KR20120123360A - 보통계 밀을 정성적 및 정량적으로 검출하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 식품 원료나 가공 식품 등 각종 피검 시료에 포함되는 밀 중, 보통계 밀을 특이적으로, 또한 고감도로, 정성적 및/또는 정량적으로 검출하는 방법을 제공한다. 식품 원재료나 가공 처리된 식품에 포함되는 보통계 밀과 보통계 밀 이외의 밀, 예를 들면, 듀럼 밀을, 정성적 및/또는 정량적으로 판별하고 검출하는 방법을 제공한다. 이들 PCR법을 이용한 검출 방법에 사용할 수 있는, 프라이머 세트, 핵산 프로브, 및 검출용 키트를 제공한다. 피검 시료에 있어서의 보통계 밀의 존재를 검출하는 방법으로서, 피검 시료로부터 추출한 핵산을 주형(template)으로 하여, 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머와 서열 번호 6으로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머를 사용하여, PCR법을 실시하고, PCR 증폭 산물의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 상기 방법; 피검 시료에 있어서의 보통계 밀의 존재를 검출하는 방법으로서, 피검 시료로부터 추출한 핵산을 주형으로 하여, 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머, 서열 번호 6으로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머, 및 서열 번호 11로 표시되는 염기 서열을 가지는 핵산 프로브를 사용하여, 정량 PCR법을 실시하고, 보통계 밀의 존재를 정성적 및/또는 정량적으로 검출하는 방법.

Description

보통계 밀을 정성적 및 정량적으로 검출하는 방법{METHOD FOR QUALITATIVE AND QUANTITATIVE DETECTION OF COMMON WHEAT}

본 발명은, PCR법을 이용한 보통계 밀의 특이적인 검출법에 관한 것이다. 본 발명은 구체적으로는, 식품 원료나 가공 식품 등 각종 피검 시료에 포함되는 보통계 밀을 특이적으로 정성적 및/또는 정량적으로 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은, 또한 피검 시료에 포함되는 밀이 보통계 밀인지, 또는 보통계 밀 이외의, 예를 들면, 듀럼 밀 등인지의 판별을 행할 수 있고, 나아가서는 이들 두가지가 모두 존재하는 것을 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 검출 방법에서 사용되는 프라이머 세트, 핵산 프로브 및 검출용 키트에 관한 것이다.

식품의 안전?안심의 관점에서, 소비자는 식품의 표시 제도에 높은 관심을 나타내고 있다. 식품에 대한 표시는, 소비자 스스로가 식품의 품질을 판단하고 선택하는데 있어서 없으면 안되는 것으로 되어 있다. 밀은 다양한 가공 공정을 거쳐 각종 제품이 되고, 시장에 유통되고 있다. 그 대표적인 제품의 하나인 마카로니류의 표시는 가공 식품 품질 표시 기준 및 마카로니류 품질 표시 기준에 정해져 있으며, 「듀럼 밀의 세몰리나」, 「듀럼 밀가루」, 「강력 밀의 파리나」또는 「강력 소맥분」을 사용한 원료 소맥분이 많은 것부터 순서대로 표시하게 되어 있다. 제조 과정에 있어서의 추적 조사를 제외하면, 이들 밀 가공 식품에 포함되는 보통계 밀과 듀럼 밀을 정성적 및/또는 정량적으로 판별 가능한 기술은 존재하지 않아, 그 기술의 개발이 요구되고 있다.

지금까지 다양한 기술을 구사하여 밀을 특이적으로 또한 고감도로 검출하기 위한 방법이 고안되어 왔다. 이들 방법은, 기본적으로 피검 시료 중에 포함되는 밀 유래의 단백질 내지는 DNA를 검출 대상으로 하고 있는 방법으로 분류된다.

단백질을 검출하는 방법으로서는, 전기 영동법, 웨스턴블로팅법, 면역화학적 방법, 또는 이들을 조합한 방법 등을 들 수 있다. 특히 ELISA법은, 주변 기기나 시약류가 잘 갖추어져 있으므로, 시장에 널리 받아들여지고 있다.

그러나, 보통계 밀과 듀럼 밀의 종의 기원은 공통성이 극히 높으며, 이들 개체를 형성하는 여러 성분도 유사하다. 단백질도 예외가 아니며, 단백질의 구성 비가 상이할 뿐이며, 각각의 밀에 포함되는 단백질의 종류에는 차이가 거의 없다. 그러므로, 단백질 레벨에 의해 보통계 밀과 듀럼 밀을 판별하는 것은 곤란하다.

한편, 유전자 증폭 기술의 하나인 PCR법을 사용하여 밀을 특이적으로 검출하기 위한 기술도 몇 가지 고안되어 왔다. 그러나, 밀의 DNA나 유전자의 해석이 반드시 충분한 것은 아니므로, 최적 검사 방법의 개발에는 어려움을 겪고 있다.

비특허 문헌 1에서는, 밀 D 게놈에 코딩되어 있는 Wx-D1 유전자를 표적으로 하여 PCR을 이용한 밀 검출법이 보고되었다. 이 검사법은, 극히 높은 특이성으로 보통계 밀을 검출하는 것이 가능하며, 식물체?곡물 껍질?밀가루 등의 밀 가공품의 검사에는 최적인 방법이다. 상기 검사법으로는, D 게놈을 가지고 있지 않은 듀럼 밀은 검출되지 않는다.

한편, 특허 문헌 1에서는, 밀 A, B, D 게놈에 코딩되어 있는 전분 합성 효소 II(Starch Synthase II, 약칭: SSII) 유전자를 표적으로 하여 PCR을 이용한 정성적 및/또는 정량적으로 밀을 검출하는 방법에 대하여 개시되어 있다. 이 검출법에 의하면, SSII-A, B, D의 공통 영역을 표적으로 하여 특이적으로, 또한 고감도로 밀을 검출할 수 있다. 특허 문헌 1에서 SSII-D를 특이적으로 판별하는 프라이머 세트가 개시되었지만, 반드시 특이성이 보장되는 것이 아니며, 또한 정량적 측정에는 부적합했다. 비특허 문헌 2에서는, 가열 등의 중?고도 가공 과정에 있어서 원료의 게놈이 물리적으로 절단되는 경우가 보고되었다. 밀 게놈의 PCR 증폭 표적 영역이 길면 가공 공정에 의해 그 내부가 절단되므로 정량적 PCR에 의한 측정값이 실제 밀의 함유량을 반영하지 못할 가능성이 있다. 그러므로, 중?고도 가공에 의해 밀 게놈이 단편화되었다고 해도, PCR 표적 영역이 단편화될 가능성이 낮아지도록 하는 연구가 필요하다.

따라서, 식품 원재료나 가공 처리된 식품에 포함되는 보통계 밀을 높은 특이성으로, 또한 고감도로 검출하는 방법이 요구되고 있다. 또한, 식품 원재료나 가공 처리된 식품에 포함되는 보통계 밀과 보통계 밀 이외의, 예를 들면, 듀럼 밀을 정성적 및/또는 정량적으로 판별하여 검출하는 적절한 방법이 아직 존재하지 않으며, 그 검출 방법의 개발이 요구되고 있다.

일본 특허출원 공개번호 2009-5588호 공보

Iida M et al., Development of taxon-specific sequences of common wheat for the detection of genetically modified wheat. J Agric Food Chem. 2005 Aug 10; 53(16): 6294-300. Yoshimura T et al., Comparative studies of the quantification of genetically modified organisms in foods processed from maize and soy using trial producing. J Agric Food Chem. 2005 Mar 23; 53(6): 2060-9.

본 발명의 목적은, 식품 원료나 가공 식품 등 각종 피검 시료에 포함되는 밀 중, 보통계 밀을 특이적으로, 또한 고감도로, 정성적 및/또는 정량적으로 검출하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 또한, 식품 원재료나 가공 처리된 식품에 포함되는 보통계 밀과 보통계 밀 이외의 밀, 예를 들면, 듀럼 밀을, 정성적 및/또는 정량적으로 판별하고 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, PCR법을 이용한 상기 검출 방법에서 사용할 수 있는, 프라이머 세트, 핵산 프로브, 및 검출용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 달성하기 위해 연구를 거듭한 결과, 밀의 D 게놈 상에 코딩되어 있는 SSII(Starch Synthase II-D, 약칭: SSII-D)에서 특이적인 염기 서열을 발견하고, 이 염기 서열을 기반으로 하여 프라이머 세트를 설계하고, 이것을 사용하여 PCR법을 행함으로써, 피검 시료 중에 포함되는 밀 중 보통계 밀을 특이적으로, 또한 고감도로 검출할 수 있는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 또한, 정량 PCR법을 실시하는데 있어서 유용한 핵산 프로브를 발견하고자, SSII-D 유전자 에서, 상기 프라이머 세트의 영역의 염기 서열 중에서, 특정한 핵산 프로브를 설계했다.

본 발명자들은 또한, 상기 보통계 밀을 검출하는 방법과, 밀의 A, B, D 게놈 상에 코딩되어 있는 SSII의 공통 영역을 특이적으로, 또한 고감도로 검출하여, 밀을 광범위하게 검출하는 방법을 조합하여, 이들 방법으로부터 얻어지는 결과를 상대 비교 및/또는 절대 비교함으로써, 피검 시료 중에 포함되는 보통계 밀과 보통계 밀 이외의, 예를 들면, 듀럼 밀을 판별할 수 있는 것을 발견하였다.

밀의 게놈은 A, B, D의 3종류의 게놈으로 구성되어 있고, 각각 7개의 염색체를 가지고 있다. 보통계 밀은 AABBDD의 6배체이며, 듀럼 밀은 AABB의 4배체이다. 지금까지 수 많은 밀 유전자가 동정(同定)되어 왔으며, 이들 유전자의 배좌(conformation)에 관한 정보도 축적되어 있지만, 이들은 반드시 충분한 것은 아니다.

본 발명에서는, 그 중에서도 특히 A, B, D의 각 게놈에 있어서의 배좌가 결정되어 있는 Starch Synthase II(약칭 SSII-A, SSII-B, SSII-D)에 주목하였다. 이들 SSII는 밀 A, B, D 게놈 각각의 7번 염색체의 단완(short arm)에 코딩되어 있는 것으로 보고되어 있다(Shimbata T et al., Mutations in wheat starch synthase II genes and PCR-based selection of a SGP-1 null line. Theor Appl Genet. 2005 Oct; 111(6): 1072-9).

A, B 및 D의 각 게놈에 코딩되어 있는 SSII의 염기 서열 간에는 미묘한 차이가 존재하며, 프라이머 세트의 설계에 따라서는 SSII-A, B, D 각각을 특이적으로 판별하는 것도 가능하다. 이들 정보를 총괄하여, SSII-A, SSII-B, SSII-D 사이에 미묘한 차를 보이는 특징적인 염기 서열을 발견함으로써, D 게놈을 가지는 보통계 밀군을 특이적으로 검출할 수 있다는 결론을 도출하였다.

즉, 보통계 밀을 구성하는 D 게놈에 코딩되어 있는 SSII-D에 있어서 특징적인 염기 서열이면서, 또한 D 게놈을 가지고 있지 않은 듀럼 밀이나 다른 식물에 교차하지 않는 염기 서열을 선발하고, 상기 염기 서열에 상보적으로 하이브리드화하는 프라이머 세트 및 핵산 프로브를 설계하고, 이들을 사용한 PCR법을 실시하여, 피검 시료 중에 포함되는 보통계 밀을 검출할 수 있게 되었다. 또한, 이 PCR법의 실시와 함께, 동일한 시료에 대하여, 앞서 개발된 방법, 즉 SSII-A, B, D 공통 영역을 표적으로 한 PCR법을 실시하고, 양 PCR법에 의한 PCR 증폭 산물의 발현을 상대 비교 및/또는 절대 비교함으로써, 피검 시료 중에 포함되는 밀 중 보통계 밀과 보통계 밀 이외의 밀, 예를 들면, 듀럼 밀 등을, 정성적 및/또는 정량적으로 판별할 수 있게 되었다.

따라서, 본 발명은, 피검 시료에 있어서의 보통계 밀의 존재를 검출하는 방법으로서, 피검 시료로부터 추출한 핵산을 주형(template)으로 하여, 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머와 서열 번호 6으로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머를 사용하여, PCR법을 실시하고, PCR 증폭 산물의 존재를 검출하는 것을 포함하는 방법이다. 여기서, PCR 증폭 산물의 존재는, 예를 들면, 전기 영동법 등의 공지의 수단에 의해 확인할 수 있고, PCR 증폭 산물이 인정되면 보통계 밀의 존재가 긍정된다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트와 소정의 핵산 프로브를 사용하여 정량 PCR법을 실시하여, 보통계 밀의 존재를 정성적 및/또는 정량적으로 검출하는 방법에도 적용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 피검 시료에 있어서의 보통계 밀의 존재를 검출하는 방법으로서, 피검 시료로부터 추출한 핵산을 주형으로 하여, 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머, 서열 번호 6으로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머, 및 서열 번호 11로 표시되는 염기 서열을 가지는 핵산 프로브를 사용하여, 정량 PCR법을 실시하고, 보통계 밀의 존재를 정성적 및/또는 정량적으로 검출하는 방법이다. 본 발명의 이 방법의 실시형태에 있어서, 서열 번호 11로 표시되는 염기 서열을 가지는 핵산 프로브는 구체적으로는 표지(labeled) 핵산 프로브로서, PCR 중에, 상기 표지 핵산 프로브에 의해 발생되는 증폭 산물량에 따른 시그널을 모니터링하여 증폭 곡선을 얻어서, 보통계 밀의 존재를 정성적 및/또는 정량적으로 검출할 수 있다.

상기 방법의 실시형태에 있어서, 단계적으로 희석한 표준 시료로 정량 PCR법을 사전에 실시하여, 증폭 곡선을 얻어서 적절한 임계값(threshold)을 설정함으로써 Ct값(Threshold Cycle)을 산출하고, 초기 주형량의 함수로서 검량선을 작성해 둠으로써, 이 검량선을 사용하여, 피검 시료에 있어서의 초기 주형량을 구할 수 있다. 따라서, 또 다른 실시형태로서 상기 정량 PCR법의 실시에 있어서, 사전에 작성한 검량선을 사용하여, 보통계 밀의 존재를 정량적으로 검출할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머와 서열 번호 6으로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 및 서열 번호 11로 표시되는 염기 서열을 가지는 핵산 프로브, 및 서열 번호 11로 표시되는 염기 서열을 가지고, 그 5' 말단이 형광 물질로 수식(modification)되고 및 그 3' 말단이 켄처(quencher) 물질로 수식되어 있는, 핵산 프로브에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 피검 시료에 있어서의 보통계 밀 및/또는 보통계 밀 이외의 밀의 존재를 검출하는 방법으로서,

(1) 피검 시료로부터 핵산을 추출하여 핵산 시료를 조제하고,

(a) 상기 핵산 시료를 사용하여, 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머, 서열 번호 6으로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머, 및 서열 번호 11로 표시되는 염기 서열을 가지는 핵산 프로브를 사용하여, 정량 PCR법을 실시하고, 상기 핵산 프로브에 의해 발생되는 증폭 산물량에 따른 시그널을 모니터링하여 증폭 곡선을 얻어, 보통계 밀의 존재를 검출하고, 및

(b) 상기 핵산 시료를 사용하여, 서열 번호 9로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머, 서열 번호 10으로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머, 및 서열 번호 13으로 표시되는 염기 서열을 가지는 핵산 프로브를 사용하여, 정량 PCR법을 실시하고, 상기 핵산 프로브에 의해 발생되는 증폭 산물량에 따른 시그널을 모니터링하여 증폭 곡선을 얻어, 밀의 존재를 검출하고, 및

(2) (a)와 (b)의 결과를 비교하는 것

을 포함하는, 방법이다.

상기 방법의 실시형태에 있어서, 단계적으로 희석한 표준 시료로 정량 PCR법을 사전에 실시하여, 증폭 곡선을 얻어 적절한 임계값을 설정함으로써 Ct값을 산출하고, 초기 주형량의 함수로서 검량선을 작성해 둠으로써, 이 검량선을 사용하여, 피검 시료에 있어서의 초기 주형량을 구할 수 있다.

따라서, 상기 방법의 실시형태에 있어서, (1) (a)에 있어서, 핵산 프로브에 의해 발생되는 증폭 산물량에 따른 시그널을 모니터링하여 증폭 곡선을 얻고, 사전에 작성한 검량선을 사용하여, 보통계 밀의 존재를 정량적으로 검출하고, 및 (b)에 있어서 핵산 프로브에 의해 발생되는 증폭 산물량에 따른 시그널을 모니터링하여 증폭 곡선을 얻어, 사전에 작성한 검량선을 사용하여, 밀의 존재를 정량적으로 검출하고, 및 (2) (a)에 있어서의 정량값과 (b)에 있어서의 정량값을 비교할 수 있다.

전술한 방법에 있어서, 예를 들면 (a)에 있어서 보통계 밀의 존재가 검출되고, 그 정량값과 (b)에 있어서의 밀의 정량값을 비교하여, (a)의 정량값＜(b)의 정량값이면, 그 차이가 피검 시료 중에 있어서의 보통계 밀 이외의 밀로부터 유래하는 것으로 추측된다. 또한, 예를 들면 (a)에 있어서 PCR 증폭 산물이 검출되지 않고, 한편 (b)에 있어서 PCR 증폭 산물이 검출되면, 피검 시료 중에 보통계 밀이 아닌, 보통계 밀 이외의 밀, 예를 들면, 듀럼 밀의 존재가 긍정된다.

상기 보통계 밀 및/또는 보통계 밀 이외의 밀의 존재를 검출하는 방법의 실시에 있어서, 서열 번호 11로 표시되는 염기 서열을 가지는 핵산 프로브 및 서열 번호 13으로 표시되는 염기 서열을 가지는 핵산 프로브는 구체적으로는, 각각, 표지 핵산 프로브일 수 있다. 또한, 서열 번호 11로 표시되는 염기 서열을 가지는 핵산 프로브는 구체적으로는, 그 5' 말단이 형광 물질로 수식되고 및 그 3' 말단이 켄처 물질로 수식되어 있는 핵산 프로브일 수 있고, 및 서열 번호 13으로 표시되는 염기 서열을 가지는 핵산 프로브는 구체적으로는 그 5' 말단이 형광 물질로 수식되고 및 그 3' 말단이 켄처 물질로 수식되어 있는 핵산 프로브일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 검출 방법을 실시하기 위한 하기 키트에 관한 것이다.

(i) 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머와 서열 번호 6으로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머의 프라이머 세트를 포함하는, 보통계 밀 검출용 키트,

(ii) 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머와 서열 번호 6으로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머의 프라이머 세트, 및 서열 번호 11로 표시되는 염기 서열을 가지고, 그 5' 말단이 형광 물질로 수식되고 및 그 3' 말단이 켄처 물질로 수식되어 있는 핵산 프로브를 포함하는, 보통계 밀 검출용 키트, 및

(iii) 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머와 서열 번호 6으로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머의 프라이머 세트, 서열 번호 11로 표시되는 염기 서열을 가지고, 그 5' 말단이 형광 물질로 수식되고 및 그 3' 말단이 켄처 물질로 수식되어 있는 핵산 프로브, 서열 번호 9로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머와 서열 번호 10으로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머의 프라이머 세트, 및 서열 번호 13으로 표시되는 염기 서열을 가지고, 그 5' 말단이 형광 물질로 수식되고 및 그 3' 말단이 켄처 물질로 수식되어 있는 핵산 프로브를 포함하는, 보통계 밀 검출용 키트.

본 발명의 보통계 밀의 검출 방법에 따라 피검 시료에 있어서의 보통계 밀의 존재를 높은 특이성으로 또한, 고감도로, 정성적 및/또는 정량적으로 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 따라 피검 시료에 포함되는 밀이 보통계 밀인지, 또는 보통계 밀 이외의, 예를 들면, 듀럼 밀인지, 또는 이들 둘 다인지의 판별을 높은 정밀도로 행할 수 있다. 나아가서는, 본 발명의 방법에 의하면, 피검 시료에 포함되는 보통계 밀 및/또는 보통계 밀 이외의 밀, 예를 들면, 듀럼 밀을 정량적으로 검출할 수 있다.

본 발명의 방법은, 피검 시료, 예를 들면, 가공 식품 중에 존재하는 밀의 판별 수단으로서 유용하고, 상기 밀이 보통계 밀인지, 또는 보통계 밀 이외의 밀(그 대표예로서의 듀럼 밀)인지의 판별 및 검출 수단으로서 유용하다. 본 발명의 프라이머 세트, 핵산 프로브, 또는 이들을 포함하는 키트를 사용하여, 본 발명의 방법을 간편하고 신속하게, 그리고 높은 정밀도로 실시할 수 있다.

도 1은 PCR에 의한 보통계 밀의 검출 한계를 나타내는 사진이다.
도 2는 정량 PCR에 있어서의 보통계 밀 검출용 프라이머 세트 3(SSII-D1769U/1889L: 서열 번호 5/6) 및 SSII-D1797T 핵산 프로브(서열 번호 11)의 평가(임계 라인에 도달하는 PCR의 사이클수와 주형 DNA의 로그와의 관계)를 나타낸 도면이다.
도 3은 정량 PCR에 의한 보통계 밀 검출용 프라이머 세트 3(SSII-D1769U/1889L: 서열 번호 5/6) 및 SSII-D1797T 핵산 프로브(서열 번호 11)의 평가(보통계 밀에 대한 프라이머 세트와 핵산 프로브의 특이성)를 나타낸 도면이다.
도 4는 혼합율을 변경한 보통계 밀의 게놈 DNA와 듀럼 밀의 게놈 DNA의 혼합액으로부터, 밀 검출용 프라이머 세트 5(SSII-A3118U/3231L: 서열 번호 9/10) 및 SSII-A ex7-T82 핵산 프로브(서열 번호 13)를 사용하여 정량 PCR을 행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 혼합 질량을 변경한 보통계 밀의 분체(分體)와 듀럼 밀의 분체로부터 게놈 DNA를 추출하고, 이들을 주형 DNA로 하고, 밀 검출용 프라이머 세트 5(SSII-A3118U/3231L: 서열 번호 9/10) 및 SSII-A ex7-T82 핵산 프로브(서열 번호 13)를 사용하여 정량 PCR을 행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 혼합율을 적절하게 변경한 보통계 밀의 게놈 DNA와 듀럼 밀의 게놈 DNA의 혼합액으로부터, 보통계 밀 검출용 프라이머 세트 3(SSII-D1769U/1889L: 서열 번호 5/6) 및 SSII-D1797T 핵산 프로브(서열 번호 11)를 사용하여 정량 PCR을 행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 혼합 질량을 적절하게 변경한 보통계 밀의 분체와 듀럼 밀의 분체로부터 게놈 DNA를 추출하고, 이들을 주형 DNA로 하고, 보통계 밀 검출용 프라이머 세트 3(SSII-D1769U/1889L: 서열 번호 5/6) 및 SSII-D1797T 핵산 프로브(서열 번호 11)를 사용하여 정량 PCR을 행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 도 6의 결과로부터, 보통계 밀의 혼합 비율과 임계 라인에 도달하는 PCR의 사이클수의 관계를 나타낸 도면이다.
도 9는 도 7의 결과로부터, 보통계 밀의 혼합 비율과 임계 라인에 도달하는 PCR의 사이클수의 관계를 나타낸 도면이다.

본 발명에 있어서의 밀이란, 게놈 구성이 AABBDD의 6배체인 보통계 밀, 및 AABB의 4배체인 2립계 밀(two-grain wheats)(주로 듀럼 밀)을 포함하는 식용 밀로서 재배되고 있는 전반적인 밀을 말한다. 보통계 밀은, 일반적으로 범용되고 있는 보통 밀이나 클럽 밀, 스펠트 밀 등으로 분류된다. 또한, 2립계 밀은 듀럼 밀 외에, 엠머 밀 등으로 분류된다.

본 발명은, 식품 원료나 가공 식품 등 각종 피검 시료에 포함되는 보통계 밀과 듀럼 밀 등의 2립계 밀의 판별에 유용하다.

본 발명에 사용되는 피검 시료, 피검 시료로부터의 핵산(예를 들면, DNA)의 추출, 핵산 시료의 조제, 검출 대상 염기 서열, 프라이머 세트, 핵산 프로브, PCR 반응 조건 및 정량 PCR법에 대하여, 이하에서 상세하게 설명한다.

피검 시료는, 피검 시료 유래의 게놈 DNA 또는 그 단편 등의 핵산을 추출할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 식물체, 원재료, 가공 과정 중에 있는 재료, 가공 식품 등을 사용할 수 있다.

예를 들면, 살아있는 종자 내지는 건조 종자, 박력분(薄力粉) 등의 분말, 오트밀 등의 중간 가공품, 과자류나 면류 등의 가열 조리된 식품 등이 있다. 또한, 이들 피검 시료는, 필요에 따라 분쇄 등을 행하여, 핵산 추출에 적합한 형상으로 가공하여 사용할 수 있다.

피검 시료에 포함되는 밀의 함유량은 특별히 지정하지 않지만, 본 발명에서는, 피검 시료로부터 핵산을 추출하고, 조제된 검체 핵산 용액 중에 밀 유래 핵산이 적어도 10 ppm, 바람직하게는 50 ppm 이상 포함되어 있으면, 피검 시료 중에 존재하는 밀의 유무를 판정할 수 있고, 또한 밀의 존재를 정량적으로 측정할 수 있다.

또한, 단백질 등의 생체를 구성하는 화합물과 비교하여, 핵산은 가열이나 가압 등의 물리적 가공에 대하여 비교적 안정적이며, 이와 같은 가공에 제공된 가공품 중에 미량이라도 핵산이 존재하고 있으면 충분히 검출할 수 있다.

이러한 사실은, 생산자가 의도하지 않은 각종 식품으로의 밀의 혼입을 검출하기 위한 기초 데이터를 얻는 것이 가능하다는 것을 의미한다.

피검 시료 유래의 핵산은, 피검 시료에 포함되는 식물체의 게놈 DNA인 것이 바람직하다. 피검 시료로부터의 핵산의 추출 방법은 특별히 제한되지 않으며, PCR법에 제공하기에 충분한 품질이 보증되는 방법이면 어떠한 방법 또는 키트라도 사용할 수 있다. 예를 들면, CTAB법이나 QIAGEN Plant mini Kit(QIAGEN GmbH사 제조) 등의 시판 키트를 사용할 수 있다.

또한, 필요에 따라 이들 방법을 수정할 수도 있다. 이들 방법에 의해 추출한 핵산은, PCR법의 주형으로서 사용하기에 적합한 상태로 유지하는 것이 바람직하고, 예를 들면, 적절한 완충액에 용해시켜 저온 하에서 보관하는 것이 바람직하다. 이와 같이 하여, 핵산 시료가 되는 핵산 용액, 예를 들면, 주형 DNA 용액을 조제할 수 있다.

얻어진 핵산의 농도와 순도는, 분광 광도계를 사용하여 230, 260, 280, 320 nm의 흡광도를 측정함으로써 검정할 수 있다. PCR법을 행하는 데 있어서, 260/230 nm의 흡광도 비가 2.0 이상, 260/280 nm의 흡광도 비가 1.8 부근으로 평가된 핵산 용액을 사용하는 것이 바람직하다.

이 때, 260/280 nm의 비가 2.0에 근접함에 따라 RNA의 혼입이 의심되므로, DNA 농도를 검정할 때는 주의할 필요가 있다.

또한, 추출한 DNA를 평가하기 위하여, 아가로스겔 전기 영동 및 피검 시료를 구성하는 식물체의 종 특이적 유전자에 상보적인 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응이 진행되는 것을 확인할 수도 있다.

DNA 염기 서열 결정 방법의 개량과 함께 다수의 유전자가 동정되고, 현재까지 NCBI(National Center of Biotechnology Information; National Institutes of Health)나 DDBJ(DNA Data Bank of Japan, 일본 국립 유전학 연구소) 등의 기관에 의해 방대한 염기 서열의 데이터베이스가 일반에 공개되고 있다. 검출 대상으로 하는 밀 DNA 염기 서열은, 이들 데이터베이스를 활용해도 되고, 스스로 실험적으로 해석?취득한 염기 서열을 사용해도 된다. 일반적으로, 밀을 포함하는 식물체의 DNA는, 게놈 DNA, 엽록체 DNA, 미토콘드리아 DNA로 구성되어 있다. 세포 내의 게놈 DNA는 핵에 1세트만 존재하지만, 이에 대한 엽록체 DNA와 미토콘드리아 DNA의 수는 세포 내에 존재하는 각 세포 소기관(organelle)의 수량에 의존하므로, 조직이나 세포에 따라 상이하다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 밀의 D 게놈 DNA에 특이적이며, 밀의 D 게놈 DNA에 있어서 카피수(copy number)가 특정되어 있는 DNA 염기 서열을 검출 대상으로 하여 선발할 필요가 있다. 선발된 염기 서열을 기본 정보로 하여, PCR법을 기반으로 한 검출 방법에 적합한 프라이머 세트 및 핵산 프로브를 설계할 수 있다.

또한, 프라이머 세트의 설계에는 다양한 조건이 부과된다. 즉, 프라이머 세트는, 증폭 대상이 되는 DNA 염기 서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 한 어떤 것이라도 상관없지만, 피검 시료가 가공 식품인 경우에는 가공 공정에 있어서 피검 시료 중의 게놈 DNA 등이 단편화되는 경우가 있으므로, PCR 증폭 산물이 80?500 bp 더욱 바람직하게는 80?150 bp 정도가 되도록 설계되는 것이 바람직하다. 그리고, 적절한 PCR 증폭 산물을 얻기 위하여, 프라이머 세트 및 정량 PCR법에 사용되는 핵산 프로브의 염기 서열의 다양한 제약을 만족시킬 필요가 있다. 정량 PCR법에 사용되는 핵산 프로브는, 대응하는 프라이머 세트의 Tm값보다 10℃ 정도 높고, 또한 켄칭 효과를 유지하기 위해 18?25 염기 정도의 길이가 되도록 설계되는 것이 바람직하다.

전술한 접근법을 고려하여, 본 발명자들은 특정 염기 서열을 발견하였다. 여기서, 서열 번호 5의 염기 서열은, 밀 SSII-D 유전자의 위치 1769?1791에 존재하는 서열이며, 서열 번호 6의 염기 서열은, 밀 SSII-D 유전자의 위치 1889?1865에 상보적인 서열이며, 이들이 프라이머 세트가 된다.

또한, 서열 번호 11의 염기 서열은, 밀 SSII-D 유전자의 위치 1797?1819에 존재하는 서열이다. 또한, 서열 번호 9의 염기 서열은, 밀 SSII-A 유전자의 위치 3118?3136에 존재하는 서열이며, 서열 번호 10의 염기 서열은, 밀 SSII-A 유전자의 위치 3231?3211에 상보적인 서열로서, 이들은 프라이머 세트가 된다. 또한, 서열 번호 13의 염기 서열은, 밀 SSII-A 유전자의 위치 3161?3185에 존재하는 서열이다.

이상과 같이 하여 설계된 프라이머 세트를 사용하고, 혹은 핵산 프로브도 사용하여, 피검 시료로부터 추출한 핵산을 주형으로 하여 PCR법, 또는 정량 PCR법을 실시할 수 있다.

PCR법 또는 정량 PCR법의 실시에는, 일반적으로 시판되고 있는 기기를 사용하여, 공지된 각종 방법 및 이들의 개량법을 사용할 수 있다. PCR법 및 정량 PCR법을 실시할 때의 구체적인 방법은, 특별히 한정되는 것은 아니다.

본 발명은, 피검 시료에 있어서의 보통계 밀의 존재를 검출하는 방법으로서, 피검 시료로부터 추출한 핵산을 주형으로 하여, 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머와 서열 번호 6으로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머를 사용하여, PCR법을 실시하고, PCR 증폭 산물의 존재를 검출하는 것을 포함하는 방법에 적합하게 사용될 수 있다.

PCR법을 실시할 때, 프라이머 세트, 주형이 되는 핵산, Tris-HCl 등의 적절한 완충액, dNTP, 염화 칼륨, 염화 마그네슘, 내열성 DNA 합성 효소 등의 시약류를 각각 적절한 양을 혼합하여, PCR 반응액으로 만들 수 있다.

PCR 반응은, 주형 DNA의 열변성, 프라이머 세트와 주형 DNA와의 어닐링, 내열성 DNA 합성 효소에 의한 DNA의 합성 반응의 3개의 스텝으로 구성된다. 각 스텝은, 각각 상이한 온도와 시간을 필요로 하므로, 증폭하고자 하는 영역의 염기 서열과 그 길이를 고려하여 적절한 범위를 설정한다. PCR 반응 공정의 구체적인 조건은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 95℃에서 10분간 유지하고, 이후 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분을 1 사이클로 하여 35?40 사이클을 반복하고, 사이클 종료 후에 72℃에서 7분 유지하고, 그 후 4℃로 유지함으로써 행할 수 있다.

이와 같은 반응은, 일반적으로 시판되고 있는 장치를 사용하여 행할 수 있고, 그 중에는 정량 PCR법에 대응하는 장치도 포함된다.

본 발명에 있어서의 PCR법에 의한 증폭 산물의 검출은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 일반적으로 전기 영동법 또는 형광 검출법에 의해 행해진다. 예를 들면, 필요에 따라 네가티브 컨트롤이나 포지티브 컨트롤, 마커와 함께 피검 시료의 PCR 증폭 산물을 아가로스 전기 영동에 제공하고, 영동 후 브롬화 에티듐 등의 인터컬레이터로 염색하고, 자외선광 조사 하에서 검출된다.

이 때, PCR 증폭 산물인 밴드가 관찰되면, 피검 시료 중에 보통계 밀이 존재하는 것을 의미한다.

본 발명은 또한, 피검 시료에 있어서의 보통계 밀의 존재를 검출하는 방법으로서, 피검 시료로부터 추출한 핵산을 주형으로 하여, 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머, 서열 번호 6으로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머, 및 서열 번호 11로 표시되는 염기 서열을 가지는 핵산 프로브를 사용하여, 정량 PCR법을 실시하여, 보통계 밀의 존재를 정성적 및/또는 정량적으로 검출하는 방법에 사용하기에 적합하다.

정량 PCR법은 일반적으로, PCR 증폭 반응 개시 시점에 있어서의 반응액 중의 주형 핵산량, 예를 들면, 주형 DNA량을 정량하기 위한 일련의 반응을 실시하는 방법을 지칭한다. 정량 PCR법으로서 구체적으로 실시간 PCR법을 채용할 수 있다. 정량 PCR법에는 인터컬레이터를 사용하는 방법과, 형광 표지 프로브를 사용하는 방법이 있으며, 형광 표지 프로브를 사용하는 방법에서는, 상기 프로브가 PCR 증폭 반응에 의해 생긴 증폭 산물의 분자 수에 대응한 시그널 변화를 가져온다.

본 발명에서는, 형광 표지 프로브를 사용하는 방법을 바람직하게 사용할 수 있으며, 그 중에서 TaqMan 프로브법을 채용하는 것이 바람직하다. 서열 번호 11을 가지는 핵산 프로브, 및 서열 번호 13의 염기 서열을 가지는 핵산 프로브가, 전술한 시그널 변화를 가져오는 TaqMan 프로브로 이용될 수 있다. 이 핵산 프로브에는 통상적으로, DNA가 사용된다.

TaqMan 프로브법을 채용할 때, 형광 물질과 켄처 물질(켄칭 효과를 가지는 물질)에 의해 이중 표지한 상기 핵산 프로브를 사용한다. 통상적으로, 핵산 프로브의 5' 말단을 형광 물질로 수식하고, 3' 말단을 켄처 물질로 수식한다. 형광 물질의 예로서 FAM, HEX, TET, FITC 등을 들 수 있으며, 켄처 물질로서는, TAMRA, Eclipse, DABCYL 등을 예로 들 수 있다. 형광 물질 및 켄처 물질은 특별히 한정되지 않으며, TaqMan 프로브법을 실시하기에 적합한 형광 물질 및 켄처 물질을 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.

PCR 증폭 반응에 의존하여 상기 TaqMan 프로브는 DNA 폴리머라아제에 의해 소화(digested)되어, 형광 물질이 유리(遊離)됨으로써 PCR 반응 용액 중의 형광량이 증가한다. 이 형광에 의해 검출한 시그널 강도를 모니터링함으로써 증폭 곡선을 얻을 수 있다. 형광량의 증가는 PCR 증폭 산물의 증가의 정도를 반영하는 지표가 된다. 이로써, PCR에 있어서의 증폭의 상태를 실시간으로 간편하게 검출할 수 있다.

정량 PCR법의 실시에 있어서, 단계적으로 희석한 표준 시료로 정량 PCR법을 사전에 실시하여, 증폭 곡선을 얻어 적절한 임계값(threshold)을 설정함으로써 Ct값(Threshold Cycle)을 산출하고, 초기 주형량의 함수로서 검량선을 작성해 둠으로써, 이 검량선을 사용하여, 피검 시료에 있어서의 초기 주형량을 구할 수 있다. 즉 피검 시료에 대하여, 표준 시료와 마찬가지로 Ct값을 산출하고, 이 검량선에 적용시킴으로써, 초기 주형량을 구할 수 있다.

정량 PCR법의 실시에 있어서, 프라이머 세트, 핵산 프로브, 주형이 되는 핵산, 적절한 완충액, dNTP, 염화 칼륨, 염화 마그네슘, 내열성 DNA 합성 효소 등의 시약류를 각각 적절한 양을 혼합시켜, PCR 반응액으로 만들 수 있다. 정량 PCR법에 있어서의 반응 조건은, 전술한 PCR법에서 설명한 바와 동일하게 설정할 수 있다. 또한, 정량 PCR법을 실시하는 장치로서는, 공지의 것을 사용할 수 있다.

본 발명은 또한, 정량 PCR법을 사용한, 상기 피검 시료에 있어서의 보통계 밀의 존재를 검출하는 방법과, 정량 PCR법을 사용한, 밀을 광범위하게 검출하는 방법을 조합한 검출 방법에 사용하기에도 적합하다. 이것은, 피검 시료에 있어서의 보통계 밀 및/또는 보통계 밀 이외의 밀의 존재를 검출하는 방법으로서, 구체적으로는

(1) 피검 시료로부터 핵산을 추출하여 핵산 시료를 조제하고,

(a) 상기 핵산 시료를 사용하여, 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머, 서열 번호 6으로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머, 및 서열 번호 11로 표시되는 염기 서열을 가지는 표지 핵산 프로브를 사용하여, 정량 PCR법을 실시하고, 상기 표지 핵산 프로브에 의해 발생되는 증폭 산물량에 따른 시그널을 모니터링하여 증폭 곡선을 얻어, 사전에 작성한 검량선을 사용하여, 보통계 밀의 존재를 정량적으로 검출하고, 및

(b) 상기 핵산 시료를 사용하여, 서열 번호 9로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머, 서열 번호 10으로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머, 및 서열 번호 13으로 표시되는 염기 서열을 가지는 표지 핵산 프로브를 사용하여, 정량 PCR법을 실시하고, 상기 표지 핵산 프로브에 의해 발생되는 증폭 산물량에 따른 시그널을 모니터링하여 증폭 곡선을 얻어, 사전에 작성한 검량선을 사용하여, 밀의 존재를 정량적으로 검출하고, 및

(2) (a)와 (b)의 결과를 비교할 수 있다.

예를 들면, 피검 시료로부터 핵산을 추출하여 조제한 핵산 시료를 적어도 2분할하되, 예를 들면, 동일한 용량으로 적어도 2분할하여, 이들을 각각 상기 (a) 및 (b)의 정량 PCR 반응에 제공할 수도 있다.

전술한 방법에 있어서, 예를 들면 (a)에 있어서 보통계 밀의 존재가 검출되고, 그 정량값과 (b)에 있어서의 밀의 정량값에 차이가 없으면, 보통계 밀의 존재가 긍정된다. 또한, 예를 들면 (a)에 있어서 보통계 밀의 존재가 검출되고, 그 정량값과 (b)에 있어서의 밀의 정량값을 비교하여, (a)의 정량값＜(b)의 정량값이면, 그 차이는 피검 시료 중에 있어서의 보통계 밀 이외의 밀로부터 유래하는 것으로 추측되어 피검 시료에 있어서의 보통계 밀과 보통계 밀 이외의 밀의 공존이 추측된다. 또한, 예를 들면 (a)에 있어서 PCR 증폭 산물이 검출되지 않고, 한편 (b)에 있어서 PCR 증폭 산물이 검출되면, 피검 시료 중에 보통계 밀이 아닌, 보통계 밀 이외의 밀, 예를 들면, 듀럼 밀의 존재가 긍정된다.

이와 같은 방법을 사용하여, 동시에 작성한 검량선을 사용한 수학적 연산에 의해, 피검 시료 중의 보통계 밀 및 밀의 존재를 정량적으로 검출할 수 있다.

본 발명의 키트는, 본 발명의 방법에 있어서 PCR법 또는 정량 PCR법을 실시하는데 있어서, 시약 키트로서 사용할 수 있다. 본 발명의 키트에는, PCR을 실시하기에 최적인 각종 시약류 및 검출을 위한 시약류가 부속되어 있어도 된다.

본 발명의 키트에 의하면, 미량의 밀 및/또는 보통계 밀을 검출할 수 있으므로, 피검 시료 중에 밀의 존재 여부에 대한 정보뿐만 아니라, 보통계 밀과 듀럼 밀의 유무와 각각의 양을 파악할 수 있다. 그러므로, 마카로니류 등의 듀럼 밀을 사용한 제품에 있어서, 사용한 원료 밀가루의 종류를 표시할 수 있게 된다.

[실시예]

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다.

1. 보통계 밀 검출을 위한 프라이머 세트 및 정량용 핵산 프로브의 구축 방법

＜표적 유전자의 선발＞

일반적으로 밀의 게놈 DNA는 3종류의 게놈으로 구성되어 있고, 각각 A, B, D 게놈으로 칭해지고 있다. 보통계 밀은 AABBDD 게놈을 가지는 6배체이며, 듀럼 밀은 AABB 게놈을 가지는 4배체이다. 본 발명에서 표적 유전자로 한 Starch Synthase II는, 밀의 A, B, D 게놈 각각의 7번 염색체의 단완에 코딩되어 있고, 이들 유전자는 각각 SSII-A, SSII-B, SSII-D로 약칭된다(Shimbata T et al., Mutations in wheat starch synthase II genes and PCR-based selection of a SGP-1 null line. Theor Appl Genet. 2005 Oct; 111(6): 1072-9).

이들 유전자를 표적 유전자로 하고, 또한 D 게놈 상의 염기 서열에 특이적으로 하이브리드화하는 프라이머 세트를 사용하여, PCR에 의한 보통계 밀의 검출법을 구축할 수 있으면, 본 과제의 목적을 달성할 수 있는 것으로 판단하고, SSII-D(Triticum aestivum wSSII-D gene for starch synthase II-D, complete cds., Accession No. AB201447, 전체 길이 7010bp)(서열 번호 12)를 검출 표적 유전자로서 선택하였다.

＜SSII-D에 특이적인 프라이머 세트의 설계＞

SSII-D 유전자를 대상으로 하여, 유전자 공학용 소프트웨어 Primer Express ver.2.0.0(어플라이드바이오시스템즈사 제조)을 사용하여 프라이머의 후보가 되는 염기 서열의 검색을 실시하였다. 최적 프라이머를 설계하기 위해서는, GC 함량이나 Tm값, 염기 서열 길이, PCR 산물 길이 등 각종 조건을 만족시킬 필요가 있다. 그 결과, 복수의 프라이머의 후보 염기 서열을 선발할 수 있었다. 선발된 염기 서열을 BLAST 검색함으로써, 밀 SSII를 특이적으로 인식할 가능성이 높은 프라이머의 범위를 좁혀, 최종적으로 4세트의 프라이머 세트를 선발했다. 이들 4세트의 프라이머 세트의 Tm값은, 염기 서열에 의해 이론적으로 산출하고, PCR 반응에 있어서의 최적의 어닐링 온도를 설정하기 위한 지표로 하였다. 이들 4세트의 프라이머 세트는, 후술하는 표 2에 나타내는 서열 번호 1과 2, 서열 번호 3과 4, 서열 번호 5와 6, 및 서열 번호 7과 8이다.

＜SSII-D에 특이적인 정량적 PCR용 핵산 프로브의 설계＞

정량적 PCR의 방법은 이미 몇 가지가 보고되어 있지만, 해석 기기나 반응 시약이 충실한 점에서, 정량 PCR법의 일종인 TaqMan 프로브법을 채용하였다. 각 프라이머 세트에 대응하는 핵산 프로브는, Primer Express ver.2.0.0(어플라이드바이오시스템즈사 제조)을 사용하여 설계했다.

그리고, 핵산 프로브의 표지 화합물에는, 형광 물질로서 FAM(어플라이드바이오시스템즈사 제조)을 사용하였고, 켄칭 효과를 가지는 물질로서 TAMRA(어플라이드바이오시스템즈사 제조)를 사용하였다.

2. PCR에 사용한 주형 DNA의 추출

각종 식물의 종자를 사용하여, 주형 DNA 시료를 조제했다. 후술하는 표 3에 각 식물의 종을 나타낸다. 밀 및 그 외에 벼과 식물이나 콩과 식물 등의 종자는, 그 표면을 계면활성화제인 SDS의 1.0% 용액으로 세정한 후, 증류수로 헹구고, 동결 건조시켰다. 이 종자를 멀티비즈쇼커(Multi-Beads Shocker)(야스이기기사 제조) 또는 초원심 분쇄기(레치사 제조)를 사용하여 미세하게 분쇄했다.

각 분쇄 시료로부터 DNA Plant Mini kit(QIAGEN사 제조)를 사용하여 게놈 DNA를 추출했다. 추출 조작에 대해서는, DNA Plant Mini Handbook을 참조하여, 일부 개량한 방법에 의해 실시하였다. 즉, 분쇄 시료를 AP1 완충액과 RNase A 및 Proteinase K의 혼합액에 현탁(懸濁)시키고, 이것을 37℃로 가온(加溫)한 반응층에서 2시간 유지하였다. 그 후의 조작에 대해서는 전술한 Handbook에 따라 실시하였다.

그리고, Proteinase K에 대해서는, 0.1g 분쇄 시료당 5㎕의 20 mg/ml Proteinase K 용액(다카라바이오사 제조)을 첨가하였다. 이 첨가량에 대해서는, 종자의 종류나 상태에 따라 적절량으로 변경할 수 있다.

추출한 DNA는, 분광 광도계에 의해 230, 260, 280, 320 nm의 흡광도를 측정하여 그 순도와 농도를 구하고, 0.8% 아가로스겔 전기 영동에 제공했다. 그 후, 순수 또는 TE 완충액을 첨가하여 20 ng/㎕로 희석하여 PCR의 주형 DNA 용액으로 만들었다.

3. PCR과 PCR 증폭 산물의 검출 방법

PCR에는, AmpliTaq(등록상표) Gold DNA Polymerase(어플라이드바이오시스템즈사 제조)와 그 부속 시약을 사용하여, 다음과 같은 조성으로 PCR 반응액을 조제했다.

즉, 2.5㎕의 PCR buffer II, 2.5㎕의 2mM dNTP mix, 1.5㎕의 25mM 염화 마그네슘, 0.125㎕의 5 units/㎕ AmpliTaq Gold DNA Polymerase, 2㎕의 2.5μM 프라이머 세트 및 13.875㎕의 멸균수를 충분히 혼합한 용액에 2.5㎕의 20 ng/㎕ 주형 DNA 용액을 첨가하여 전체 량을 25㎕로 만들었다.

PCR 증폭 장치로는 2720 Thermal Cycler(어플라이드바이오시스템즈사 제조)를 사용하여, 하기 표 1에 나타낸 반응 조건에서 실시하였다. 어닐링 온도는, 전술한 계산법으로 구한 각각의 프라이머의 Tm값을 기준으로 하여 실험적으로 검증되므로, PCR에 사용하는 프라이머 세트마다 최적 온도를 설정했다.

PCR 증폭 산물의 전기 영동을 행할 때에는, PCR 반응액과 로딩 완충액을 적정량 혼합하고, 3% 아가로스겔에 제공했다.

전기 영동 후, 브롬화 에티듐 염색을 행하고, 각 프라이머 세트에 의한 최적사이즈의 PCR 증폭 산물을 확인함으로써 샘플 중의 보통계 밀의 유무를 판정하였다. 이 때, 포지티브 컨트롤 및 네가티브 컨트롤의 증폭 밴드의 유무에 의해 PCR의 타당성을 확인하였다.

[표 1] PCR의 반응 조건

* 어닐링 온도는, 사용하는 프라이머 세트에 따라 상이하며, 어닐링 온도는, 서열 번호 1과 2의 세트, 서열 번호 3과 4의 세트 및 서열 번호 7과 8의 세트에서는 55℃로 설정하였고, 서열 번호 5와 6의 세트에서는 60℃로 설정하였고, 그리고 서열 번호 9와 10의 세트에서는 56℃로 설정했다(후술하는 표 2 참조).

4. 각종 프라이머 세트에 의한 보통계 밀의 검출

밀 D 게놈에 코딩되어 있는 SSII-D(서열 번호 12)를 모서열(parent sequence)로 하여 설계한 각종 프라이머 세트 1?4, 및 밀 A 게놈에 코딩되어 있는 SSII-A(서열 번호 14)를 모서열로 하여 설계한 프라이머 세트 5를 하기 표 2에 나타낸다.

서열 번호 1의 염기 서열은, 밀 SSII-D 유전자의 위치 4015?4037에 존재하는 서열이며, 서열 번호 2의 염기 서열은, 밀 SSII-D 유전자의 위치 4142?4122에 상보적인 서열이며, 서열 번호 3의 서열은 밀 SSII-D 유전자의 위치 4469?4487에 존재하는 서열이며, 서열 번호 4의 서열은 밀 SSII-D 유전자의 위치 4555?4531에 상보적인 서열이며, 서열 번호 7은 밀 SSII-D 유전자의 위치 937?955에 존재하는 서열이며, 서열 번호 8은 밀 SSII-D 유전자의 위치 1080?1061에 상보적인 서열이다. 그리고, 서열 번호 9 및 10의 서열은 각각, 일본 특허출원 공개번호 2009-5588호 공보에 개시된 서열 번호 3 및 4의 서열에 해당한다.

[표 2]

이들 프라이머 세트를 사용하여, 상기 「3. PCR과 PCR 증폭 산물의 검출 방법」에서 언급한 방법에 따라, 상기 실시예에서 얻은 각 식물종으로부터의 주형 DNA 시료를 사용하여, PCR법을 실시하였다. 그 결과, 각 프라이머 세트에 의한, 최적 사이즈의 PCR 증폭 산물의 유무를, 표 3 중에 ＋, -로 표시한다.

[표 3]

프라이머 세트 3(SSII-D1769U/1889L: 서열 번호 5/6)은, 보통계 밀의 시료 만으로 목적으로 하는 길이의 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있었으나, 듀럼 밀, 보리, 호밀, 메밀, 쌀, 옥수수, 대두의 각 식물종에서는 PCR 증폭 산물은 얻을 수 없었다. 이 결과는, 이 프라이머 세트가 보통계 밀을 특이적으로 인식하고 있는 것을 나타낸다.

한편, 다른 프라이머 세트에서는, 듀럼 밀의 시료에 대해서도 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있었다.

5. PCR법에 의한 검출 한계의 평가

보통계 밀을 특이적으로 검출하는 프라이머 세트 3(SSII-D1769U/1889L: 서열 번호 5/6)을 사용한 PCR에 의해, 보통계 밀 DNA의 반정량적(semiquantitative)인 검출 한계를 검토했다. 연어 정자 DNA 용액을 희석 모체로 하여, 보통계 밀로부터 추출한 게놈 DNA를 20 ng/㎕, 10 ng/㎕, 1 ng/㎕, 0.1 ng/㎕, 50 pg/㎕, 10 pg/㎕, 1 pg/㎕가 되도록 단계적으로 희석했다.

상기 「3. PCR과 PCR 증폭 산물의 검출 방법」에서 기술한 방법에 따라, 이 용액 2.5㎕를 주형 DNA 용액으로 하여 PCR을 실시하고, 5.0㎕의 PCR 반응액을 전기 영동에 제공했다. 그 검출 결과를 도 1에 나타낸다.

보통계 밀 DNA 용액을 주형으로 한 검출 한계는, 프라이머 세트 3에 있어서 50 pg/㎕였다. 이러한 사실로부터 프라이머 세트 3을 사용한 PCR에 의해 50 pg/㎕의 고감도로 보통계 밀 게놈 DNA를 검출하는 것이 가능하게 되었다.

6. 정량 PCR에 의한 보통계 밀의 특이적 검출의 확인

보통계 밀을 특이적으로 검출한 프라이머 세트 3(SSII-D1769U/1889L: 서열 번호 5/6)과, 이와 함께 사용하는 핵산 프로브에 의한, 정량 PCR에 있어서의 보통계 밀의 특이적 검출의 성능을 조사하였다.

주형 DNA로서, 보통계 밀, 듀럼 밀, 보리, 쌀, 메밀의 합계 5종류의 피검 시료로부터 추출한 DNA를 사용하였다. 이 때, 블랭크(blank)로서 주형 DNA를 포함하지 않는 멸균수의 증폭 시그널의 유무에 의해 정량 PCR의 타당성을 확인하였다.

정량 PCR에는, TaqMan Universal PCR Master Mix(어플라이드바이오시스템즈사 제조)를 사용하여, 하기와 같은 조성으로 정량용 PCR 반응액을 조제했다. 즉, 12.5㎕의 TaqMan Universal PCR Master Mix(2X), 0.5㎕의 25μM 프라이머 세트, 0.5㎕의 10μM 핵산 프로브 및 9㎕의 멸균수를 충분히 혼합한 용액에 2.5㎕의 주형 DNA 용액을 첨가하여 전체 량을 25㎕로 만들었다. 밀의 주형 DNA 용액에는, 연어 정자 DNA 용액을 희석 모체로 하여 밀 게놈 DNA를 20 ng/㎕, 10 ng/㎕, 1 ng/㎕, 0.1 ng/㎕, 50 pg/㎕, 10 pg/㎕, 1 pg/㎕가 되도록 단계적으로 희석한 밀 DNA 용액을 사용하였다. 듀럼 밀, 보리, 쌀, 메밀의 경우에는, 연어 정자 DNA 용액으로 10 ng/㎕로 희석한 DNA 용액을 사용하였다. 그리고, 이 정량 PCR에 사용한 핵산 프로브를 표 4에 나타낸다.

[표 4] 핵산 프로브의 서열

이 핵산 프로브의 5' 말단을 FAM으로 수식하고, 3' 말단을 TAMRA로 수식했다.

정량 PCR 반응은, 이번에는 정량 PCR 장치 Rotor-Gene3000(Corbett Research사 제조)을 사용하여 행하였으나, 타사의 정량 PCR 장치를 사용해도 동일한 결과를 얻을 수 있다.

반응 조건은, 반응액을 95℃에서 10분간 유지하고, 이후 95℃에서 15초, 60℃에서 30초를 1 사이클로 하여 45 사이클을 반복하였다. 반응 과정에 있어서 각 반응 웰 중의 형광량이 경시적으로 계속 계측되므로, 반응 종료 후에 반응 튜브별로 형광량의 경시적인 변화를 해석함으로써 형광량의 증가가 일어난 튜브를 특정할 수 있다. 표적 염기 서열에 하이브리드화한 핵산 프로브가 DNA의 신장 반응의 과정에서 분해되고, 이에 따라 형광 표지된 염기가 유리되므로, 형광량은 PCR 증폭 반응의 진행과 함께 증가한다. 따라서, 형광량의 증가는 PCR 증폭 반응이 일어나고 있는 것을 의미한다.

보통계 밀로부터 추출한 DNA를 주형으로 한 정량 PCR의 결과를 도 2에 나타낸다. 도면 중의 화살표가 나타내고 있는 것은, 각 농도의 주형 DNA를 사용했을 때 얻어진 정량 PCR에 있어서의 증폭 곡선이다. 프라이머 세트 3과 서열 번호 11의 핵산 프로브의 조합에 의해 바람직하게 증폭 시그널이 인식되며, 검출 한계는 50 pg/㎕였다. 이들 증폭 시그널이 임계 라인에 도달하는 사이클수와 주형 DNA 농도의 로그는 직선 관계에 있으며, 바람직한 정량적 PCR가 진행되고 있는 것을 나타낸다.

또한, 보통계 밀, 듀럼 밀, 보리, 쌀, 메밀로부터 추출한 DNA를 주형으로 한 정량 PCR의 결과를 도 3에 나타낸다. 보통계 밀에서는, 증폭 시그널을 얻을 수 있었지만, 듀럼 밀, 보리, 쌀, 메밀에서는 증폭 시그널을 얻을 수 없었다.

도 2, 도 3의 결과는, 전술한 프라이머 세트와 핵산 프로브의 조합이 정량 PCR에 있어서, 고감도로 바람직하게 보통계 밀을 정량적으로 검출할 수 있는 것을 나타내고 있다.

7. 2종의 정량 PCR의 조합에 의한, 보통계 밀 또는 듀럼 밀의 특이적 검출의 확인

동일 검체에 대하여, 밀 DNA를 특이적으로 검출하는 프라이머 세트 및 상기 염기 서열을 특이적으로 인식하는 핵산 프로브에 의한 정량 PCR과 보통계 밀 DNA를 특이적으로 검출하는 프라이머 세트 및 상기 염기 서열을 특이적으로 인식하는 핵산 프로브에 의한 정량 PCR을 행하여, 상기 검체에 포함되는 보통계 밀과 듀럼 밀을 각각 정량 가능한지에 대해 확인하였다.

정량 PCR는, 전술한 방법에 따라, 밀 DNA를 특이적으로 검출하는 프라이머 세트 5(SSII-A3118U/3231L: 서열 번호 9/10)와, 상기 프라이머 세트에 대응하는 이하의 핵산 프로브 SSII-A ex7-T82를 사용한 정량 PCR과, 보통계 밀 DNA를 특이적으로 검출하는 프라이머 세트 3(SSII-D1769U/1889L: 서열 번호 5/6)과 서열 번호 11의 핵산 프로브(SSII-D-1797T)를 사용한 정량 PCR을 각각 행하였다.

검체로 하는 주형 DNA 용액으로서 다음의 2 종류를 조제했다.

(1) 보통계 밀의 게놈 DNA 용액과 듀럼 밀의 게놈 DNA 용액을 용량비 100: 0, 50:50, 5:95, 0.5:99.5, 0.25:99.75, 0:100의 비율이 되도록 혼합하고, 총 DNA 농도를 20 ng/㎕로 한 「DNA 용액 혼합 검체」

(2) 보통계 밀의 분체와 듀럼 밀의 분체를 질량비 100:0, 50:50, 5:95, 0.5:99.5, 0.25:99.75, 0:100의 비율로 되도록 혼합하고, 이들로부터 게놈 DNA를 추출하고, DNA 농도를 20 ng/㎕로 조제한 「분체 혼합 검체」밀 DNA의 정량에 사용한 핵산 프로브를 표 5에 나타낸다.

[표 5] 핵산 프로브의 서열

이 핵산 프로브의 5' 말단을 FAM으로 수식하고, 3' 말단을 TAMRA로 수식했다.

밀 DNA를 특이적으로 검출하는 정량 PCR의 결과를 도 4, 도 5에 나타낸다. 도 4는 「DNA 용액 혼합 검체」를 주형 DNA로서 사용한 결과를 나타내고, 도 5는 「분체 혼합 검체」를 주형 DNA로서 사용한 결과를 나타내고 있다. 도면 중 화살표가 나타내고 있는 것은, 각 농도의 주형 DNA를 사용했을 때 얻어진 정량 PCR 증폭 곡선이다. 도 4 및 도 5의 결과로부터, 프라이머 세트 5와 서열 번호 13의 핵산 프로브를 조합하면, 모든 주형 DNA에 있어서 바람직하게 증폭 시그널이 인식되며 이들 증폭 시그널이 동일한 곡선을 그리는 것을 알았다.

보통계 밀 DNA를 특이적으로 검출하는 정량 PCR의 결과를 도 6, 도 7에 나타낸다. 도 6은 「DNA 용액 혼합 검체」를 주형 DNA로서 사용한 결과를 나타내고, 도 7은 「분체 혼합 검체」를 주형 DNA로서 사용한 결과를 나타내고 있다. 도면 중 화살표가 나타내고 있는 것은, 각 농도의 주형 DNA를 사용했을 때 얻어진 정량 PCR 증폭 곡선이다. 도 6 및 도 7의 결과로부터, 프라이머 세트 3과 서열 번호 11의 핵산 프로브의 조합에 의해, 보통계 밀과 듀럼계 밀의 비율이 100:0, 50:50, 5:95, 0.5:99.5, 0.25:99.75인 샘플에 대하여, 바람직하게 증폭 시그널이 인식되며, 보통계 밀의 농도가 높은 샘플일수록, 증폭 시그널이 크며, 증폭 곡선이 빨리 상승하는 것을 알았다. 단, 보통계 밀과 듀럼계 밀을 0:100으로 혼합한 것에 대해서는 증폭 시그널을 얻을 수 없었다.

또한, 도 6, 도 7의 결과에 대하여, 각각, 보통계 밀의 혼합 비율을 가로축에, Ct(임계 라인에 도달했을 때의 사이클수, Threshold Cycle)를 세로축에 플롯팅 한 그래프를 도 8, 도 9에 나타낸다. 도 8, 도 9 모두 주형 DNA 중의 보통계 밀의 혼합 비율이 증가함에 따라, Ct가 비례적으로 작아지고 있고, 보통계 밀의 정량이 가능한 것을 알 수 있었다.

[서열목록 프리 텍스트]

서열 번호 1: PCR용 프라이머

서열 번호 2: PCR용 프라이머

서열 번호 3: PCR용 프라이머

서열 번호 4: PCR용 프라이머

서열 번호 5: PCR용 프라이머

서열 번호 6: PCR용 프라이머

서열 번호 7: PCR용 프라이머

서열 번호 8: PCR용 프라이머

서열 번호 9: PCR용 프라이머

서열 번호 10: PCR용 프라이머

서열 번호 11: PCR용 핵산 프로브 수식: 1-FAM-a, 23-a-TAMRA

서열 번호 12: Triticum aestivum wS SII-D 유전자의 서열

서열 번호 13: PCR용 핵산 프로브 수식: 1-FAM-a, 25-a-TAMRA

서열 번호 14: Triticum aestivum wS SII-A유전자의 서열

SEQUENCE LISTING <110> Incorporated Administrative Agency National Agriculture and Food Research Organization; NIPPON FLOUR MILLS Co., LTD.; Nisshin Seifun Group Inc. <120> METHOD FOR QUALITATIVE AND QUANTITATIVE DETECTION OF COMMON WHEAT <130> Y1R-0704 <150> JP2009-289340 <151> 2009-12-21 <160> 14 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 caacatccgc aaatagtgag cat 23 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 ggctaggtcg ggctctatga g 21 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 tcctcgacct cccattcca 19 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 ccggtgttag ttctatgatg attcg 25 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 caccatcagt gaaggaatga atg 23 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 ggcgatattt ggtacctaat tgaag 25 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 tccgttgtcc cagctgaga 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 8 tggctttgga gcttcttcga 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 ggatggaaat ctggtgttt 19 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 accataatgg accgagtgta c 21 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> modified_base <223> Probe for PCR, 1-FAM-a, 23-a-TAMRA <400> 11 tacccgatcg accgttttgc cca 23 <210> 12 <211> 7010 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> CDS <222> join(236..499, 604..1309, 1398..1462, 2363..2440, 2530..2640, 2738..2782, 3163..3336, 6054..7010) <223> Triticum aestivum wSSII-D gene for starch synthase II-D, complete cds. <400> 12 gggggccgtt cgtacgtacc cgcccctcgt gtaaagccgc cgccgtcgtc gccgtccccc 60 gctcgcggcc atttcttcgg cctgaccccg ttcgtttacc cccacacaga gcacactcca 120 gtccagtcca gcccactgcc accgcgctac tctccactcc cactgccacc acctccgcct 180 gcgccgcgct ctgggcggac caacccgcga accgtaccat ctcccgcccc gatccatgtc 240 gtcggcggtc gcgtccgccg catccttcct cgcgctcgcg tcagcctccc ccgggagatc 300 acgcaggcgg gcgagggtga gcgcgcagcc accccacgcc ggggccggca ggttgcactg 360 gccgccgtgg ccgccgcagc gcacggctcg cgacggagct gtggcggcgc tcgccgccgg 420 gaagaaggac gcggggatcg acgacgccgc cgcgtccgtg aggcagcccc gcgcactccg 480 cggtggcgcc gccaccaagg tagttagtta tgaccaagtt atgacgcgtg cgcgcgcctc 540 gagatcatcg tcgtctcgct cacgaattgt ttatttatac aaaacgcacg cccgcgtgtg 600 caggtcgcgg agcgaaggga tcccgtcaag acgctcgacc gcgacgccgc ggaaggcggc 660 gggccgtccc cgccggcagc gaggcaggac gccgcccgtc cgccgagtat gaacggcatg 720 ccggtgaacg gcgagaacaa atctaccggc ggcggcggcg cgactaaaga cagcgggctg 780 cccacgcccg cacgcgcgcc ccatccgtcg acccagaaca gagcaccggt gaacggtgaa 840 aacaaagcta acgtcgcctc gccgccgacg agcatagccg aggccgcggc ttcggattcc 900 gcagctacca tttccatcag cgacaaggcg ccggagtccg ttgtcccagc tgagaagacg 960 ccgccgtcgt ccggctcaaa tttcgagtcc tcggcctctg ctcccgggtc tgacactgtc 1020 agcgacgtgg aacaagaact gaagaagggt gcggtcgttg tcgaagaagc tccaaagcca 1080 aaggctcttt cgccgcctgc agcccccgct gtacaagaag acctttggga tttcaagaaa 1140 tacattggtt tcgaggagcc cgtggaggcc aaggatgatg gccgggctgt cgcagatgat 1200 gcgggctcct ttgaacacca ccagaatcac gactccggac ctttggcagg ggagaatgtc 1260 atgaacgtgg tcgtcgtggc tgctgagtgt tctccctggt gcaaaacagg catggacatt 1320 acctcttcag tctctcttcc tgttgttcat aaaactttgc tcgaattact cataagaaca 1380 aacattgtgt tgcataggtg gtctgggaga tgttgcgggt gctctgccca aggctttggc 1440 aaagagagga catcgtgtta tggtactaca agctttcatt taactctgtt gggtccatat 1500 gttcgaataa tatcagtgag tagtataatg ttattaagtg caagacatga aagtgttctt 1560 ttgtcatact ccctccgtaa attaatataa gagcgtttag attactactt tagtgatcta 1620 aacgctctta tagtagttta cagacggagt agagtatttc atagccaacc ctggaggtta 1680 ggttgctgag gcctactggg tgggggaggg ggtttgaaac aagtggtggt tagcagccag 1740 atttcacaaa gaaggaggct gataaccaca ccatcagtga aggaatgaat gtcgggtacc 1800 cgatcgaccg ttttgcccaa cgtcgggttt acccgcccta tagatccgaa taagtagttc 1860 ctatcttcaa ttaggtacca aatatcgcca gcgcccgtgt gtgtatttat actactggat 1920 gatcaattta tcaacatttc cggttaatgg tttctatcat attcactgta attgttagta 1980 aacagtagat gtttgtaatg tagatgatgg ataaatgtat gttgtcgagc tttcatttca 2040 atgcaatttt gattgggagc tagtttcgcg gttcggttag agccatcaaa accccagaat 2100 ttttgggagt tggcttgtga gagagggttt tggggagtta actttcggga ttcagttaga 2160 gacgctctta ctagttccag taaagagtaa actattttct gcaggcatcc caattattct 2220 gtagaaatta gaagtggaaa atagttatgg tatcatataa accatatatt attcaaaatc 2280 tagaatcatg gacttggcta gactttgata atctgaaatt ttaaatttga tgataattga 2340 gaaatgatcc tttctatctt aggttgtggt accaaggtat ggggactatg aagaagccta 2400 cgatgtcgga gtccgaaaat actacaaggc tgctggacag gtaagcaaaa atgcaatcga 2460 aggggagctg aaattttatt gcttattgtc ataataaatc aatttttaag tgtttttttt 2520 gtcctgcagg atatggaagt gaattatttc catgcttata tcgatggagt tgattttgtg 2580 ttcattgacg ctcctctctt ccgacaccgt caggaagaca tttatggggg cagcagacag 2640 gttaatcttc tatatgttgg tgtttgattg cactgataaa ctgagaacaa gccaaggcct 2700 actgactggc atatgattac acattttatt ttttcaggaa attatgaagc gcatgatttt 2760 gttctgcaag gccgctgttg aggtatctct ccaactcaat tgacaaccta ttaccactat 2820 acaattatgt gtatgcatgt atttcaacag atacataatc tcttgtgaag tgcatatata 2880 ctaataacat ttcaatacct tacatgcaca tttggtcaag cgttatgatt taacttctga 2940 taatctattg cactgatgaa caattatctt gatgatcctt gttacttcat cgttatgttt 3000 ccatgttctc ttcaccgcga attgatttgg aaatagcatt tccacctgcc acaaacaata 3060 atatacactc ctactttcat ccaatttaga tattttcgta cttggcatat catcccatta 3120 aatattattg gtccatcatt tttattcctc tataatttgc aggttccatg gcacgttcca 3180 tgcggcggtg tcccttatgg ggatggaaat ctggtgttta ttgcaaatga ttggcacacg 3240 gcactcctgc ctgtctatct gaaagcatat tacagggacc atggtttgat gcagtacact 3300 cggtccatta tggtgataca taacatcgct caccaggttc cttttctcct aatcttgatt 3360 tttctctagt ctctactatt tactccacat tgtttgagga aactaaacgg gttgcaaaat 3420 tatgatggct tatgaaagtt atagtcttat agaggtaaat gcaccagtgg tgcttgaact 3480 tgtcacgcgt gttcactttg gtgcttacag ttgtagacta tgaaaaacgg gtgcaaaaac 3540 ttgctgttgt gtgccatacg gtgcattttc cgtatgtagg agtcaaacgt tgcctatgtg 3600 ggcattgtat tcccgtctat agctgttaga ccgtgcctac gtcgccattg ggcccacaca 3660 ctctctattt acatgtgggc cccacttgtc aacctatgac ataaataaat ggaaatttat 3720 aataaaaatg atggcctggg gtcttgaaaa tgggacctcg caggtatgct ggtagccagc 3780 acgccctaaa cattaatccc ctatgcactt catgtcttgt gtatgtgtgt gtctgtgtgg 3840 ggaggggggg ggtatgtatg cttatatcct ttgctccaag gctaccatcc tcaacaagcc 3900 cacctccgct tcaacacggc cagcgccttc atgatggccc aggtgctccg caccatcgct 3960 caaagcggca acgtcgttgt catgaccatc caccaaccca acacacaaaa tcctcaacat 4020 ccgcaaatag tgagcatgcc cctcttgtcc tttcccctcg tacccaaaca tgtcttgata 4080 acccttggag ctgcacaagt tgtgaccatc gcctgcgtcg cctcatagag cccgacctag 4140 ccggaccgtt atagaagcct acttgggagc ccatacctcc ctgcacatcc tcctctttcc 4200 ccatagatcg tgccgccatc gcaaaccaac ttctcctctc cttctcccac tctggccgtt 4260 tcccccgccg cgaagctgca atacatgccg agttggccat ggccctattc cccaattgct 4320 cgcactagga ggtcctcctc taagcctagc accttttccc ctcaccaatt gcaagttggg 4380 gagcccctcg cgagctccct acgtcggctg cagttgcctg ccgcctcaac tctgatccag 4440 acctcgttcc cgtggcctcg gcgacatctc ctcgacctcc cattccacac gtggcctggc 4500 gaggatcacc gcatgttcat ccatgtgaac cgaatcatca tagaactaac accggagagg 4560 tcatcccgac ggcgtcgcac tgttcctcta ttccccccaa gccgtgtcgc gtcataatat 4620 aagacggact tatttgtatc ccttgggtca tcggttcaat ggctatttct ttctcctgtc 4680 tactgataag tgggacccac acgccacact aagccctttc tttctcctac ccgttgataa 4740 gtgggaccca cacacagtac ttagccagag agagaacatg agcttgttgg tgccacgtcg 4800 gcaagccatg tcagcagtct taacggctac aaacaacgga tatggtgtca cgtgagcgtt 4860 tacgaatgga aagtgcatca tactgcatgc gagagccaga gccaggtttt tgcaccagtt 4920 ttctgtattt tacaactgcg agcatcaaag tgtacatatg ccgaaccaaa gtgaacatgg 4980 tgagtccatt cttttctggt gcggtgggtg gctcaaagac accccaatag aagctattgc 5040 ctccgacatt gccaattcgg tgccgaacca tattgaagtg gtgaggtcag ttgcttgtgc 5100 tatgactact aggtattgga tgagggacat aaaggatctc ataaatattg caatgttcat 5160 tcaaattctt aacatttgcg aagcgcttca tgatttccat ctcccctaga tcagagacac 5220 ttggtcgtgt acactgaatt tctcaggtcg cttctcgtct aaatccgcat atgtagctca 5280 cttcaatgac ttgcctttgg tccagctaac gccatttgcg tagcaaattt ttcatatggc 5340 tcgctctgcg caagaggatt tggatcacgg gcagacgcgc tagacaaggt cttccgcaca 5400 atgaacattg agttttttga tccgctcttc ccgaagacac ttgtgatctt attacgagtt 5460 gtgccatttc aaacatctgt ctctccatgg tcgccccagc catagatgcc ttgttctctg 5520 aatggtgggt ttcagctagg aacagggtgc caccttcgga caagaagttg cgtagtttgg 5580 tcgtcttaac tgcttggttg atttggaagg aacacaacaa cagtctttga aggcaaagct 5640 aattccttcg atcaagttat tagacggatc aagtgtgatg aatcctactg gtacaatgcc 5700 gttgctagtt gcttggagtc actatttggc taggtcgctt gccatcccgc tctgtgctaa 5760 gcgcttgggg tcgcttttgc tcaatttgta ttttgttgtt atgtgttttt agtaatgtaa 5820 cctgaacttt ctggactaag tagaaaaaaa ttctcctcca taatgatcac atacagttct 5880 cctgcatggt tcgaaaaaaa aatgagaaca tccgtggcaa gtttaagcac caccggtgca 5940 tttttacctc aaagttatat acaacactga catgccgaat tacatgcttt ggtcagttat 6000 tccattcttc ggtactccgt tgggctaatt ctttctcttc atgttgcatg cagggccgtg 6060 gccctgtaga tgaattcccg ttcaccgagt tgcctgagca ctacctggaa cacttcagac 6120 tgtacgaccc cgtgggtggt gaacacgcca actacttcgc cgccggcctg aagatggcgg 6180 accaggttgt cgtggtgagc cccgggtacc tgtgggagct gaagacggtg gagggcggct 6240 gggggcttca cgacatcata cggcagaacg actggaagac ccgcggcatc gtcaacggca 6300 tcgacaacat ggagtggaac cccgaggtgg acgcccacct caagtcggac ggctacacca 6360 acttctccct gaggacgctg gactccggca agcggcagtg caaggaggcc ctgcagcgcg 6420 agctgggcct gcaggtccgc gccgacgtgc cgctgctcgg cttcatcggc cgcctggacg 6480 ggcagaaggg cgtggagatc atcgcggacg ccatgccctg gatcgtgagc caggacgtgc 6540 agctggtgat gctgggcacc gggcgccacg acctggagag catgctgcag cacttcgagc 6600 gggagcacca cgacaaggtg cgcgggtggg tggggttctc cgtgcgcctg gcgcaccgga 6660 tcacggcggg ggcggacgcg ctcctcatgc cctcccggtt cgagccgtgc gggctgaacc 6720 agctctacgc catggcctac ggcaccgtcc ccgtcgtgca cgccgtcggc ggcctcaggg 6780 acaccgtgcc gccgttcgac cccttcaacc actccgggct cgggtggacg ttcgaccgcg 6840 ccgaggcgca caagctgatc gaggcgctcg ggcactgcct ccgcacctac cgagacttca 6900 aggagagctg gagggccctc caggagcgcg gcatgtcgca ggacttcagc tgggagcacg 6960 ccgccaagct ctacgaggac gtcctcgtca aggccaagta ccagtggtga 7010 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> modified_base <223> Probe for PCR, 1-FAM-a, 25-a-TAMRA <400> 13 ctcctgcctg tctatctgaa agcat 25 <210> 14 <211> 6898 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> CDS <222> join(247..510, 602..1307, 1396..1460, 2277..2354, 2444..2554, 2652..2696, 3080..3253, 5942..6898) <223> Triticum aestivum wSSII-A gene for starch synthase II-A, complete cds. <400> 14 gggggccgtt cgtacgtacc cgcccctcgt gtaaagccgc cgccgtcgtc gccgtccccc 60 gctcgcggcc atttccccgg cctgaccccg tgcgtttacc ccacagagca cactccagtc 120 cagtccagcc cactgccgcc gcgctactcc ccactcccgc tgccaccacc tccgcctgcg 180 ccgcgctctg ggcggaggac caacccgcgc atcgtaccat cgcccgcccc gatcccggcc 240 gccgccatgt cgtcggcggt cgcgtccgcc gcgtccttcc tcgcgctcgc ctccgcctcc 300 cccgggagat cacgcaggcg ggcgagggtg agcgcgccgc caccccacgc cggggccggc 360 aggctgcact ggccgccgtg gccgccgcag cgcacggctc gcgacggagg tgtggccgcg 420 cgcgccgccg ggaagaagga cgcgagggtc gacgacgacg ccgcgtccgc gaggcagccc 480 cgcgcacgcc gcggtggcgc cgccaccaag gtagttggtt cgttatgact tgctgtatgg 540 cgcgtgcgcc tcgagatcag ctcacgaatt gtttctacaa aacgcacgcg ctcgtgtgca 600 ggtcgcggag cggagggatc ccgtcaagac gctcgatcgc gacgccgcgg aaggtggcgc 660 gccggcaccg ccggcaccga ggcaggacgc cgcccgtcca ccgagtatga acggcacgcc 720 ggtgaacggt gagaacaaat ctaccggcgg cggcggcgcg accaaagaca gcgggctgcc 780 cgcacccgca cgcgcgcccc atccgtcgac ccagaacaga gtaccagtga acggtgaaaa 840 caaagctaac gtcgcctcgc cgccgacgag catagccgag gtcgtggctc cggattccgc 900 agctaccatt tccatcagtg acaaggcgcc ggagtccgtt gtcccagccg agaagccgcc 960 gccgtcgtcc ggctcaaatt tcgtggtctc ggcttctgct cccaggctgg acattgacag 1020 cgatgttgaa cctgaactga agaagggtgc ggtcatcgtc gaagaagctc caaacccaaa 1080 ggctctttcg ccgcctgcag cccccgctgt acaagaagac ctttgggact tcaagaaata 1140 cattggcttc gaggagcccg tggaggccaa ggatgatggc tgggctgttg cagatgatgc 1200 gggctccttt gaacatcacc agaaccatga ttccggacct ttggcagggg agaacgtcat 1260 gaacgtggtc gtcgtggctg ctgaatgttc tccctggtgc aaaacaggca tggacattac 1320 ctcttcagtc tctcttcccg ttgttcataa aactttgctc gaatcactca taagaacaaa 1380 cattgtgttg cataggtggt cttggagatg ttgcgggtgc tctgcccaag gctttggcaa 1440 agagaggaca tcgtgttatg gtactgcagg ctttcactta actctgttga gtccatatgt 1500 tcgaataata tcagtgattg gcataatgtt attaagtgca agacatgaaa gtgttcttct 1560 gttagagtat ttcatagcca accctggagg ttaggttgtt ggggcctact gggtgcggga 1620 gggggtttgc aaaaagtggt ggttagcagt cggatttcac aaataaggag gctgataacc 1680 acgccatcag tgaagggaat gagtgtcggg tacccgatcg accgttttgc ccgacgtcag 1740 gtttacctgc cctgtagatc cgaataagta gttcctatcc tcagttaagt accaaatatc 1800 gccagcaccc gtgtgtgtat ttatagtact ggatgatcaa tttatcaaca tttccggtta 1860 atggttgcta tcatattcac tgtaattgtt agtaaacagt ggatgtttgt aatgtagatg 1920 atggctaaat gtatgttgtc aagctttcat tttaaagaaa attttattgg gagctagttt 1980 tcgggtttgg ttagagccac caaaacccca gaatttttgg gagttggctt gtgacagagg 2040 gttttgggga gttaactttc gggattcagt tagagacgct cttactagtt ccagtaaaga 2100 gtaaactatt ttctgcagtc atcccaattg ttctgtagaa attaaaagta gaaaatagtt 2160 gtggtatcat ataaaccata tattattcaa aatctagaat catggacttg gctagacttt 2220 gatgatctga aattttaaat ttgatgataa ttgagaaatg atcctttcta tcttaggttg 2280 tggtaccaag gtatggggac tatgaggaag cctacgatgt cggagtccga aaatactaca 2340 aggctgctgg acaggtaagc gaaaatgcaa tcaaagggga gctgaaattt caatgcttac 2400 tatcataata aatcaatttt aagtaaaaaa atttgtcctg caggatatgg aagtgaatta 2460 tttccatgct tatatcgatg gagttgattt tgtgttcatt gacgctccta tcttccgaca 2520 ccgtcaggaa gacatttatg ggggcagcag acaggttaat tttctatatg ttggtgtttg 2580 attgcactga taaactgaga ataagccaag gcctactgac tggcatatga ttacacattt 2640 tattttttca ggaaattatg aagcgcatga ttttgttctg caaggccgct gtcgaggtat 2700 cctctccaac tcaattgaca acctattacc actatacaat tatgtgtatg catgtatttc 2760 aacagatacg taatctccct tgtgaagtgt atatatacta ataacatttc aatacctcac 2820 atgcacattt ggtcaagcgt tatgatttaa cttctgataa tctattgcac tgatgaacaa 2880 taatattgat gatccttgtt acttcatcgt tatgtttatg ttctcttcac cggcgcattg 2940 attttggaaa tagcatttcc acctgccaca aacaataata tatactccta ctttcatcca 3000 atgtagatat tttcgcactt ggcatatcat cccattaaat attattggtc catcattttt 3060 attcctctat aatttgcagg ttccttggca cgttccatgc ggcggtgtcc cttatgggga 3120 tggaaatctg gtgtttattg caaatgattg gcacacggca ctcctgcctg tctatctgaa 3180 agcatattac agggaccatg gtttgatgca gtacactcgg tccattatgg tgatacataa 3240 catcgcgcac caggttcctt ttctcctaat cttgtttttt ctctagtctc tactattcac 3300 tccacattgt ttgaggaaac taaaggggtt gcaaaattat gatggcttat gaaagttatg 3360 gaggtaaatg catcagtggt gcttgaactt gtcacgcatg ttcactttgg tgcttacagt 3420 tgtagactac ggaaaactgg tgcaaaaact tggctattgt gtgcaatacg gtgtattttc 3480 cgtatgtagg gtcaaatgtt gcctatgtgg cattgtattc ccgtctatag atgttagacc 3540 gtgcctacat cgccattggg cccacacact ccctattaca tgtgggaccc acttgtcagc 3600 ctatgacata aataaaatgg aaatttataa taaaaatgat ggcctggggt cttgaaaatg 3660 ggacctcgca ggtatgccgc tagccagcac gccctaatca ttaatcccct atgcacttca 3720 gtatgtgtgt gtctgtgtgt ggagtcgggg gggggggggg tatgtattct tatatccttt 3780 gctctaaggc tatcattggc gtgctagcac cgccgggtct ccatcaacac cgacatcatc 3840 cacgacccca tccagctctt cctcaacaag cccacctcca gcctcaactc gggcagcacc 3900 ttcatggtgg cctaggtgct ctgcaccatc gctcgaagtg gcaacgtcgt tgtcatgacc 3960 atccaccaac ccaacacgca aaatcctcaa catcatttga cagtgagcat gcccctcttg 4020 tcatttcccc ctcataccca aacctgtctc gataaccctt ggagctgcac aagttgtgac 4080 catcgcctgc gtcgctgcac aacgcctgac ctagccggac cattatagaa gcctgccttg 4140 ggagcccata cctccctgca catcctcctc tttccccata gaccgtgccg ccatcgcaaa 4200 tcgacttctc ctctcctcct tctcctgctc tggccgtttt ccccgccgcg aagctgcaat 4260 ccatggcgag ttggccatgg ccctattccc caattgctcg cactaggagg tcctccttga 4320 agcctagcac ctttccccct cactaattgc aagttgggga gcccctcacg agctccctac 4380 attggccgta gtcgcctgcc gcctcaactc tggtccagac ctcgttcccg tggcctcgac 4440 gacatctcct cgacctccca ttccacacgc ggcctggaga ggatcaccgc atgttcatcc 4500 atccgacccg aatcatcata gaaccaacgc cagagaggtc atcccgacga cgtcgcactg 4560 ttcctctatt tcccccaagc tgtgtcgcgt cataatataa gacgggcttg tttgtatctc 4620 taggggtcat cgggttcaat ggctagctca tgcatggacc tgactttagg tcccaggttc 4680 gaacccccgc gtgcacataa tttatttgct atttatttct cctatctact aataagtggg 4740 acccacacat catactaagc cctttttgtc tcttgcctgc tgataagtgg gacccacacg 4800 caatacttag ccagagagag aacatgagct tgttggtgcc gcgttggcaa gccacgccag 4860 cagtcttaac ggctacaaac agaggatatg gtgtcacatc aacgtgcaga gcgtttacga 4920 atggaaagtg tactatatgc acacaagagc cagagccagg tttttgcacc agttttttgt 4980 attctacaac tgcgagcacc aaagtgtaca tgccgaacca aagtgaacac ggcgagtcca 5040 ttcttttctg gtacgatggg tggctcaaag acaccccaat agaagctatc acctcggaca 5100 ttgccaattg ggtgccgaac tacattaaag tggcaaggtc agttgattgc gctatgtgtt 5160 ggatcaggga cataaacgat tccataaata ttgcaatgtt cattcaaatt cttaacattt 5220 gcgaggcgct tcatgatttc catctccctc atatcagaga catttggtcg tgtacactaa 5280 atttctcagg tcacttctcg tctaaatccg catatgtagc tcacttcaat gacttgactt 5340 tggtccagct aacgccattt ggcgctcttg ggcccctttg cgtagcaatt ttttcatatg 5400 gctcgctccg cgcaatagga tttggatcac gggcagacgc gctagatgag gtcttccaca 5460 caatgaacat tgcgttcttt gctctgctct tccagaagac acttgtgatt ttattacgag 5520 ttgtgccata gatgccggtg ggtttcagct aggaacaggg tgtcaccttc ggacaagaag 5580 aagttgcata gtttggtcgt cttaactgct tggtcgattt ggaaggagca caacaacagt 5640 ctttgaaggc aaagctaatt ccctcgatca agttattaga cggatcaaat gtggtacagt 5700 gccatggcta gttgcttgga gtcactttta agctaggtcg cttgccatca cgctttgtgt 5760 taagcgcttg gggtcgcttt tgctcaattt gtattttgtt gttatgtgtt tttagttatg 5820 tagcctgaac tttctggact tagttttttc ctctataatg atcacatgct ttggtcagtt 5880 attcctttct tgggtactcc gttgggctaa ttctttctct tgattgatgt tgtatatgca 5940 gggccgtggc ccagtagatg aattcccgtt caccgagttg cctgagcact acctggaaca 6000 cttcagactg tacgaccccg tgggtggtga gcacgccaac tacttcgccg ccggcctgaa 6060 gatggcggac caggttgtcg tggtgagccc cgggtacctg tgggagctca agacggtgga 6120 gggcggctgg gggcttcacg acatcatacg gcagaacgac tggaagaccc gcggcatcgt 6180 caacggcatc gacaacatgg agtggaaccc cgaggtggac gtccacctcc agtcggacgg 6240 ctacaccaac ttctccctga gcacgctgga ctccggcaag cggcagtgca aggaggccct 6300 gcagcgcgag ctgggcctgc aggtccgcgc cgacgtgccg ctgctcggct tcatcggccg 6360 cctggacggg cagaagggcg tggagatcat cgcggacgcc atgccctgga tcgtgagcca 6420 ggacgtgcag ctggtcatgc tgggcaccgg ccgccacgac ctggagagca tgctgcggca 6480 cttcgagcgg gagcaccacg acaaggtgcg cgggtgggtg gggttctccg tgcgcctggc 6540 gcaccggatc acggcgggcg ccgacgcgct cctcatgccc tcccggttcg agccgtgcgg 6600 gctgaaccag ctctacgcca tggcctacgg caccgtcccc gtcgtgcacg ccgtcggcgg 6660 gctgagggac accgtgccgc cgttcgaccc cttcaaccac tccggcctcg ggtggacgtt 6720 cgaccgcgcc gaggcgcaca agctgatcga ggcgctcggg cactgcctcc gcacctaccg 6780 ggactacaag gagagctgga ggggcctcca ggagcgcggc atgtcgcagg acttcagctg 6840 ggagcatgcc gccaagctct acgaggacgt cctcctcaag gccaagtacc agtggtga 6898

Claims (14)

1. 피검 시료 중의 보통계 밀의 존재를 검출하는 방법으로서,
   상기 피검 시료로부터 추출한 핵산을 주형(template)으로 하여, 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머와 서열 번호 6으로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머를 사용하여, PCR법을 실시하고, PCR 증폭 산물의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 보통계 밀의 존재를 검출하는 방법.
2. 피검 시료 중의 보통계 밀의 존재를 검출하는 방법으로서,
   상기 피검 시료로부터 추출한 핵산을 주형으로 하여, 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머, 서열 번호 6으로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머, 및 서열 번호 11로 표시되는 염기 서열을 가지는 핵산 프로브를 사용하여, 정량 PCR법을 실시하는 것을 포함하는, 보통계 밀의 존재를 검출하는 방법.
3. 제2항에 있어서,
   서열 번호 11로 표시되는 염기 서열을 가지는 핵산 프로브가 표지(labeled) 핵산 프로브이며, PCR 중에, 상기 표지 핵산 프로브에 의해 발생되는 증폭 산물량에 따른 시그널을 모니터링하여 증폭 곡선을 얻는 것을 포함하는, 보통계 밀의 존재를 정성적 및/또는 정량적으로 검출하는 방법.
4. 제2항에 있어서,
   서열 번호 11로 표시되는 염기 서열을 가지는 핵산 프로브가 표지 핵산 프로브이며, PCR 중에, 상기 표지 핵산 프로브에 의해 발생되는 증폭 산물량에 따른 시그널을 모니터링하여 증폭 곡선을 얻어, 사전에 작성한 검량선을 사용하여, 보통계 밀의 존재를 정량적으로 검출하는, 보통계 밀의 존재를 정성적 및/또는 정량적으로 검출하는 방법.
5. 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머와 서열 번호 6으로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트.
6. 서열 번호 11로 표시되는 염기 서열을 가지는 핵산 프로브.
7. 제6항에 있어서,
   서열 번호 11로 표시되는 염기 서열을 가지고, 그 5' 말단이 형광 물질로 수식(modified)되고 및 그 3' 말단이 켄처(quencher) 물질로 수식되어 있는, 핵산 프로브.
8. 피검 시료 중의 보통계 밀 및/또는 보통계 밀 이외의 밀의 존재를 검출하는 방법으로서,
   (1) 피검 시료로부터 핵산을 추출하여 핵산 시료를 조제하고,
   (a) 상기 핵산 시료를 사용하여, 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머, 서열 번호 6으로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머, 및 서열 번호 11로 표시되는 염기 서열을 가지는 핵산 프로브를 사용하여, 정량 PCR법을 실시하고, 상기 핵산 프로브에 의해 발생되는 증폭 산물량에 따른 시그널을 모니터링하여 증폭 곡선을 얻어, 보통계 밀의 존재를 검출하고, 및
   (b) 상기 핵산 시료를 사용하여, 서열 번호 9로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머, 서열 번호 10으로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머, 및 서열 번호 13으로 표시되는 염기 서열을 가지는 핵산 프로브를 사용하여, 정량 PCR법을 실시하고, 상기 핵산 프로브에 의해 발생되는 증폭 산물량에 따른 시그널을 모니터링하여 증폭 곡선을 얻어, 밀의 존재를 검출하고, 및
   (2) 상기 (a)와 상기 (b)의 결과를 비교하는 것을 포함하는, 보통계 밀 및/또는 보통계 밀 이외의 밀의 존재를 검출하는 방법.
9. 제8항에 있어서,
   (1) 상기 (a)에 있어서, 핵산 프로브에 의해 발생되는 증폭 산물량에 따른 시그널을 모니터링하여 증폭 곡선을 얻어, 사전에 작성한 검량선을 사용하여, 보통계 밀의 존재를 정량적으로 검출하고, 및
   상기 (b)에 있어서 핵산 프로브에 의해 발생되는 증폭 산물량에 따른 시그널을 모니터링하여 증폭 곡선을 얻어, 사전에 작성한 검량선을 사용하여, 밀의 존재를 정량적으로 검출하고, 및
   (2) 상기 (a)에 있어서의 정량값과 상기 (b)에 있어서의 정량값을 비교하는, 보통계 밀 및/또는 보통계 밀 이외의 밀의 존재를 검출하는 방법.
10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    서열 번호 11로 표시되는 염기 서열을 가지는 핵산 프로브 및 서열 번호 13으로 표시되는 염기 서열을 가지는 핵산 프로브가, 각각 표지 핵산 프로브인, 보통계 밀 및/또는 보통계 밀 이외의 밀의 존재를 검출하는 방법.
11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 번호 11로 표시되는 염기 서열을 가지는 핵산 프로브가 그 5' 말단이 형광 물질로 수식되고 및 그 3' 말단이 켄처 물질로 수식되어 있는 핵산 프로브이며, 및 서열 번호 13으로 표시되는 염기 서열을 가지는 핵산 프로브가 그 5' 말단이 형광 물질로 수식되고 및 그 3' 말단이 켄처 물질로 수식되어 있는 핵산 프로브인, 보통계 밀 및/또는 보통계 밀 이외의 밀의 존재를 검출하는 방법.
12. 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머와 서열 번호 6으로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머의 프라이머 세트를 포함하는, 보통계 밀 검출용 키트.
13. 제12항에 있어서,
    또한 서열 번호 11로 표시되는 염기 서열을 가지고, 그 5' 말단이 형광 물질로 수식되고, 및 그 3' 말단이 켄처 물질로 수식되어 있는 핵산 프로브를 포함하는, 보통계 밀 검출용 키트.
14. 제13항에 있어서,
    또한, 서열 번호 9로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머와 서열 번호 10으로 표시되는 염기 서열을 가지는 프라이머의 프라이머 세트, 및 서열 번호 13으로 표시되는 염기 서열을 가지고, 그 5' 말단이 형광 물질로 수식되고, 및 그 3' 말단이 켄처 물질로 수식되어 있는 핵산 프로브를 포함하는, 보통계 밀 검출용 키트.

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