CN104004768B - 一种能够提高番茄果实营养品质的猕猴桃基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能够提高番茄果实营养品质的猕猴桃基因及其应用方法，特征是该猕猴桃基因具有序列表SEQ ID NO.1的DNA序列；将其克隆至真核表达载体，获得含有猕猴桃基因序列SEQ ID NO.1的质粒；将该质粒转化农杆菌，将转化的农杆菌用于侵染番茄愈伤组织，获得能够提高番茄果实中糖分、色素含量的转基因植株。采用本发明的转基因番茄果实与野生型番茄果实相比，番茄果实的糖分，番茄红素，beta-胡萝卜素，叶绿素的含量能够得到明显提高。本发明所获得的基因SEQ ID NO.1在研究调控果实色素的积累过程和改良果实营养品质方面具有着重要理论意义和实际立用价值。

Description

一种能够提高番茄果实营养品质的猕猴桃基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及与猕猴桃果实营养品质有关的基因序列，含该基因的真核表达重组质粒及所构建的真核表达载体在番茄果实营养品质改良中的应用方法。

背景技术

果实中的色素含量是影响外部观感的重要因素，糖分、类胡萝卜素、维生素、矿物质含量等决定了果实的营养价值。目前，常采用三种方式来提高果实中色素含量，改善果实营养品质。第一种方式是转化色素合成途经中的结构基因，例如美国《代谢工程》杂志(MetabolicEngineering.2013，17：59-67)介绍了将番茄中转入雨生红球藻β-类胡萝卜素酮化酶和羟化酶，所获得的转基因番茄能够表达虾青素。表达外源结构基因来改良植物营养品质是目前植物工程领域应用最多的技术手段。第二种方式是改变光信号途经中某些基因的表达量可以增加果实中色素的含量。例如《美国科学院院刊》(ProcNatlAcadSciUSA，2004，101：9897-902)介绍，利用RNA干涉技术(RNAi)技术组成型地干涉番茄光形态建成的正调控基因(LeHY5)的表达，使番茄果实的类胡萝卜素含量和叶片中的叶绿素的含量下降，而番茄光形态建成的负调控基因(LeCOPlLIKE)的RNAi转基因番茄，果实中类胡萝卜素的总含量明显提高，叶片呈现深绿色。据英国《植物学报》(PlantJournal，2008，55，89-103)介绍，番茄中存在一类单基因的高色素突变体highpigment-1(hp1)和highpigment-2(hp2)，这类突变体的成熟果实积累的类胡萝卜素总量可以达到野生型的三倍，叶片和未成熟的绿果实中叶绿素的含量也比野生型的高。研究发现这类突变体可能影响红光远红光受体(phytochrome)和蓝光受体(crytochrome)下游的信号转导。第三种方式是改变某些与叶绿体发育有关转录因子的表达，也能够显著的影响果实的品质。如英国《植物学报》(PlantJournal，2002，31：713-727)介绍，转录因子Golden-like(GLK)在多个物种中调控叶绿体发育，如在拟南芥中AtGLK1或AtGLK2任何一个突变不会影响叶片中叶绿体的发育，但AtGLK2会使种子荚颜色变为淡绿色，AtGLK1和AtGLK2的双突变，会使得拟南芥叶片中的发育受到影响。GLKs除与叶片中叶绿体发生有关外，GLKs还与果实中叶绿体的发育有关。美国《科学》杂志(Science，2012，336：1711-1715)报道了在番茄中存在两种与叶绿体发育有关的基因，SlGLK1和SlGLK2，这2个基因在叶片中均表达，但仅SlGLK2在番茄果实中表达。在番茄中分别过表达AtGLKs(AtGLK1或AtGLK2)和SlGLK2均能使番茄色素和糖分含量显著增加，相反若基因SlGLK2突变会导致着果颜色较浅，成熟后颜色均匀，但糖分，类胡萝卜素等含量降低。商业培育者利用该基因的突变筛选出颜色均一，卖相好看，但营养品质欠佳的番茄果实。

《自然-通讯》(Nat.Commun.2013，4：2640)介绍了本发明人课题组前期对红阳猕猴桃进行全基因组测序，组装出了全长为616.1Mb，包含39,040个基因的基因组。通过进一步的生物信息学分析，发现了一个与猕猴桃营养品质有关的转录调控基因。通过RT-PCR和克隆技术，从猕猴cDNA中获得了该基因，将该基因克隆至二元表达载体，二元载体转化农杆菌，转化的农杆菌侵染番茄愈伤组织，愈伤组织再生获得的转基因番茄果实具有较高的色素含量和糖分含量。

尽管基因组数据库(http：//bioinfo.bti.comell.edu/cgi-bin/kiwi/home.cgi)公开了登录号为Achn385381的猕猴桃EST序列，通过生物信息分析，该EST序列可能与果实营养品质有关，但该序列并不完整，而且还未经过生物学功能验证。另外，尽管已有许多研究利用外源基因遗传转化番茄提高番茄果实品质和色素含量，但之前尚未见到有发现影响猕猴桃营养品质的基因以及该基因在改造果实品质方面的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够提高番茄果实中糖分和色素含量的猕猴桃基因序列，包含该序列的真核重组质粒，以及利用该基因和真核重组质粒提高番茄色素和营养品质以获得含有高糖分、高类胡萝卜素含量的番茄品种的方法。

本发明的能够提高番茄果实中糖分、色素含量的猕猴桃基因，是根据对猕猴桃全基因组测序结果，利用生物信息学方法进行注释分析得到一个与果实营养品质有关的EST序列，该序列在猕猴桃数据库中的登录号为Achn385381，其特征在于：根据Achn385381序列设计探针并进行同位素标记，同时提取猕猴桃果实RNA，进行反转录，构建cDNA文库，探针与文库进行杂交，挑取阳性克隆并测序，获得的如序列表所示的猕猴桃基因序列SEQIDNO.1。

本发明的能够提高番茄果实中糖分、色素含量的重组质粒，其特征在于：根据序列SEQIDNO.1设计正向引物和反向引物；分别用所述正向引物和反向引物扩增猕猴桃基因序列SEQIDNO.1，用连接酶连接扩增的PCR产物以及真核表达载体，连接产物转化大肠杆菌，获得转化克隆；所述真核表达载体可选用PBI121、pHB、pMON1772、pBE12、pBC7或pBA。

本发明的能够提高番茄果实中糖分、色素含量的基因和真核重组质粒的应用方法，其特征在于：将含猕猴桃基因序列SEQIDNO.1的真核表达载体转化农杆菌，同时将野生型番茄种子进行浸泡溶胀，用次氯酸钠溶液消毒，然后无菌水清洗，将清洗后的种子放入1/2MS培养基上进行发苗，待子叶发出、真叶长出之前，剪取叶片，置于预培养基上进行培养至产生愈伤，然后将含有猕猴桃基因序列SEQIDNO.1的真核表达载体转化的农杆菌侵染预培养番茄叶片，侵染时间5-20分钟，吸干叶片上的菌液，置于共培养基上培养2-4天，然后将叶片转移至再生培养基上，每20-30天更换再生培养基一次直至幼苗出现，然后将幼苗转移至生根培养基上获得转基因植株。

原公开的猕猴桃EST序列Achn385381仅有420bp，而本发明获得的核酸序列SEQIDNO.1长度为1194个核苷酸，经预测本发明序列含有完整的阅读框；由基因SEQNO.1预测的如后面序列表中所示的氨基酸序列SEQIDNO.2，氨基酸长度为397个氨基酸残基。

将本发明获得的上述含猕猴桃基因序列SEQIDNO.1克隆至真核表达载体，获得含有猕猴桃基因序列SEQIDNO.1的质粒，并将该质粒转化农杆菌，将转化的农杆菌用于侵染番茄愈伤组织，获得能够提高番茄果实中糖分、色素含量的转基因植株。将采用本发明的转基因番茄果实与野生型番茄果实相比，番茄果实的糖分，番茄红素，beta-胡萝卜素，叶绿素的含量能够获得明显提高。结果显示，本发明所述基因和真核重组载体能够提高果实的营养品质。本发明通过基因工程技术克隆获得的基因，在研究调控果实色素的积累过程和改良果实营养品质方面，具有着重要理论意义和实际应用价值。

附图说明

图1为PCR扩增探针杂交阳性克隆所获得的目的基因片段。

图2为采用本发明的植物过表达载体的构建过程示意图。

图3为采用本发明获得的转基因番茄植株PCR鉴定结果的示意图。

图4为采用本发明获得的过表达番茄植株果实与野生番茄不同时期的果实表型比较图片。

图5为采用本发明获得的过表达番茄植株叶片与野生型番茄叶片表型比较图片。

图6为本发明的基因在番茄叶片中的表达。

图7为野生型和采用本发明获得的转基因番茄果实叶绿素a含量比较图。

图8为野生型和采用本发明获得的转基因番茄果实总叶绿素含量比较图

图9为野生型和采用本发明获得的转基因番茄叶片中叶绿素a含量比较图。

图10为野生型和采用本发明获得的转基因番茄叶片中总叶绿素含量比较图

图11为采用本发明获得的过表达转基因番茄与野生型番茄果实中番茄红素的含量比较图。

图12为采用本发明获得的过表达转基因番茄与野生型番茄果实中胡萝卜素的含量比较图。

图13为采用本发明获得的过表达转基因番茄与野生型番茄果实中糖分的含量比较图。

具体实施方式

本发明是通过全基因组测序和生物信息学方法，分离并克隆影响猕猴桃果实品质的基因，并在番茄果实中进行功能鉴定。为进一步理解本发明的内容与目的及其使用方法和效果，下面以实施例详细介绍本发明的具体技术实施步骤。

实施例1：本发明的猕猴桃基因序列SEQIDNO.1的克隆

1.1猕猴桃果实RNA的提取

1.1.1分别用液氮迅速研磨猕猴桃果肉组织，按50-100mg组织/mlTrizol加入Trizol，剧烈震荡，室温放置5min。

1.1.212,000rpm离心5min。

1.1.3取上清，按200μl氯仿/mlTrizol加入氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min。

1.1.4在4℃12,000g条件下离心15min。

1.1.5取上清，按0.5ml异丙醇/mlTrizol加入异丙醇混匀，室温放置10min。

1.1.6在4℃12,000g条件下离心10min，弃上清，RNA沉于管底。

1.1.7按lml75％乙醇/mlTrizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。

1.1.8在4℃8,000g条件下离心5min，尽量弃上清。

1.1.9室温干燥5-10min(RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。)。

1.1.10用50μlDEPC-H₂O溶解RNA样品，55-60℃，5-10min。

1.1.11Poly(A)+RNA的纯化，通常采用Oligo(dT)Cellulose层析法分离Poly(A)+RNA。

1.2猕猴桃果实cDNA文库的建立

使用cDNA文库建立试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司，货号6136)将1.1获得的cDNA克隆构建表达文库，具体的步骤按试剂盒说明书进行。

1.3文库的筛选

1.3.1根据已知猕猴桃基因组序列和EST序列(登录号Achn385381)设计探针，5‘CTCCGATTCCTCGCCCCCGCTGG3’，并进行同位素标记。

1.3.2将1.2获得的克隆文库，在Φ15emLB/Amp(l00μg/mlAmp)平板培养基上按每个平板约产生5万个以下的克隆进行涂布，37℃培养6～8小时。

1.3.3在生长菌落的平板上慢慢铺放尼龙膜，然后在尼龙膜背面用针穿刺做好定位标记。

1.3.4将尼龙膜的菌落面朝上，铺放入另一新的LB/Amp(l00μg/mlAmp)平板培养基上培养数小时，以确保菌落生长。(MasterPlate再培养数小时后4℃保存。)

1.3.5在适当的容器内放入2张滤纸，用0.5NNaOH浸润，将尼龙膜上的菌落面朝上平铺于滤纸上，再用0.5NNaOH浸润尼龙膜30秒钟以上。

1.3.6按照上述1.3.5的方法，使用新的2张滤纸，用lMTris-HCl(pH7.6)处理30秒钟以上。

1.3.7再按照1.3.6的方法使用新的2张滤纸，用lMTris-HCl(pH7.6)/1.5MNaCl处理30秒钟以上。

1.3.8将尼龙膜浸入新的1MTris-HCl(pH7.6)/1.5MNaCl溶液中，慢慢洗去尼龙膜上的菌体残渣。

1.3.9再将尼龙膜浸入新的lMTris-HCl(pH7.6)/1.5MNaCl中洗净。

1.3.10将尼龙膜夹在滤纸内，80℃处理2小时，使DNA固定于尼龙膜上。

1.3.11将滤膜转到盛有150ml预杂交液(20×SSC30ml，100×Demhardt1.5ml，ddH2O118.5ml，其中20×SSC含3mol/LNaCl，0.3mol/L柠檬酸钠，pH7.0；100×Demhardt含牛血清白20g/L，聚乙烯吡咯啶20g/L，聚蔗糖20g/L)的皿中，68℃下预杂交4小时。

1.3.12将步骤1.3.1合成的探针加到杂交袋中杂交过夜。

1.3.13杂交结束后，去除杂交液，立即于室温把滤膜放入大体积(300-500m1)的2×SSC和0.1％SDS溶液中，轻轻振摇5分钟，洗膜2次。

1.3.14用300-500mll×SSC和0.1％SDS溶液68℃条件下洗膜两次，每次1-1.5小时。

1.3.15进行放射自显影，底片显影后，记录显影位置，找出平板对应克隆。

1.3.16挑取阳性克隆测序，获得一株含有如SEQNO.1核酸序列的阳性克隆，其预测的氨基酸序列如最后所附序列表中所示的SEQIDNO.2。

实施例2：本发明的含猕猴桃基因序列SEQIDNO.1的载体构建及其功能鉴定

根据序列表SEQNO.1序列设计正向引物5‘GCTCTAGAATGGAGAGTTTTCTCATGGGGGGAG3′和反向引物5′CGAGCTCTTAGGATATGTCGTCGAATTTAGGGTT3’，其中下划线核酸分别是XbaI和SacI酶切位点，扩增基因片段如图1，其中从左到右，电泳泳道1为分子量Marker，泳道2为扩增的SEQIDNO.1基因片段，大小约1200bp。

2.1为鉴定所克隆的基因功能，设计构建该基因的植物表达载体(图2)。将扩增获得的PCR片段和真核表达载体分别用XbaI和SacI(内切酶均为宝生物工程(大连)有限公司产品)分别用双酶切，酶切条件如下：

PCR产物或真核表达载体：200ng

XbaI10U

SacI10U

10XMbuffer5ul

加ddH₂O至50μl

37℃酶切3h

2.2用凝胶回收试剂盒(Transgene公司产品)分别回收上述酶切片段，操作按说明书进行。

2.3将回收的基因片段用T4连接酶进行连接，反应条件如下：

PCR酶切回收片段：10ng

PBI121载体片段：60ng

5XT4buffer：2ul

T4连接酶：100U

加ddH2O至终体积：10μl

16℃连接过夜。

2.4将上述连接反应体系转化DH5α大肠杆菌，挑取阳性克隆并用PCR验证，用质粒提取试剂盒(Transgene公司产品)提取质粒和并用酶切进行鉴定，结果正确者送测序(南京金斯瑞生物科技有限公司)。

2.5将构建好的植物表达载体转入农杆菌，在含有卡那霉素与利福平(浓度均为50mg/L)的LB固体培养基上划线，28℃暗培养两天，挑取单菌落，作PCR验证后，采用浸染叶盘转化法[McCormickSeta1.Leafdisctransformationofcultivatedtomato(Lesculentum)usingAgrobacteriumtumefaciens.PlantCellRep，l986，5：81-84]转化番茄，获得转基因植株。

2.6农杆菌介导的遗传转化番茄预伤组织鉴定猕猴桃基因序列SEQIDNO.1功能，步骤如下：

2.6.1植物材料的准备

①将番茄种子先浸泡于35℃左右的温水中18-30小时，再浸于浓度为10％的次氯酸钠溶液中10-15分钟，期间摇晃2-3次，最后以无菌水充分漂洗种子3-4次。

②将种子点播于装有1/2MS培养基的中，再进行暗培养2-3天，露白后转移到25℃光照下培养。

③在第一片真叶长出之前剪下子叶。若子叶长度>lem则剪成两半，将子叶正面向下置于预培养培养基上。

2.6.2重组农杆菌的重悬

①将转化阳性农杆菌在含有卡那霉素与利福平的LB固体培养基上划线，28℃暗培养2天，挑取单菌落28℃振荡培养24h。

②取200μl过夜培养物于5mlLB选择培养液，28℃振荡培养过夜。

③转速5000rpm，室温离心l0min。

④弃上清液，加入诱导培养基重悬细菌团，用于转化。

2.6.3愈伤组织的再生和生根

①共培养：分别将预培养过的子叶浸入农杆菌重悬液中15min，取出置于无菌滤纸上吸干外植体表面的液体，放入共培养基中，封口，25℃，16h光照培养3天。共培养培养基不带任何抗生素

②再生培养：将外植体从共培养基中转移至再生培养基中(含羧苄青霉素和卡那霉素)，每日光照16h，25℃；3周后更换培养基，继代培养，直至外植体愈伤组织长出新生芽，分化长茎。

③生根培养：当植株长到2-3em时，切除外植体底部周围多余的愈伤组织，移入生根培养基中，每日光照16h，25℃生根。

④盆栽培养：待幼苗根系发达后移出，转移至盆中，温室中培养，25℃，每日光照16h。

2.7提取转基因幼嫩叶片的总DNA，根据已知的真核表达载体中NPTII筛选标记基因的序列设计引物，NPTII-F：5’TCTCATGCTGGAGTTCTTCGC3’和NPTII-R：5’GTCACCGACTTGAGCCATTTG3’。取转化苗总DNA每个样品各0.5μl为模板，以真核表达空载体作为阳性对照，非转基因植株总DNA作为阴性对照，用上述引物进行PCR扩增，鉴定转基因植株(图3)，图3中M是分子量Marker，l为阳性对照，2-6为转基因番茄植株，7是野生型番茄植株。

图4所示为番茄果实表型，上面一排是不同时期的转基因植株果实的表型；下面一排是与转基因对应时期的野生型植株果实的表型。图5是叶片表型，左一是野生型植株的叶子，右边从左至右依次是转基因植株的K1-K3号株系的叶子。图4和图5结果表明，所获得的转基因番茄不同时期的果实和叶片颜色均较野生型的深。

实施例3：RT-PCR验证猕猴桃基因序列SEQIDNO.1的表达

所用的试验材料包括TaqDNA聚合酶、Trizol试剂、反转录试剂盒购自Transgene公司；PCR引物由南京金斯瑞公司合成；其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。番茄野生型种子为AC+，实验室保存。

3.1番茄的RNA提取

3.1.1分别用液氮迅速研磨番茄组织，按50-100mg组织/mlTrizol加入Trizol，剧烈震荡，室温放置5min。

3.1.212,000rpm离心5min。

3.1.3取上清，按200μl氯仿/mlTrizol加入氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min。

3.1.4在4℃12,000g条件下离心15min。

3.1.5取上清，按0.5ml异丙醇/mlTrizol加入异丙醇混匀，室温放置10min。

3.1.6在4℃12,000g条件下离心10min，弃上清，RNA沉于管底。

3.1.7按lml75％乙醇/mlTrizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。

3.1.8在4℃8,000g条件下离心5min，尽量弃上清。

3.1.9室温干燥5-10min(RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。)。

3.1.10用50μlDEPC-H2O溶解RNA样品，55-60℃，5-10min。

3.2半定量PCR(RT-PCR)

3.2.1反转录PCR

加入以下组分：

按以下程序进行反转录：42℃45min；94℃5min；4℃5min。

3.2.2半定量PCR(RT-PCR)

半定量PCR引物的设计：

内参基因为番茄Ubiquitin3基因(GenBankaccessionno.X58253)，其引物如下，预期扩增片段345bp：

UBI3-F5’-AGAAGAAGACCTACACCAAGCC-3’，

UBI3-R5’-TCCCAAGGGTTGTCACATACATC-3’：

基因的引物如下，预期扩增片段为485bp：

正向引物：5′GAGCAACTAGGGGTGGATAAGG3′，

反向引物：5′GGTGGAATCCCAGGGACAA3′。

反应体系为：

RT-PCR的程序如下：94℃变性5min，94℃30s，退火温度55℃30s，延伸72℃40s38cycles，72℃延伸5min。

鉴定结果如图6所示，上图是ACTIN在番茄中的表达情况，其中A1为野生型番茄，A2-A4为转基因株系K1-K3番茄；下图为猕猴桃基因SEQIDNO.1在果实中的表达情况，其中为B1野生型番茄果实，B2-B4为转基因株系K1-K3番茄。结果表明，在番茄果实表达了猕猴桃基因SEQIDNO.1。

实施例4：叶绿素的测定

采用分光光度法进行测定样品中叶绿素的含量。准确称取3g左右的野生型番茄或转基因番茄，加液氮快速研磨，加入30ml96％的乙醇提取2-3次至残渣无色，滤纸过滤，将上述色素提取液倒入光径1em的比色杯内。以96％乙醇为空白，在波长665nm和649nm下测定光密度，带入下下述公式分别计算叶绿素a(Ca)和叶绿素b(Cb)的含量(单位mg/L)。样品生物重复3次测定。

Ca＝13.95D665-6.88D649

Cb＝24.96D649--7.32D665

组织中叶绿素的含量(mg/g湿重)按以下公式计算：

叶绿素的含量＝(叶素的浓度(C)×取体液体积×稀释倍数)/样品湿重

测定结果如图7-图10所示，其中图7为果实中叶绿素a的含量，柱形图a1是野生型WT叶绿素a的含量0.025mg/g湿重，柱形图b1，c1，d1分别是独立转基因株系K1-K3的叶绿素a的含量较野生型提高了6-9倍，图8是果实中叶绿素的总含量，柱形图a2是野生型WT总叶绿素的含量为0.032mg/g湿重，柱形图b2，c2，d2分别是独立转基因株系K1-K3总叶绿素的含量，与叶绿素a结果相似，转基因植株较野生型提高了6-9倍；图9是叶片中叶绿素a的含量变化，图10是叶片中总叶绿素的含量。由图7-图10结果可以看出，转基因番茄中叶绿素的含量均较野生型番茄有明显的提高。

实施例5：果实中类胡萝卜素和番茄红素含量的测定

采用高效液相色谱仪(Waters公司)测定样品中类胡萝卜素的含量[陈敏，等.反相高效液相色谱法测定枸杞中类胡萝卜素及酯类化合物.分析化学，2006，34：27-30]，色谱条件：二极管阵列检测器(PAD)，色谱柱为反相ODS-C18，流动相1：甲醇-已腈-二氯甲烷-正己烷(15：40：20：20,v/v)；流动相2：乙腈-二氯甲烷(60：42,v/v)；流动相3：甲醇-乙腈(25：75,v/v)，柱温：25度，流速：1ml/min，等度洗脱，检测波长450nm。

样品处理，准确称取3g左右的野生型番茄以及转基因番茄，加液氮快速研磨，加入0.01％BHT抗氧化剂，30ml石油醚-丙酮(2：1)混合溶剂提取2-3次至残渣无色，合并提取液转入分液漏斗，蒸馏水洗去水溶性组分，石油醚层用无水Na₂SO₄干燥，旋转蒸发浓缩至干，定溶至25ml，微孔滤膜滤过后进高效液相色谱仪，在整个提取过程中需避光操作。样品进行3次生物重复测定，取平均值。

对照品的准备，精密称定番茄红素、beta-胡萝卜素各1.00mg，少量二氯甲烷溶解后用HPLC的流动相分别定容至10ml，配制成100mg/L作为对照品溶液。

结果如图11和图12所示，其中图11为过表达转基因番茄与野生型番茄果实中番茄红素的含量比较图，柱形图a5是野生型番茄红素的含量50μg/(g湿重)，b5，c5，d5是独立转基因株系K1-K3的测定结果，番茄红素含量60-80μg/(g湿重)，番茄红素有明显的提高。图12为过表达转基因番茄与野生型番茄果实中胡萝卜素的含量比较图，柱形图a6是野生型beta-胡萝卜素的含量0.8μg/(g湿重)，b6，c6，d6是独立转基因株系K1，K2，K3的测定结果，beta-胡萝卜素含量1.1-1.4μg/(g湿重)，beta-胡萝卜素有明显的提高。图11和图12可以看出转基因番茄果实中番茄红素和beta-胡萝卜素的含量均较野生型番茄有明显的提高。

实施例6：果实中糖度的测定

采用手提式折光仪进行测定(PR-101α，日本)测定番茄果实糖分含量。

图13为过表达转基因番茄与野生型番茄果实中糖分的含量比较图。从图13中给出的测定结果表明：柱形图a7是野生型WT番茄中糖含量，约为5％左右，b7，c7，d7是转基因植株K1-K3糖分含量，糖含量可达8％-11％。

以上实施例1至实施例6是以PBI121为骨架构建的含猕猴桃基因SEQIDNO.1的表达载体所获得的实验结果，本发明人对其它真核表达载体pHB、pMON1772、pBE12、pBC7或pBA为骨架构建含猕猴桃基因SEQIDNO.1的表达载体也获得了类似的实验结果。

本发明所涉及到的细菌和农杆菌培养及农杆菌介导的遗传转化试剂及配方如下：

1.大肠杆菌培养基：

LB培养基(1L)：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，用1mol/L的NaOH调pH至7.5。

2.农杆菌培养基：

YEB液体培养基(1L)：胰蛋白胨5g，酵母抽提1g，牛肉浸膏5g，NaCl：5g，MgCL₂·7H₂O0.493g，pH7.0。

3.农杆菌介导的遗传转化所用培养基及配方如下：

每升基本培养基(MS)包括以下组分：无水CaCl2330mg；KNO31900mg；MgSO₄.7H₂O370mg；NH₄NO₃1650mg；KH₂PO₄170mg；FeSO₄.7H₂O27.85mg；Na₂-EDTA37.25mg；肌醇100mg；烟酸(NicotinicAcid)0.5mg；盐酸吡多醇(Pyridoxine-HCl)0.5mg；甘氨酸(Glycine)2.0mg；盐酸硫铵0.4mg；叶酸(FolioAcid)25mg，生物素(Biotin)2mg；KI8.3mg；H₃BO₃62mg；Na₂MoO₄.2H₂O2.5mg；MnSO₄.4H₂O223mg；ZnSO₄.7H₂O86mg；CuSO₄.5H₂O0.25mg；CoCl₂.6H₂O0.25mg；蔗糖：20g；琼脂粉：7g，其中有机成分除蔗糖和琼脂外均过滤除菌，其余全121℃，20min灭菌。

预培养基：MS+1mg/L6-苄氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)；0.04mg/L吲哚乙酸(IndoleaceticAcid，IAA)

诱导培养基：5mlAB盐；2mlMES缓冲液；2ml磷酸钠盐缓冲液；91ml1％葡萄糖(100ml)

共培养基：MS+0.2mg/LKH₂PO4；0.1mg/L激动素(Kinetin，Kt)；0.2mg/L2,4-二氯苯氧基乙酸(2，4-DichlorophenoxyaceticAcid，2,4-D)；15mg/L乙酰丁香酮(Acetosyringone，ACE)

再生培养基：MS+500mg/L羧卞青霉素钠(Carbenicillin)；50mg/L硫酸卡那霉素(Kanamycin)；2mg/L6-BA；0.2mg/LIAA

生根培养基：MS+500mg/L羧卞青霉素钠；2mg/LIAA。

Claims (3)

1.一种能够提高番茄果实中糖分、色素含量的猕猴桃基因，其特征在于基因序列为SEQIDNO.1所示。

2.一种能够提高番茄果实中糖分、色素含量的重组表达质粒，其特征在于含有权利要求1所述的序列SEQIDNO.1。

3.一种能够提高番茄果实中糖分、色素含量的基因和真核重组质粒的应用方法，其特征在于：将含有SEQIDNO.1序列的真核重组质粒转化农杆菌，转化的农杆菌侵染番茄愈伤组织，筛选获得表达SEQIDNO.1基因序列的转基因番茄植株。