CN111850161A

CN111850161A - 沙融山羊草7Ssh染色体特异分子标记及其应用

Info

Publication number: CN111850161A
Application number: CN202010904637.9A
Authority: CN
Inventors: 汪晓璐; 刘成; 韩冉; 郭军
Original assignee: CROP Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: CROP Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-09-01
Filing date: 2020-09-01
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2040-09-01
Also published as: CN111850161B

Abstract

本发明属于作物分子生物学与遗传育种领域，具体涉及沙融山羊草7S^sh染色体的特异分子标记的建立与应用。本发明提供的分子标记可以对小麦背景中是否含有沙融山羊草7S^sh染色体进行有效检测。本发明获得的特异分子标记不仅可用于小麦－沙融山羊草杂交群体的筛选、鉴定，还可以应用于辅助选育抗白粉病小麦新品系/品种，提高筛选效率，缩短育种时间，具有极大的产业化价值。

Description

沙融山羊草7Ssh染色体特异分子标记及其应用

技术领域

本发明属于作物分子生物学与遗传育种领域，具体涉及沙融山羊草7S^sh染色体特异分子标记及其应用。

背景技术

山羊草属（Aegilops）包含11个二倍体、10个四倍体和2个六倍体，基本基因组涉及D、S、U、C、N和M（Schneider et al.，2008）。二倍体物种沙融山羊草（Ae. sharonensis Eig.，2n = 2x = 14，基因组S^shS^sh），主要分布在黎巴嫩南部和以色列的沿海地区（vanSlageren，1994），其基因组与普通小麦的B基因组亲缘关系较近（Olivera andSteffenson，2009）。沙融山羊草是抗病、抗虫的丰富基因资源（Gill et al.，1985；Oliveraet al.，2007）。据报道，沙融山羊草抗叶锈病（Snyman et al.，2004；Olivera et al.，2007）、秆锈病（Valkoun et al.，1985；Olivera et al.，2007）、条锈病（Anikster et al.，2005；Olivera et al.，2007）、白粉病（Dhaliwal et al.，1993；Olivera et al.，2007）和麦二叉蚜（Gill et al.，1985）。此外，沙融山羊草对盐胁迫、干旱胁迫和铝胁迫等也具有耐受性（Manyowa，1989；Waines et al.，1993；Xu et al.，1993），是小麦遗传改良优异的基因资源。

在小麦－沙融山羊草远缘杂交方面，Miller等（1982）将沙融山羊草与小麦中国春进行杂交，从其杂交后代中筛选获得一个小麦－沙融山羊草单体附加系并用染色体Ｃ分带和原位杂交技术对该材料进行了鉴定，然而，鉴定结果没有明确该单体附加系中沙融山羊草染色体的同源群归属。此后，该课题组又从该杂交组合后代材料中鉴定获得了小麦－沙融山羊草4S^sh（4D）代换系。徐霞等（1992）利用小麦与11个山羊草（包括沙融山羊草和拟斯卑尔脱山羊草等）杂交，再以4D缺体为轮回亲本对杂种进行回交，借助幼胚培养技术获得了小麦－沙融山羊草单体异代换系。Zhao等（2014）和Jiang等（2014）将沙融山羊草与四倍体小麦杂交，把沙融山羊草高分子量谷蛋白亚基转移给了小麦，获得了四倍体小麦－沙融山羊草双二倍体。除此之外，有关小麦与沙融山羊草远缘杂交成功的鲜有报道。

在沙融山羊草染色体分子研究方面，相关研究非常罕见。仅见Dvorak等（1998）利用RFLP标记对沙融山羊草和高大山羊草（Ae. longissima）进行研究，发现二者有很高比例的杂合位点，说明它们在进化过程中存在异交情况。Goryunova等（2008）通过RAPD标记也发现沙融山羊草和高大山羊草的种内基因型多样性。此外，Ezrati等（2005）通过AFLP标记评价了从以色列12个地区采集的236份沙融山羊草的多态性，认为其多态性丰富。然而，上述研究未报道沙融山羊草7S^sh染色体特异分子标记的建立情况。我们的前期研究发现，中国春－沙融山羊草4S^sh+7S^sh（4D）四体代换系高抗小麦白粉病，而中国春－沙融山羊草4S^sh+5S^shL（4D）二体+端体代换系、中国春－沙融山羊草4S^sh二体附加系以及对照小麦中国春等材料均高感白粉病，这表明，沙融山羊草7S^sh染色体含有抗白粉病基因，因而，开发沙融山羊草7S^sh染色体特异分子标记，对筛选鉴定杂交分离群体材料以及选育抗病小麦品系/品种均具有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术中没有沙融山羊草7S^sh染色体特异PCR标记的问题，本发明提供了一种能够快捷、有效、简便地鉴定待测样本中是否含有沙融山羊草7S^sh染色体的特异分子标记。

本发明的目的是建立沙融山羊草7S^sh染色体特异分子标记，为小麦背景中沙融山羊草7S^sh染色质的检测提供了新方法。

一种沙融山羊草7S^sh染色体特异分子标记为下列四对引物中的一对以上的组合，其碱基序列如下：

所述的分子标记为下列四对引物中的一对以上的组合，其碱基序列如下：

TNAC1867-PLUG:

F：5’-GCCTTTCCTTTGGTAGTCTGG-3’,编号为SEQ ID NO.1；

R：5’-CGATCCAAATGATCCTGAAGA-3’ ,编号为SEQ ID NO.2;

TNAC1924-PLUG：

F：5’-TAGCTTTGGAACGATGTGTGG-3’，编号为SEQ ID NO.3 ,

R：5’-TGTGGAGCAGTGCTGTTTATG-3’ ,编号为SEQ ID NO.4；

TNAC1902-PLUG：

F：5’-AATACCAGGTCCTCCAACTTT-3’，编号为SEQ ID NO.5,

R：5’-TGGAATCGCTGAGAAAGAATG-3’ ,编号为SEQ ID NO.6；

TNAC1806-PLUG：

F：5’-ATTCCTCGTGAATTGCTGGAT-3’ ,编号为SEQ ID NO.7，

R：5’-TCTGCAGTTAGGGACTTGAAA-3’ ,编号为SEQ ID NO.8 。

本发明中所述的一种沙融山羊草7S^sh染色体特异分子标记的应用，具体为使用沙融山羊草7S^sh染色体特异分子标记对待测材料基因组总DNA进行PCR扩增，对小麦背景中是否含有沙融山羊草7S^sh染色体进行检测或辅助检测，以应用在杂交种质筛选与鉴定中。

进一步地，对小麦背景中是否含有沙融山羊草7S^sh染色体进行检测或辅助检测的方法包括以下步骤：

（1）以待测的可能含有沙融山羊草7S^sh染色体的小麦背景系的基因组总DNA为模板，用沙融山羊草7S^sh染色体特异分子标记分别对其进行PCR扩增，扩增产物使用凝胶电泳进行检测；

（2）如果待测模板DNA凝胶电泳检测图谱中含有与阳性对照相同的特异DNA条带而阴性对照无该带，则说明待测小麦背景系的基因组中含有沙融山羊草7S^sh染色体；如果待测模板DNA凝胶电泳检测图谱中不含有与对照相同的特异多态性DNA条带，则说明待测小麦背景系的基因组中不含有沙融山羊草7S^sh染色体。

进一步地，步骤（1）中所述的阳性对照为中国春－沙融山羊草双二倍体；所述的阴性对照为中国春小麦。

进一步地，所述的4对引物对扩增特征在于30μL PCR反应体系为：25ng/μL的模板DNA 2.0μL，5U/μL Taq DNA polymerase 0.3μL，200μM的dNTPs，含Mg²⁺的10×PCR buffer3.0μL，10μM的上、下游引物各2μL，用无菌双蒸馏水补充反应体系至30μL。

进一步地，所述的PCR反应扩增程序为：94℃预变性3min，随后35个循环：94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸2min，最后72℃延伸10min，4℃保存。

进一步地，所述的PCR反应扩增程序还包括利用限制性内切酶酶切，具体为引物TNAC1902和TNAC1806使用限制性内切酶TaqI进行酶切。

进一步地，步骤（1）中使用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

PCR产物（未酶切）经琼脂糖电泳后发现，仅引物TNAC1867和TNAC1924分别能在中国春－沙融山羊草4S^sh+7S^sh（4D）四体代换系中扩增出长度都约为750bp的特异DNA条带（图1），而该两特异条带不能在中国春－沙融山羊草4S^sh+5S^shL（4D）二体+端体染色体代换系、中国春－沙融山羊草4S^sh二体附加系和对照中国春等材料中扩增出，表明这两条特异条带可能是沙融山羊草7S^sh染色体特异片段。除上述两引物外，其他引物例如TNAC1902和TNAC1806均不能直接在阳性对照和阴性对照中扩增出多态性DNA条带。

为了获得更多的多态性，用限制性内切酶TaqI对引物TNAC1902和TNAC1806扩增的PCR产物进行酶切（包含无菌双蒸馏水6.5μL，10×NEB buffer 3.0μL，10×BSA 0.3ΜL，限制性内切酶0.2μL，酶切温度为65℃，酶切时间为2h）后电泳，结果发现，引物TNAC1902和TNAC1806分别可以在中国春－沙融山羊草4S^sh+7S^sh（4D）四体代换系中获得长度约为1500bp和800bp的多态性片段（图2），而不能在中国春－沙融山羊草4S^sh+5S^shL（4D）二体+端体染色体代换系、中国春－沙融山羊草4S^sh二体附加系和阴性对照中获得这些多态性片段，这表明，这些片段可能是沙融山羊草7S^sh染色体特异片段。

利用现有已鉴定的中国春－沙融山羊草二体附加系、四体附加系、四体代换系、二体+端体代换系及对照小麦为材料（表1），对上述4个可能的沙融山羊草7S^sh染色体特异片段进行染色体定位验证，综合比较分析PCR结果发现，该4个片段仅存在于7S^sh染色体上（图3），因为该4个片段是沙融山羊草7S^sh染色体特异分子标记，分别记为TNAC1867-PLUG、TNAC1924-PLUG、TNAC1902-PLUG和TNAC1806-PLUG。

为了验证TNAC1867-PLUG、TNAC1924-PLUG、TNAC1902-PLUG和TNAC1806-PLUG的可用性，对中国春-沙融山羊草4S^sh+7S^sh（4D）四体代换系/中国春杂交F₂群体进行验证，结果显示，这4个标记均能用于杂交群体的筛选与鉴定，具有实用价值。

有益效果：

1、本发明建立了沙融山羊草7S^sh染色体的新标记，提供了使用新标记检测小麦背景中沙融山羊草7S^sh染色体的新方法。因为沙融山羊草7S^sh染色体上含有抗小麦白粉病基因，因此，本发明获得的特异分子标记可用于杂交群体的筛选、鉴定与辅助选育抗白粉病的小麦新品系/品种；

2、所筛选出的特异性分子标记，对小麦背景中是否含有沙融山羊草7S^sh染色体进行检测或辅助检测，特异性强，检测准确率高，提高筛选效率，缩短育种时间，具有积极的产业化价值。

附图说明

图1. 引物TNAC1867（A）、TNAC1924（B）、TNAC1902（C）和TNAC1806（D）的扩增产物（未经过酶切）在2%琼脂糖凝胶中的电泳结果，箭头所示为多态性条带。M=Marker（DL2000），泳道上的1-8分别代表中国春－沙融山羊草双二倍体、中国春、中国春－沙融山羊草2S^sh二体附加系、4S^sh二体附加系、4S^sh+5S^shL（4D）二体+端体代换系、6S^sh二体附加系、4S^sh+6S^sh四体附加系、4S^sh+7S^sh（4D）四体代换系。

图2. 引物TNAC1902（A）和TNAC1806（B）的扩增产物（用TaqI酶切）在2%琼脂糖凝胶中的电泳结果，箭头所示为多态性条带。M=Marker（DL2000），泳道上的1-8分别代表中国春－沙融山羊草双二倍体、中国春、中国春－沙融山羊草2S^sh二体附加系、4S^sh二体附加系、4S^sh+5S^shL（4D）二体+端体代换系、6S^sh二体附加系、4S^sh+6S^sh四体附加系、4S^sh+7S^sh（4D）四体代换系。

图3. 引物TNAC1867（A）、TNAC1924（B）、TNAC1902（C）和TNAC1806（D）的扩增产物（其中TNAC1902和TNAC1806用TaqI酶切）在2%琼脂糖凝胶中的电泳结果，箭头所示为多态性条带。M=Marker（DL2000），泳道上的1-14分别代表中国春－沙融山羊草双二倍体、中国春、中国春－沙融山羊草2S^sh二体附加系、4S^sh二体附加系、4S^sh+5S^shL（4D）二体+端体代换系、6S^sh二体附加系、4S^sh+6S^sh四体附加系、4S^sh+7S^sh（4D）四体代换系、济麦21、济麦22、济麦23、济麦44、济麦229和济麦262。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

下述实施例中所用的植物材料（表1）和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，如无特殊说明，所用PCR体系方法与发明内容部分的描述的PCR体系及方法相同，所有引物合成均由成都瑞信生物公司完成。JIC编号的实验材料（表1）由英国约翰英纳斯中心（John Innes Centre）种质库的Reader教授惠赠，公众可从英国约翰英纳斯中心网站（https://www.jic.ac.uk/germplasm/）有偿获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。中国春（CS）由电子科技大学生命科学与技术学院杨足君教授提供。济麦21、济麦22、济麦23、济麦44、济麦229和济麦262，均由申请人所在研究团队自主培育。F₂-1－F₂-20是中国春－沙融山羊草4S^sh+7S^sh（4D）四体代换系与中国春杂交获得F₂后代材料。

表1 供试材料

1、引物的设计与合成

小麦、水稻和包括沙融山羊草在内的小麦远源物种的基因具有较好的共线性，并且三者基因间可能具有序列多态性，因此，基于PCR的地标式特异基因引物的设计及扩增主要依据于物种基因共线性关系，进而对沙融山羊草和小麦基因组DNA进行扩增甚至对其扩增产物进行酶切来建立沙融山羊草染色体特异标记。所用引物依据水稻EST序列为基础，利用软件Primer5分析基因序列多态性及设计引物，设计引物参照的EST序列在小麦染色体上的位置通过电子科技大学杨足君教授团队开发的网页http://mcgb.uestc.edu.cn/tnac进行定位。

2、引物筛选与沙融山羊草7S^sh染色体特异DNA片段的获得

为了对设计引物进行筛选并初步获得沙融山羊草7S^sh染色体特异DNA片段，以中国春为阴性对照，以中国春－沙融山羊草双二倍体为阳性对照，筛选基于PCR的地标式特异基因引物，基于PCR的地标式特异基因引物扩增特征在于30μL PCR反应体系为：25ng/μL的模板DNA 2.0μL，5U/μL Taq DNA polymerase 0.3μL，200μM的dNTPs，含Mg²⁺的10×PCR buffer3.0μL，10μM的上、下游引物各2μL，用无菌双蒸馏水补充反应体系至30μL；PCR反应扩增程序为：94 ℃预变性3min，随后35个循环：94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸2min，最后72℃延伸10min，4℃保存。

将上述30μL PCR产物均分到3个不同的PCR管中，向TNAC1902和TNAC1806扩增的PCR产物中加入限制性内切酶TaqI酶切（体系包含无菌双蒸馏水6.5μL，10×NEB buffer3.0μL，10×BSA 0.3ΜL，限制性内切酶0.2μL，酶切温度为65℃，酶切时间为2h），未酶切及酶切后的PCR产物均在2%的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE。扩增产物10μL在150V恒压下电泳约25min，然后用1μg/mL的溴化乙锭溶液进行染色30min，最后在GDS-Gel Dol2000紫外凝胶成像系统下扫描照相。

PCR产物（未酶切）经琼脂糖电泳后发现，仅引物TNAC1867和TNAC1924分别能在中国春－沙融山羊草双二倍体和中国春－沙融山羊草4S^sh+7S^sh（4D）四体代换系中扩增出长度都为750bp的特异DNA条带，而该两特异条带不能在中国春－沙融山羊草4S^sh附加系、中国春－沙融山羊草4S^sh+5S^shL（4D）二体+端体代换系、阴性对照和其他附加系或代换系中扩增出（图1A、B），这表明，这两条特异条带可能是沙融山羊草7S^sh染色体特异片段。除上述两引物外，其他引物TNAC1902和TNAC1806均不能直接在上述材料中扩增出多态性DNA条带（图1C、D）。

用限制性内切酶TaqI对引物TNAC1902和TNAC1806扩增的PCR产物进行酶切后电泳，结果发现，引物TNAC1902/TaqI和TNAC1806/TaqI分别可以在中国春－沙融山羊草双二倍体和中国春－沙融山羊草4S^sh+7S^sh（4D）四体代换系中获得长度约为1500bp和800bp的多态性片段，而不能在中国春－沙融山羊草4S^sh二体附加系、中国春－沙融山羊草4S^sh+5S^shL（4D）二体+端体代换系、阴性对照和其他材料中获得这些多态性片段，这表明，这些片段是沙融山羊草7S^sh染色体特异分子标记（图2A、B）。

依据上述方法步骤，获得一种沙融山羊草7S^sh染色体特异分子标记，碱基序列如下表2所示：

表2. 沙融山羊草7S^sh染色体特异标记及其相关信息

注：“—”表示PCR产物无需酶切即可获得多态性。

3、沙融山羊草7S^sh染色体特异片段的验证

为了验证上述DNA片段是沙融山羊草7S^sh染色体特异片段，以TNAC1867、TNAC1924、TNAC1902和TNAC1806为引物对小麦中国春、济麦21、济麦22、济麦23、济麦44、济麦229、济麦262、中国春－沙融山羊草双二倍体、中国春－沙融山羊草2S^sh二体附加系、4S^sh二体附加系、4S^sh+5S^shL（4D）二体+端体代换系、6S^sh二体附加系、4S^sh+6S^sh四体附加系和4S^sh+7S^sh（4D）四体代换系基因组DNA进行扩增，TNAC1867和TNAC1924的扩增产物直接进行琼脂糖凝胶电泳，TNAC1902和TNAC1806的扩增产物用TaqI进行酶切可获得多态性条带。结果发现，上述4对引物或引物/限制性内切酶组合分别能在中国春－沙融山羊草4S^sh+7S^sh（4D）四体代换系中获得长度约为750bp（图3A）、750bp（图3B）、1500bp（图3C）和800bp（图3D）的多态性片段，而在其他供试材料中没有获得这些多态性片段，因此，这些片段是沙融山羊草7S^sh染色体特异分子标记。

4、获得标记对杂交群体筛选与鉴定的实用性

为了验证获得标记的实用性，我们将小麦－沙融山羊草4S^sh+7S^sh（4D）四体代换系与中国春杂交获得F₂后代材料。利用上述引物或引物/限制性内切酶组合对上述F₂后代材料中的F₂-1－F₂-20进行扩增筛选和验证，以中国春－沙融山羊草双二倍体为阳性对照，中国春为阴性对照。结果发现，TNAC1867和TNAC1902能在编号为F₂-2、F₂-6、F₂-8、F₂-9、F₂-12、F₂-15和F₂-17的后代材料中分别获得长度约为750bp和1500bp的多态性片段，TNAC1924和TNAC1806能在编号为F₂-4、F₂-6、F₂-10、F₂-14和F₂-19的后代材料中分别获得长度为750bp和800bp的多态性片段，而在其他后代材料中没有获得这些多态性片段，因此，F₂-2、F₂-4、F₂-6、F₂-8、F₂-9、F₂-10、F₂-12、F₂-14、F₂-15、F₂-17和F₂-19植株中含有沙融山羊草7S^sh染色体或染色体片段。上述扩增结果表明，这4个沙融山羊草7S^sh染色体特异标记可以应用于杂交群图的筛选与鉴定。

以上所述仅是本专利的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本专利的保护范围。

序列表

<110> 山东省农业科学院作物研究所

<120> 沙融山羊草7Ssh染色体特异分子标记及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcctttcctt tggtagtctg g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgatccaaat gatcctgaag a 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tagctttgga acgatgtgtg g 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtggagcag tgctgtttat g 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aataccaggt cctccaactt t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggaatcgct gagaaagaat g 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

attcctcgtg aattgctgga t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tctgcagtta gggacttgaa a 21

Claims

1.一种沙融山羊草7S^sh染色体特异分子标记，其特征在于：所述的分子标记为下列四对引物中的一对以上的组合，其碱基序列如下：

TNAC1867-PLUG:

F：5’-GCCTTTCCTTTGGTAGTCTGG-3’,编号为SEQ ID NO.1；

R：5’-CGATCCAAATGATCCTGAAGA-3’ ,编号为SEQ ID NO.2;

TNAC1924-PLUG：

F：5’-TAGCTTTGGAACGATGTGTGG-3’，编号为SEQ ID NO.3 ,

R：5’-TGTGGAGCAGTGCTGTTTATG-3’ ,编号为SEQ ID NO.4；

TNAC1902-PLUG：

F：5’-AATACCAGGTCCTCCAACTTT-3’，编号为SEQ ID NO.5,

R：5’-TGGAATCGCTGAGAAAGAATG-3’ ,编号为SEQ ID NO.6；

TNAC1806-PLUG：

F：5’-ATTCCTCGTGAATTGCTGGAT-3’ ,编号为SEQ ID NO.7，

R：5’-TCTGCAGTTAGGGACTTGAAA-3’ ,编号为SEQ ID NO.8 。

2.权利要求1所述的沙融山羊草7S^sh染色体的应用，其特征在于，使用沙融山羊草7S^sh染色体特异分子标记进行PCR扩增，对小麦背景中是否含有沙融山羊草7S^sh染色体进行检测或辅助检测。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的检测或辅助检测的步骤如下：

以待测的可能含有沙融山羊草7S^sh染色体的小麦背景系的基因组总DNA为模板，用沙融山羊草7S^sh染色体特异分子标记分别对其进行PCR扩增，扩增产物使用凝胶电泳进行检测；

如果待测模板DNA凝胶电泳检测图谱中含有与阳性对照相同的特异DNA条带而阴性对照无该带，则说明待测小麦背景系的基因组中含有沙融山羊草7S^sh染色体；如果待测模板DNA凝胶电泳检测图谱中不含有与对照相同的特异多态性DNA条带，则说明待测小麦背景系的基因组中不含有沙融山羊草7S^sh染色体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（1）中所述的阳性对照为中国春－沙融山羊草双二倍体；所述的阴性对照为中国春小麦。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（1）中所述的6对引物对扩增特征在于30μL PCR反应体系为：25ng/μL的模板DNA 2.0μL，5U/μL Taq DNA polymerase 0.3μL，200μM的dNTPs，含Mg²⁺的10×PCR buffer 3.0μL，10μM的上、下游引物各2μL，用无菌双蒸馏水补充反应体系至30μL；

所述的PCR反应扩增程序为：94℃预变性3min，随后35个循环：94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸2min，最后72℃延伸10min，4℃保存。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（1）中所述的PCR反应扩增程序还包括利用限制性内切酶酶切，具体为引物TNAC1902和TNAC1806使用限制性内切酶TaqI进行酶切。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤（1）中使用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。