク
ロサテライトをもたない配列により引き起こされること
が示唆された。

【００８１】実施例４ コムギ及びその類縁種における
縦列型反復配列の検出 コムギ及びその類縁種〔Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ，Ｔ．ｄ
ｕｒｕｍ，Ａｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ（ＫＴ１１５−
１），Ａｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ（ＫＵ５７２７），
Ｔ．ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ，Ａｅ．ｓｑｕａｒｒｏｓ
ａ，Ｓ．ｃｅｒｅａｌ〕における２５０ｂｐ領域反復を
調べた。

【００８２】ｐＢｓ３０１中の２８８ｂｐ領域（以下、
ｐＢｓ３０１−１という、配列番号：２、図５等）を増
幅しうるプライマー対： ＺＣＦ１〔5'-ctggccttgagaagacgttc-3'（配列番号：
３）〕、及び ＺＣＲ１〔5'-cctcgtaatctcccgcataa-3'（配列番号：
９）〕、 を用いて、コムギ及びその類縁種のＤＮＡを鋳型とし
て、ＰＣＲを行なった。なお、前記ＰＣＲのサーマルプ
ロファイルは、〔９４℃、３０秒間−５９℃、３０秒間
−７２℃、３０秒間〕を１サイクルとする３０サイクル
である。ＰＣＲの結果を図４のパネルＡに示す。

【００８３】図４のパネルＡに示すように、使用された
すべての種において、いくつかの弱いシグナルのバンド
を伴う２５０ｂｐ断片及び／又は３００ｂｐ断片が認め
られた。増幅産物をｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙ ｖｅｃｔ
ｏｒ（プロメガ）にクローン化し、該増幅産物の塩基配
列を決定した。

【００８４】その結果、ＣＳに由来する２つのクローン
（それぞれ、２４５ｂｐ及び２５３ｐ）、並びにＡｅ．
ｓｐｅｌｔｏｉｄｅ（ＫＴ１１５−１）に由来する２つ
のクローン（それぞれ、２５３ｂｐ及び２４７ｐ）は、
わずか２個〜４個のＣＡＡの反復を含むことが示され
た。前記クローンについて、パンコムギにおいて、図１
のパネルＢに示すように、２８個の異なる数個の弱いＦ
ＩＳＨシグナルが検出され、図１のパネルＣに示すよう
に、デュラムコムギではより強い２８個のシグナルが検
出され、図１のパネルＤに示すように、ライムギにおい
て、１４個のシグナルが検出され、これらは、すべてセ
ントロメア領域において現れた。

【００８５】コムギ由来２４５ｂｐクローン（Ｎｏ．
２）を用いて、Ｓａｕ３ＡＩ消化した各種ゲノムＤＮＡ
に対するサザンブロットハイブリダイゼーションを行な
った。

【００８６】その結果、Ｓａｕ３ＡＩ消化のゲノムＤＮ
Ａに対するサザンブロットハイブリダイゼーションで
は、スメアパターンは、認められず、２５０ｂｐの単量
体バンド又は５００ｂｐの二量体バンドのみがパンコム
ギ又はデュラムコムギ、Ａｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓに
おいて生じ、５００ｂｐのバンドがＴ．ｍｏｎｏｃｏｃ
ｕｍにおいて現れた〔図３のパネルＢ〕。単量体のサイ
ズは一定していない（２４５ｂｐ〜２５３ｂｐ）が、配
列は、コムギのＡゲノム染色体及びＢゲノム染色体並び
にライムギのＲゲノム染色体におけるセントロメア領域
内に反復に配置されていた。それとは反対に、イネ、オ
オムギ、アワ（ｍｉｌｌｅｔ）又はエンバクではシグナ
ルは認められなかった〔図３のパネルＢ〕。

【００８７】実施例５ 縦列型反復配列に基づくコムギ
及びその類縁種の系統樹 ３００ｂｐ領域又は２５０ｂｐ領域における多様性を調
べるために、鋳型として種々のゲノムＤＮＡを用いてＰ
ＣＲを行なった。なお、前記ＰＣＲのサーマルプロファ
イルは、〔９４℃、３０秒間−５９℃、３０秒間−７２
℃、３０秒間〕を１サイクルとする３０サイクルであ
る。得られたＰＣＲ産物を、ＳＵＰＲＥＣ ^TM ＰＣＲ
（宝酒造社製）により精製した。得られた精製ＰＣＲ産
物を、ｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙベクター（プロメガ社
製）に連結して、組換えベクターを得た。得られた組換
えベクターにより、大腸菌（ＸＬ−１０−Ｇｏｌｄ）を
形質転換し、配列決定した。プライマーとして、 ＺＣＦ１〔5'-ctggccttgagaagacgttc-3'（配列番号：
３）〕、 ＺＣＦ３〔5'-cgttcgaaacaaagctcgat-3'（配列番号：
４）〕、 ＺＣＦ４〔5'-gattatgcgggagattacgagg-3'（配列番号：
５）〕、 ＺＣＦ５〔5'-aatggctacgagcacgatgt-3'（配列番号：
６）〕、 ＺＣＦ６〔5'-caggtacgggattatgacca-3'（配列番号：
７）〕、 ＺＣＦ７〔5'-tcagcaaatgatgtctgacca-3' （配列番号：
８）〕、 ＺＣＲ１〔5'-cctcgtaatctcccgcataa-3'（配列番号：
９）〕、 ＺＣＲ２〔5'-gaacgtcttctcaaggccag-3'（配列番号：１
０）〕、 ＺＣＲ５〔5'-ttgtcgtggtggttgttgtt-3'（配列番号：１
１）〕、 ＺＣＲ６〔5'-accaccaaacacaagcaaaa-3'（配列番号：１
２）〕、及び ＺＣＲ７〔5'-gatggtcataatcccgtacctg-3'（配列番号：
１３）〕 を用いた。

【００８８】データ処理のためにソフトウエアＳｅｑＥ
ｄ ｖ１．０３（ＡＢＩ社製）とソフトウエアＧＥＮＥ
ＴＹＸ−ＭＡＣ−ＡＴＳＱ−３．１（Ｓｏｆｔｗａｒｅ
Ｄｅｖ．）とを用い、相同性比較のためにソフトウエ
アＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ１０．１（Ｓｏｆｔｗａｒｅ
Ｄｅｖ．）を用いて、全配列データを分析した。全て
の配列をＢＬＡＳＴ２相同性検索ソフトウエアを用いる
ＮＲ−ＮＴの非重複核酸配列データベースと比較した。

【００８９】３００ｂｐ領域及び２５０ｂｐ領域の進化
関係を明らかにするために、パンコムギから単離された
５個のクローン〔Ｎｏ．２（配列番号：１４）、Ｎｏ．
３（配列番号：１５）、Ｎｏ．１４（配列番号：１
６）、Ｎｏ．１５（配列番号：１７）、Ｎｏ．１７（配
列番号：１８）〕、Ａｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅ（ＫＴ１
１５−２）から単離された５個のクローン（ｐＢｓ３０
１−１、ＩＩＩ１０、ＩＩＩ５０、ＩＶ３２、Ｖ４
１）、及びＡｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅ（ＫＵ５７２７）
から単離された６個のクローン（ＩＩ７、ＩＩ８、ＩＩ
１０、ＩＩ２０、ＩＩ２４、ＩＩ３１）を分析して、系
統樹を構築した。

【００９０】２つのＡｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓの２５
０ｂｐ領域はすべて、サイズが異なり（１７３ｂｐ〜２
８５ｂｐ）、ｐＢｓ３０１−１の相同性が異なっていた
（６１．５％〜８３．７％）。

【００９１】５個のコムギクローンのすべて（４個の２
５０ｂｐ領域及び１個の３００ｂｐ領域）をｐＢｓ３０
１−１とともにアラインメントした。結果を図５に示
す。

【００９２】マイクロサテライト反復は、大きな点変異
速度及び変化しやすいコピー数等の遺伝子変化を受けや
すいことがよく知られている [エレグレン(Ellegren,
H) 、Trends Genet., 16, 551-558 (2000)]。図５にお
いて、ｐＢｓ３０１−１のマイクロサテライト反復に対
応する非常に多くの変化が蓄積しているが、それらの隣
接末端において、その配列は比較的保存的であることが
わかる。

【００９３】かかる３００ｂｐ領域及び２５０ｂｐ領域
における主な変異事象は、Ａ／Ｔ−Ｃ／Ｇ間の点変異及
びいくつかの欠失／挿入であった。

【００９４】Ｎｏ．１４は、ｐＢｓ３０１−１とは異な
り、３コピーのＡＡＣ及びｐＢｓ３０１−１の（配列番
号：２）の塩基番号：２５６〜２５８の位置での３ｂｐ
を有することが示された。

【００９５】すべての２５０ｂｐ領域様領域は、大部分
のマイクロサテライトを欠損していた。Ｎｏ．１５は、
ｐＢｓ３０１−１（配列番号：２）の塩基番号：１８４
〜２１８及び２５６〜２５８の位置において３５ｂｐの
ギャップ及び３ｂｐのギャップの両方を有することが示
された。Ｎｏ．２は、ｐＢｓ３０１−１（配列番号：
２）の塩基番号：２３８〜２４６及び２５６〜２５８の
位置において９ｂｐのギャップ及び３ｂｐのギャップを
有することが示された。Ｎｏ．１７は、ｐＢｓ３０１−
１とほぼ同じ隣接配列を有することが示された。Ｎｏ．
３は、ｐＢｓ３０１−１（配列番号：２）の塩基番号：
７１〜７３及び２５６〜２５８の位置において、２つの
３ｂｐのギャップを有することが示された。

【００９６】プライマー対ＺＣＦ７＋ＺＣＲ７を使用し
て、Ａｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ（ＫＴ１１５−１）に
由来する産物をさらに調べた。得られた産物のうち、ク
ローンＺＣＲ７−１及びクローンＺＣ７−１１の２つの
２５０ｂｐ部分をｐＢｓ３０１−１とアラインメントし
た。結果を図６に示す。

【００９７】ｐＢｓ３０１−１に対する異なる種類の欠
失により、２５０ｂｐ領域のすべてがｐＢｓ３０１−１
の１個の原型配列に由来することが示唆される。

【００９８】実施例６ ２５０−３００ｂｐ領域間の介
在配列の解析 ２５０−３００ｂｐ領域間の介在配列配列を増幅し、解
析するため、ＣＳ及びｐＢｓ３０１−１クローンにおけ
る保存配列に基づく３種のＰＣＲプライマー：ＺＣＦ
３、ＺＣＦ４及びＺＣＲ２を組合わせ、Ａｅ．ｓｐｅｌ
ｔｏｉｄｅｓ（ＫＴ１１５−１）、Ａｅ．ｓｑｕａｒｒ
ｏｓａ及びＣＳ由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた
ＰＣＲを行なった。なお、前記ＰＣＲのサーマルプロフ
ァイルは、〔９４℃、３０秒間−５９℃、３０秒間−７
２℃、３０秒間〕を１サイクルとする３０サイクルとし
た。得られたＰＣＲ産物を、ＳＵＰＲＥＣ^TM ＰＣＲ
（宝酒造社製）により精製した。得られた精製ＰＣＲ産
物を、ｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙベクター（プロメガ社
製）に連結して、組換えベクターを得た。得られた組換
えベクターにより、大腸菌（ＸＬ−１０−Ｇｏｌｄ）を
形質転換し、末端を配列決定した。

【００９９】データ処理のためにソフトウエアＳｅｑＥ
ｄ ｖ１．０３（ＡＢＩ社製）とソフトウエアＧＥＮＥ
ＴＹＸ−ＭＡＣ−ＡＴＳＱ−３．１（Ｓｏｆｔｗａｒｅ
Ｄｅｖ．）とを用い、相同性比較のためにソフトウエ
アＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ１０．１（Ｓｏｆｔｗａｒｅ
Ｄｅｖ．）を用いて、全配列データを分析した。全て
の配列をＢＬＡＳＴ２相同性検索ソフトウエアを用いる
ＮＲ−ＮＴの非重複核酸配列データベースと比較した。

【０１００】その結果、１９クローンのうち、１６クロ
ーンは、Ｈ．ｖｕｌｇａｒｅのｃｅｒｅｂａ、Ｔｙ３／
ｇｙｐｓｙ様レトロエレメントの部分 [アクセッション
番号：ＡＹ０４０８３２、ＡＦ０７８８０１、図７Ａ、
フダコワ(Hudakova)ら, Nucleic Acids Res., 29, 5029
-5035, (2001)]との配列ホモロジーを含むことがわかっ
た。プライマーＺＣＦ３とＺＣＲ２との組み合わせで増
幅されたＰＣＲ産物は、ｃｅｒｅｂａ ＤＮＡの２つの
別々の領域： ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子の５’末端の８０ｂｐ領域
（１３９９−１４７９）であり、かつその上流の異なる
長さの非コード領域、 ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子におけるコード領域３４−１
０５ｂｐ長であり、かつその全ては、１９２６位から始
まる領域、 と高いホモロジー（８２％以上）を示した。

【０１０１】この結果は、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子におけ
る２つの相同的な領域の間に異なるギャップがあること
を示す。ギャップ配列（１４７９−１９２６位）と、ｐ
Ｂｓ３０１等の２５０−３００ｂｐ領域との間には、Ｄ
ＮＡ配列レベルでホモロジーが見出されなかったが、ｐ
Ｂｓ３０１の推定アミノ酸配列は、１５３１−１８２４
のギャップ配列のものと約５３％類似性（４１％同一
性）を示した（図７のパネルＢ）。これは、２５０−３
００ｂｐ領域が、Ｈ．ｖｕｌｇａｒｅにおけるｃｅｒｅ
ｂａ様、Ｔｙ３／ｇｙｐｓｙ様レトロエレメントに起因
し、コムギＡゲノム及びＢゲノム染色体並びにライゲノ
ム染色体におけるｃｅｒｅｂａ様レトロエレメントがあ
るが、ギャップ領域（ｃｅｒｅｂａ、アクセッション番
号：ＡＹ０４０８３２における１５３１−１８２４位）
は、本実施例で同定された２５０−３００ｂｐ領域に置
換されたことを示唆する。Ｄゲノムにおいてさえ、同じ
プライマーの組み合わせで類似の配列を増幅できたの
で、少数のこの種のレトロエレメントが存在することが
示唆される。この知見を確認するために、ｃｅｒｅｂａ
配列 (アクセッション番号：ＡＦ０７８８０１）に基づ
き、４５８ｂｐ断片（ｃｅｒｅｂａ、アクセッション番
号：ＡＦ０７８８０１における３２９２−３７４９位）
又は４８５ｂｐ断片（ｃｅｒｅｂａ、アクセッション番
号：ＡＹ０４０８３２における１４６７−１９５１位）
を増幅することが予想される新たなペアのＰＣＲプライ
マーをデザインした。前記プライマーペアは、オオムギ
からｃｅｒｅｂａとほとんど同じ配列を有する予想され
たサイズの断片を増幅し、Ａｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ
（ＫＴ１１５−１）由来の全４つのＰＣＲ産物は、２５
０−３００ｂｐ配列を含んでいた。クローンＺＣ７−１
の配列は、CAA マイクロサテライトのコピー数が５まで
減ったことを除き、ｐＢｓ３０１−１のものと同じであ
った。

【０１０２】コムギ及びＡｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ由
来のＰＣＲ産物において、２５０−３００ｂｐ領域とｃ
ｅｒｅｂａ様配列とのジャンクションにおいて、ｃｅｒ
ｅｂａ又はｐＢｓ３０１−１の配列とはホモロジーを示
さない高度に保存された約４０ｂｐ及び４８ｂｐ配列が
見いだされた（図７のパネルＣ）。ＤＮＡデータベース
において、４０ｂｐ配列又は４８ｂｐ配列の何れに対し
てもホモロジーを有する配列が見出されなかったので、
これらの２つの配列の起源は、不明である。

【０１０３】２５０ｂｐ領域の配列のＤＮＡ配列は、ｃ
ｅｒｅｂａ又は他のレトロトランスポゾン様配列とはホ
モロジーを示さなかったが、前記領域の隣接又は介在配
列は、ｇａｇ遺伝子及びｃｅｒｅｂａにおけるその上流
領域の２つの別々の配列に対して高いホモロジーを示し
た（図７のパネルＡ）。これは、数コピーのｃｅｒｅｂ
ａ様配列が、コムギのＡゲノム及びＢゲノムに存在し、
２５０ｂｐ領域が、ｃｅｒｅｂａ配列にも関連すること
を示唆した。約５３％の類似性が、７つのCAAを有する
２５０ｂｐ由来の推定アミノ酸配列とｇａｇ−ｐｏｌ遺
伝子由来の推定アミノ酸配列との間で得られた（図７の
パネルＢ）。これは、当該領域に対応するＤＮＡ配列
（ｃｅｒｅｂａ、アクセッション番号：ＡＹ０４０８３
２における１４８０−１９２５位のヌクレオチド）が、
オオムギから、コムギ及びライにわたり非常に分岐して
いることを示す。したがって、前記配列及び２５０ｂｐ
配列は、それぞれ、オオムギセントロメア及びコムギセ
ントロメアを同定するためのプローブとして用いられう
る。

【０１０４】図７のパネルＣに示されるように、コムギ
及びＡｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓのｃｅｒｅｂａ様配列
において、数コピーのCAA マイクロサテライトを有する
２５０ｂｐ領域は、タンデムに配列されているが、多コ
ピーのCAA マイクロサテライトを有するものは、そうで
はないように思われる。この知見は、何故、２５０ｂｐ
単位だけが、タンデムに増幅されるのかという疑問を生
じる。縦列型反復配列は、高等真核生物のセントロメア
領域に共通し、数多くの増幅機構が示唆されている。こ
の縦列型反復配列の増幅は、おそらく、セントロメア領
域における多量のｃｅｒｅｂａ様配列により引き起こさ
れたのであろう。２５０−３００ｂｐ領域及びｃｅｒｅ
ｂａ様配列の両方のジャンクションにおいて、高度に保
存された配列 (それぞれ、約４０ｂｐ及び４８ｂｐ、図
７のパネルＣ）が見出された。それらは、ｃｅｒｅｂ
ａ、ｐＢｓ３０１−１及びＤＮＡデータベースにおける
他の配列と高いホモロジーをもたなかったので、その起
源は、不明である。これらは、組換えのホットスポット
として機能を果たすこと等、反復配列をタンデムに増幅
するのに重要な役割を果たすのであろう。組換えは、４
８ｂｐジャンクション配列の末端に局在するマイクロサ
テライト配列(CCA)₂(GCA)(CCA)(CAA)₂(CCA) （図７のパ
ネルＣ、配列番号：２４中の配列）と２５０−３００ｂ
ｐ領域におけるCAA マイクロサテライトとの間で生じる
であろう。

【０１０５】ｃｅｒｅｂａ (アクセッション番号：ＡＹ
０４０８３２）における１４８０−１９２５位のヌクレ
オチド領域と２５０ｂｐ領域との間にＤＮＡ配列ホモロ
ジーが検出されなかったが、それらの間の強制的なアラ
インメントは、ｃｅｒｅｂａ中の塩基配列：CAACCA(CA
A)₂C （アクセッション番号：ＡＹ０４０８３２におけ
る１６３０−１６４２）が、ｐＢｓ３０１−１における
(CAA)₄C で整列化されうることを示す。これは、(CAA)₄
C 配列が、マイクロサテライト配列の原型であることを
示す。オオムギにおけるｃｅｒｅｂａとＡｅ．ｓｐｅｌ
ｔｏｉｄｅｓ及びコムギにおけるｃｅｒｅｂａ様配列の
両方は、同様のレトロトランスポゾンに由来すると思わ
れる。

【０１０６】配列表フリーテキスト 配列番号：３は、合成プライマーの配列である。

【０１０７】配列番号：４は、合成プライマーの配列で
ある。

【０１０８】配列番号：５は、合成プライマーの配列で
ある。

【０１０９】配列番号：６は、合成プライマーの配列で
ある。

【０１１０】配列番号：７は、合成プライマーの配列で
ある。

【０１１１】配列番号：８は、合成プライマーの配列で
ある。

【０１１２】配列番号：９は、合成プライマーの配列で
ある。

【０１１３】配列番号：１０は、合成プライマーの配列
である。

【０１１４】配列番号：１１は、合成プライマーの配列
である。

【０１１５】配列番号：１２は、合成プライマーの配列
である。

【０１１６】配列番号：１３は、合成プライマーの配列
である。

【０１１７】

【発明の効果】本発明の単位核酸及び本発明のポリヌク
レオチドによれば、コムギ及びその類縁種の物理的地図
等のマッピング、コムギの品種判別等におけるマーカ
ー、育種、コムギの進化学的分析等に用いることができ
るという優れた効果を奏する。また、本発明の染色体解
析方法によれば、コムギ及びその類縁種の染色体を解析
することができ、有用品種の育種における評価、セント
ロメア領域遺伝子の探索、特定染色体の有無の検定を可
能にし、機能、構造等を良好に調べることができるとい
う優れた効果を奏する。さらに、本発明のコムギの品種
判別方法によれば、植物体、特に、コムギ及びその類縁
種の品種を判別することができ、かつ、簡便かつ良好に
調べることができるという優れた効果を奏する。

【０１１８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation <120> REPETIVE SEQUENCE LOCALIZED AT CENTROMERE DERIVED FROM WHEAT <130> KJ-14-007 <150> JP 2001-310662 <151> 2001-10-05 <160> 24 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1087 <212> DNA <213> Aegilops speltoides <400> 1 gatcaaaaag agagaagaag ccatctagct aataactatg gacctgtcgt ggaattaaca 60 cgtgagatgt catagtgtga ggacttagtc gtgaggccaa cacatctatg tggtagcttg 120 agaggggttg agcggaatcg agaaacacaa cacaagtacg aggatttatg acagctttgg 180 gccccgggaa acatcatccg gtaatagccc tacatgctgt ttgtggctag gtctcattat 240 catcacgagt gagtcgccgt aaaccggctc tcctctagtt gtgtctagcc ctagagattg 300 tttcttgttg cttgtccctc tttggggagc cctgcccctc cttatataag ttgaaggggc 360 gggttacatg tagagtccat ctcggactaa gacttaaact attttgactt cctttcctgg 420 gcttcttaac gtctgccggt ttaacattgt ttgtcggttt accgtctgtc ttagccatct 480 gtcttgactc tctgtcttaa ctgtccgccg gtttaccatc cgccggttta ccaagtccaa 540 gccggtttac aattccagcc gggtcatacc gcggggtata tccccgacat tagcccccag 600 tttaatttga atttatccat tttaaactcg aagaacagtt tatacatctc cacgggcgtc 660 gcacccatga agtgttggag agctcgcggt ccctccggat tgaattccca caggcggagg 720 gggcgacgtt tgcaaggcag aaggcgtcga atcagcatga cctgcgccac tacaaccaga 780 ttgatcactg gccttgagaa gacgttcgaa acaaagctcg ataacagatt taatgaactg 840 cttgcgcgtc ttccaccacc ggttgcacct gccgcacctc tgcaacaaca acaacaacaa 900 caacaacaac aacaacaaca acaacaacaa tgactacctc cacatcgcga aacaaccctc 960 caccgagcga gccgtgttcc tcttcaacct ggccaaactg ttggtgctgc tgttgataat 1020 tctgtggctc ctgctgctga tggggaggag gatgattatg cgggagatta cgaggatgag 1080 gttgatc 1087 <210> 2 <211> 288 <212> DNA <213> Aegilops speltoides <400> 2 ctggccttga gaagacgttc gaaacaaagc tcgataacag atttaatgaa ctgcttgcgc 60 gtcttccacc accggttgca cctgccgcac ctctgcaaca acaacaacaa caacaacaac 120 aacaacaaca acaacaacaa caatgactac ctccacatcg cgaaacaacc ctccaccgag 180 cgagccgtgt tcctcttcaa cctggccaaa ctgttggtgc tgctgttgat aattctgtgg 240 ctcctgctgc tgatggggag gaggatgatt atgcgggaga ttacgagg 288 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pri mer <400> 3 ctggccttga gaagacgttc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pri mer <400> 4 cgttcgaaac aaagctcgat 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pri mer <400> 5 gattatgcgg gagattacga gg 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pri mer <400> 6 aatggctacg agcacgatgt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pri mer <400> 7 caggtacggg attatgacca 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pri mer <400> 8 tcagcaaatg atgtctgacc a 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pri mer <400> 9 cctcgtaatc tcccgcataa 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pri mer <400> 10 gaacgtcttc tcaaggccag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pri mer <400> 11 ttgtcgtggt ggttgttgtt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pri mer <400> 12 accaccaaac acaagcaaaa 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A sequence for synthesized pri mer <400> 13 gatggtcata atcccgtacc tg 22 <210> 14 <211> 245 <212> DNA <213> Triticum aestivum <400> 14 ctggccttga gaagacgttc gaaacaaagc tcgataacag atttaatgaa ctgcttacgc 60 gtcttccacc atcggctgca cctgccgcac ctctgcaaca actactacta ctactatacc 120 tccagatcgc gaaacagccc tccgccgagc gagccgtgtc cttcttcagc ctggccaaac 180 tgttggtgct gctgttgata gttctgctgc tgatgcggag ggtgattatg cgggagatta 240 cgagg 245 <210> 15 <211> 253 <212> DNA <213> Triticum aestivum <400> 15 ctggccttga gaagacgttc gaaacaaagc tcgataacag atttaatgaa ctgcttgcgc 60 gtcttccacc ggctgcacct gccgcacctc tgtagcaaca acaacaacta ctactacctc 120 ccacgtcgcg aaacagccct ccaccgagcg agccgtgtcc ttcttcagcc tggccaaact 180 gttggtgctg ttgttgatac ttctgtggct cctgctgctg atgtggagga tgattatgcg 240 ggagattacg agg 253 <210> 16 <211> 297 <212> DNA <213> Triticum aestivum <400> 16 ctggccttga gaagacgttc gaaacaaagc tcgataacag atttaatgaa ctgcttgcgc 60 gtctttcacc accggctgca cctgccgcac ctctgcagca gcagcaacaa caacaacaac 120 aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac aaagacgact acctccacgt cgcgaaacag 180 ccatccgtcg agcgagccgt gtccttcttt agcctggcca aactgttggt gctgctgtta 240 atacttttgt ggctcctgct gctgatgcgg aggatgatta tgcgggagat tacgagg 297 <210> 17 <211> 223 <212> DNA <213> Triticum aestivum <400> 17 ctggccttga gaagacgttc gaaacaaagc tcgataacag atgcaatgaa ctgcttgcgc 60 gtcttccacc accggctgca cctgccgcac ctctgcaaca acaacaacaa caacaactac 120 taactccatg ccgcgaaaca gccctccgcc gagcgagctg ctgatgatac ttctgtggct 180 cctgttgctg atgcgaagga tgattatgcg ggagattacg agg 223 <210> 18 <211> 263 <212> DNA <213> Triticum aestivum <400> 18 ctggccttga gaagacgttc gaaacaaagc tcgataacag atttaatgta ttacttgcgc 60 gtcttccacc accggctgca cctgccgcac ctctgcaata acaacaacaa caacaacgac 120 tacctcccac tgtcgggaaa cagccctctg ccgagcgatt cgtgtccctc ttcagcctgg 180 ccaaactgct ggtgctgctg ttgatacttc tgtggctcct gctgctgatg tggaggagta 240 tgattatgcg ggagattacg agg 263 <210> 19 <211> 252 <212> DNA <213> Aegilops speltoides <400> 19 ctggccttaa gaagacgttc gaaacaaagc tcgataacag atttaatgaa ctgcttgcac 60 gtcttccacc accggctgca cctgccgcac ctctgcaaca acaacaacaa caacctccac 120 atcgtgaaac agccctccgc cgagcgagcc atgttcctct tcagcctggc caaactattg 180 gtgctgctgt tgataattct gtggctcctg ctgctgatgg ggaggaggat gattatgtgg 240 gagattacga gg 252 <210> 20 <211> 255 <212> DNA <213> Aegilops speltoides <400> 20 ctggccttga gaagacgttc ggaacaaagc tcgataacag atttaatgaa ctacttgcgc 60 gtcttccacc tccggctgca cctgccgcac ctctgcaaca acaacaacga cgactacctc 120 cacatcgcga aacagccctc cgccaagcga gccgtgttcc tcttcagcct ggccaaacta 180 ttggtgctgc tgttgataat tctgtggctc ctgctgctaa tggggaggag gaggattatg 240 cgggagatta cgagg 255 <210> 21 <211> 90 <212> PRT <213> Aegilops speltoides <400> 21 Ile Thr Gly Leu Glu Lys Thr Phe Glu Thr Lys Leu Asp Asn Arg Phe 1 5 10 15 Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu Pro Pro Pro Val Ala Pro Ala Ala Pro 20 25 30 Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Leu Pro Pro His Arg Glu Thr Thr 35 40 45 Leu His Arg Ala Ser Arg Val Pro Leu Gln Pro Gly Gln Thr Val Gly 50 55 60 Ala Ala Val Asp Asn Ser Val Ala Pro Ala Ala Asp Gly Glu Glu Asp 65 70 75 80 Asp Tyr Ala Gly Asp Tyr Glu Asp Glu Val 85 90 <210> 22 <211> 99 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 22 Leu Asp Gly Met Glu Gln Lys Phe Asp Thr Lys Met Asn Ala Lys Phe 1 5 10 15 Asn Glu Val Leu Ala Arg Leu Pro Pro Pro Ala Ile Ala Ser Val Pro 20 25 30 Leu Gln Pro Gln Gln Arg Arg Arg Pro Gly Arg Val Pro Leu Gly His 35 40 45 Val Gln Pro Phe Ile Gly Leu Asp Pro Pro Thr Val Ala Ala Gly Ala 50 55 60 Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Val Ser Pro 65 70 75 80 Ala Glu Gln His Asp Asp Tyr Asp Asp Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Asp 85 90 95 Ala Glu Gly <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Aegilops speltoides <400> 23 agatgtgctg aacaattttg aagaggcctt ggagaagatc 40 <210> 24 <211> 46 <212> DNA <213> Aegilops speltoides <400> 24 tgatcaaaya gawctacgwg carccaccag caccacaaca accagg 46

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＧＩＳＨ及びＦＩＳＨを行なった結果
を示す。パネルＡは、ビオチン化Ae. speltoidesゲノム
ＤＮＡとジゴキシゲニン標識ｐＳｃ７４とを用いて、８
倍体ライコムギ系統Ｙ４６８３の染色体を解析した結果
を示す。パネルＢは、ジゴキシゲニン標識ＮＯ．２クロ
ーンを用いて、パンコムギの染色体を解析した結果を示
す。パネルＣ及びＤは、ジゴキシゲニン標識ＮＯ．２ク
ローンを用いて、それぞれ、デュラムコムギ（パネル
Ｃ）及びライムギ（パネルＤ）を解析した結果を示す。
パネルＥは、ビオチン化Ｃ５クローンを用いて、パンコ
ムギの染色体を解析した結果を示す。パネルＦは、ｃｅ
ｒｅｂａの３７２８ｂｐ−３９２０ｂｐから増幅したジ
ゴキシゲニン標識ＰＣＲ産物を用いて、パンコムギの染
色体を解析した結果を示す。

【図２】図２は、クローン３０７−５の配列を示す。

【図３】パンコムギ (ＣＳ; Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｃｕ
ｍ）、デュラムコムギ（Ｔ．ｄｕｒｕｍ）及び他の５つ
の二倍体野生種〔Ｓ．ｃｅｒｅａｌｅ，Ａｅ．ｓｑｕａ
ｒｒｏｓａ，Ａｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ（ＫＴ１１５
−１），Ａｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ（ＫＵ５７２
７），Ｔ．ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ〕を、ジゴキシゲニン
標識ｐＢｓ３０１（パネルＡ）又はジゴキシゲニン標識
Ｎｏ．２クローン（パネルＢ）を用いて、サザンブロッ
トハイブリダイゼーションにより解析した結果を示す。

【図４】コムギ及びその類縁種〔Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ
（レーン１）、Ｔ．ｄｕｒｕｍ（レーン２）、Ａｅ．ｓ
ｐｅｌｔｏｉｄｅｓ（ＫＴ１１５−１）（レーン３）、
Ａｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ（ＫＵ５７２７）（レーン
４）、Ｔ．ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ（レーン５）、Ａｅ．
ｓｑｕａｒｒｏｓａ（レーン６）及びＳ．ｃｅｒｅａｌ
ｅ（レーン７）における縦列型反復配列を解析した結果
を示す。パネルＡは、プライマーＺＣＦ１とＺＣＲ１と
の組合せを用いた場合の結果を示し、パネルＢは、プラ
イマーＺＣＲ２とＺＣＲ３との組合せを用いた場合の結
果を示す。

【図５】図５は、５種のパンコムギクローンの配列と、
ｐＢｓ３０１−１の配列とをアライメントした結果を示
す。

【図６】図６は、Ａｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ（ＫＴ１
１５−１）のＤＮＡを鋳型とし、プライマーＺＣＦ７と
ＺＣＲ７とを用いて得られたクローンＺＣＲ７−１及び
クローンＺＣ７−１１の２つの２５０ｂｐ部分をｐＢｓ
３０１−１とアラインメントした結果を示す。

【図７】図７は、２５０−３００ｂｐと、ｃｅｒｅｂ
ａ、Ｈ．ｖｕｌｇａｒｅのＴｙ３／ｇｙｐｓｙ様レトロ
エレメントとの間の関係を示す概略図である。パネルＡ
は、ＬＴＲ（Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａ
ｔ）と、プライマー結合部位と、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子
とを含むｃｅｒｅｂａの部分を示す。番号は、ｃｅｒｅ
ｂａ（アクセッション番号：ＡＹ０４０８３２）のヌク
レオチド位置に対応する。矢印及び矢頭は、ＺＣＦ３プ
ライマーとＺＣＲプライマーとの組み合わせにより増幅
されたＰＣＲ産物との高いホモロジー（８２％以上）を
有する領域を示す。パネルＢは、ｐＢｓ３０１−１から
推定されたアミノ酸配列と、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子の部
分（ＡＹ０４０８３２の１５３１−１８２４位）から推
定されたアミノ酸配列とのアラインメントを示す。パネ
ルＣは、２５０−３００ｂｐ反復配列領域と、該２５０
−３００ｂｐ反復配列領域の上流領域及び顆粒領域に見
出される非相同配列との推定構造を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CB03 4B024 AA07 AA11 CA02 DA06 EA04 HA14 4B063 QA01 QA05 QA12 QQ09 QQ42 QR32 QR56 QR62 QS25 QS34 QS36 QX01 QX02

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）配列番号：２、１４、１５、１
   ６、１７、１８、１９、及び２０からなる群より選ばれ
   た塩基配列からなる核酸、（ｂ）核酸多型を介して、前
   記（ａ）の核酸の塩基配列とは異なる塩基配列からなる
   核酸、（ｃ）前記（ａ）の核酸にストリンジェントな条
   件下にハイブリダイズしうる核酸、（ｄ）前記（ａ）の
   核酸の塩基配列に対して、少なくとも８０％の配列同一
   性を有する塩基配列からなる核酸、及び（ｅ）前記
   （ａ）の核酸の塩基配列において、少なくとも１塩基の
   欠失、置換、挿入又は付加を有する塩基配列からなる核
   酸、からなる群より選ばれた核酸であって、コムギＡゲ
   ノム染色体及びＢゲノム染色体のセントロメアに局在す
   る縦列型反復配列の単位となる単位核酸。
2. 【請求項２】 該（ａ）〜（ｅ）いずれかの核酸の塩基
   配列において、ＣＡＡを１単位としてなるマイクロサテ
   ライト配列が存在してなる、請求項１記載の単位核酸。
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載の単位核酸に特異的
   に結合しうる、請求項１又は２記載の単位核酸を検出す
   るためのポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 （Ａ）請求項１若しくは２記載の単位核
   酸の塩基配列に相補的な塩基配列、又は（Ｂ）請求項１
   若しくは２記載の単位核酸の塩基配列中の塩基配列であ
   って、連続した少なくとも１０ヌクレオチドからなる塩
   基配列若しくはその相補鎖、からなるポリヌクレオチ
   ド。
5. 【請求項５】 配列番号：３〜１３からなる群より選ば
   れた１つの塩基配列からなる、請求項４記載のポリヌク
   レオチド。
6. 【請求項６】 請求項１若しくは２記載の単位核酸又は
   請求項３〜５いずれか１項に記載のポリヌクレオチド
   を、該単位核酸を検出するためのプローブとして用い
   て、被検試料中の該単位核酸を検出することを特徴とす
   る、染色体解析方法。
7. 【請求項７】 請求項３〜５いずれか１項に記載のポリ
   ヌクレオチドの少なくとも２つを、請求項１若しくは２
   記載の単位核酸を増幅するためのプライマー対として用
   いて、被検試料中の該単位核酸を検出することを特徴と
   する、染色体解析方法。
8. 【請求項８】 請求項１若しくは２記載の単位核酸又は
   請求項３〜５いずれか１項に記載のポリヌクレオチド
   を、該単位核酸を検出するためのプローブとして用い
   て、被検試料中の該単位核酸を検出することを特徴とす
   る、コムギの品種判別方法。
9. 【請求項９】 請求項３〜５いずれか１項に記載のポリ
   ヌクレオチドの少なくとも２つを、請求項１若しくは２
   記載の単位核酸を増幅するためのプライマー対として用
   いて、被検試料中の該単位核酸を検出することを特徴と
   する、コムギの品種判別方法。