CN107236811A - 白叶枯病抗性基因Xa21辅助育种分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供白叶枯病抗性基因Xa21辅助育种分子标记，所述分子标记是与水稻白叶枯病抗性基因Xa21共分离的SNP标记RSXA211110，该SNP标记检测水稻第11号染色体20894905位碱基；基于KASP技术开发的该SNP标记的引物，包括特异引物X、特异引物Y和通用引物C，引物序列分别如SEQ ID NO:1‑3所示。本发明还提供SNP标记RSXA211110在白叶枯病抗性基因Xa21辅助育种中的应用。本发明具有操作简单、成本低廉、周期短的优点，而且该标记的稳定性好，不受其它基因效应和环境因素的影响，可在早代选择，缩短育种年限，提高育种效率，对水稻抗白叶枯的品种改良具有重要意义，适用于Xa21基因的辅助选择育种。

Description

白叶枯病抗性基因Xa21辅助育种分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学及作物育种技术领域，具体地说，涉及白叶枯病抗性基因Xa21辅助育种分子标记及其应用。

背景技术

水稻白叶枯病菌具有生理小种专化性，品种的抗性基本上都是受核基因组中的主效抗性基因控制，自世纪年代日本科学家利用黄玉和兰泰耶玛斯与金南风杂交后代分析其对日本菌群抗性反应，鉴定并命名2个显性抗性基因后，有关水稻白叶枯病抗性基因的鉴定与发掘研究就没停止过。1975年以后，国际水稻研究所用菲律宾生理小种先后鉴定出7个抗病基因(章琦，2007)。其他国家科研人员也相继鉴定出一批抗性基因，但由于各国科学家使用的菌系不同，其鉴定结果缺乏可比性，在一定程度上影响到该研究领域的进展。因此从1982年开始，IRRI与日本科学家开始合作进行白叶枯病基因鉴定工作，创建了水稻白叶枯病抗性基因鉴别系统，到1987年确认了Xa1、Xa2、Xa3、Xa4、Xa5、Xa6、Xa7、Xa8、Xa10、Xa11、Xa12等11个抗性基因的存在(Ogawaet al.,1987)。随后有更多的基因被鉴定、定位与克隆。我国科学家Lin等(1996)通过对云南品种扎昌龙的抗性遗传研究，在第11染色体短臂末端定位一个新的显性抗病基因Xa22(t)，且该基因表现出广谱抗性。Chen等(2002)对明恢63与珍汕97的杂交后代进行抗性遗传分析，表明明恢对菲律宾菌株的抗性受一对显性基因控制，并将其抗性基因定位于第12染色体上，命名为Xa25(t)。

截至到目前，已确认和报道的白叶枯抗性基因有38个，命名排序至Xa38(虞玲锦等，2012；国家水稻数据中心)。其中有26个为显性基因，其余为隐性基因；已经被定位的有26个，其中有8个基因已被克隆，分别为Xa1、xa5、Xa27、xa13、Xa3/Xa26、Xa4、Xa21和Xa23(王春连，2006；裴庆利等，2011；国家水稻数据中心)。

目前，育种家们通过分子标记辅助选择(molecular assistedselectoin，MAS)，已利用Xa4、Xa21和Xa23选育出了许多抗病恢复系品种，如IR26、IR28、IR30、IR32、IR36、IR50、IR54等。国内大面积种植的杂交稻中大多含有Xa4基因，不过长期大面积地使用单一抗源已经导致了新致病菌株的进化，杂交稻抗病的持久性得不到保证。因此，如何利用新的抗病基因，尽快提高杂交稻的抗病性是育种中急待解决的问题。Xa21是第一个从野生稻中被克隆出来的重要功能基因。Khush等报道其抗性供体为西非长药野生稻，在水稻分蘖后期抗当时菲律宾的全部6个小种。经杂交导入IR24后，通过回交、自交获得了BC4F2群体，分析其中两个F2群体对菲律宾小种1、2、4和6的抗性遗传，表明其广谱抗性由一对显性基因控制，有别于已鉴定的17个抗性基因，被命名为Xa21，后来进一步选育成携有Xa21的近等基因系IRBB21。Ronald等将Xa21定位于第11染色体上，与RAPD818、RAPD248和RG103标记的遗传图距都不超过1.2cM。随后该基因由宋文源等克隆，并迅速广泛应用于国内外水稻抗白叶枯病转基因育种(国家水稻数据中心)。因此，利用MAS等现代育种技术，将Xa21基因导入主栽的杂交稻恢复系中，有望大大提高我国水稻的抗病性和生产安全。

由于Xa21基因已经被克隆，目前将Xa21基因导入水稻中的研究主要利用转基因技术和应用分子标记辅助选择。转基因政策在我国尚未放开，转Xa21材料无法应用在实际大规模育种中。辅助选择中应用的标记一般为RAPD、SSR、AFLP、RFLP、CAP或dCAP等标记，或基于需要PCR或酶切或两者结合，这些都需要繁琐且存在污染风险的电泳检测。发明人通过3000份水稻重测序数据库，通过序列比对，挖掘了在基因连锁定位区间内，与Xa21紧密连锁的特异性SNP分子标记，结合KASP检测技术，无需凝胶电泳检测也不限制于高成本的限制性内酶，在Xa21遗传育种中可以高通量、快速、精确的鉴定Xa21基因，大大提高基因转育的效率。

发明内容

本发明的目的是开发出高抗、广谱、持久的抗白叶枯病基因Xa21的分子标记，其能用于Xa21基因的鉴定及辅助选择育种。

本发明白叶枯病抗性基因Xa21辅助育种分子标记的开发流程见图1。鉴于Xa21基因已被成功克隆，根据文献将Xa21基因位置确定在水稻11号染色体的21273014-21277323区间，利用Xa21的供体材料与非供体材料的重测序数据对此基因区间及其附近两侧的SNP位点进行挖掘。挑选出的SNP位点，提取侧翼序列，并利用在线引物设计网站BatchPrimer3对其进行引物设计。针对这些候选SNP标记，对含有Xa21基因的水稻品种华恢1437、华恢1337、IRBB21、中恢8015、R66、R104、R108共7份基因供体材料和其它不含Xa21的15个水稻品种进行KASP反应验证，挑选出与Xa21供体材料共分离及扩增效果好的SNP标记RSXA211110。随后利用约190份材料对所挑选的抗性基因连锁SNP标记进行自然群体验证，证明本发明检测的Xa21基因位点为高特异性的抗性位点。利用Xa21供体亲本中恢8015和受体亲本内香5A的F2杂交群体进行了遗传位置验证及表型验证，再次验证了本发明的可行性和准确性。

为了实现本发明目的，本发明提供白叶枯病抗性基因Xa21辅助育种分子标记，所述分子标记是与水稻白叶枯病抗性基因Xa21共分离的SNP标记RSXA211110，该SNP标记检测水稻第11号染色体20894905位碱基；基于KASP技术开发的该SNP标记的引物，包括特异引物特异引物X、特异引物引物Y和通用引物C，引物序列分别如SEQ IDNO:1-3所示。

本发明还提供基于KASP技术开发的用于鉴定水稻白叶枯病抗性基因Xa21的引物，包括特异引物X、特异引物Y和通用引物C，引物序列分别如SEQ ID NO:1-3所示。

本发明还提供含有上述引物的检测试剂或试剂盒。

本发明还提供所述分子标记、引物、检测试剂或试剂盒在鉴定水稻白叶枯病抗性基因Xa21中的应用。

本发明还提供所述分子标记、引物、检测试剂或试剂盒在白叶枯病抗性基因Xa21辅助育种中的应用。

本发明还提供所述分子标记、引物、检测试剂或试剂盒在选育具有白叶枯病抗性的水稻资源中的应用。

所述应用包括以下步骤：

1)提取待测水稻样品的DNA；

2)取20ng干燥模板DNA，100UM特异引物X 0.005μl，100UM特异引物Y 0.005μl，100UM通用引物C 0.0125μl，2×KASP Master Mix 1.4792μl，H₂O 1.4983μl，进行PCR扩增；

3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物基因型。

步骤2)PCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应：94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。

步骤3)具体为：利用生物学软件对PCR扩增产物进行分型，等位位点RSXA211110-A为具有白叶枯病抗性优异等位类型的水稻植株。

利用本发明提供的SNP标记RSXA211110，通过检测某水稻品种是否含有“Xa21基因位点”，最终确认在被测定水稻品种中是否含有Xa21基因。目前由于没有报道用于鉴定Xa21基因的紧密连锁的分子标记。一般可采用白叶枯病菌的抗谱分析来鉴定Xa21基因的存在，但是该方法需要多个菲律宾生理小种，接菌条件包括水稻的生育时期、气候、温度等也比较严格，不适合大面积鉴定和应用。

本发明具有操作简单、成本低廉、周期短的优点，而且该标记的稳定性好，不受其它基因效应和环境因素的影响，可在早代选择，缩短育种年限，提高育种效率，适于推广应用。本发明对水稻抗白叶枯的品种改良具有重要意义，适用于Xa21基因的辅助选择育种。

附图说明

图1为本发明白叶枯病抗性基因Xa21辅助育种分子标记的开发流程图。

图2为本发明实施例2中SNP标记RSXA211110检测自然群体分型图。

图3为本发明实施例3中SNP标记RSXA211110在水稻第11号染色体上的遗传位置验证。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 水稻白叶枯病抗性基因Xa21辅助育种分子标记的获得

1、引物设计

根据相关文献将Xa21基因位置确定在水稻11号染色体的21273014-21277323区间，利用Xa21的供体材料与非供体材料(共3000份水稻材料)的重测序数据对此基因区间及其附近两侧的SNP位点进行挖掘。挑选出的SNP位点，提取侧翼序列，并利用在线引物设计网站BatchPrimer3(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)对其进行引物设计。每组标记有三条引物，在其中两条特异性引物5’端分别连接FAM和HEX荧光序列。引物委托Invitrogen公司合成。

基于KASP反应原理及抗感材料的单碱基差异设计的标记能高通量地对水稻材料进行Xa21抗性基因检测，如果样品中只检测到FAM荧光，则该样品的碱基为Allele X；如果只检测到HEX荧光，则该样品的碱基为Allele Y；如果同时检测到两种荧光，则该位点碱基为杂合状态(表1)。

表1

2、DNA提取：从水稻叶片中提取基因组DNA，采用简化CTAB法。

①取样放入2.0ml Tube中，预先加入两粒钢珠和750uL CTAB溶液，震荡匀浆样品1.5min；

②65℃震荡加热0.5h(0.5-1h)；

③冷却至室温，在通风橱中加入750ml氯仿︰异戊醇(24︰1)溶液混匀；

④12000rmp离心10min，取上清约500ml转移至新的1.5ml离心管中；

⑤加入等体积异丙醇溶液轻摇混匀，于-20℃沉淀1小时以上，12000rmp离心10min，去上清；

⑥加入1000ml 70％乙醇，轻弹沉淀，1000rmp离心3min，去上清；

⑦加300uL H₂O过夜溶解备用。

3、KASP反应测试

KASP反应测试在LGC SNPline基因分型平台上进行。在微孔反应板中加入20ngDNA样品，烘干后加入KASP反应混合液，反应体系见表2。PCR扩增在水浴热循环仪中完成，Touchdown PCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。反应完成后利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。

本发明中使用的LGC SNPline基因分型平台与其配套试剂耗材均购于英国LGC公司。

表2 KASP检测的反应体系

	终浓度	体积(μl)
			100UM Primer C	0.42UM	0.0125
100UM Primer X	0.17UM	0.0050
			100UM Primer Y	0.17UM	0.0050
2×KASP Master Mix	1×	1.4792
			超纯水		1.4983
总体积		3

4、标记分型数据

用标记RSXA211110对含有Xa21基因的水稻品种华恢1437、华恢1337、IRBB21、中恢8015、R66、R104、R108共7份基因供体材料和其它不含Xa21的15个水稻品种进行KASP初筛反应验证，结果见表3。含Xa21基因的水稻品种在RSXA211110测试位点检测结果均为碱基A，除了无扩增的3份材料，12份不含Xa21水稻品种无论是其他抗白叶枯基因供体还是感病材料均在测试位点检测出碱基T。

表3 标记RSXA211110初筛分型数据

实施例2 水稻白叶枯病抗性基因Xa21 SNP标记RSXA211110的应用

为了检测本发明SNP标记RSXA211110的特异性和实用性，利用188份材料对SNP标记RSXA211110进行自然群体验证。188份材料中包括已知含纯合Xa21基因的品种，含有其他抗白叶枯供体、普感材料、常见杂交稻和核心水稻育种材料。标记在自然群体分型结果如图2所示，7份已知含Xa21基因的品种检测为具有白叶枯抗性的纯合Xa21基因型，含有其他抗白叶枯基因供体、普感材料和除中恢8015外(Xa21供体)的核心水稻育种材料均检测为无白叶枯抗性纯合xa21基因型，常见杂交稻中少数检测出杂合Xa21基因型。可见，SNP标记RSXA211110检测Xa21基因位点为高特异性的抗性位点，可便捷高效的用于鉴定水稻品种中是否含有Xa21基因。

实施例3 与水稻白叶枯病抗性基因Xa21共分离的SNP标记的遗传定位及表型验证

利用Xa21供体亲本中恢8015和受体亲本内香5A的F2杂交群体进行了遗传位置验证及表型验证，再次验证了本发明的可行性和准确性。

1、标记遗传位置验证

利用F2群体和10个在父母本中具有多态性的SNP标记以及本发明中的Xa21特异性标记RSXA211110进行遗传位置验证，本发明的标记RSXA211110被定位到水稻第11号染色体21.2cM位置(图3)。

2、标记表型验证

利用中恢8015和受体亲本内香5A的F2群体对本发明与基因Xa21连锁标记RSXA211110进行遗传表型验证。在水稻孕穗期，对F2群体119个单株及2个亲本品种接种广东白叶枯病菌株PXO61，21天后调查病情，表型数据与基因型一致性为97％，再次验证了本发明的可行性和准确性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 华智水稻生物技术有限公司

<120> 白叶枯病抗性基因Xa21辅助育种分子标记及其应用

<130> KHP171113254.5

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aagatttgat agctgccaag ga 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aagatttgat agctgccaag gt 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cttgcagcca acagcctatc 20

Claims (9)

1.白叶枯病抗性基因Xa21辅助育种分子标记，其特征在于，所述分子标记是与水稻白叶枯病抗性基因Xa21共分离的SNP标记RSXA211110，该SNP标记检测水稻第11号染色体20894905位碱基；

基于KASP技术开发的该SNP标记的引物，包括特异引物X、特异引物Y和特异引物C，引物序列分别如SEQ ID NO:1-3所示。

2.基于KASP技术开发的用于鉴定水稻白叶枯病抗性基因Xa21的引物，其特征在于，包括特异引物X、特异引物Y和通用引物C，引物序列分别如SEQ ID NO:1-3所示。

3.含有权利要求2所述引物的检测试剂或试剂盒。

4.权利要求1所述分子标记、权利要求2所述引物或权利要求3所述检测试剂或试剂盒在鉴定水稻白叶枯病抗性基因Xa21中的应用。

5.权利要求1所述分子标记、权利要求2所述引物或权利要求3所述检测试剂或试剂盒在白叶枯病抗性基因Xa21辅助育种中的应用。

6.权利要求1所述分子标记、权利要求2所述引物或权利要求3所述检测试剂或试剂盒在选育具有白叶枯病抗性的水稻资源中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测水稻样品的DNA；

2)取20ng干燥的模板DNA，100UM特异引物X0.005μl，100UM特异引物Y0.005μl，100UM通用引物C0.0125μl，2×KASP Master Mix 1.4792μl，H₂O 1.4983μl，进行PCR扩增；

3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物基因型。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤2)PCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应：94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，步骤3)具体为：利用生物学软件对PCR扩增产物进行分型，等位位点RSXA211110-A为具有白叶枯病抗性优异等位类型的水稻植株。