CN102121016A

CN102121016A - 一种基因、重组质粒及在提高番茄果实色素积累中的应用

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Publication number: CN102121016A
Application number: CN2010105985514A
Authority: CN
Inventors: 刘永胜; 高永峰; 李颖楠; 刘继恺; 唐晓凤; 张治国; 苗敏
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2010-12-21
Filing date: 2010-12-21
Publication date: 2011-07-13
Anticipated expiration: 2030-12-21
Also published as: CN102121016B

Abstract

一种基因，它具有序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。一种真核重组质粒，由序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的基因片段和真核表达载体构成，所述基因片段是起始密码子下游1135bp至1549bp的核苷酸序列，所述基因片段正向和反向插入真核表达载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子。制备方法：(1)将上述基因片段正向插入到pSK载体上，再将该基因片段反向插入已含正向插入基因片段的pSK载体；(2)利用限制性内切酶切下pSK载体上含有所述基因片段的部段连接到真核表达载体上。实验表明，所述真核重组质粒可在提高番茄果实色素积累中应用。

Description

一种基因、重组质粒及在提高番茄果实色素积累中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种调控番茄果实色素积累的基因、真核重组质粒及其制备方法与应用。

背景技术

番茄红素是重要的抗氧化剂之一，具有清除活性氧自由基、促进细胞间隙连接通讯、防癌抗癌等多种生理功能。

近年来基因工程从对结构基因的遗传操作已拓展到对调节基因的遗传操作(Gantet P et al.，2002，Trends Pharmacol Sci，23：563-9；Wagoner W et al.2003，Activation tagging in tomato identifies a transcriptional regulator of anthocyanin biosynthesis，modification，and transport.Plant Cell，15：1689-703)。通过RNA干扰技术(RNAi)获得目标基因表达水平降低的转基因植株，再观察转基因植株的表现型来研究基因的功能，也就是功能基因组学研究中应用最广泛的反向遗传学方法。如，利用CaMV35S启动子在番茄中过量表达燕麦的红光和远红光受体光敏素(PHYA)可以引起番茄果实高色素表现型，叶片和果实颜色加深，但植株矮化(Boylan MT，Quail PH.1989，Oat phytochrome is biologically active in transgenic tomatoes.Plant Cell，1：765-73)。过量表达蓝光受体隐花色素(CRY2)基因也可以提高果实中类黄酮和番茄红素的含量，叶片中叶绿素和花青素含量提高，植株矮化(Leonardo G，et al.，2005，Manipulation of the Blue Light Photoreceptor Cryptochrome 2 in Tomato Affects Vegetative Development，Flowering Time，and Fruit Antioxidant Content.Plant Physiology，137：199-208)。利用RNAi技术组成型地干涉光形态建成的正调控基因LeHY5的表达，使番茄果实的类胡萝卜素含量和叶片中的叶绿素的含量下降，而光形态建成的负调控基因LeCOP1LIKE的RNAi转基因番茄果实中类胡萝卜素的总含量明显提高，叶片呈现深绿色。(Liu YS，et al.，2004， Manipulation of light signal transduction as a means of modifying fruit nutritional quality in tomat

综上所述，现有技术中虽然公开了一些用于调控番茄果实色素积累的基因，但通过基因工程技术克隆和筛选出更多的调节基因，对提高番茄果实色素积累，培育品质优良的番茄仍然有着重要的作用。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种新的基因、真核重组质粒及其制备方法，本发明的目的之二是将所述基因和真核重组质粒在提高番茄果实色素积累中应用，以培育出品质更好的番茄。

本发明的技术方案如下：

利用生物信息学方法分析确定一个与质体分裂调控有关的基因HP1(Gene Bank：AY531660.1)作为诱饵基因构建到PLexA酵母双杂交系统的表达载体中，然后利用番茄果实发育的目标基因文库(所述文库及其构建见实施例1)筛选到与HP1基因相互作用的目标基因，命名为HP5(high-pigment 5)基因。序列分析显示基因HP5的mRNA包含1551个碱基的开放阅读框，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。在DFCI网站(http://compbio.dfci.harvard.edu)找到7个EST (expressed sequence tag)，显示该基因可能是番茄的一个调节基因。

本发明所述真核重组质粒，由序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的基因片段和真核表达载体构成，所述基因片段是位于起始密码子下游1135bp至1549bp的核苷酸序列，将所述基因片段正向和反向插入真核表达载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子。

本发明所述真核重组质粒的制备方法，其特征在于步骤如下：

(1)在序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中选择一段基因片段，所选择的基因片段是位于起始密码子下游1135bp至1549bp的核苷酸序列，将所述基因片段正向插入到质粒pSK载体上形成中间载体，再将该基因片段反向插入已含正向插入基因片段的pSK中间载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子；

(2)利用限制性内切酶切下pSK中间载体上含有正向插入与反向插入的基因片段的部分，然后连接到真核表达载体上，即获真核重组质粒。

本发明所述真核重组质粒及其制备方法中，所述真核表达载体为pHB、pMON1772、pBE12、pBC7、pBI121中的一种。

将本发明所述真核重组质粒转化番茄，获得转基因番茄植株。实验表明：所述转基因番茄植株的未成熟果实颜色明显深于野生型番茄植株的未成熟果实；对成熟的转基因番茄果实和野生型番茄果实的番茄红素的含量进行测定显示：与野生型番茄的番茄红素含量相比，转基因番茄的番茄红素含量有明显的提高。由此可见，本发明所述基因HP5和真核重组质粒能够调控质体的发育和调控番茄果实色素积累，可在提高番茄果实色素积累中应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明通过酵母双杂交系统筛选，克隆了一个新的基因HP5，并从该基因的核苷酸序列中选择了一段基因片段与真核表达载体构建真核重组质粒，为提高番茄果实色素积累提供了一种新的真核重组质粒，有利于番茄品质的改良。

2、本发明所用的基因为番茄本身自有的基因，所以转基因番茄的安全性能高。

3、本发明所述基因的克隆和番茄转基因均为常规方法，所需材料易于获取。

附图说明

图1是本发明所述基因HP5全长序列的扩增电泳图，图中，M泳道：分子量标记(Trans2k plus DNAMarker，购自TRANS公司)；1泳道：基因HP5的全序列。

图2是本发明所述真核重组质粒(pBI121-HP5RNAi)的一种示意图，其中，sense为正向基因片段，anti-sense为反向基因片段。

图3是真核重组质粒pBI121-HP5RNAi转基因番茄植株中转基因抗性筛选标记卡那霉素抗性基因(NPTII)的PCR扩增结果图，图中，M泳道：Marker(DL2000)；P泳道：阳性对照，PCR模板为真核重组质粒pBI121-HP5RNAi；C泳道：阴性对照，PCR模板为野生型番茄植株DNA；1-7泳道：PCR模板为候选的转基因番茄植株DNA。

图4是番茄植株的RT-PCR鉴定结果图，图中，WT泳道：野生型番茄植株；1泳道：真核重组质粒pBI121-HP5RNAi转基因番茄1号植株；2泳道：真核重组质粒pBI121-HP5RNAi转基因番茄2号植株；3泳道：真核重组质粒pBI121-HP5RNAi转基因番茄3号植株。

图5是真核重组质粒pBI121-HP5RNAi转基因番茄植株叶片和野生型叶片的颜色对比照片，从左至右计数，第1～3片番茄叶分别为pBI121-HP5RNAi转基因番茄1号、2号、3号植株的叶片；第4片番茄叶为野生型番茄植株的叶片。

图6是真核重组质粒pBI121-HP5RNAi转基因番茄植株叶片和野生型番茄植株叶片叶绿素含量测定的统计图，图中，WT代表野生型番茄植株，

图7是真核重组质粒pBI121-HP5RNAi转基因番茄果实和野生型番茄果实在绿肩(green shoulder)期间的色素含量对比照片，其中，A为野生型番茄果实；B、C、D为分别为pBI121-HP5RNAi转基因番茄1号、2号、3号的果实。

图8是真核重组质粒pBI121-HP5RNAi转基因番茄植株和野生型番茄植株在相同的生长环境下生长60天后植株的表型对比照片，图中，WT代表野生型番茄植株。

图9是真核重组质粒pBI121-HP5RNAi转基因番茄植株和野生型番茄植株节间长的统计分析图，图中，WT代表野生型番茄植株。

图10是根据紫外分光光度计测定番茄红素标准品的吸光值绘制的标准曲线图。

图11是真核重组质粒pBI121-HP5RNAi转基因番茄果实中的番茄红素含量和野生型番茄果实中的番茄红素含量测定统计分析图，图中，WT代表野生型番茄植株。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook，Russell的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：番茄果实发育的目标基因文库(cDNA)构建

1、番茄果实Total RNA的提取

1)液氮迅速研磨番茄果实(直径2-3cm的绿色果实)，按50-100mg组织/ml Trizol(购自北京天为时代科技有限公司)加入Trizol，剧烈震荡，室温放置5min。

2)212,000rpm离心5min。

3)取上清，按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min。

4)4℃12,000g离心15min。

5)取上清，按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置10min。

6)4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。

7)按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。

8)4℃8,000g离心5min，尽量弃上清。

9)室温干燥5-10min(RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。)。

10)用50ul DEPC-H2O溶解RNA样品，55-60℃，5-10min。

2.、磁珠法分离mRNA(promega mRNA分离试剂盒，购于宝信生物技术有限公司)

1)在RNase-free的Eppendorf管中加入0.1～1.0mg的总RNA和RNase-free水至终体积为500ul.

2)65℃加热10分钟。

3)加入3ul生物素标记的Oligo(dT)和13ul 20×SSC于RNA中，轻轻混合，室温放置逐渐冷去至室温，一般需10分钟左右。

4)同时配0.5×SSC 1.2ml和0.1×SSC 1.4ml.

5)将磁珠(SA-PMPs)轻晃散开，放入磁性分离架上，使SA-PMPs集中于管的一侧(约30sec)，小心去上清，切不可离心。用0.3ml 0.5×ssc漂洗SA-PMPs，用磁性分离架集中磁珠，去除上清，重复3次。

6)将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0.1ml 0.5Xssc，注意漂洗后的SA-PMPs应在30分钟内使用。

7)将(3)中的oligo(dT)/mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA-PMPs管中，轻轻摇匀，室温下放10分钟。

8)用磁性分离架捕获SA-PMPs，小心去上清，但不要弃去。

9)用0.1×SSC，每次0.3ml洗3次，每次都晃至SA-PMPs悬浮，最后一次漂洗后尽可能多的吸取水相，而不损坏SA-PMPs。

10)将SA-PMPs重新悬浮在0.1ml RNase-free水中，反复颠倒，使SA-PMPs散开，洗脱mRNA。

11)用磁性分离架捕获SA-PMPs，将洗脱的mRNA吸入另一个新的Eppendorf管中。

12)将SA-PMPs再悬浮于0.15ml RNase-free的水中，洗脱，与(11)步洗脱液合并。

13)将得到的mRNA溶液取几微升跑电泳，若mRNA浓度不足以进行下一步的反转录，则需将得到的mRNA溶液浓缩(浓缩步骤见14-18)。

14)加0.1体积的3mol/l NaAc和1.0体积的异丙醇于洗脱液中，-20℃沉淀过夜。

15)4℃，13000g离心60分钟。去上清，加入500ul 70％乙醇混匀。

16)4℃，7500g离心10分钟。

17)去上清，真空或空气中自然风干，但不要太干，加适量RNase-free水溶解。

18)重复步骤5-12，将步骤8保留下的样品重新上柱。

3、cDNA双链合成(promega cDNA文库构建试剂盒，购于宝信生物技术有限公司)

3.1Superscipt II-RT合成第一链：

1)在一RNase-free的0.2ml PCR管中，加入

5ul mRNA(大约500ng)

1ul Xho I Primer(1.4ug/ul)

(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT...3’)

6ul RNase-free water

2)混匀后，70℃反应10分钟。

3)反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5min。

稍微离心一下，顺序加入以下试剂：

5×first strand buffer，4ul；0.1M DTT，2ul；10mM dNTP，1ul；混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟；反应完成，趁热加入1ul Superscipt II-RT，混匀；42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶。

3.2cDNA第二链的合成：

1)第一链反应完成后，取2ul一链产物-20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega)：

10×DNA Polymerase I buffer，20u l；10mM dNTP，6ul；dd H2O，163ul；RNase H(2U/ul)，1ul；DNA Polymerase I(10U/ul)，10ul；总体系为200ul。

2)混匀后，16℃反应2.5小时。

3)70℃灭活10分钟。

4)反应完成后，得到200ul cDNA第二链反应体系，将此体系置于冰上。

5)取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。

3.3双链cDNA末端补平

1)在第二链反应体系中，顺序加入下列试剂(promega cDNA文库构建试剂盒，购于宝信生物技术有限公司)：

10mM dNTP，6ul；T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)，2ul；BSA(10mg/ml)，2ul。

2)稍微离心混匀反应物，37℃反应至少30分钟，然后75℃灭活10分钟。

3)加入等体积酚/氯仿/异戊醇，剧烈振荡后，常温下13000g离心5分钟。

4)离心后，吸取上清于另一1.5ml eppendof管中，加入等体积氯仿，上下颠倒几次混匀后，常温下13000g离心5分钟。

5)吸取上清至另一eppendof管，加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇，混匀，-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA。

6)第二日，将昨日沉淀物在4℃，13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA。

7)离心完毕，弃上清，加入1ml 70％乙醇洗涤沉淀，常温下13000g离心5分钟。

8)离心完毕，弃上清，干燥沉淀至无乙醇气味。

9)PCR纯化试剂盒操作流程：

9-1)溶液PE使用前应加入适量体积95％-100％的乙醇，混匀。

9-2)向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。

9-3)加入spin column中，13000rpm离心1min。

9-4)加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。

9-5)13000rpm，再离心1min。

9-6)将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。

9-7)13000rpm离心2min。

9-8)加入30ul buffer EB，静置10min。

9-9)13000rpm离心2min。

9-10)加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，-20℃沉淀过夜。

3.4EcoR I接头(adaptor)加接：

1)往双链cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul)，4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀。

2)溶解完成后，顺序加入下列试剂：

10×Ligase Buffer，1.2ul；10mM rATP，1ul；T4DNA Ligase(4U/ul)，1ul。

3)混匀后，4℃连接3days，或者8℃过夜连接。

3.5双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切：

1)连接反应完成后，将反应体系70℃放置15分钟灭活T4DNA Ligase。

2)稍微离心使反应物集中至管底，室温下放置5分钟，然后加入下列试剂：

10×Ligase Buffer，1ul；10mM rATP，1ul；dd H2O，6ul；T4PNK(10U/ul)，1ul。

3)37℃反应30分钟，然后70℃灭活15分钟。

4)稍微离心使反应物集中至管底。

5)室温放置5分钟；然后加入下列试剂：

Xho 10×Buffer，4ul；BSA，2ul；ddH2O，5ul；Xho I(10U/ul)，8ul。

6)37℃反应1.5小时，然后65℃灭活酶10分钟。

7)反应完成，双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。

3.6胶回收cDNA(QIAEXII GEL Extraction Kit回收试剂盒，购于保守宝信生物技术有限公司)

1)配制小胶数板(每个样品一板)：1％琼脂糖凝胶，2ul EB/300ml胶。

2)取4℃保存样品上样，40ul/孔。

3)电泳50V；1hr。

4)紫外灯下分别切下500～1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。

5)称取胶重，加入三倍体积buffer QXI(例如，100mg胶中加入300ul buffer QXI)。

6)50℃水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹QIAEX II使重悬，每管中加入5ulQIAEXII。

7)50℃水浴10min，每隔2min取出颠倒混匀数次，使QIAEX II保持悬浮。

8)4℃，13000rpm，30sec。(弃上清，离心机中甩一下，吸取上清)。

9)加入500ul buffer QXI，轻弹管底使QIAEX II重悬。

10)离心并去上清(同操作8)。

11)加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，去上清。

12)再加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清。

13)超净台上吹干(至无乙醇味)，加入10ul elution buffer，重悬QIAEX II，静置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。

14)取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准(1kb ladder)及DNA含量标准(10ng，20ng)作对照。

15)将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。

4、载体制备

4.1pBlueScriptII的提取(promega cDNA文库构建试剂盒，购于宝信生物技术有限公司)

1)取1ul商品的pBlueScriptII，转化入大肠杆菌宿主菌中，取5ul转化产物均匀涂布在含AMP的LB平板上，37℃培养过夜。

2)第二天取一只无菌的50ml离心管，加入10ml AMP抗性的LB液体培养基，挑单克隆于离心管中，37℃，250rpm，培养过夜。

3)第三天取200μl小摇后的菌液接种于250ml含AMP的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养6hr左右，使OD值达到0.6-0.8。

4)将菌液移入250ml离心管中，4℃，3000rpm，离心15min。取出离心管，菌团朝上倒掉上清，将离心管倒置于吸水纸上使上清充分滤干。

5)加入10ml溶液I(50mM Glucose，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)，加入RNase至终浓度100μg/ml，晃动摇菌，使菌体充分悬浮，静置10min。

6)按NaOH(0.4N)∶SDS(2％)--1∶1的比例新鲜配制溶液II，加入20ml溶液II，静置3-5min。

7)加入15ml冰浴的溶液III，冰浴15-30min。

8)4℃，5000rpm，离心15min。

9)取上清于两个50ml离心管中，弃去原离心管中的沉淀。

10)每管加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀，室温下放置10min。

11)20℃，12000g，离心20min回收质粒沉淀。

12)弃上清，用70％的乙醇洗2次。

13)弃上清，倒扣于吸水纸上，尽量空干液体。

14)用3ml TE(pH8.0)溶解沉淀，移入1.5ml Eppendorf离心管中。

15)电泳检查DNA质量并定量。

4.2pBlueScriptII的双酶切消化

1)以如下体系进行EcoRI酶切：

pBSK(+)，20μl；ddH2O，154μl；10×Buffer E，20μl；混匀，加入限制性内切酶：EcoRI(10U/μl)，6μl；总体积为，200μl。

2)轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下。

3)37℃，水浴1hr。

4)加入200ul 1∶1的酚/氯仿，混匀。4℃，13000rpm，离心15min。

5)取上清，加入等体积的氯仿，4℃，13000rpm，离心10min。

6)取上清，加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃，沉淀30min。

7)4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。

8)加入200ul 70％的乙醇洗沉淀。

9)4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。

10)自然风干沉淀，至无乙醇味，加入100ul ddH2O充分溶解沉淀。

11)加入以下试剂进行XhoI酶切：

ddH2O，74μl；10×Buffer D，20μl；混匀，加入限制性内切酶XhoI：XhoI(10U/μl)，6μl；总体积为200μl。

12)轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下。

13)37℃，水浴1.5hr。

14)加入200ul 1∶1的酚/氯仿，混匀。

15)4℃，13000rpm，离心15min。

16)取上清，加入等体积的氯仿，4℃，13000rpm，离心10min。

17)取上清，加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃，沉淀30min。

18)4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。

19)加入200ul 70％的乙醇洗沉淀。

20)4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。

21)自然风干沉淀至无乙醇味，加入40ulddH2O充分溶解沉淀，得到双酶切载体。

4.3载体去磷酸化

1)在40ul双酶切载体中加入以下试剂：

10×buffer，6ul；CIAP(0.01U/ul)，6ul；ddH2O，8ul；总体积60ul。

2)轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下。

3)37℃，水浴1hr。

4)70℃，15min，灭活酶。

5)电泳分离，胶回收双酶切载体，定量。

5、cDNA双链和载体的连接：

根据载体和cDNA的电泳定量结果，每个样品设置3个比例的连接，即：insert/vector＝1/3 incert/vector＝1/1 insert/vector＝3/1

按以下体系依次加入： ddH2O xul

T4ligase 10x buffer 1ul

PBK(E/X)vector(20ng/ul) 1ul

cDNA(由浓度及连接比例而定)

T4DNA ligase(3U/ul) 1ul

Total 10ul

14℃，连接12小时。

6、连接产物纯化和电转化

6.1连接产物纯化

1)将连接产物转移至一1.5ml Eppendorf管中，加入下列试剂：

ddH2O，10u l；3M NaAC(PH5.2)，2ul；无水乙醇，50ul；轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上。

2)4℃，top Speed离心30分钟。

3)小心移去上清，避免接触到管底的沉淀物；

4)加入500ul70％的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀(注：不要离心混匀)。

5)4℃，top Speed离心5分钟。

6)小心移去上清，将此Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味。

7)加入10ulddH2O重新溶解沉淀，4℃短期保存，-20℃长期保存备用。

6.2电转化

1)从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻。

2)取1μl纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。

3)将40～100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml的离心管中，小心混匀，冰上放置10min。

4)打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。

5)将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部。

6)将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1000μl的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。

7)37℃，220-250rpm复苏1小时。

8)取20ul转化产物加160ulSOC涂板，放于37℃温室，过夜培养，次日查看转化结果，其余菌液加1∶1的30％的甘油后混匀-80℃保存。

7.菌落PCR

1)取适量PCR薄壁管，置于冰上，每管先加入17.3ul的灭菌水。

2)用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中，振荡混匀。

3)依次加入：

10xbuffer 2.5ul

Mgcl2(25mM) 1.8ul

DNTP(2.5mM) 1ul

T3引物(10pmol) 1ul

T7引物(10pmol) 1ul

Taq酶 0.4ul

total 25ul

各试剂均加好后，离心机上甩一下，使之沉底，置于PCR仪上

4)反应条件：94℃5min(预变性)；94℃40s(变性)，53.6℃30s(复性)，72℃4min(延伸)，所述变性-复性-延伸35个循环；72℃5min(终延伸。)

5)待PCR反应进入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳，同时上1Kb DNA ladder。半小时后照相，观察胶图，根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。

6)将快速鉴定和菌落PCR检测合格的文库送检。

8.pBlueScript cDNA库扩增

1)将cDNA文库转入大肠杆菌，如DH5a(DH10B)后，取少量菌液涂布氨苄平板，以推算克隆总量。

2)取一大小合适的三角瓶，根据克隆总量配制2x LB液体，每500ml 2x LB液体可扩增5x105个克隆，可以适当增加2x LB液体的量，但不能少于此比例。

3)按每100ml加0.3g的比例在2xLB液体中加入琼脂糖。

4)70℃加热搅拌至琼脂糖溶解，高压灭菌后再70℃搅拌30分钟。

5)37℃放置1小时。

6)加入适量安苄青霉素，使之终浓度为50ug/ml。

7)加入全部菌液，并轻柔旋转使之混匀，避免振荡。

8)将三角瓶置于冰水中1小时，水面必须没过三角瓶内液面。

9)轻轻取出三角瓶，30℃培养40-45小时。

10)将三角瓶内容物全部转入离心管中，离心10,000g，20分钟，必须室温。

11)弃上清，每100ml培养基离心得到的沉淀用10ml 2x LB-甘油(12.5％)重悬。

12)将重悬液留下10ul检测滴度，其余分装于1.5ml离心管，-80℃冰箱内保存。

13)取1ul扩增后菌液倍比稀释。

14)各取10ul稀释为10-5和10-6的菌液涂布于含安苄青霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养，次日计算其克隆数以及扩增后总克隆数。

通过本实施例获得了番茄果实发育目标基因的cDNA文库。

实施例2：利用酵母双杂交实验筛选与HP1基因相互作用的目标基因

1、培养基与试剂

1.1SD/-Ura液体培养基

酵母氮源(YNB)，0.67g；葡萄糖，2.00g；10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)，10.0ml；20×His，5.0ml；20×Leu，5.0ml；20×Trp，5.0ml；ddH2O至100.0ml；115℃，灭菌15min。

1.2YPD液体培养基

Polypepton，6.0g；bacto-Yeast Extract，3.0g；葡萄糖，6.0g；ddH2O补至300ml，115℃，灭菌15min。

1.310×Dropout(-His，-Trp，-Leu，-Ura)氨基酸溶液

为不含His，Trp，Leu，Ura等成份的10×Dropout溶液。

每1000ml溶液中含有下列成份，用ddH2O配制后保存于4℃。

1)L-Isoleucine L-异亮氨酸 300mg

2)L-Valine L-缬氨酸 1500mg

3)Adenine腺嘌呤 200mg

4)L-Arginine HCl L-精氨酸 200mg

5)L-Lysine HCl L-赖氨酸盐酸盐 300mg

6)L-Methionine L-甲硫氨酸 200mg

7)L-Phenylalanine L-苯丙氨酸 500mg

8)L-Threonine L-苏氨酸 2000mg

9)L-Tyrosine L-酪氨酸 300mg

1.4 20×氨基酸储存液

每100ml溶液中分别含有下列成份，配制后保存于4℃。

20×His L-Histidine L-组氨酸 40mg

20×Trp L-Tryptophan L-色氨酸 40mg

20×Leu L-Leucine L-白氨酸 200mg

20×Ura Uracil尿嘧啶 40mg

1.5酵母转化缓冲液：

缓冲液体积缓冲液配制

10×TE：100ml Tris 1.21g；EDTANa2·2H2O 0.37g；ddH2O 80ml；盐酸调pH7.5；ddH2O

定容

10×LiAc：100ml LiAc·2H2O 10.20g；ddH2O 50ml，冰醋酸调pH7.5；ddH2O定容

50％PEG：100ml PEG335050.0g；ddH2O定容

1.6其它缓冲液：

缓冲液体积缓冲液配制

TE 1000ml；Tris 1.21g；EDTANa2·2H2O 0.37g；ddH2O 800ml；调pH；ddH2O定容。

STE 1000ml：NaCl 5.84g；Tris 1.21g；EDTANa2·2H2O 0.37g；ddH2O 800ml；盐酸调pH8.0；ddH2O定容

2、酵母双杂交实验的基本流程

2.1将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选。

2.2同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。

2.3构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-HP1，作为钓饵(bait)。

2.4将上述钓饵质粒pLexA-HP 1转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株，用SD/-His/-Ura筛选；

并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。

转化质粒选择培养基克隆生长情况说明

pLexA-Pos SD/-His，-Ura 蓝阳性对照

pLexA SD/-His，-Ura 白阴性对照

PLexA-HP1 SD/-His，-Ura 白没有直接激活活性

PLexA-HP1 SD/-His，-Ura 蓝具有直接激活活性

PLexA-HP1 SD/-His，-Ura 菌落不能生长酵母细胞毒性

1)如果pLexA-HP1能够自动激活报告基因，则设法去除其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组，减少半乳糖苷酶的信号作用。

2)如果pLexA-HP1虽然不会自动激活报告基因，但对酵母宿主细胞有毒性，则需要与纯化的文库DNA同时转化酵母。

2.5如果pLexA-HP1既不会自动激活报告基因，也不具有毒性，则可以与实施例1纯化的文库DNA同时、或顺序转化酵母细胞，并检测质粒转化效率。

转化质粒SD固体培养基LacZ表型

对照1pLexA-Pos Gal/Raf/-His/-Ura蓝

对照2pLexA-53Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu+pB42AD-T蓝

实验pLexA-HP1Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu+pB42AD-文库待测

1)用SD/-His/-Trp/-Ura培养基选择阳性共转化子，并扩增，使宿主细胞中的质粒在诱导前达到最大拷贝数。

2)上述重组转至含X-gal的固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，观察LacZ及Leu报告基因的表达情形，蓝色克隆即为阳性。白色克隆为假阳性，说明Leu虽有表达，但半乳糖苷酶无表达。

3)同时用LacZ、Leu两个报告基因的目的，是为了尽可能消除实验的假阳性误差，譬如：AD融合蛋白不与目标蛋白结合，而直接与启动子序列结合域结合等情况。由于2个报告基因的启动子不同，出现上述假阳性的几率就大大减少了。

4)将蓝色阳性克隆进行1次以上的划种，尽可能分离克隆中的多种文库质粒。

2.6阳性克隆的筛选

1)随机选取50个阳性克隆，扩增、抽提酵母质粒，电转化E.coli KC8宿主菌，抽提大肠杆菌中的质粒，酶切鉴定是否具有插入片段及排除相同的文库质粒。

2)如果重复的插入序列较多，可另取50个阳性克隆来分析。最后得到数种片段大小不同的插入序列，再转化新的宿主细胞，检测是否仍为阳性克隆。

2.7用质粒自然分选法(Natural Segregation)筛除只含有AD-文库杂合子的克隆

1)将初步得到的阳性克隆接种SD/-Trp/-Ura液体培养基，培养1-2天，含有HIS3编码序列的BD-靶质粒在含有外源His培养基中，将以10％-20％左右的频率随机丢失。

2)30℃孵育2-3，将上述克隆，转铺固体培养基SD/-Trp/-Ura。

3)再挑取生长的单克隆，转入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培养基中，筛选His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文库杂合子的重组子。

4)将His表型缺陷的克隆转化固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura，以验证AD-文库能否直接激活报告基因的表达，弃去阳性克隆，保留阴性克隆。

2.8酵母杂合试验(Yeast Mating)确定真阳性克隆

如下表所示，在酵母EGY48及其对应的YM4271宿主细胞中分别转入相应的质粒或文库DNA，通过杂合实验确筛选pLexA-HP1与pB42AD-文库确实具有相互作用的真阳性克隆。

质粒1

(in YM4271)质粒2

(in EGY48)LacZ表型Leu表型

pLexA pB42AD白不能生长

pLexA-HP 1pB42AD白不能生长

pLexA pB42AD-文库白不能生长

pLexA-HP 1pB42AD-文库蓝真阳性

pLexA-Lam pB42AD-文库白不能生长

2.9阳性克隆的进一步筛选和确证

1)扩增初步确定的阳性克隆，抽提酵母DNA。该DNA为混合成份，既含有酵母基因组DNA，也含有3种转化的质粒DNA。

2)将上述DNA电转化E.coli KC8宿主菌。由于在大肠杆菌中，具有不同复制起始调控序列的质粒不相容；同时利用营养缺陷型筛选。因此，在M9/SD/-Trp培养基上，只有含有AD-文库质粒的转化菌才能生长，将其扩增、并抽提质粒DNA，酶切鉴定。

3)用pLexA-HP1与pB42AD-库DNA一一对应、共转化只含有报告基因的酵母菌EGY48中，先到SD/-His/-Trp/-Ura板扩增，并与后面的诱导板形成对照，说明报告基因的表达与诱导AD融合蛋白的表达有关，再确证LacZ、Leu报告基因的表达。

4)扩增与靶DNA相互作用的文库DNA，进行序列分析及进一步的结构、功能研究。

通过本实施例获得一个与HP1基因相互作用的新基因，命名为HP5(high-pigment 5)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

实施例3：基因HP5的克隆

1、试剂

限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、PrimeStar热启动高保真DNA聚合酶、pMD18-T克隆载体、大肠杆菌(E.coli)JM109菌株等购自大连宝生物工程公司；Trizol试剂购自北京天为时代科技有限公司；质粒提取及DNA回收试剂盒购自OMEGA公司；PCR引物由上海英俊生物公司合成；其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、大肠杆菌菌株和植物材料

大肠杆菌克隆菌株为E.coli JM109，购自Clontech公司。番茄野生型种子为AC⁺，可通过市场购买。

3、培养基和溶液

LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

SOB培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L，NaCl 0.58g/L，KCl 0.19g/L，100×Mg²⁺10mL。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

SOC培养基：SOB+20mM葡萄糖。

TB buffer(临用前配置)：1MKCl 4mL，0.45MMnCl₂2.4mL，0.50M CaCl₂0.6mL，0.50M K-MES 0.5mL，ddH₂O 12.5mL(总体积20mL)。

100×Mg²⁺溶液：20.33g MgCl₂.6H₂O；24.65g MgSO₄.7H₂O定容于100mL H₂O，高压灭菌。

20％葡萄糖溶液：20g葡萄糖定容于100mL H₂O，过滤除菌。

1M KCl溶液：7.45g KCl定容于100mL H₂O，高压灭菌。

0.45M MnCl₂溶液：8.9g MnCl₂.4H₂O定容于100mL H₂O，高压灭菌。

0.50M CaCl₂溶液：7.35g CaCl₂.2H₂O定容于100mL H₂O，高压灭菌。

0.50M K-MES溶液：9.76g MES定容于100mL H₂O，用KOH调pH至6.3，过滤除菌，分装成0.5mL每管，-20℃储存。

DMSO：分装200μl新鲜DMSO，-20℃储存。

4、实验方法

4.1质粒微量提取

1)将带有克隆载体pMD18-T质粒(购自大连宝生物工程公司)的E.coli JM109接种于裝有5ml LB培养液(含适量抗生素)的试管中，37℃摇床培养12～16hr，以扩增质粒。

2)取1.5～5ml的菌液，于室温下10,000xg离心1min。倒净培养基，往沉淀中加入250μl的solution I/RnaseA(购自OMEGA公司)混和液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮。

3)往重悬混和液中加入250μl solution II(购自OMEGA公司)，轻轻翻转试管4～6次混和溶液，以获得一澄清的裂解液。

4)往上述混和液中加入350ul solution III(购自OMEGA公司)，并温和地上下颠倒离心管数次，直至形成白色絮狀沉淀。于室温下10,000xg离心10min。

5)取一干净的质粒微量分离柱置于2ml收集试管上(已备)。小心将上清转至质粒微量分离柱內，确保转至柱內的上清中没有细胞杂质沉淀。于室温下10,000xg离心1min，使裂解液完全流过柱子。

6)弃去离心甩出液，加入500μl的solution HB缓冲液(购自OMEGA公司)到柱子上，室温下10,000xg离心1min洗涤柱子，确保除去残余的蛋白质以得到后面操作所需的高质量DNA。

7)弃去收集液，加入700μl用无水乙醇稀释的wash buffer缓冲液洗涤柱子，室温10,000xg离心1min，弃去洗涤液。

8)可选做步骤：重复步骤7，用700μl wash buffer缓冲液再洗涤柱子一次。

9)室温下10,000xg离心空柱2min以甩干柱子基质。

10)把柱子置于一干净的1.5ml离心管上，直接加入30～50μl灭菌去离子水或TE缓冲液液到柱子基质上(所加的量取决于预期终产物浓度)，10,000xg离心1min以洗脱出DNA。

4.2DNA回收方案

见实施例1的3.6胶回收方案。

4.3番茄叶片RNA的提取

见实施例1的1.番茄果实Total RNA的提取。

4.4RT-PCR

1)RT

冰上在一个200μl EP管中加入以下组分：

5×RT Buffer 4μl

dNTP Mixture(各10mM) 2μl

RNase Inhibitor(10U/μl) 1μl

Oligo(dT)₂₀(10pmol/μl) 1μl

Total RNA 3μl

RNase-Free H₂O 8μl

ReverTra Ace 1μl

按以下程序进行反转录：42℃20min(反应)；99℃5min(酶变性)；4℃5min(保存)。

2)PCR

1))番茄基因HP5的克隆

冰上在一个的200μl EP管中加入以下组分：

5×PrimeStar Buffer 10μl

dNTP Mixture(各2.5mM) 4μl

RT产物 1μl

HP5-F1 1μl

HP5-R1 1μl

ddH₂O 32.5μl

PrimeStar 0.5μl

按以下程序进行扩增：98℃3min(预变性)；98℃10s(变性)，58℃15s(复性)，72℃2min(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃5min(终延伸)。

以上述PCR产物为模板，以巢式引物HP5-F2和HP5-R2进行第二轮高保真PCR，延伸时间2min，其它条件同上。

引物序列如下：

HP5-F1：5’-GCAGCCATATAAAACATGAGACT-3’

HP5-R1：5’-CTATTTACTTCGAACATCAGGCC-3’

HP5-F2：5’-GGATCCATGGAGACTTCATTGGTTAATC-3’

HP5-R2：5’-GAGCTCCTATTTACTTCGAACATCAGGC-3’

通过上述操作，获得了番茄HP5基因的全长片段(1551bp)。

4.5目的DNA片段与克隆载体pMD18-T的连接

目的DNA片段与克隆载体pMD18-T按摩尔分子数比3/1连接，反应体系如下：

10×ligase Buffer 1μl

pMD18-T(50μg/μl) 1μl

目的DNA片段(～150μg/μl) 1μl

T4Ligase(350U/μl) 1μl

ddH₂O 6μl

16℃，连接12小时。

4.6大肠杆菌转化

1)感受态细胞的制备

a)接种大肠杆菌单菌落于2mL SOB培养液中，37℃过夜培养；

b)转接0.5mL过夜培养物至50mL SOB培养液中，18℃剧烈震荡18～24h至A₆₀₀≈0.55；

c)将培养液转入50mL离心管中，冰浴10min，4℃4,000rpm离心10min；

d)去上清，加16mL预冷的TB缓冲液悬浮细胞(注意：轻轻旋转，不要用振荡器或吹吸混匀)，冰浴10min，4℃4,000rpm离心10min；

e)去上清，加4mL预冷的TB缓冲液悬浮细胞，加入280μl的DMSO，轻缓混匀，冰浴10min；

f)分装于预冷得1.5mLEP管中，液氮冻存。

2)转化

a)从液氮中取出感受态细胞冰浴解冻；

b)将10μl连接产物与感受态细胞轻轻混匀，冰浴30min；

c)42℃热冲击90s，立即冰浴1-2min；

d)加0.8mL的SOC，混匀，37℃温和摇床1h。

e)室温13,000rpm离心1min，倒掉一部分上清液，留约200μl的上清液，用枪头将上清液与细胞混匀，涂布LB+amp(50μg/ml)平板，37℃培养过夜。

4.7细胞快速裂解法鉴定重组质粒

1)挑取单个转化子接种于500μl含相应抗生素的LB培养液中，37℃振荡培养至A₆₀₀为0.6～0.8。

2)取200μl菌液至0.5ml EP管中，13,000rpm离心1min，去上清，留约20μl上清。

3)加20μl 2×快速裂解液[0.2mol/L NaOH 50mL+SDS 0.5g，蔗糖27.2g，加双蒸水至200ml]，剧烈振荡。

4)13,000rpm离心15min。

5)取5μl上清直接电泳。与对照比，电泳带滞后的即可能是重组质粒。

4.8菌落PCR鉴定重组质粒

经过快速裂解法鉴定的重组质粒再做菌落PCR以确定插入片段是目标片段，反应体系如下：10×PCR Buffer 2μl

Mg²⁺(1.5mM) 1.2μl

dNTP Mixture(各2.5mM) 0.6μl

菌液 1μl

M13F 0.4μl

M13R 0.4μl

ddH₂O 12.4μl

TaqDNA聚合酶 1μl

反应条件：94℃5min(预变性)；94℃40s(变性)，56℃30s(复性)，72℃2min(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃5min(终延伸)。

对菌落PCR确定的重组质粒进行测序，对测序结果进行比对和拼接，所得序列为序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

实施例4：真核重组质粒的构建及其功能验证

1、材料

1.1实验材料

番茄野生型种子为AC⁺，可通过市场购买。

1.1.1主要试剂

1)菌株

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α，购自天为时代公司。

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105：由本实验室保存。

2)质粒

pMD18-T载体：衍生自pUC18，2.692Kb，Ampr，为克隆PCR产物(TA Cloning)的专用载体，插入位点为EcoRV的酶切位点，购自TaKaRa。

质粒pSKint(以下简写pSK)：Amp抗性，具有两处多克隆位点。

植物真核表达载体pBI121：含有选择标记基因新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因及β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因，由本实验室保存。

3)植物激素

吲哚乙酸(Indoleacetic Acid，IAA)；激动素(Kinetin，Kt)；6-苄氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)；乙酰丁香酮(Acetosyringone，ACE)；2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-Dichlorophenoxyacetic Acid，2，4-D)。

4)抗生素

羧卞青霉素(Carbenicillin)；硫酸卡那霉素(Kanamycin，Km)

5)植物DNA提取缓冲液

100mmol/L Tris·HCl(pH8.0)，50mmol/L EDTA(pH8.0)，500mmol/L NaCl，10mmol/Lα-巯基乙醇，10％或20％SDS。

6)培养基与溶液

酵母提取物1g/L，胰蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，MgSO₄.7H₂O 0.5g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

番茄转化过程中所用培养基如下：(表1)

表1番茄组织培养所用培养基

注：植物激素及抗生素均待培养基冷却到40-50℃时加入。

2、方法

2.1真核重组质粒的构建

2.1.1基因片段的获得

根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列起始密码子下游1135bp至1549bp的基因片段设计构建真核重组质粒的引物如下：

HP5-RNAi-F1：5’-CTCGAGGGATCCTATTGAATGTGGGGACTGGTG-3’

HP5-RNAi-R1：5’-AAGCTTATTTACTTCGAACATCAGGCC-3’

HP5-RNAi-F2：5’-GAGCTCTATTGAATGTGGGGACTGGTG-3’

HP5-RNAi-R2：5’-GAATTCATTTACTTCGAACATCAGGCC-3’

以HP5-RNAi-F1和HP5-RNAi-R1为正向扩增引物，以HP5-RNAi-F2和HP5-RNAi-R2为反向扩增引物，按下面的PCR反应体系以及以下程序进行扩增：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火温度57℃30s延伸72℃30s。

10×PCRBuffer 2μl

Mg²⁺(1.5mM) 1.2μl

dNTP Mixture(各2.5mM) 0.6μl

菌液 1μl

HP5-RNAi-F1 0.4μl

HP5-RNAi-R1 0.4μl

ddH₂O 12.4μl

TaqDNA聚合酶 1μl

2.1.2PCR产物胶回收纯化

DNA片段的回收纯化参照Omega公司的凝胶回收试剂盒提取说明书，具体步骤如下：

1)用琼脂糖凝胶电泳目的片段，在长波紫外灯下切取目的片段放入预先称重的1.5mL的EP管中，称量胶的重量。按重量比1∶3的比例加入溶胶/结合液DB。

2)65℃水浴10min，胶完全融化即可，其间可震荡助融2-3次，待融化之后置室温加入150μL异丙醇，充分混匀。

3)将上一步所得溶液加入吸附柱AC中，12,000rpm离心1min，弃废液。

4)加入700μL漂洗液WB，12,000rpm离心1min，弃废液。

5)加入500μL漂洗液WB，12,000rpm离心1min，弃废液。

6)12,000rpm离心3min，弃废液。

7)向离心柱中间白膜中滴入50μL EB(65℃预热)室温放置2min。

8)12,000rpm离心2min，产物置于-20℃条件下保存。

2.1.3目的基因片段与克隆载体pMD18-T的连接

(操作步骤见实施例3的4.5)

2.1.4连接产物的转化(操作步骤见实施例3的4.6)

2.1.5菌落PCR鉴定重组质粒(操作步骤见实施例3的4.8)

对菌落PCR确定的重组质粒进行测序，对测序结果与基因片段进行比对，确定所扩增片段为目的基因片段。

2.1.6正向基因片段与PSK中间载体的连接

将测序正确的正向基因片段和PSK中间载体，以Xho I、Hind III进行双酶切后，反应体系如下：

10×M buffer 5.0μL

Xho I 1.0μL

HindIII 1.0μL

质粒 15μL

ddH₂O 28.0μL

37度反应3小时后，跑凝胶电泳回收正向基因片段和PSK载体，具体步骤见本实施例中的2.1.3。

正向基因片段与PSK中间载体的连接反应体系(20μl)：

PSK 7μl

正向基因片段 10μl

T4连接酶 1μl

10×T4连接缓冲液 2μl

Total 20μl

混匀，16℃温育12小时。

连接产物的转化，操作步骤见实施例3的4.6。

2.1.7反向基因片段与已连有正向基因片段的PSK中间载体的连接

将测序正确的反向基因片段和PSK中间载体，以Sac I、EcoR I进行双酶切后，反应体系如下：

10×M buffer 5.0μL

Sac I 1.0μL

EcoR I 1.0μL

质粒 15μL

ddH₂O 28.0μL

37度反应3小时后，跑凝胶电泳回收反向基因片段和PSK载体，具体步骤见实例2的2.1.3。

反向基因片段与PSK中间载体的连接反应体系(20μl)：

PSK 7μl

反向基因片段 10μl

T4连接酶 1μl

10×T4连接缓冲液 2μl

Total 20μl

混匀，16℃温育12小时。

连接产物的转化，操作步骤见实施例3的4.6。

2.1.8真核重组质粒的获得

将含有正向基因片段和反向基因片段的PSK中间载体用Xba I和Sac I酶切，同时将pBI121真核载体用Xba I和Sac I酶切，切除载体中GUS基因，回收切除GUS基因的大片段载体部分。酶切反应的反应体系如下：

10×M buffer 5.0μL

Xba I 1.0μL

Sac I 1.0μL

质粒 15μL

ddH₂O 28.0μL

37度反应3小时后，跑凝胶电泳回收含有正向和反向基因片段的部段以及，回收的具体步骤见本实施例的2.1.3。

正向和反向基因片段的部段与pBI121载体的连接反应体系(20μl)：

PBI 7μl

正向和反向基因片段 10μl

T4连接酶 1μl

10×T4连接缓冲液 2μl

Total 20μl

混匀，16℃温育12小时。

连接产物的转化，操作步骤见实施例3的4.6。

通过以上操作，获得真核重组质粒，命名为pBI121-HP5RNAi(如图2所示)。

2.2农杆菌感受态细胞的制备

1)挑取农杆菌单菌落于2ml的YEB液体培养基(含Rif50μg/ml)中，28℃振荡培养过夜；

2)取过夜培养液500μl转接于50ml YEB(含Rif50μg/ml)液体培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.5；

3)4℃5000rpm离心5min收集菌体，加10ml 0.15M的NaCl溶液悬浮菌体，冰浴10min；

4)4℃5000rpm离心5min收集菌体，用1ml预冷的20mM CaCl₂溶液悬浮菌体，冰浴10min；

5)制备好的细胞立即使用，或分装成200μl/管，液氮中速冻1min，置-70℃保存备用。

2.3农杆菌的转化

1)取200μl感受态细胞，冰上解冻。

2)加1μg构建好的pBI-HP5RNAi重组载体，轻弹混匀，冰浴30min。

3)液氮中速冻1min，37℃水浴5min，然后加入1ml YEB培养基，28℃振荡培养4h。

4)将培养物涂布于含50μg/ml Kan和50μg/ml Rif的YEB平板上，28℃培养约48h。

2.4农杆菌阳性克隆的鉴定

挑取平板上长出的单菌落，接种于含50μg/ml Kan和50μg/ml Rif的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜，以菌液为模板进行PCR扩增鉴定。

2.5农杆菌介导法转化番茄

构建好的真核重组质粒pBI121-HP5RNAi转入农杆菌中备用。

用10％次氯酸钠浸泡番茄种子10min，再用无菌水清洗4～5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分后于1/2MS培养基上培养，25℃，暗培养4d左右，露白后转置于光照下，光照1500lx，16h/d，在其第一片真叶长出前取下子叶，置于预培养基上培养2d。转化法采用叶盘法。将带有目的基因的农杆菌28℃过夜培养，5000r/min，5min，室温下离心，去除上清液，用诱导培养基将农杆菌稀释至OD＝0.1，将预培养2d的子叶浸入其中10～15min，倒掉菌液将子叶置于无菌滤纸上，吸干多余菌液后转到共培养基上培养3d。然后转入再生培养基上继代筛选培养，每3周换一次培养基，待不定芽长到3cm左右时，切下转移至生根培养基上生根。等根发育好后，移出，温室盆栽。转基因植株在生根培养基上生根的同时，培育一些野生型番茄植株，作为转基因番茄植株的对照。

2.6转基因植株的鉴定

2.6.1基因组DNA的提取

(1)取100mg新鲜的转基因番茄叶片，在添加液氮状况下研成细粉，分装于1.5mLeppendorf管中，每管加入500μL 65℃预热的2×CTAB提取缓冲液(100mmol/L Tris-Hcl pH8.0，20mmol/LEDTApH 8.0，1.4mol/LNaCl，40mmol/L2-巯基乙醇，2％CTAB)混匀。

(2)65℃水浴保温60min，冷却至室温，加入等体积的氯仿。

(3)5000g离心10min，取上清液，加入等体积的异丙醇，室温放置15min，沉淀DNA。

(4)12000g离心10min，弃上清留沉淀，用70％乙醇至少洗两遍，吹干沉淀。

(5)将沉淀溶于200μL TE中，加入RNase A(10mg/mL)，37℃保温30min，加入等体积的酚/氯仿，混匀。

(6)12000g离心10min，取上清，加入1/10体积3mol/LNaAc和2.5倍体积的无水乙醇，室温放置10min。

(7)12000g离心10min，弃上清，用70％乙醇冲洗后吹干沉淀，溶于20μL的ddH2O中。

2.6.2转基因番茄基因组DNA的PCR检测

为了确定HP5基因是否已经整合到番茄基因组中，我们以转基因番茄基因组DNA为模板，对番茄卡那霉素抗性标记基因(NPTII)进行了PCR扩增。卡那霉素抗性基因特异引物为NPTII-F1和NPTII-R1。

NPTII-F1：5’-TCTCATGCTGGAGTTCTTCGC-3’

NPTII-R1：5’-GTCACCGACTTGAGCCATTTG-3’

按以下程序进行扩增：94℃5min(预变性)；94℃40s(变性)，60℃40s(复性)，72℃1min(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃5min(终延伸)。

2.6.3转基因番茄阳性筛选植株RT-PCR鉴定

分别提取转基因番茄植株和野生型番茄植株叶片的mRNA，反转录后，做RT-PCR分析，同时以番茄内参基因(UBI3)做为对照。HP5基因RT-PCR扩增引物为：

RT-HP5F：5’-TCTAAGCGATTCGTCTGTGG-3’

RT-HP5R：5’-AATAGGCTTTGAACCTCGGC-3’

按以下程序进行扩增：94℃5min(预变性)；94℃40s(变性)，55℃40s(复性)，72℃30s(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃5min(延伸)。

UBI3基因的RT-PCR扩增引物为：

RT-UBI3F1：5’-AGAAGAAGACCTACACCAAGCC-3’

RT-UBI3R1：5’-TCCCAAGGGTTGTCACATACATC-3’

按以下程序进行扩增：94℃5min(预变性)；94℃40s(变性)，60℃40s(复性)，72℃30s(延伸)，所述变性-复性-延伸26个循环；72℃5min(终延伸)。

2.7叶绿素含量的测定

取田间栽培野生型番茄植株和转基因番茄植株的叶片0.2～0.5g，液氮充分研磨，用1mL80％的丙酮充分萃取，萃取液离心后用分光光度计检测，读取645nm和663nm下的光吸收值A645和A663。按照MacKinney常数计算出叶绿素a和b的含量：叶绿素a (chlorophylla)＝12.7(A663)-2.69(A645)和叶绿素b(chlorophyll b)＝22.9(A645)-4.48(A663)，采用数据学软件SPSS12进行统计学分析。

2.8番茄植株节间长的测定

取相同生长期的野生型番茄植株和经过阳性鉴定的转基因番茄植株，分别测定其上部，中部，下部的节间长，每个植株重复测定3次，然后做统计学分析。

2.9番茄红素标准曲线的绘制

称取番茄红素标准品1.0mg，用1.0ml二氯甲烷充分溶解后，以石油醚定容至50ml，然后迅速将上述番茄红素标准液稀释成不同浓度，采用分光光度计法在472nm处测其吸光值，并以吸光值(A₄₇₂)对番茄红素浓度作图，得到番茄红素标准吸收曲线，如图10所示。

2.10番茄果实番茄红素的提取和测定

番茄红素的提取采用石油醚浸提法(番茄红素见光易分解，提取时采用棕色瓶及在暗室内操作进行避光)。取3株转pBI121-HP5RNAi基因番茄的成熟果实，分别捣碎成泥状，取5g，加入25ml蒸馏水，混匀，再加入25ml石油醚，充分混合，静置30min，分液，吸取上层，加入25ml石油醚，再分液，抽虑后取3ml采用分光光度计法在472nm下测其吸光值(A)，代入标准曲线公式，求出番茄红素的含量。

3、结果

3.1转基因植株的鉴定

3.1.1转基因番茄阳性筛选植株PCR鉴定结果

以空质粒pBI121为阳性对照，非转基因植株为阴性对照。提取转基因番茄植株的总DNA，根据已知的质粒pBI121中选择标记基因NPT II序列设计引物，经PCR扩增得到与预期大小一致的857bp的条带，而非转基因番茄则无条带出现，如图3所示。

3.1.2转基因番茄阳性筛选植株RT-PCR鉴定结果

鉴定结果表明：pBI121-HP5RNAi转基因番茄的3个独立的植株(pBI121-HP5RNAi-1，pBI121-HP5RNAi-2和pBI121-HP5RNAi-3)中HP5基因的mRNA的量有比较明显降低，而野生型番茄中HP5基因的mRNA的含量却保持不变，如图4所示。

3.2番茄转基因植株结果及表型分析

3.2.1植株叶片及果实绿色加深

对番茄植株生长的观察显示：pBI121-HP5RNAi转基因番茄植株叶片的颜色要比野生型番茄植株叶片的颜色深(见图5)；pBI121-HP5RNAi转基因番茄植株的果实在绿肩(green shoulder)时期的颜色比野生型番茄植株的果实更绿更深(见图7)。测定转基因番茄植株叶片和野生型番茄植株叶片的叶绿素含量表明，pBI121-HP5RNAi转基因番茄植株叶片的叶绿素含量明显的高于野生型番茄植株叶片的叶绿素含量(见图6)。

3.2.2转基因植株节间长的变化

对番茄植株生长的观察显示：pBI121-HP5RNAi转基因番茄植株的节间明显比野生型番茄植株的节间短，如图8所示。测定野生型番茄植株和转基因番茄植株的节间长度，经统计学分析表明：转基因番茄植株的节间比野生型番茄植株的节间短(见图9)。由此可见，HP5基因可能参与调控番茄营养生长阶段的生长和发育，如影响节间的长短、株高和侧枝的数目等。

3.2.3转基因番茄果实番茄红素含量的变化

将三株不同的pBI121-HP5RNAi转基因番茄植株和野生型番茄植株的番茄果实的番茄红素含量测定数据通过标准曲线公式分别计算出番茄果实的番茄红素含量，结果如图11所示。从图11可以看出，pBI121-HP5RNAi转基因番茄植株1番茄果实中番茄红素含量比野生型番茄植株的高出30％，pBI121-HP5RNAi转基因番茄植株2番茄果实中番茄红素含量比野生型番茄植株的高出36％，pBI121-HP5RNAi转基因番茄植株3番茄果实中番茄红素含量比野生型番茄植株的高出80％。由此可见，在pBI121-HP5RNAi转基因的番茄植株中，HP5基因的表达受到抑制或者沉默，而番茄红素的含量却相应的增加，说明番茄中HP5基因可以负调控番茄红素的积累。因此，番茄HP5基因及重组质粒可以提高番茄中番茄红素的积累。

Claims

1.一种基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.一种真核重组质粒，其特征在于由序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的基因片段和真核表达载体构成，所述基因片段是起始密码子下游1135bp至1549bp的核苷酸序列，所述基因片段正向和反向插入真核表达载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子。

3.根据权利要求2所述的真核重组质粒，其特征在于所述真核表达载体为pHB、pMON1772、pBE12、pBC7、pBI121中的一种。

4.一种真核重组质粒的制备方法，其特征在于步骤如下：

(1)在序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中选择一段基因片段，所选择的基因片段是起始密码子下游1135bp至1549bp的核苷酸序列，将所述基因片段正向插入到质粒pSK载体上形成中间载体，再将该基因片段反向插入已含正向插入基因片段的pSK中间载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子；

5.根据权利要求4所述的真核重组质粒的制备方法，，其特征在于所述真核表达载体为pHB、pMON1772、pBE12、pBC7、pBI121中的一种。

6.权利要求2或3所述真核重组质粒在提高番茄果实色素积累中的应用。