JP2001526054A - 組合せライブラリーをスクリーニングするための方法および細胞 - Google Patents

組合せライブラリーをスクリーニングするための方法および細胞

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、少なくとも１つの次に述べるものを同定および単離する方法である：対象ポリペプチドおよび／またはその遺伝子；標的化合物および／またはその遺伝子（ここで、対象ポリペプチドまたは標的化合物あるいは両方は未知である）。該方法は、（１）原核細胞または真核細胞の集団の表面にある対象ポリペプチドのライブラリーを呈示すること；（２）集団を標的化合物に曝露させること；および（３）集団を選択剤に曝露させること、からなる段階に基く。３つの成分の間の相互作用が、ポリペプチドを“インプリントする”：すなわち、前述の方法において、該相互作用は、ポリペプチドが標的化合物と相互作用する細胞を選択する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 組合せ化学（Janda、１９９４において論じられた）（実験室構築分子の多様 なライブラリーが、対象の特性を呈する構造についてスクリーニングされる）は
、相対的に新規で、潜在的に強力なテクノロジーであり、３つの一般領域におい
て有用な適用を約束している。第１に、組合せ化学を用いて、生体分子の調査、
臨床療法または診断に用いる、非常に特異的な接着または酵素活性をもつ分子を
同定することができる。第２に、既知の重要な対象化合物と特異的に相互作用す
る分子に対してライブラリーをスクリーニングすることによって、組合せ化学は
、既知化合物の先天的相互作用体の同定を援助することができる（Phizickyら、
１９９５）第３に、組合せ化学は、エピトープマッピングに用いることができ、
２つの対象分子間の構造的相互作用の外面を解明するのに役立つ。
【０００２】 現在のタンパク質の組合せ化学は、強力ではあるが、２つの別個の制限を有し
ている。多くのライブラリーにおいて、強い構造的完全性を付与できないプラッ
トホーム上に様々なタンパク質が呈される；結果として、タンパク質は、可塑性
がありすぎるため、安定した形態および一貫した特性を呈することができない。
同じく重要なことに、スクリーニング操作は、激しい労働であり、対象特性をタ
ンパク質が披露することとは無関係な因子が、スクリーニングによるその単離に
影響を及ぼしうるものになることが多い。このことは、文献に報告されているほ
とんどのスクリーニングにおいて起こっている（Phizickyら、１９９５など）。
２ハイブリッドシステムなど、関連するテクノロジーは、前述した後者の２つの
適用、すなわち、相互作用研究およびエピトープマッピング（Phizickyら、１９
９５）において有用であることがわかっている。しかし、２ハイブリッドシステ
ムには、研究される相互作用の種類において非常にきびしい制限がある：相互作
用の両成分はタンパク質でなければならず、それらは容易に核内へ運搬されなけ
ればならない。
【０００３】 本発明の目的は、他のテクノロジーが遭遇している多くの困難を解決またはく
まなく考査する、ポリペプチド組合せ化学およびポリペプチド相互作用同定の方
法を提供することである。（本明細書において用いる語句ポリペプチドは、グリ
コプロテイン、プロテオグリカン、リポタンパク質、アセチル化タンパク質また
は（他の）加工されたペプチドまたはタンパク質体といったようなすべてのタイ
プのポリペプチドまたはタンパク質を含む）。本発明の別の目的は、組合せまた
は他のペプチドライブラリーのための、用途が広くて広範囲に適用しうる、迅速
かつ確実なスクリーニング方法を提供することである。
【０００４】 これらの目的は、少なくとも１つの次に述べるもの：対象ポリペプチド、標的
化合物または対象ポリペプチドの遺伝子、または標的化合物の遺伝子（ここで、
対象ポリペプチドまたは標的化合物あるいは両方は未知である）を同定および単
離する方法であって、 ａ）細胞外または細胞内ドメインに対象ポリペプチドを有する膜ポリペプチド
を発現するように細胞集団を工作することによって、細胞集団を構築し [ここで、細胞外または細胞内ドメインは、直接または間接的に選択剤特異的選 択部位と相互作用する各細胞の表面上の１つまたはそれ以上のコピーに呈示され
ており、対象ポリペプチドへの標的化合物の結合に基いて、対象ポリペプチドへ
の標的化合物の結合を呈示する細胞の該選択部位は、該結合を呈示しない細胞か
ら該結合を呈示する細胞を選択するために選択剤が用いるという作法によって、
変更される]； ｂ）細胞集団を、標的化合物が対象ポリペプチドへ結合するのに十分な時間だ
け、標的化合物または標的化合物の集団に曝露し； ｃ）細胞集団を、選択剤が選択部位と相互作用するに十分な時間だけ、段階ｂ
と同時またはその後に選択剤に曝露し； ｄ）標的化合物の対象ポリペプチドへの結合を示すクローンを選択すること； ｅ）必要に応じて、選択されたクローンを増殖させる；次いで、 ｆ）対象ポリペプチドおよび／または標的化合物および／または対象ポリペプ
チドの遺伝子および／または標的化合物の遺伝子を単離する、 ステップを含む方法にとって、目的にかなうものである。
【０００５】 本発明においては、ポリペプチドのライブラリーは、細胞集団によって、膜ポ
リペプチドの１つまたはそれ以上の細胞外または細胞内ドメインに呈示される。
選択剤によって行使される選択圧力によって、そのポリペプチド配列が予め選択
された標的化合物に結合できない細胞が排除される。したがって、様々なポリペ
プチド配列を呈示しうる細胞集団から、その配列が標的化合物を結合する細胞が
選択され、たとえば成長によって増殖される。語句“ポリペプチドインプリンテ
ィング”は、標的化合物を結合するかまたは特異的特性を呈示するポリペプチド
を呈示している細胞を選択するという、本発明方法の用途に言及するために用い
られる。
【０００６】 本発明方法を用いて、様々な種類の原核および真核ポリペプチドをインプリン
トすることができ、予定の標的に対する親和性の高いポリペプチド配列の創生ま
たは発見、相互作用の研究、もしくはエピトープマッピングなどに役立つ。本発
明のより洗練された具体例において、ポリペプチドは次の特異的特性を呈示する
ようにインプリントされる：予定の標的に対する多価結合；標的に対する高い親
和性および１つまたはそれ以上の標的に非常に関連のある分子に対する低い親和
性；生物学的経路における阻害活性（アンタゴニズム）；生物学的経路における
刺激活性（アゴニズム）；または酵素活性。
【０００７】 ポリペプチドライブラリーばかりでなく、同時的または二者択一的に、標的分
子集団をスクリーニングすることも可能である。 前述したように、本発明は、インプリントされるポリペプチドを膜タンパク質
の細胞外または細胞内ドメインに呈示することによって行うことができる。 本発明の好ましい具体例は、この後の記載および実施例ならびに図面において
記載する。 本発明は、ｉ．原核および真核細胞膜およびそれらの複合構成物の研究；ｉｉ
．毒素、バクテリオシンまたはウイルス寄生体の選択圧力下における微生物集団
の進化の研究；iii．ポリペプチド組合せライブラリーの設計およびスクリーニ ング；という調査の３つの異なる領域の集合の産物である。 本発明方法を用いて、将来有望な特性をもつポリペプチドを迅速に同定し、増
幅し、単離することができ、このことが本発明方法は非常に感受性の高いものに
している。最低１０6個の非特異的ポリペプチドからなるバックグラウンドから 、リガンドに結合する１つのポリペプチドを選択することが可能であるが、本発
明方法それ自体に関しては、感受性の上限についての証拠は無い。
【０００８】 本発明方法を用いて、ポリペプチドの組合せライブラリーのすべての細胞およ
び／または標的化合物が、順次というよりもむしろ同時にスクリーニングされ、
多くの別のテクノロジーと比べて大幅に時間が短縮される。重要なパラメーター
が当業者であれば容易に調節可能なので、本発明は使用が容易である。一組の細
胞を選択すれば、ポリペプチドまたは標的化合物の遺伝子を（もしこれらが細胞
によっても発現されるなら）容易に単離することができる。 対象ポリペプチドは、既知であり、細胞外または細胞内ドメイン（細胞表面な
ど）に外来性タンパク質を呈示するのに用いられる、広範囲の細胞タイプのいず
れかによって呈示される。このことによって、本発明方法は、発現システムの偏
りを避けることができる。標的化合物、または単離されたポリペプチド／標的ペ
アが適用される予定のシステムにとって生化学的に適している膜タンパク質にポ
リペプチドが発現するのが好ましい。
【０００９】 本発明の主要な構成要素の１つである、組合せ化学は、２つまたは３つの工程
からなり、しばしば相互に作用するサイクルにおいて機能する。最初の工程は、
組合せライブラリーと呼ばれる、分子の種々の集団の生成である。第２の工程で
は、組合せライブラリー中の分子は、特定の化合物への親和性または酵素活性と
いったような、研究者が求める特性の呈示にしたがって分配される。組合せ化学
の具体例の幾つか（すべてではない）において実施される第３の工程では、所望
の特性を呈示することが見出された分子が複製または再合成される。次いで、サ
イクルが繰り返され、分子集団に新しいバリエーションが導入されて最初の工程
が開始されるか、または所望の特性の呈示にしたがって集団の分配をが行われる
第２工程が開始される。組合せアプローチが好結果であるとき、分子の多様性を
生成し、所望の特性を呈示する少数の分子のために多様性を削減し、次いで、こ
れらの分子の数を増やす（幾つかの場合）サイクルは、所望の特異的活性を呈示
している分子をもたらす。
【００１０】 免疫系は、本質的に遺伝子コード化された組合せライブラリーであり、変異、
選択および複製という工程を完備している：Ｂ細胞の表面には、非常に多様な抗
体が呈示され（変異）、細胞による抗原の特異的認識が、その細胞の増殖の引き
金をひく（分配および複製）。したがって、最初のインビトロ遺伝子コード化さ
れた組合せライブラリーが、免疫系から直接割り当てられたことは驚くべきでは
ない：Ｂ細胞はハイブリダイゼーションを通して骨髄腫細胞系に対して固定化さ
れた（Marksら、１９９１）。後に、ハイブリダイゼーションの困難性をくまな く探査するため、および抗体レパートリーのより多くの部分を採用するために、
抗体の可変鎖を発現し、分泌するように大腸菌が工作された。しかし、分泌され
た抗体は、“タグ付けされていない”（Janda、１９９４）、すなわち、それら の遺伝子コードに物理的に連結されていなかったので、抗原を結合する抗体のた
めのスクリーンは、研究者が各選択された抗体からそれをコードする遺伝子へと
追跡しなければならない技術にしたがって行われなければならなかった。このこ
とは、スクリーニング可能なクローンの数を非常に制限した。ファージ−ディス
プレイともいう“融合ファージ”の出現は、ライブラリーが、“タグ付けされた
”（Janda、１９９４）可変タンパク質をスクリーニングするのを可能にし、こ れによって迅速な複製が可能になった。融合ファージは、吸着タンパク質ｐＩＩ
Ｉの末端近くのサンドイッチ融合として、セミランダム外来性タンパク質を運ぶ
ように工作されているフィラメント状のバクテリオファージまたはファージミド
より構成される（Janda、１９９４、Marksら、１９９１）。標的化合物に対する
親和性を呈示するファージについてこれらのライブラリーをスクリーニングする
方法は、“アフィニティー精製”として知られている：標的を固相表面またはカ
ラムに固定化しれ、これを通してファージライブラリーを洗浄し；標的に結合し
たファージを溶離し、細菌培養にて成長させて増殖し、次いで、分配の他のラウ
ンドに付す。通常、処理しやすい数のクローンが単離されるまで、このサイクル
を繰り返す。ファージライブラリーは、エピトープマッピング（Phizickyら、１
９９５）、すなわち、対象標的化合物の結合に関連する大きなタンパク質の中の
領域を正確に指摘すること、ならびに新規なリガンドを標的に誘導するのに用い
られている。全一本鎖可変フラグメント抗体（ｓｃＦｖ’ｓ）が、ファージミド
ｐＩＩＩに挿入されており(Marksら、１９９１)、ｓｃＦｖ’ｓまたは。セミラ ンダムオリゴペプチドが、種々の医学的に重要なポリペプチド、核酸および、こ
れまでにタンパク質を結合することが知られていない分子への結合についてスク
リーニングされている。
【００１１】 しかし、ライブラリーを“タグ付けする”認識によって、非常に増加した数の
配列がスクリーニングされるようになったように、融合ファージテクノロジーは
、組合せ化学において、重要な進歩の原因であるが、ファージライブラリー自体
は、いくつかの絶えずつきまとう困難から逃げ出せないままである。第１に、フ
ァージライブラリーのアフィニティー精製において、標的化合物に対する親和性
以外の因子が、クローンの選択に大きく寄与している。たとえば、アフィニティ
ー精製によって単一のライブラリーから選択されたクローンの採集は、標的化合
物の固相基質からファージを溶離させるのに用いた技術に応じて劇的に変化する
（Phizickyら、１９９５）。第２に、ファージ吸着タンパク質ｐＩＩＩは、呈示
されたタンパク質を十分に安定なプラットホームに提供することができない。多
くのポリペプチドは、ある強いられているコンホーメーションにおいてのみ構造
的剛性を獲得する；さもなければ、それらは極度に可塑性のままである。したが
って、機能的に活性な構造であるためには、多くのポリペプチドがｐＩＩＩ以外
の基礎を必要とするだろう。
【００１２】 タンパク質の組合せライブラリーが、細菌外膜タンパク質の細胞外ループに呈
示されたとき、ポリペプチド呈示のためのプラットホームという問題の有望な解
決が、披露された（Brown、１９９２）。このライブラリーを構築するために、 それぞれ１つ当たりの長さが３３塩基の１から２０個のセミランダムオリゴヌク
レオチドが、外膜ポーリンＬａｍＢの細胞外ループをコードする遺伝子サイトに
挿入された。トポロジー（Boyd、１９９４）や抗原提示（Georgiouら、１９９７
）の研究の対象となっている多くの膜タンパク質と同様に、ＬａｍＢは、外来性
ポリペプチド配列が１つまたはそれ以上のタンパク質の細胞外ドメインに挿入さ
れた場合でさえも、外膜をインターカーレートする。したがって、ｌａｍＢ遺伝
子を含んでいるインサートを用いて大腸菌を形質転換すると、各形質転換細胞は
、１つの細胞外ドメインが１１〜２２０個のアミノ酸長さの１つのセミランダム
、外来性オリゴペプチドを呈示するＬａｍＢを発現した。
【００１３】 標的化合物である酸化鉄に対する親和性を呈示しているタンパク質についてラ
イブラリーをスクリーニングするために、大腸菌集団を酸化鉄粒子の懸濁液に入
れて結合を引き起こし、磁石を用いて金属に接着した細菌を回収した（Brown、 １９９２）。選択された集団を成長によって増殖し、分配手順を繰り返した。選
択と増殖のサイクルを４回行った後、これまでに蓄積された配列情報を消さない
ような方策にしたがって、新鮮な変異体を導入した。別に行った４サイクルの選
択と増殖では、４個のクローンが得られ、それらのうち３つは酸化鉄の結合に対
する共通配列をもっていた。 ＬａｍＢにおける組合せライブラリーが、多様なポリペプチドのライブラリー
を提示するためのプラットホームとして細菌外幕タンパク質を使用することの有
望な可能性を披露したとはいえ、該ライブラリーに適用される選択手順は多くの
労力を必要とし、その適用可能性は非常に限定されたものであった。標的化合物
、すなわち酸化鉄は、磁力についてスクリーニングできるように選ばれたが、こ
れはポリペプチドが呈示される対象相互作用の大部分において、そのスクリーニ
ングには適用できない手順であった。本発明は、膜ポリペプチドのプラットホー
ムに存在するすべての種類のポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする
ことが可能な、使用者が取り扱いやすく、有効で正確な選択方法を提供する。
【００１４】 本明細書において外膜または内膜と称する、原核または真核細胞を覆っている
膜は、細胞外または細胞内環境に対して非常に入り組んだ表面を呈している。こ
れらの分子（本明細書においては膜外または膜内ポリペプチドと称する）は、非
常に広い範囲の特徴的なコンホーメーション、化学および電気特性を示す。他の
文献にも詳しく調査されているように（Singer、１９９０）、膜ペプチドは数種
の構造上のファミリーに類別される。膜ポリペプチドは、外来性配列を呈示する
のに用いられ、標的化合物との相互作用に対して選択される基底構造を提供する
ので、これらのファミリー間のコンホーメーションおよび機能の差異は、本発明
に関連がある。さらに、本発明は、膜ポリペプチドをその特性を呈示するように
インプリントするか、またはそれらの天然のものと同様の機能が作動するように
インプリントすることによって、膜ポリペプチドの本質的な特性を利用すること
が多い。最後に、ここで示される構造ファミリーの描写は、本発明の利用性を非
常に広くする、細胞膜上のポリペプチドが呈示する非常に広い範囲の特性のプロ
ファイルをも提供すべきである。
【００１５】 バイトピックポリペプチドとも呼ばれるシングルパス膜貫通ポリペプチド（Si
nger、１９９０）は、１つの膜内ドメインと１つの膜外ドメインならびに膜を貫
く中間セクションをもつ。末端ドメインは３次構造に折り畳まれているが、膜貫
通セクションは、ヒドロパシックなαへリックス構造をとることが多く、そこで
は２０個の膜貫通残基のうち２個以下の残基がイオンである。Singer（Singer、
１９９０）は、パイトピックポリペプチドをＩａ、ＩｂおよびＩＩ型に分類して
いる。ＩａおよびＩｂ型は、外膜の細胞外サイドにアミノ末端を呈示している。
きわだって特徴的なＩａ型は、膜へのエキスポートを指揮するアミノ末端シグナ
ル配列であり、最終的な膜挿入の前に切断される。Ｉａ型ポリペプチドは遍在性
であり、真核生物では、それらが優勢である。Ｉａ型ポリペプチドの膜貫通配列
は代表的にカルボキシル末端に近く、細胞外ドメインは大きいことが多い。した
がって、Ｉａ型ポリペプチドは、特に細胞外標的への高親和性接着または高特異
性結合などの機能に有能である。Ｉａ型ポリペプチドは、成長因子およびペプチ
ドホルモンに対する受容体；免疫系抗原認識分子；および細胞接着しうる分子で
ある（Singer、１９９０、Stauntonら、１９９０）。細胞外標的への接着傾向ま
たは高度に特異的な結合によってＩａ型ポリペプチドは本発明の多くの具体例に
おける使用に適しており、特に、ポリペプチドが細胞外標的へ結合するようにイ
ンプリントされる場合に適している。
【００１６】 Ｉｂ型ポリペプチドは、切断可能なシグナル配列をもたない。膜貫通区間は代
表的にアミノ末端に近く、したがって２、３個の細胞外残基がある（Singer、１
９９０）。このことから、Ｉｂ型ポリペプチドは複雑な細胞質機能および相互作
用に適しているが、細胞外媒体にある標的との相互作用にはあまり適していない
。 ＩＩ型バイトピックポリペプチドは、膜の外側にあるそのカルボキシル末端に
指向性がある（図１）。Ｉａ型バイトピックポリペプチドと同様に、ＩＩ型ポリ
ペプチド分子の大部分は、通常、細胞の外側にある。ＩＩ型ポリペプチドは代表
的に、グリコシルトランスフェラーゼなどの細胞外活性部位をもつ酵素またはア
シアログリコプロテインなどの高特異的細胞外受容体である（Singer、１９９０
）。細胞外酵素または受容体活性への適性があることから、ＩＩ型バイトピック
ポリペプチドは、細胞外ドメインが細胞外媒体中の標的を結合または酵素的に修
飾するようにインプリントされる本発明の具体例における使用に適している。
【００１７】 ポリトピックポリペプチドとも呼ばれるマルチパス膜貫通ポリペプチド（Sing
er、１９９０）は、２〜１５あるいはそれ以上の経路で脂質二重層を横断する。
布地に縫われた糸のように、このポリペプチドは、膜の一方の側から始まり、そ
れを通過し、膜の外側の空間でループを作り、次いで、もう一度膜を横断してそ
のいづれかの末端を露出するか、またはさらなる膜貫通経路を形成するもうひと
つのループを作る（図１）。“ループ”と呼び、そのように描いてはいるが、マ
ルチパスポリペプチドの露出領域は、アミノ酸のユニーク配列を呈示するのみな
らず、特有の３次構造をなしている。シングルパス膜貫通ポリペプチドのように
、マルチパス膜貫通ポリペプチドは、膜貫通ストランドの疎水性によって脂質二
重層に懸濁している。しかし、マルチパスポリペプチドでは、これらのストラン
ドは、ペプチド結合間の水素結合のための別の方策を採用することができるので
、常にねじれてαへリックス構造になっているわけではない：もし、各ストラン
ドが第２構造のβストランドを採用するなら、これらのストランドは一緒にカー
ルして閉じたシリンダーになり、別のストランド上のペプチド結合間に水素結合
を形成するようになる。得られる３次構造は、βバレルと呼ばれる（図１）。こ
の構造は、非常に安定であり、３次構造を変性することなく外膜から放出されう
る。本発明の幾つかの好ましい具体例では、非常に安定なポリトピックβバレル
ＯｍｐＡが、種々の標的に結合するようにインプリントされる。
【００１８】 αへリックスコンホーメーションで膜を横断するポリトピックポリペプチドは
、酵母交配フェロモンなどのメッセンジャーまたはホルモンの特異的受容体とし
て機能することが多い。これらおよび他のαへリックスポリトピック受容体がSi
ngerによって、ＩＩＩ型ポリペプチドとして分類されている（Singer、１９９０
）。標的分子に特異的に、および時には多価的に結合するそれらの能力によって
、αへリックスポリトピック受容体は、本発明多くの具体例において用いるのに
理想的である。さらに、本発明の選択システムは、選択に関与する膜ポリペプチ
ドがポリトピックである場合に、構築するのが容易である。
【００１９】 多くの原核および真核細胞表面ポリペプチドは、疎水性膜貫通ストランドでは
なく、糖脂質アンカーによって脂質二重層に固定される（Cross、１９９０）（ 図１）。アンカーは、順に、膜ポリペプチドに共有的に結合するマルチ残基糖複
合体によって修飾された、ジミリスチルグリセロールまたはアルキルアシルグル
セロールといったような脂質分子からなる。真核生物では、タンパク質の２つの
シグナルエレメントが、糖脂質アンカーの付加を指揮する：小胞体のルーメンへ
の輸送を可能にする、十分に解明されたアミノ末端シグナル配列、および正確に
は解明されていないが、一般に、１対の小残基へカルボキシ末端から１０〜１２
残基に位置する短い疎水性ドメインからなる、カルボキシ末端糖脂質付加配列（
Cross、１９９０）。タンパク質のカルボキシ末端に付加されると、糖脂質アン カーそれ自体が、外膜の標的領域におけるポリペプチド挿入を指揮する。 細胞内ドメインが欠如していると、糖脂質アンカーがついた外膜タンパク質は
、細胞質ゾルおよび細胞周辺機能を遂行することができない。その代わりに、そ
れらは、細胞外環境からの保護、あるいは細胞外基質を排他的に認識する酵素ま
たはアドヘシンとしての機能を提供する。少なくとも６つの白血球表面タンパク
質、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する多くの他の真核タンパク質（Cr
oss、１９９０）、およびトリパノソーマ可変表面グリコプロテイン（トリパノ ソーマが宿主免疫系による検出を回避するために連続的に変化させるタンパク質
）は、糖脂質によってアンカー付けされる。これらの例は、本発明の具体例にお
ける使用にとって重要である、糖脂質アンカーされたタンパク質の特徴を説明す
る：高特異的接着能力および、外膜へのエキスポートおよび外膜における挿入の
ための確固たるシステムを妨げることなく、アンカーされたタンパク質を変化さ
せる可塑性。
【００２０】 真核細胞では、表面タンパク質の多様なアレイが、サッカリドなどの特有の特
性をもつ他の一列の複合体分子によって装飾される（Lisら、１９９３）。オリ ゴサッカリド装飾グリコプロテインは、一般に、１５残基以下からなる。しかし
、分枝ならびに直線構造への組み立てを許可する、残基および共有結合の多様性
のために、オリゴサッカリドは何千もの異なる構造を呈する。膜内在性プロテオ
グリカンのポリサッカリドは、オリゴサッカリドよりも大きく、数十個の残基を
含むことができる。 ポリペプチドの特定の部位で付着されたオリゴおよびポリサッカリド分子は、
単純な機能の局所アミノ酸配列ではない。異なる細胞で発現したときに、同じポ
リペプチド配列が別のサッカリド鎖を受け取り、単一細胞型で発現したポリペプ
チドの別々のコピーが、所定の部位で付着された異なる糖をもつことができる。
糖残基が連続して付加され、それぞれ特定の酵素によってタンパク質が一連の翻
訳、折り畳みプロセスにさらされ、外膜へ運搬されるので、部位におけるグリコ
シル化は、該部位が各酵素にされされる程度および期間によって大きく異なる。
部位の曝露は、タンパク質が折り畳まれるやり方および翻訳から挿入までのステ
ップを経過してゆく速度によって、順に影響を受ける。したがって、部位におけ
るグリコシル化は、局所的配列またはポリペプチド中の他の配列に対する変化に
よって、予測できない方法で、変更することができる（Lisら、１９９３）。
【００２１】 分子構造が多様であること、および細胞外環境への曝露が比較的完全であるこ
とから、タンパク質に付加されたサッカリドは、細胞の外側の特異的基質の有効
な受容体になる。グリコプロテインおよびプロテオグリカンは、細胞内認識およ
び精子−卵子相互作用を支える接着に関連する（Lisら、１９９３、Singer、１ ９９０）。接着を介してそれらがこれらの重要なプロセスにおいて演ずる役割か
ら、グリコプロテインとプロテオグリカンは、本発明の具体例に用いるのに理想
的なものになる。 したがって、本発明の好ましい具体例において、膜タンパク質は、αへリック
スポリトピック受容体、糖脂質−アンカーポリペプチド、ポリトピック膜内ポリ
ペプチド、分泌ポリペプチドの膜結合イソ体、バイトピック膜内ポリペプチド、
グリコプロテインまたはプロテオグリカンである。
【００２２】 膜へのポリペプチドの挿入および膜を通して分泌ポリペプチドの翻訳が同じ細
胞内機構によって遂行されることは、本発明のいくつかの具体例において重要で
ある（Singer、１９９０）。真核生物では、小胞体（ＥＲ）に挿入された膜内ポ
リペプチドは、完全にトランスロケーションされたポリペプチドと同じ切断可能
または非切断可能なアミノ末端シグナル配列をもつ。このことは、挿入および分
泌が同じ細胞質シグナル認識タンパク質（ＳＲＰ）に依存しており、それが挿入
および分泌タンパク質の両方をＥＲ膜上のＳＲＰ受容体に移すという事実に匹敵
する。同様に、細菌では、膜挿入およびトランスロケーションは、同じ遺伝子産
物、すなわち、ｓｅｃＡおよびｓｅｃＹ必要とするように思われる（Singer、１
９９０）。原核および真核生物においても同様に、分泌および膜結合ポリペプチ
ドイソ体の多くの例がある。イソ体の間の唯一の相異は、残基の疎水性ストレッ
チまたは膜結合ポリペプチドのカルボキシ末端近くの糖脂質アタッチメント部位
の存在であることが多い（Singer、１９９０）。
【００２３】 ＩＩＩ型ポリペプチドの膜へのインターカーレーションのプロセスもまた、本
発明にとって重要な関係がある。バイトピックポリペプチドを挿入し、分泌ポリ
ペプチドをトランスロケートする細胞機構もまた、αへリックスマルチパスポリ
ペプチドを外膜へインターカーレートすることに関連がある。このことは、ｉ）
ＩＩＩ型ポリペプチドはバイトピックおよび分泌ポリペプチドと同じシグナル配
列をもつことがある、およびｉｉ）ＩＩＩ型ポリペプチドの膜インターカーレー
ションにはバイトピックポリペプチドの挿入と同じ遺伝子産物が必要であるとい
うことを示す研究から明らかである。遺伝子融合を含めた幾つかの実験的アプロ
ーチは、ポリペプチドを外膜へ挿入する細胞機構が、一度に１つの親水性細胞外
ループをトランスロケートすることにより、ほとんどのＩＩＩ型ポリペプチドを
インターカーレートすることを示している。したがって、ポリペプチドは一連の
独立して挿入されるセグメントとしてインターカーレートされる（Singer、１９
９０）。 本発明のほとんどの具体例は、インプリントポリペプチドの位相学的マップお
よび新しい配列をインプリントポリペプチドの特定の細胞外ドメインへ導入する
ための技術を要求する。これらの両方の要求は、遺伝子融合技術によって満たさ
れる。
【００２４】 非常に種々のポリペプチド、特に上記検討したポリペプチドはすでに遺伝子融
合技術を用いて位相学的にマッピングがなされている。これらの実験では、膜ポ
リペプチドの遺伝子を、細胞膜の特定の側に位置するときだけ機能的に活性とな
るタンパク質である“リポーター”をコードする遺伝子と合わせた。この遺伝子
構築物は、膜ポリペプチドが中間配列挿入またはＣ末端延長としてリポーター部
分を運ぶハイブリッドポリペプチドをコードした。外来性部分が、適当な膜への
ポリペプチドの選別も膜へのポリペプチドの挿入も混乱させないならば、リポー
ターは膜ポリペプチドすぐ近くの領域と同じ方法で局在化された。次いで、膜の
外側または内側のこの領域の位置が、リポーターの活性またはその欠如から推論
された。完全なポリペプチドのトポロジーは、それぞれがリポーターを膜ポリペ
プチドの配列中の異なる箇所へ運ぶ、一組のハイブリッドポリペプチドにおいて
リポーター活性をアッセイすることによって演繹された（これらの遺伝子融合マ
ッピング技術は、Boyd、１９９４に記載されている）。このアプローチは、遺伝
子テクノロジーにおいて通例用いられるポリペプチド、特に前述したポリペプチ
ドの大部分の位相学的マップを提供したのみならず、まだマッピングされていな
い膜ポリペプチドのトポロジーを決定するのにも用いることができ、本発明によ
るインプリンティングのための候補である。
【００２５】 インプリントポリペプチドの位相学的マップに加えて、本発明の具体例はそれ
ぞれ、外来性ペプチド配列をインプリントポリペプチドにおける１つまたはそれ
以上の細胞外または細胞内部位へ挿入するための技術を要求する。別法として、
外来性ペプチド配列は、膜の細胞外または細胞内ドメインの存在セクションと置
き換えてもよい。 遺伝子融合トポロジー研究は、それぞれがリポーターを、膜に対するその位置
がマッピングされるべき領域に運ぶ、一組のハイブリッドポリペプチドを用いた
ので、リポーター遺伝子を膜タンパク質遺伝子内の正確に特定化された部位へ挿
入することができるように、幾つかの技術が発達した。これらの技術として、ｉ
）膜タンパク質遺伝子内の独特な位置に見出される制限部位をもつベクターの使
用；ｉｉ）オリゴヌクレオチド指向性欠失突然変異誘発法；およびｉｉｉ）ポリ
メラーゼ鎖反応法（Boyd、１９９４）が挙げられる。これらの技術のそれぞれが
、外来性配列をインプリントポリペプチドの特定の部位へ挿入するために本発明
方法において用いることができる；新規変異を細胞外または細胞内ドメインへ挿
入するために本発明において用いる、これらの技術を拡張したものを以下に記載
する。
【００２６】 位相学的マップおよび外来性ペプチド配列を挿入するための技術以外にも、遺
伝子融合研究は、ペプチドの外来性配列を膜ポリペプチドの細胞外または細胞内
ドメインへ導入することが、ポリペプチドをその適当な膜へ選別することを妨げ
ないこと、あるいは膜へのポリペプチドの正常な挿入を妨げないことを集合的に
実証している。外来性オリゴペプチドを適応させる細胞外または細胞内ドメイン
の能力は、膜ポリペプチドの細胞外または細胞内ドメインにおける外来性オリゴ
ペプチドの組合せライブラリーの構築にとって重大なものである。したがって、
この能力は、本発明の具体例にとっても重大である。それは種々の細菌、酵母お
よび哺乳動物ポリペプチドにおいて観察されており、本明細書で記載された実施
例においても同様である。
【００２７】 大腸菌の外膜ポーリンである、ｌａｍＢの細胞外ドメインが、タンパク質の正
常な選別または挿入を妨げることなく長さ１６５アミノ酸までの外来性ポリペプ
チドを受容することが明らかにされている（Brown、１９９２）。外来性配列は 、大腸菌のＰｈｏＥ（ホスフェート−制限−誘導可能外幕孔）およびＦｈｕＡ（
フェリクロム取りこみ受容体）の細胞外ドメインにも挿入されており、該挿入は
、タンパク質の選別または挿入に影響を及ぼさなかった（Georgiou、１９９７）
。細菌の外膜の最も豊富なポリペプチドのひとつである、大腸菌ＯｍｐＡの特別
の場合において（Morona、１９８９）、制限エンドヌクレアーゼ部位に富むオリ
ゴヌクレオチドをＯｍｐＡ遺伝子のタンパク質ループＩＩおよびＩＶに対応する
部位に挿入すると、変質したタンパク質が発現され、正常に呈示された（Freudl
、１９８９）。その後、インフルエンザヘマグルチニン、βガラクトシダーゼ、
口蹄疫ウイルスタンパク質１（ＦＭＤＶ−ＶＰ１）、マラリア抗原および数種の
長さ５６アミノ酸までの他の抗原性ポリヌクレオチドがＯｍｐＡループＩＩＩお
よびＩＶにおいて呈示された（Georgiouら、１９９７）。さらに、２つの方向の
証拠が、これらの外来性ポリペプチドが、安定に折り畳まれた構造を採用するこ
とを実証した。一つ目は、ウサギにおいて、細菌抗原を呈示しているＯｍｐＡ融
合タンパク質が、強いウイルス特異的免疫応答を引き出すことが明らかにされた
ことである（Georgiouら、１９９７）。２つ目は、ＯｍｐＡの細胞外ドメインに
提示されたＣｅｘエキソグルカナーゼが、慣例的に固定化された酵素と同じ程度
に有効にセルロースを加水分解したことである（Franciscoら、１９９３）。
【００２８】 酵母では、多くの膜タンパク質の細胞外ドメインは、正常な選別および挿入の
妨害を呈示することなく外来性ペプチド配列を受容する（Boyd、１９９４、Bode
rおよびWittrup、１９９７）。高等真核膜ポリペプチドもまた、細胞外ドメイン
における外来性インサートを受容する能力を呈示している。ポリペプチドが真核
細胞において発現されるとき、遺伝子融合実験は、リポーターとして機能する余
分のグリコシル化部位を挿入することができる：ＥＲの内腔側のポリペプチドド
メインのみがグリコシル化酵素に曝露され、内腔ドメインが細胞外ドメインにな
る。余分のグリコシル化部位が、マウス筋肉ニコチンアセチルコリン受容体の膜
外領域に挿入された：挿入された部位は、外膜ポリペプチドの正常な選別または
挿入を妨げなかった；細胞外受容体ドメインに挿入された部位は、実際にグリコ
シル化された（Chavezら、１９９１）。
【００２９】 要約すると、遺伝子融合マッピング技術は、４つの方法で本発明に寄与する。
一つ目は、これらの技術が無数の外膜ポリペプチドのトポロジーを決定するのに
広く用いられており、これらの多くは前述したものであり、本発明によってイン
プリントすることができることである。２つ目は、これらの技術を用いて、まだ
マッピングされていないが、本発明によってインプリントされるための候補とな
りうるポリペプチドの位相学的マップを提供することができることである。３つ
目は、遺伝子融合技術が、本発明に、外来性ペプチド配列を膜ポリペプチドの特
定の領域に挿入するための通例行われる方法を提供することである；本発明にお
けるこれらの技術の使用、ならびに可変配列の挿入を可能にするまっすぐな延長
について以下に記載する。４つ目は、遺伝子融合トポロジーの研究が、多くのマ
ッピングされたポリペプチドの細胞外または細胞内ドメインへの外来性配列の導
入が、膜へのポリペプチドのエキスポートまたは挿入を妨害しないことを実証し
ていることである。本発明の具体例は、外膜または内膜へのアタッチメントのポ
リペプチドのモードの変更に関連している。膜への挿入および膜を横断するトラ
ンスロケーションは、同じ細胞機構によって処理されるので、単一のポリペプチ
ドの分泌、膜貫通および糖脂質アンカー同形体が内部変換されることが多い。さ
らに、分泌および膜結合同形体は、同じアミノ末端シグナル配列を用いることが
でき、多くの場合、その同形体へのポリペプチドの転換に必要な変更のみが、ポ
リペプチドのカルボキシ末端における変化である。２０残基の疎水性配列を分泌
ポリペプチドのカルボキシ末端へ付加することが、膜貫通スパンによってアンカ
ーされる同形ポリペプチドを構築するのに十分であることが多い；分泌ポリペプ
チドを膜結合ポリペプチドに変換するためのこの技術は、文献に記載されている
（Singer、１９９０）。別法として、糖脂質アンカーポリペプチドの先駆体から
のカルボキシ末端シグナル配列を付加することによって膜貫通または分泌ポリペ
プチドを変換して糖脂質アンカー体にすることができる（Cross、１９９０）。 いくつかの場合、糖脂質アンカーは、外来性ポリペプチドを細胞膜へ付加するば
かりでなく、アンカーされた外来性ポリペプチドの選別の指揮も行う。このよう
な場合、単一糖脂質アンカー配列が、外来性ポリペプチドを膜へ割り当て、トラ
ンスロケートし、アンカーするために必要なすべてである（Cross、１９９０） 。
【００３０】 本発明の具体例において、両構成要素ポリペプチドの細胞外および／または細
胞内ドメインを含むキメラマルチパスポリペプチドを構築するために、２つまた
はそれ以上の外膜または内膜ポリペプチドが融合される。この処理は種々の原核
および真核ポリペプチドを用いてうまく行われている。たとえば、大腸菌ｏｍｐ
Ｆ−ｏｍｐＣキメラタンパク質３６０１（Fourelら、１９９０）においては、細
胞外ループ１〜５を含むｏｍｐＦの領域が、細胞外ループ６および７を含むｏｍ
ｐＣの領域に融合されている。大腸菌ＳＭ１００５（Ｆ-ＤｌａｃＵ１６９ ｒ ｐｓＬ ｒｅｌＡ ｔｈｉＡ ｆｉｂＢ ｇｙｒＡ ｏｍｐＣ ｏｍｐＦ）で発
現される場合、このキメラポリペプチドは、正しく外膜に挿入される（Fourelら
、１９９０）。真核キメラポリペプチドの構築の例では、新規な膜貫通ポリペプ
チドを以下のように作成した。ポリペプチドの膜貫通ドメイン（野生型タンパク
質における第４０〜６１残基である２０個の残基が疎水性）を含む、ヒトアシア
ログリコプロテイン受容体Ｈ１を直列に２、３または４回繰り返した。各ケース
において、Ｈ１リピートは、ヘキサペプチドＨＲＰＳＬＧなどの相対的に親水性
のリンカーで連結した。これらの構築物は膜に正常に挿入され、内腔ドメインは
正常にグリコシル化された。
【００３１】 膜タンパク質の融合を可能にすることが多い一般的原理はすでに概説されてい
る：上記の膜タンパク質挿入のプロセスに関する記載は、ポリトピック膜タンパ
ク質のαへリックス膜貫通ストランドが連続的および互いに独立して挿入される
ことを強調する。膜貫通ストランドのインターカーレーションの機構の意味する
ところは、もし各疎水性ストレッチが独立して膜において安定であるならば、ア
ミノ末端シグナル配列および、より親水性の残基で交換されている、複数の２０
残基長さの疎水性ストレッチで構築される、ほとんどキメラのポリペプチドが正
常に挿入されうるということである。 本発明の好ましい具体例において、膜ポリペプチドの細胞外または細胞内ドメ
インは可変性の高い領域を含み、それは標的化合物への結合において、対象ポリ
ペプチドまたはその一部として同定され、単離される。上記遺伝子テクノロジー
の手法を組合せ遺伝学と組合せて用いて、当業者は、非常に種々の可変領域を呈
示している細胞のライブラリーを作成することができ、現在の問題となっている
ポリペプチドを非常に短い時間で同定し、単離することができる。 対象ポリペプチドと同時にタンパク質ポリペプチドの遺伝子を提供することが可
能である。可変性の高いドメインは、ｃＤＮＡライブラリーまたはその一部によ
ってコードされるポリペプチドを含む。
【００３２】 膜ポリペプチドは、細胞（本発明方法に対して適合された）に対して相同なタ
ンパク質であることも可能であり、あるいは宿主細胞に対して異種ポリペプチド
であることも可能であり、これが好ましい。 膜ポリペプチドは、細胞表面上互いに隣接して存在する可変ドメインおよび選
択部位を含むように遺伝子工作されるのが好ましい。 標的化合物は、たとえば、化学的に生成された物質、タンパク質、核酸、生物
源から誘導された複合物、またはこれらの材料の混合物もしくは（組合せ）ライ
ブラリーなど、どのような材料でもよい標的化合物として好ましい物質は、既知
の薬物（またはその誘導体）（たとえば、このような化合物のポリペプチドへの
結合パターンをさらに研究するために）、ポリペプチド（タンパク質／タンパク
質相互作用を同定し、単離するために）、抗体または抗原、ワクチンまたは病原
体である。
【００３３】 膜タンパク質の細胞内ドメインを用いて本発明を行う、すなわち対象ポリペプ
チドが内部表面（ペリプラズムを含む）に呈示されるならば、細胞の標的化合物
が細胞の内側にあることが必須である。このことは、細胞の外側からの標的化合
物の輸送または核酸によって達成されうる（しかし、これは少ないかまたは小さ
い標的化合物においてのみ可能である）。細胞内へ標的化合物も運搬する別の方
法は、対象ポリペプチドおよび標的化合物が同じ細胞内で共発現することによる
ものである。このような２つ（またはそれ以上）の外来性タンパク質が１つの同
じ細胞内で共発現するのを可能にするシステムは、当業界で公知である。本発明
を行うこの方法が、宿主細胞によって産生されうる標的化合物（タンパク質また
は核酸など）に限定されることは明らかである。 標的化合物と対象ポリペプチド間の相互作用の選択のために、当業界で公知の
いずれかの適当な選択システムを本発明方法に適合させることができる。これら
の選択システムは原則として当業者には公知であり、本発明にしたがっていずれ
かの適当な選択システムを適合させることについて以下に説明する。
【００３４】 本発明の重大なポイントは、標的化合物と対象ポリペプチドの結合が選択部位
にどのように影響を及ぼすかである：本発明にしたがって、対象ポリペプチド−
膜ポリペプチドの部分と標的化合物の間の結合の結果として、選択部位の状態に
影響を及ぼすシグナルが得られる。この影響とは、膜ポリペプチドまたは結合し
た標的化合物と選択部位との直接または間接的相互作用である。直接的相互作用
は、たとえば、標的分子の結合における選択部位の空間的障害、すなわち、標的
分子の物理的存在ゆえに、選択剤が結合すべき部位がもはや接近できないことに
よって行われる。別法として、対象ポリペプチド−膜ポリペプチドの部分への標
的化合物の結合における膜ポリペプチドのコンホーメーション変化によって、こ
のような空間的障害を誘発することができる。たとえば、膜ポリペプチドへの共
有結合によって、選択部位が膜ポリペプチドの近傍に存在するのが好ましい。選
択部位は、膜ポリペプチドそれ自体の一部であることもできる。このような場合
、システムの空間的障害は明確に定義され、通例のタンパク質工学によって容易
に調節可能である。 したがって、本発明の好ましい具体例は、対象ポリペプチドを有する細胞外ま
たは細胞内ドメインと選択部位との間の相互作用が、空間的障害、特に標的化合
物が対象ポリペプチドに結合した後に、選択剤が選択部位と相互作用しないよう
にする空間的相互作用であるという方法である。選択部位が、対象ポリペプチド
の細胞外または細胞内ドメインのすぐ近く（特に共有結合を介して）であるのが
好ましい。
【００３５】 本発明の好ましい具体例において、選択部位は、選択剤の接着ドメイン、たと
えば、対象ポリペプチドを呈示している膜ポリペプチドの一部でもある接着ドメ
インである。 他の好ましい具体例では、膜タンパク質は、細胞表面に追加のドメインを呈し
ており、追加のドメインは、可変ドメインと選択部位の両方に近く、この付加ド
メインも、好ましくは結合によって、標的化合物と相互作用する。
【００３６】 間接的相互作用は、たとえば、結合の際に放出され、結合または接触によって
選択部位の変化を引き起こすメッセンジャー分子によって行われる。細胞の選択
特異性における変化が、標的化合物の対象ポリペプチドへの結合に対する間接的
相互作用であること、すなわち、結合が、選択部位との（直接または間接的）相
互作用を迅速に引き起こすことが最も重要である。 本発明の方法において選択の様式は重要ではなく、正および／または負の選択
プロトコルが適切である。好ましい具体例において、選択剤は毒性剤である。 （外）膜のポリペプチドの多くが、侵入した細胞を殺傷または増殖を妨害する
毒性剤にとっての接着のポートである。本発明の目的において、語句“毒性剤”
は、細胞を損傷させるか、または細胞の成長を阻害する作用剤を意味する。分子
生物学に適用される大部分の伝統的な選択システムがこのタイプの選択システム
に該当する。その性質から、この選択システムは、対象ポリペプチドが膜ポリペ
プチドの細胞外ドメインに存在する、本発明の“細胞外”具体例に適用するのが
好ましい。
【００３７】 多くの毒性剤が、特定タイプの細胞（宿主）表面にある特異的ポリペプチド（
受容体）の特異的領域（接着ドメイン）を認識する。接着ドメインに毒性剤が結
合することが、細胞溶解または細胞の成長および増殖の阻害が最高点に達するプ
ロセスにおける第１段階である。もし、この第１段階が接着ドメインの突然変異
、受容体の抑制あるいは接着ドメインをさえぎるインヒビターの干渉によって妨
げられるなら、細胞への選択剤の侵入が遮断される。細胞上の作用剤の可能な受
容体分子がすべて、どのような理由であれ、作用剤の侵入に対して接近不可能ま
たは機能しない場合、細胞は免疫を付与される。すべてではないが幾つかの受容
体が接近不可能または機能しない場合、細胞は耐性になるが免疫性にはならない
：受容体の数の減少によって作用剤の侵入が遅くなり、したがって、作用剤の有
害な影響の速度または強度が減少される。
【００３８】 本発明の目的のために、対応する天然に存在する作用剤とは細胞における特異
性および行動が異なるように変更されている選択剤を用いることができる。たと
えば、上記接着ドメインを介する経路が全く一般的である、バクテリオシンまた
はバクテリオファージなどの病原性剤は、特異的接着ドメインに対するそれらの
優先性を変えるように変更することができる。したがって、多種ある接着ドメイ
ンに対して病原体を接着させるための方策を設計することは、当業者にとって容
易に可能である。 本発明の好ましい具体例において、選択剤は、バクテリオシン、バクテリオフ
ァージまたは毒素あるいは真核細胞のウイルスなどの病原性剤である。 バクテリオシンは、それらを発現し、分泌する菌株にとっては無害であり、他
の細菌（密接に関連することが多い）にとっては致命的な、細菌が産生するタン
パク質である（バクテリオシンは、Pattusら、１９９０に記載されている）。最
も詳細に研究されているバクテリオシンは、大腸菌によって発現されるコリシン
であり、コリシン産生細胞にコリシン免疫性を付与するタンパク質もコードする
プラスミドによってコードされる。コリシンは、それぞれがコリシン活性の３つ
の一連のステップのひとつの原因である、３つの構造的ドメインから構成される
：ｉ．接着ドメインの認識；ｉｉ．細胞膜を横断するトランスロケーション；お
よびｉｉｉ．細胞の破壊（Pattusら、１９９０）。
【００３９】 コリシンは２つの機構によって殺傷する：ｉ．細胞質膜に孔を形成し、膜を透
過性にし、失活させる（コリシンＥ１、Ａ、Ｂ、Ｉａ、ＩｂおよびＫ）；ｉｉ．
ＤＮＡまたはリボソームＲＮＡを酵素的に切断する（コリシンＥ２およびＥ３）
（Pattusら、１９９０）。細菌がコリシンに曝露されたときの細胞死の速度は、
毒性分子が細胞に致死量（単一分子のみを含むが、一度の一斉に行われるステッ
プでインポートされた多数の活性分子からなることもある）で別々に侵入するこ
とを示唆する。ここで重要なポイントは１回の投与が１つの細胞を殺すことであ
る。 大腸菌のほとんどすべての主要外膜タンパク質は、少なくとも１つのコリシン
の受容体である。複数のコリシンが１つの受容体を認識する場合、それらの接着
ドメインは部分的にオーバーラップする。ＯｍｐＦ（主要な外膜ポーリンである
）に接着する２つのコリシンについて例として述べる。図２に示されるように、
ＯｍｐＦは、Ｌ１〜Ｌ７という７つの細胞外ループを呈示し、Ｌ１はアミノ末端
に隣接し、Ｌ７はカルボキシ末端に隣接する。コリシンＮの接着ドメインは、Ｌ
１、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５およびＬ６を含むが、Ｌ２またはＬ７を含まない。したが
って、Ｌ１のペプチド配列における変更は、コリシンＮに対する全免疫性をもた
らし、一方、Ｌ２に対する変更は、わずかな耐性さえももたらさない。ＯｍｐＦ
を認識する他のコリシンであるコリシンＡの接着ドメインは、幾分異なる。コリ
シンＡがその受容体と結合するにはループ１〜５が必要であり、一方Ｌ６および
Ｌ７は不必要である（Fourelら、１９９０）。前述のキメラｏｍｐＦ−ｏｍｐＣ
タンパク質３６０１は、ｏｍｐＦからのループ１〜５とｏｍｐＣからのループ６
および７を含む。予想されるように、３６０１を発現している大腸菌ＳＭ１００
５は、全体としてコリシンＡに影響されやすいが、全体としてコリシンＮに対す
る免疫をもつ。
【００４０】 高度に可変な集団から特定の細胞を選択する本発明方法を容易に扱うには、細
胞当たりの受容体の数が重要である。コリシンの機能的受容体は一般に、細胞の
表面に数千コピー存在する。しかし、本発明を最適条件で実行するには、ほとん
どの受容体の発現レベルが容易に操作されることが重要である：受容体をコード
する遺伝子は、すでに誘発可能な異種プロモーターをもつプラスミドにクローニ
ングされており（あるいは容易にクローニングすることができる）、発現の外部
調節をすることができる。誘発可能な異種プロモーターをもち、発現の調節をす
ることができるプラスミドの構築および処理は、文献に記載されている（Brown 、１９９２、Freudl、１９８９）。誘発可能な異種プロモーターをもち、発現の
調節をすることができるプラスミドの構築および処理のためのプロトコルは、糖
業者には入手可能である。 バクテリオファージは、遍在し、非常に多様なグループの細菌のウイルス寄生
体である。形態がわかっている３５００の異なる隔離集団を含む、１２ファミリ
ーのファージが存在し、１００以上の細菌の属に感染する。それらの広大なバリ
エーションは、核酸レベルにおいてさえも明らかである：種、一本鎖ＤＮＡ、二
本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡ含有ファージなどに応じて変化す
る。広範な形態は、通常、４つのカテゴリーに分類される：尾あり；キューブ状
；線維状；および多態型。形態学、遺伝学、生態学およびライフサイクルに関す
る広範なレビューは、文献にて入手可能である（Calendar、１９８８）。
【００４１】 バクテリオシンと同様に、ファージは宿主表面にある受容体の特異的接着ドメ
インに結合する。一重の外膜タンパク質は、複数のファージ種にとっての受容体
となることができ、その接着ドメインは、色々と変化する範囲でオーバーラップ
する。図３は、大腸菌の外膜タンパク質Ａを受容体として利用する、種々のファ
ージならびにコリシンのひとつの接着ドメインを示す。図は、ファージによって
明らかに利用されない受容体ドメインも示す：受容体のこれらの領域に対する変
更は、ファージの吸着に影響を及ぼさず、したがって細菌細胞にファージ耐性を
付与しない。ファイジ受容体は、バクテリオシンの受容体のように、細胞当たり
１００から１０００コピー存在することが多い。これまでに強調したように、イ
ンプリントポリペプチドの発現レベルの調節が、本発明にとって重要である。誘
発可能なプロモーターを有するプラスミドの構築および操作のためのプロトコル
は文献に記載されている。
【００４２】 受容体への結合に続いて、ウイルス核酸が細菌宿主に侵入し、ファージの図食
が始まる。増殖の方策および宿主における増殖の影響は、ファージの種によって
大きく異なる。感染後すぐに、すべてではないが幾つかの種のファージは、同じ
ファージ種の他の個体による次の感染に対する免疫を付与する。もし、感染して
いるファージがビルレントファージならば、ファージそれ自体の増殖に適したも
のにするために、正常な細菌の組み立てをすばやく変更し、細胞外の区域へ放出
する。放出の個々の方策は、宿主に対して非常に相異した影響をもつ。イノウイ
ルス科（繊維状ファージの科のひとつ）は、排出によって解放される：新しいフ
ァージが、細菌膜を通して分泌される（Calendar、１９８８）。このプロセスは
細菌にとって致死的ではないが、代謝的に負担が重く、したがって、感染した細
菌は、非感染細菌よりも遅い速度で分裂する。伝播は垂直にもおこり、娘細胞は
親から感染を受け継ぐ。排出に類似した放出のための方策は、プラズマウイルス
科（多態型ファージの科のひとつ）によって呈示される。リポタンパク質のエン
ベロープによって囲まれた二本鎖ＤＮＡ分子のみからなる、これらのファージは
、分芽することによって細胞膜から解放される。また、このプロセスは致死性で
はないが、増殖を妨げる。逆に、“尾あり”および“キューブ状”のファージの
放出手段である溶菌は、宿主を破壊する。細胞内ファージがその数を２０〜１０
００に増やした後、それらは細菌細胞を内部から弱め、破裂させ、次いで感染粒
子を解放する（Calendar、１９８８）。
【００４３】 バクテリオファージは、その宿主に広範囲の影響を及ぼすので、同じ受容体を
用いるファージ種間でさえ、数種の異なる感染結果がある。さらに、その宿主に
及ぼすファージの効果は、操作できる。突然変異誘発に続いてファージのビルレ
ンス（毒性）またはベネボレンス（善性）を人工的に選択することにより、宿主
に対するファージの有害な影響を強化または緩和することができる。感染細菌に
代謝能力または抗生物質耐性を付与する遺伝子の挿入といったような、ファージ
遺伝子の挿入または欠失が、ファージが細菌宿主に及ぼす影響を操作するための
通例行われている手段である。宿主に及ぼすファージの影響を変更するための他
の方法は、宿主を変更することである。たとえば、大腸菌のｇｒｏＥＬ突然変異
は、Ｔ４、Ｔ５、λおよび１８６ファージに感染しやすい菌株を生み出すが、成
熟ファージ粒子の細胞内組み立てを許可しない（Zeilestra−Ryallsら、１９９ ３）。したがって、感染した細菌は、成長を妨げられるか、あるいは殺傷される
ことさえあるが、感染性のファージ粒子を生み出さない；要するに、これらの細
菌は感染するファージにとって、行き止まりである。最終的に、宿主に及ぼすフ
ァージの影響は、文献に記載された方法で（Boulangerら、１９８８）、ファー ジゴースト（ＤＮＡ涸渇ファージ）の作製によって変更することができる。それ
らはゲノムをもたないので、ファージゴーストは細胞に感染しない。しかし、そ
れらは、細胞に接着し、細胞質膜に貫通して、正常時にはファージゲノムを輸送
する役目を果たすイオンチャネルを形成する。正常ファージはこれらのチャネル
を後ろで閉じるが、ファージゴーストはチャネルをいつまでも開けたままにする
。これらのチャネルを通るイオンの流出速度は、細胞に結合するゴーストの数に
直線的に相関する；流出は細胞を消極化し、細胞は最後には死亡する。
【００４４】 真核細胞の毒素およびウイルスは、真核細胞表面にあるそれらの受容体の特異
的接着ドメインを認識する。１１の異なるウイルス科を含む、真核細胞系のウイ
ルスの少なくとも３０の異なる種の受容体は、文献に記載されており、これらの
病原体のほとんどについて、ペプチド配列または糖で修飾されていない配列によ
ってグリコシル化されているオリゴサッカリドからなるウイルス接着ドメインが
、特徴づけされている（Tylerら、１９９６）。バクテリオシンまたはバクテリ オファージを含む作用剤のような真核病原性剤の受容体は、通例、ベクターでク
ローニングされ、誘発可能なプロモーターから発現されるので、ひとつの細胞に
発現した受容体の数の操作をすることができる（Stauntonら、１９９０）。 主なグループであるヒトライノウイルス（ＨＲＶ）は、真核細胞に影響を及ぼ
す病原性剤の一例を提供し、本発明での使用に適している。ＨＲＶは、ピコルナ
ウイルス科のメンバーであり、ＲＮＡゲノムを含む小さいタンパク質キャプシド
構造をもつウイルスである。ライノウイルスの１００のセロタイプのうち、８９
が、非常によく特徴がわかっているグリコプロテイン、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ−５
４）をその受容体として使用する。ＨＲＶセロタイプ１４は、よく研究されてお
り、実験室で容易に繁殖させることができ、したがって、本発明において使用す
るのに適している（Stauntonら、１９９０、Couch、１９９６）。主なグループ であるＨＲＶは、ヒト細胞培養の多くの異なる細胞系において効率よく成長する
。もっともよく使用される組織は、ＷＩ−３８二倍体繊維芽細胞、胎児扁桃、Ｍ
ＲＣ、ＨｅＬａおよびＣＯＳ細胞系である。成長のための最適条件およびプロト
コルは、文献に記載されている（Couch、１９９６）。ＨＲＶは、ウイルス剤へ 曝露するための記載された技術のいずれか１つによって曝露された種々の細胞系
のモノレイヤーにプラークを形成する。感染細胞は、インキュベーションの１０
〜１２時間後に、１つの細胞に１０〜２００のプラーク形成ユニットを生じる。
【００４５】 ＨＲＶ１４の構造は、Ｘ線結晶解析によって明らかにされている（Stauntonら
、１９９０）。キャプシドは、直径３０ｎｍの対称２０面体であり、軸の５倍に
沿って走り、病原体の受容体結合部位を含む、幅３０オングストローム、深さ２
５オングストロームのキャニオンがある。受容体は、免疫グロブリンスーパーフ
ァミリーのよく特徴がわかっているメンバー、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ−５４）であ
り、その長さは５３２残基、線状に配置された５つの免疫グロブリン様ドメイン
およびドメイン２と３の間にヒンジを含む１９ｎｍ×２〜３ｎｍの棒状体である
（図４）。ウイルスの結合は、末端の免疫グロブリン様ドメイン（Ｄ１）のウイ
ルスキャニオンへの挿入が関与している。この形態の相互作用は、空間障害によ
る妨害に対して非常に脆弱である（Stauntonら、１９９０）。したがって、低位
の免疫グロブリン様ドメイン（Ｄ３〜Ｄ５）はウイルスの結合には直接関与せず
、それらに起こる突然変異は接着を妨げないが、それらの完全な欠失は、Ｄ１の
接近可能性を低下させるので、接着を阻害する。
【００４６】 ＩＣＡＭ−１は、複数のＮ−結合オリゴサッカリドをもち、細胞型間のグリコ
シル化におけるバリエーションから、ＩＣＡＭ−１の分子量に７６〜１１４ｋＤ
という不均一性が生じる。それは、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）のた
めの細胞−表面リガンドとして機能し、ＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１の間の結合は
、数種の免疫的および炎症プロセスにおける白血球の接着に寄与する（Staunton
ら、１９９０）。ＩＦＮ−ｇ、ＴＮＦ−ａおよびｂ、ならびにＩＬ−ａおよびｂ
といったようなＴリンパ球および単球によって分泌されるサイトカインは内皮細
胞あたり３．５×１０6コピーの発現を誘発する。しかし、非誘発細胞は、非常 に低いレベルでＩＣＡＭ−１を呈示し、ＣＤＭ８発現系においては、誘発可能プ
ロモーターのコントロールを介してＩＣＡＭ−１を外来的に調節することができ
（Stauntonら、１９９０）、このシステムは本発明の機能に非常に優れて適して
いる。 本発明の好ましい具体例において、方法は、高処理量スクリーニングアッセイ
の形体で行われ、該細胞集団は、対象ポリペプチドに対する未知の結合パートナ
ーが同定され、単離される、多数の標的化合物に曝露される。この具体例におけ
る標的化合物は、単一の確定された化合物、化合物の混合物または、多くの結合
可能性をテストするために、化合物の（組合せ）ライブラリーである。 このような高処理量アッセイは、広範囲にわたる、完全なゲノム情報が入手可
能な微生物（マイコバクテリウム・ツベルクロシスまたはヘリコバクターなど）
のスクリーニングに特に適している。
【００４７】 本発明方法は、通常、前記ステップａ）からｆ）を行うことによって実行され
る。たとえば、選択圧力の増加をともなう選択プロセスを繰り返すことが必要で
ある。これは、たとえば、単離された、ポジティブなクローンの数が処理するに
は多すぎる場合に適している。 このような場合、ステップｂ）からｅ）を少なくとも１回繰り返すのが好まし
く、繰り返しステップにおける選択圧力を増加して行うのが好ましい。 方法は、細胞集団が所望の数のはっきりと識別しうるクローンを含むまでｂ）
からｅ）のステップによって行う。
【００４８】 語句“バックグラウンド”は、標的化合物を結合しないが、それでもなお選択
された集団に残っている細胞を意味するために用いられる。一般に、ＣＩＳＴＥ
Ｍが、インプリントドメインが標的化合物を結合しない細胞を確実に排除し、イ
ンプリントドメインが標的を結合する細胞を確実に選択するために、バックグラ
ウンド細胞の数を最少化することが望ましい。バックグラウンドの低減化のため
の１つの方策においては、ＣＩＳＴＥＭ細胞集団は、その機能が選択剤の伝播と
増殖である“ヘルパー細胞”を補足される。この選択剤の増殖は、選択の強度を
増加し、それによって、残留するバックグラウンド細胞を減少させる。ヘルパー
細胞は、残りのＣＩＳＴＥＭ細胞集団に存在する選択可能なマーカーが欠如して
いる；このことから、ヘルパー細胞が選択剤の増殖という目的を果たした後のヘ
ルパー細胞の効率よい排除が可能になる。 補足細胞は、選択剤の行動を調節するために他の方法においても用いられる。
たとえば、作用剤の作用を停止するために、作用剤の受容体をもつ加熱殺傷細胞
をＣＩＳＴＥＭ細胞集団に加える。これらの細胞は、作用剤に結合し、残りのＣ
ＩＳＴＥＭ細胞集団における選択活性からそれらを除去する。
【００４９】 ステップを繰り返す場合、ステップｂ）〜ｅ）を繰り返す前に、ステップｄ）
で選択されたクローンの可変領域に新たな配列バリエーションを導入することが
できる。スクリーニングテストは（付加的に）、機能パラメーターによって行う
こともできる。本発明の特定の具体例において、対象ポリペプチドは標的化合物
に結合し、その機能に影響を及ぼす。次いで、ステップｄ）で選択され、ステッ
プｅ）で増殖されたクローンによって呈示されるポリペプチドが、標的化合物の
機能に影響を及ぼす能力によってスクリーニングされる。 対象ポリペプチドが酵素活性を呈示するならば、スクリーニングのステップが
可能である。このような場合、本発明方法は、各細胞の生命維持に必要な化合物
の供給が、標的化合物と構造的に類似しているが同一ではない化合物において酵
素的に作用する細胞の可変領域に依存する栄養培地に細胞集団が置かれるステッ
プを含む。
【００５０】 本発明は、対象ポリペプチドと標的化合物の間の相互作用の検出を用いて、対
象ポリペプチドまたは標的化合物もしくは該ポリペプチドまたは該標的の遺伝子
を同定し、単離する方法を提供する。この相互作用において、少なくとも１つの
相互作用が未知である。該方法は、未知の相互作用パートナー、すなわち、対象
ポリペプチドおよび／または標的化合物の同定を可能にする。幾つかの具体例で
は、たとえば未知のリガンドが、受容体部位における結合の際に、アンタゴナイ
ズまたは干渉されることを必要とする細胞にある効果を及ぼし、リガンドおよび
それが結合する受容体ドメインの両方が同定されることを必要とする場合など、
両方の相互作用が未知である。（本明細書において、語句“同定する”および“
同定”は、天然に存在する対象ポリペプチドの発見および天然には生じないポリ
ペプチドの設計を意味する。）本発明方法の具体例を、ＣＩＳＴＥＭ（選択によ
る細胞インプリンティング：分子の目的諭的展開（Cellular Imprinting by Sel
ection: Teleological Evolution of Molecules）の頭字語である）と呼ぶ。Ｃ ＩＳＴＥＭは、膜ポリペプチドがこれまでに述べた特性を示す細胞の頻度を増幅
するための、遺伝子工作された細胞の集団に対する選択圧力を提供する。このプ
ロセスは、前述したように、ポリペプチドを“インプリントする”という語句で
表現される。本発明方法によってインプリントされるポリペプチドの範囲は広く
、広範なサイズ、多様な基礎構造を呈し、数種の原核または真核細胞培養物のい
ずれか１つである、タンパク質、グリコプロテイン、プロテオグリカンなどが含
まれる（図１）。
【００５１】 本発明の目的における、語句“相互作用”および“相互作用する”とは、（膜
タンパク質の細胞外または細胞内ドメイン中の）対象ポリペプチドに対する標的
化合物の作用を意味し、この作用は、選択剤が選択部位を利用することができな
いように選択部位を変更または妨害する。 選択部位が接着ドメイン上に位置する特定の具体例において、標的化合物の結
合は、たとえば、選択剤をその接着ドメインから妨げることによって、（膜ポリ
ペプチドにおける）分子内相互作用を介する選択剤の作用を妨げる。これには、
接着ドメインへの影響力をもつ可変ドメインの結合、接着、構造的変化または化
学的修飾が含まれる。このような接着ドメインへの影響力は、とりわけ、選択剤
の有害作用を防ぐ、接着ドメインのコンホーメーションの変化である。
【００５２】 本発明は、少なくとも３つの分野において有用である。第一に、本発明は、医
学の診断、治療、調査、実験操作または他の適用に有用な特性をもつポリペプチ
ドの同定に用いることができる。本発明方法によって同定されるポリペプチドは
、実質的にどのような与えられた標的化合物とも相互作用する、特に、高親和性
および高特異性をもって結合するポリペプチド、複数のエピトープでそれぞれの
標的化合物に接着するポリペプチド、それぞれの標的化合物を結合するが、標的
化合物に密接に関連する化合物に対して親和性を示さないポリペプチド、酵素的
ポリペプチドおよび受容体のアンタゴニストまたはアゴニストとしての活性など
の生物学的活性を示すポリペプチドである。第二に、重要な対象である既知の化
合物である標的と特異的に相互作用するポリペプチド配列を同定することによっ
て、本発明は、既知の化合物の本来の相互作用の同定を補助することができる。
第３に、本発明は、既知の対象ポリペプチドと既知の標的分子間の相互作用を分
析するのに用いることができる。対象ポリペプチド中のどの配列が標的化合物と
相互作用するかを同定することによって、本発明は、相互作用において役割を演
ずるポリペプチドエピトープのマッピングを補助する。別の具体例において、本
発明方法は、標的化合物集団のスクリーニングおよび既知のポリペプチドに結合
するこのような化合物の同定に用いることができる。この具体例において、たと
えば、対象ポリペプチドと相互作用する医薬的活性化合物をスクリーニングする
ためのテスト細胞として、膜ポリペプチドの細胞外または細胞内ドメインに既知
のセクションを呈示している細胞を用いてスクリーニングアッセイを行う。 本発明は、標的化合物との相互作用特性が、これまでに述べた結合親和性より
もさらに複雑な特性であるポリペプチドの同定にも用いることができる。本発明
方法によって同定される分子は、以下のようなポリペプチドである：多価結合を
呈するポリペプチド；ひとつの分子には強く結合するが、もうひとつの密接に関
連した分子には親和性を示さないポリペプチド；それらが結合する標的化合物の
機能的活性に影響を及ぼすポリペプチド；および酵素的ポリペプチド。
【００５３】 本発明は、３つのＣＩＳＴＥＭ構成要素の相互作用に基いている：（１）遺伝
子工作された原核または真核細胞の集団；（２）標的化合物；および（３）選択
剤（図５）。集団中の各細胞の表面には、ＣＩＳＴＥＭの操作に関与する少なく
とも２つのポリペプチドドメインがある：細胞ドメインは、未知の標的化合物と
の相互作用が決定されることになっている既知のポリペプチド、または未知のポ
リペプチドの場合、インプリントドメインおよび接着ドメインなどの選択部位の
いずれかを含んでいる。ＣＩＳＴＥＭ細胞集団は、インプリントドメインにおい
て少なくとも１０12個の個々のオリゴヌクレオチドを呈示するように工作されて
いるので、インプリントドメインは、高度に可変である。（もし、集団が真核細
胞ならば、オリゴヌクレオチドを多様なオリゴサッカリドまたはポリペプチドの
翻訳後プロセシングから得られる他の構造体によって装飾することができる。）
標的化合物と選択部位との直接的相互作用の場合、各細胞表面上のインプリント
ドメインは、選択部位の隣であり（接着ドメインなど）、細胞に影響を及ぼすた
めに、ＣＩＳＴＥＭ選択剤に対する構造が結合しなければならない。病原性剤の
場合、これは、微生物または分子であり、細胞に対して致死性であるかまたは単
にそれらの成長を妨害するが、作用剤による細胞の破壊または妨害における最初
のステップは、必然的に作用剤とその接着ドメイン間を結合している。２つの重
要なドメイン、いわゆるインプリントドメインおよび接着ドメインは、各細胞の
表面にある複数のコピーにおいて発現されるが、直接的相互作用の場合、それら
は、通常互いに隣接する：更に詳しくは、それらは互いに標的化合物がインプリ
ントドメインと相互作用するとき、接着ドメインを越えるに十分なだけ長く伸び
るか、または、異なる経路（たとえば選択部位の分子内空間変更によって）で選
択部位に影響を及ぼすかのいずれかであるように十分に接近しなければならない
。
【００５４】 標的化合物は、ＣＩＳＴＥＭによって同定されたポリペプチド配列が、それら
の所望される特性を呈するかまたは機能を行うように、前述の方法で相互作用し
なければならない分子または一組の分子である。言い方をかえれば、ＣＩＳＴＥ
Ｍは、標的化合物と相互作用し（結合するなど）、必要に応じて構造的または機
能的に変更するポリペプチドを同定する。標的化合物は、どのような分子でもよ
く、特にタンパク質、炭水化物、サッカリド、グリコプロテイン、プロテオグリ
カン、ホルモン、受容体、抗原、抗体、病原体、基質、代謝産物、遷移状態類縁
体、補因子、インヒビター、薬物、着色剤、栄養剤、小分子化合物などが挙げら
れるがこれらに限定されるものではない。各ＣＩＳＴＥＭは、標的化合物に対し
ただ１つの要求のみを出す：それは、対象ポリペプチドへの結合の際に、選択部
位における変化に影響を及ぼすことにおいて効果的でなければならないというこ
とである。たとえば、インプリントドメインへ付着した結果として隣接した接着
ドメインを妨害するのに十分大きくなければならないか、または、選択部位が十
分に変化して選択剤を妨害するかまたは選択剤を作用させるように、その結合が
膜タンパク質の構造に影響を及ぼさねばならないなどである。
【００５５】 最も基本的なＣＩＳＴＥＭ（未知の相互作用物がポリペプチドである具体例の
ために例示される）を組み立て、選択を開始するために、次のステップを行う。
第一に、ＣＩＳＴＥＭ構成要素（１）である細胞集団をＣＩＳＴＥＭ構成要素（
２）である標的化合物の溶液または懸濁液とともにインキュベートする。ＣＩＳ
ＴＥＭ細胞集団を標的化合物に曝露している間に、インプリントポリペプチドの
可変領域の構造的多様性の結果としてインプリントドメインと標的分子の間に広
範な相互作用が起こる。すなわち、別々の細胞のインプリントドメインに呈示さ
れた別個の構造は、標的とそれらの結合反応において独特のオンレート、オフレ
ートおよび解離定数を示す（図６）。インキュベーション後またはインキュベー
ション中に、ＣＩＳＴＥＭ構成要素（３）を導入する：バクテリオシン、バクテ
リオファージ、ウイルスまたは毒素粒子を細胞および標的化合物に加える。この
ステップで、基本的ＣＩＳＴＥＭの組み立ては完成し、選択が始まる。
【００５６】 ３つのＣＩＳＴＥＭ構成要素の間の相互作用は、インプリントドメインが標的
化合物を結合する細胞に選択的利点を付与する（図７）。これは以下のように行
う。前述したように、もし、インプリントドメイン（次のように、本発明の構造
的特徴を記述する場合に、語句“インプリントドメイン”は、未知の標的化合物
との相互作用が決定されることになっている既知の対象ポリペプチドを含むドメ
インに対しても用いられる。したがって、語句“インプリントポリペプチド”は
、このような既知の対象ポリペプチドを含むタンパク質をも意味する。）および
選択部位が細胞表面のすぐ隣にあるならば（たとえば、もし選択部位が接着ドメ
インにあるならば）、結合における相互作用を、非常に明確な容易に組み立てら
れた方法で行うことができる。したがって、標的化合物がインプリントドメイン
に位置する構造に結合する場合、化合物は隣接する、選択部位をもつ接着ドメイ
ンの表面をオーバーラップすることができる。このオーバーラップは、接着部位
への選択剤の付着を妨害し、したがって細胞を保護され、分裂を継続できるよう
になる（図７）。対照してみると、インプリントドメインが適切な親和性をもつ
標的化合物を結合しない細胞は、未保護のままであり、したがって、選択剤によ
って選択される（殺されるかまたは妨害される）。このように、各選択されたク
ローンは分裂を続けるので、頻度および数において増加するが、非保護クローン
は選択剤によって苦しめられる。インプリントドメインにおいて非常に多様な構
造を呈示する細胞集団から、ＣＩＳＴＥＭは、標的化合物を結合する構造を発現
するクローンを選択し、増殖させる（図８）。
【００５７】 基本的なＣＩＳＴＥＭを修飾し、精巧にすることによって、インプリントドメ
インと標的との相互作用において指定された親和性または性質の選択が可能にな
る。特異性が高く、予定の部位に結合するか、または特定の構造モチーフによっ
て結合する、多価結合を選択することができる。さらに、ＣＩＳＴＥＭを拡張し
て、結合のみならず、機能的活性も選択することができる；これらの拡張された
ＣＩＳＴＥＭを用いて、酵素および他の機能的活性分子を生成することができる
。 上述したように、本発明の具体例をＣＩＳＴＥＭ（選択による細胞インプリン
ティング：分子の目的諭的展開（Cellular Imprinting by Selection: Teleolog
ical Evolution of Molecules））と呼ぶ。一般に、ＣＩＳＴＥＭは、３つの構 成要素からなる。それらは、（１）遺伝子工作された原核または真核細胞の集団
；（２）標的化合物；および（３）選択剤（図５）である。
【００５８】 ＣＩＳＴＥＭ細胞集団は、原核または真核細胞である。未知の相互作用体が対
象ポリペプチドである場合、ＣＩＳＴＥＭ細胞集団において、膜ポリペプチド（
“インプリントポリペプチド”）の１つの細胞外または細胞内ドメイン（“イン
プリントドメイン”）は、高度に可変なポリペプチド配列を呈するように工作す
る。もしＣＩＳＴＥＭ細胞集団が、真核細胞ならば、インプリントドメイン内の
グリコシル化部位を、可変複合体サッカリドによって装飾してもよい。インプリ
ント部位における高い配列可変性は、変化が望まれる翻訳された領域に対応する
、ポリペプチド遺伝子内の部位への可変オリゴヌクレオチドの挿入によって達成
される。これらの可変オリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ランダム配列、または
オリゴヌクレオチドのいずれかの他の形体であってよい。外来性オリゴヌクレオ
チドに対する遺伝子を外膜タンパク質遺伝子中の標的部位に挿入するための技術
は、前述した通りであり、可変オリゴヌクレオチド（単一のステレオタイプの配
列の代わりに、少なくとも１０5から１０12個の異なる配列）を挿入しうる、こ れらの技術を拡張したものを以下に詳述する。
【００５９】 前述したように、多くの病原性剤は、もし、それらが最初に細胞表面の特定の
ドメインに結合することができる場合にのみ、細胞を殺す、あるいは成長を妨害
することができる。ＣＩＳＴＥＭの選択剤は、ＣＩＳＴＥＭ細胞集団の細胞の表
面にあるインプリントドメインに直接に隣接して位置する接着ドメインに結合す
ることができる（図５）。本発明で用いる膜タンパク質のほとんどにおいて、隣
接する細胞外または細胞内ドメインは、３〜３０オングストロームである。以下
に詳述する、本発明の好ましい具体例において、このドメインのアレンジは、イ
ンプリントポリペプチドおよび選択剤を、インプリントポリペプチドが接着ドメ
インに直接に隣接するように、注意深く選択した結果である。前述したように、
ほとんどすべての膜ポリペプチドは、それぞれ別個の接着ドメインを利用する、
複数の選択剤の受容体として働く。しかし、本発明の他の具体例では、膜タンパ
ク質は、インプリントドメインが接着ドメインに隣接するハイブリッドポリペプ
チドを構築するように遺伝子工作される。膜タンパク質を工作するための技術は
、前述したとおりである；本発明の具体例に対するそれらの特定の適用を以下に
記載する。
【００６０】 標的化合物は分子または一組の複数の別個の分子であり、それらは、本発明の
細胞集団に単純に加えるか、あるいは本発明の幾つかの具体例においては、細胞
それ自体によって分泌される。本発明は、呈示されたポリペプチド配列が、標的
化合物と相互作用するか、あるいは標的化合物に含まれる分子のサブセットと相
互作用する細胞を同定し、選択するものであり、この相互作用イベントは、酵素
活性または標的化合物の生物学的活性の変更といったような、ポリペプチドが最
終的に適用される機能にとって必要である。分子相互作用の分析への本発明の適
用において、標的化合物は、未知のポリペプチドと重要な相互作用をもつと考え
られる既知の対照化合物である。これらの未知ポリペプチドの同定は、標的化合
物が相互作用する配列を同定する、本発明同定法によって補助される。エピトー
プマッピングにおいて、標的化合物は、対象分子であり（ポリペプチドである必
要はない）、対象ポリペプチドとの相互作用が関連することがわかっている。標
的を結合するポリペプチド配列の同定によって、本発明は、標的化合物との相互
作用に直接関連する既知のポリペプチドの領域を詳細に描写することを補助する
。本明細書に言及した適用の３つの分野−有用な機能をもつ配列の同定；相互作
用の分析；およびエピトープマッピング−のそれぞれに対する、特異的標的化合
物を以下に記載する。
【００６１】 本発明の第３の構成要素は、選択剤である。選択剤の最も重要な必要条件は、
すでに述べている：細胞における選択剤の影響は、標的化合物の結合イベントに
際し修飾される選択部位への選択剤の結合能力しだいでなければならない。この
選択部位は、インプリントドメインに隣接する接着ドメインであるのが好ましい
。病原性剤などの選択剤の、毒性や濃度といったような、その他の属性は、必要
に応じて通例の実験操作で変更できる。これらの属性およびその調節については
すでに記載している。 標的化合物を結合するポリペプチ配列の選択の実行には２つのステップがある
。幾つかの場合においては同時であるけれども、本発明のほとんどの具体例にお
いて、これらのステップは連続的に行われる。第一に、本発明の構成要素（１）
であるＣＩＳＴＥＭ細胞集団を、本発明の構成要素（２）である標的化合物の懸
濁液または溶液とともにインキュベートする。インキュベーションの溶液は、細
胞成長のための標準培地であり、細胞系および培地に関する一節により詳細に記
載している。インキュベーション中、可変領域の構造的多様性から、インプリン
トドメインと標的化合物の間に広範な結合相互作用が起こる：別々の細胞のイン
プリントドメインに呈示された別個の構造は、独特のオンレート、オフレートお
よび解離定数を示す（図６）。インプリントドメインと標的化合物の間の結合が
平衡レベルに近づくまでインキュベーションを続ける。本発明のほとんどの具体
例において、１時間で十分である。本発明の、ある具体例においては、標的に対
して親和性が高いばかりでなく、ひときわ優れた高いオンレートを示すポリペプ
チドにとって好都合にするために、インキュベーション時間は短くカットされる
；これらのＣＩＳＴＥＭについて以下に記載する。
【００６２】 インキュベーション後、本発明の構成要素（３）である選択剤を細胞と標的化
合物の懸濁液に加える。細胞集団の曝露は、作用剤に適した方法によって行う。
たとえば、もし作用剤がバクテリオファージならば、細胞および標的化合物の懸
濁液を、一般的なファージ感染にさらす。別法として、もし作用剤が、コリシン
ならば、作用剤への細胞集団の曝露は、単に、細胞が標的化合物とともにインキ
ュベートされる培地にコリシンを加えることによって行う。病原性剤の形体の選
択剤が、バクテリオファージなどの繁殖している微生物の場合、曝露後にその活
動を停止する必要がある。病原性剤の適切な濃度、曝露時間および作用剤の活動
を停止するための操作は、当業者の一般知識に含まれるものである。細胞と標的
化合物の懸濁液への選択剤の添加によって、ＣＩＳＴＥＭの組み立てが完了し、
選択が始まる。３つのＣＩＳＴＥＭ構成要素の間の相互作用は、インプリントド
メインが標的化合物を結合する細胞に選択の利点を付与する：たとえば、インプ
リントドメインに位置する構造が標的化合物を結合する場合、化合物は隣接する
接着ドメインの表面をオーバーラップする。本発明の好ましい具体例において用
いたポリペプチドの隣接する細胞外または細胞内ドメイン間の距離は、ほんの３
〜３０オングストロームにすぎないので、小さいペプチドホルモンでさえ、それ
が結合するインプリントドメインから到達して隣接する接着ドメインをオーバー
ラップするのに十分に大きい標的である。このオーバーラップは、選択剤の付着
を妨げ、細胞を保護し、細胞を増殖可能にする（図７）。インプリントドメイン
が標的化合物を適切な親和性をもって結合しない細胞は保護されず、したがって
病原性（選択）剤によって殺されるかまたは成長を妨げられる（図７）。
【００６３】 ＣＩＳＴＥＭ集団中の各細胞は、そのインプリントポリペプチドの複数コピー
を発現し、結合は、オンレートとオフレートがバランスしている動的プロセスで
ある。したがって、細胞のインプリントポリペプチドが、標的化合物に対して高
い親和性を呈している場合でさえも、インプリントポリペプチドの数個のコピー
が、保護されない状態で残っている時間がある。したがって、ＣＩＳＴＥＭ集団
のすべての細胞は、たとえどのように標的化合物に対するその親和性が高かろう
と、選択剤によって殺される幾らかの確率を有する。それでもなお、標的化合物
に対する細胞の親和性が、より高い場合、この確率は、より低い。さらに、ＣＩ
ＳＴＥＭ中の各クローンは複数のコピー中に存在するので（ＣＩＳＴＥＭ細胞集
団は重剰性である）、単一の細胞が殺されるであろう確率は、殺されるであろう
細胞クローン集団の確率の一部であり、クローン集団の特異な排除は、選択のま
さしく基礎である。したがって、各選択されたクローンは分裂しつづけるので、
頻度および数において増加し、一方保護されなかったクローンは破壊される。簡
単にいうと、ＣＩＳＴＥＭは、標的化合物を結合する構造を発現しているクロー
ンを選択し、増殖させる（図８）。
【００６４】 選択部位が接着ドメインに位置する本発明の好ましい具体例に関連した標的化
合物の影響は、インプリントドメインとの相互作用におけるその大きさ、広がり
により、インプリントドメインから接着ドメインにわたる。これは、本発明によ
ってインプリントされたポリペプチドの多くにおいて３〜３０オングストローム
である。別法として、その大きさにかかわらず、標的化合物とインプリントドメ
インとの間の相互作用は、可変ドメインおよび／または接着ドメインのコンホー
メーション的および／または化学的変化をもたらし、選択剤の付着を妨げる。本
発明のこの特別の具体例での特定の適用におけるＣＩＳＴＥＭの標的化合物、そ
の源、調製および使用を以下に記載する。ＣＩＳＴＥＭ中の標的化合物の濃度も
またその機能にとって重要であるとはいえ、この濃度は他のＣＩＳＴＥＭ構成要
素の性質に依存するものであり、それについて以下のように議論する。
【００６５】 診断アッセイにおいて、特異性の高いマーカーまたは分配剤として働くように
インプリントされたポリペプチドに対して設計されたＣＩＳＴＥＭでは、標的化
合物は、単に、ポリペプチドによってタグ付けおよび／または分配される予定の
分子である。たとえば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に強く、特異的に結合
する診断ポリペプチドの設計に用いられる本発明の具体例において、標的化合物
は、ＨＩＶｇｐ２０、すなわち主要ＨＩＶグリコプロテインの細胞外サブユニッ
トである（Fantiniら、１９９７）。ＣＩＳＴＥＭでの使用に適した可溶体の組 換えｇｐ１２０の産生は、文献に記載されている（Fantiniら、１９９７）。本 発明の他の具体例を用いて、異なるウイルス、Ｉ型ヒトＴ細胞白血球ウイルス（
ＨＴＬＶ−１）の直接検出用診断ポリペプチドを設計する；ここで、標的化合物
はＨＴＬＶ−１表面グリコプロテインｇｐ４６である。組換えワクシニアウイル
ス／Ｔ７ポリメラーゼ系における確実な、グリコシル化ＨＴＬＶ−１ｇｐ４６の
産生は、文献に記載されている（Arpら、１９９６）。ヒトのウイルス感染を検 出するための診断アッセイは、ウイルスそれ自体に拘束されず、むしろ感染剤に
対する抗体に関連することが多い。本発明のひとつの好ましい具体例は、モノク
ローナル抗体ＭＡｂＴ７に対して高い親和性を呈するようにポリペプチドをイン
プリントする。このＣＩＳＴＥＭにおける標的化合物であるＭＡｂＴ７それ自体
は、市販されている（ノバジーン）。
【００６６】 本発明は、生物学的に活性な分子の機能的活動のアンタゴニスト、アゴニスト
あるいはモジュレーターとして働くようにポリペプチドをインプリントするため
にも用いられる。本発明がアンタゴニストとして働くようにポリペプチドをイン
プリントするのに用いられる場合、標的化合物はアンタゴナイズされる予定の相
互作用に関連する分子のいずれかである。ＨＩＶｇｐ１２０は、ＣＤ４受容体に
結合して、ヒト細胞へのウイルスの侵入を媒介するウイルスグリコプロテインで
ある（Fantiniら、１９９７）。ＨＩＶｇｐ１２０に特異的に結合するようにポ リペプチド（ＩＣＡＭ−１、前述）をインプリントする本発明の具体例は、ウイ
ルスグリコプロテインとその宿主細胞受容体の間の相互作用のアンタゴニストと
して働くポリペプチドを提供する。
【００６７】 ＣＩＳＴＥＭによって選択されたポリペプチドは、ＣＩＳＴＥＭの標的化合物
が１つの相互作用体の活性部位に対して可能な限り切り詰められる場合、所定の
分子相互作用を、もっと機能的にアンタゴナイズしそうに思われる。別個であり
、活性部位から位相学的に離れているどちらかの相互作用体の構造は、標的化合
物としての有望性は低いが、これはこのような構造を結合するポリペプチドは、
活性分子の正常な相互作用を妨げることができないからである。たとえば、本発
明の１つの具体例は、真核細胞−シグナリングタンパク質であるＲａｓとＲａｆ
の間の相互作用のアンタゴニストとして働くように、ポリペプチド（大腸菌Ｏｍ
ｐＡ；図１３に示し、以下に詳述する）をインプリントする（Blockら、１９９ ６）。（すぐ上流のタンパク質であるＲａｓによる、タンパク質キナーゼである
Ｒａｆの活性化は、転写因子のリン酸化、多数遺伝子の刺激および最終的に細胞
の増殖および分化に至る経路を開始する。ＲａｓまたはＲａｆの構造的に活性な
ガン遺伝子突然変異が、多数のヒトの腫瘍において発生する（Blockら、１９９ ６）。）このＣＩＳＴＥＭにおいて、標的化合物は、Ｒａｓへの結合に直接関連
することがわかっているＲａｆのドメイン（アミノ酸５１〜１３１）である（Ｒ
ａｆのいわゆるＲａｓ結合ドメインまたはＲａｆ−ＲＢＤである）（Blockら、 １９９６）。Ｒａｆ−ＲＢＤのための組換え発現ベクターの構築、大腸菌におけ
る発現およびタンパク質の精製は文献に記載されている（Blockら、１９９６） 。標的化合物としてＲａｆの完全体よりもむしろＲａｆ−ＲＢＤを用いることに
より、ＣＩＳＴＥＭによって選択されたポリペプチドが、重要な細胞−シグナリ
ング相互作用にとって重要でないＲａｆのエピトープよりもむしろ、Ｒａｓと相
互作用するＲａｆのドメインに正確に結合するのが確実となる。
【００６８】 本発明を用いて、受容体または生物学的経路のアンタゴニストよりもむしろア
ゴニストとして働くようにポリペプチドをインプリントする場合、標的化合物は
インプリントポリペプチドが活性化することを予定される受容体または生体分子
である。たとえば、インターロイキン６を模倣し、インターロイキン６の受容体
（ＩＬ−６Ｒ）のアンタゴニストとして機能するようにポリペプチド（大腸菌Ｏ
ｍｐＡ）をインプリントする本発明の具体例において、標的化合物はＩＬ−６Ｒ
の可溶化体である：ＣＨＯ細胞における可溶性ヒトＩＬ−６Ｒの発現およびタン
パク質の精製は、文献に記載されている（Yasukawaら、１９９０）。このＣＩＳ
ＴＥＭが、ＩＬ−６Ｒに対する親和性をもつポリペプチドを選択した後、第２の
スクリーンを用いて、その受容体への結合の結果としてＩＬ−６によって正常に
開始されるシグナルの形質導入が起こるポリペプチドを単離する。この第２のス
クリーンについては、基本的ＣＩＳＴＥＭの拡張に関する一節に記載する。 本発明を用いてアゴニストを作製する場合、標的化合物は、アゴナイズされる
予定の受容体または生体分子の活性部位に対して可能な限り切り詰められる。こ
れは、標的化合物からの重要でないエピトープの除去が、標的を結合するインプ
リントポリペプチドもまたアゴニストとして活性である確率を大きくする、と言
う理由から行われる。
【００６９】 アゴニストの作製に対する本発明の適用の他の例においては、ＣＩＳＴＥＭを
用いて、感染性の病原体または癌に存在する特異的抗原を同定もしくは模倣体を
作製する。これらの抗原または抗原模倣体は、次いで、病原体または腫瘍に対す
る特異的免疫応答を引き起こすために用いられることが多い。これらの本発明の
具体例において、標的化合物は１つ以上の分子からなる：複数のモノクローナル
抗原、細胞毒性Ｔリンパ球受容体またはＭＨＣ−Ｉ分子といったような特異的免
疫受容体、またはメニンギコッカルＯｐａタンパク質といったような特異的抗原
、メニンギコッキといったような特異的病原体またはメラノーマといったような
腫瘍に曝された個体から誘導されたポリクローナル抗血清。ポリクローナル抗血
清は動物、ヒトボランティアまたは実際の患者から誘導される。この混成標的は
、痕跡（impression）−抗原の“陰型”または“足跡”−として用いられ、この
足跡から、ＣＩＳＴＥＭを実施例２で記載するように用いて、抗原を同定または
抗原模倣体を作製する。抗原に対する血清を構成する抗体を結合するようにイン
プリントされるポリペプチドは、抗原によって引き出された応答に非常に類似し
た免疫応答を引き出しそうに思われることから、抗原模倣体は興味深いものであ
る。ナイセリアタンパク質Ｏｐａ ５ｃを模倣するように大腸菌ＯｍｐＡをイン プリントするためのＣＩＳＴＥＭにおける標的化合物としての使用に適した抗体
としては、ｍＡｂ Ｂ３０６、ｍＡｂ Ａ２２２／５ｂ、および文献（Olyhoekら 、１９９１）に記載された他のものが挙げられる。腫瘍抗原を同定するためのＣ
ＩＳＴＥＭにおける標的化合物として用いるための抗体は、癌患者のポリクロー
ナル血清から誘導され、その単離は文献に広範に記載されている。 エステル加水分解などの化学反応の触媒を創作するために、遷移状態類縁体を
結合するようにポリペプチドをインプリントする。これらの遷移状態類縁体の調
製および構造は、文献に記載されている（Charbonnierら、１９９５など）。本 発明のひとつの具体例においては、リン酸塩遷移状態類縁体（構造および調製に
ついてはCharbonnierら、１９９５に記載されている）が、ｐ−ニトロフェニル エステルの加水分解の触媒として機能するように大腸菌ＯｍｐＡをインプリント
するための標的化合物として用いられる。
【００７０】 特異的酵素活性をもつポリペプチドを創作するために用いられる本発明の他の
具体例においては、標的化合物は遷移状態類縁体というよりもむしろ修飾された
基質である。標的は、インプリントポリペプチドが最終的に作用する基質に構造
的に非常に類似しているが同一ではない分子である。基質それ自体よりもむしろ
わずかに修飾された構造を用いる理由は、以下のとおりである：もし、基質それ
自体を標的化合物として用いるならば、基質を結合するばかりでなく、所望の酵
素活性を遂行するインプリントポリペプチドは、基質を変更し、次いで放出し、
基礎をなす細胞を選択剤に対して感受性にする。したがって、もし基質それ自体
を標的化合物として用いたならば、ＣＩＳＴＥＭは、所望の酵素活性を有するポ
リペプチドを発現しているクローンに対して選択したであろう。したがって、標
的化合物は、基質の有効な構造模擬体でなければならない（すなわち、標的を結
合するポリペプチドは、基質も結合しなければならない）が、予想される酵素活
性に対して傷つけられないものでなければならない（すなわち、基質に酵素的に
作用するポリペプチドは、標的化合物に作用することが不可能でなければならな
い）。
【００７１】 たとえば、２つのメチオニン間の結合を加水分解する配列特異的プロテアーゼ
として機能するように大腸菌をインプリントする本発明の具体例においては、標
的化合物は、オリゴペプチドＮＨ２−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｍ１＝Ｍ２−Ｒ４−Ｒ
５−ＣＯＯＨである。Ｍ１およびＭ２は、メチオニン残基を表す；“＝”で表さ
れるそれらの間の結合は、加水分解不可能なメチレン基結合である。通常のアミ
ド結合は、“−”で表される。Ｒ１から５は、可変残基であり、それらは２０個
のアミノ酸からランダムに選ばれる。これらの残基は、標的化合物のしっかりし
たＭ１＝Ｍ２モチーフに結合するインプリントポリペプチドのみがＣＩＳＴＥＭ
によって選ばれるように変化する。異なるペプチドモチーフに対し高い親和性を
示すインプリントポリペプチドは、標的ポリペプチドの小さなフラクションのみ
を結合するだけであり、したがって選択剤に対して傷つけられないままである。
このオリゴペプチド標的化合物の合成法の幾つかは、文献に記載されている（Ja
nda、１９９４）。 ＣＩＳＴＥＭが、修飾された基質を結合するインプリントポリペプチドを発現
しているクローンを選択した後、第２のスクリーニングを行って、標的を結合す
るのみならず、所望の酵素活性を遂行する、インプリントポリペプチドを単離す
る。２つのメチオニン間の結合を加水分解するようにポリペプチドをインプリン
トするＣＩＳＴＥＭにおいて用いられるスクリーニングなどの第２のスクリーニ
ングを以下に述べる。
【００７２】 アンタゴニストおよび酵素といったような機能的に活性なポリペプチドの創作
に加えて、本発明は、相互作用分析にも適用することができる（現行の技術はPh
izickyら、１９９５に記載されている）。重要な対象である標的化合物と特異的
に相互作用する配列について多様なライブラリーをスクリーニングすることによ
り、本発明は、該化合物の本来の相互作用体の同定を補助する。たとえば、Ｒａ
ｓおよびＲａｆ−ＲＢＤの間の構造的相互作用は、結晶学および突然変異分析に
おいて、よく解析されているけれども（Blockら、１９９６）、ＲａｓによるＲ ａｆの活性化は、まだ完全には理解されていない複合プロセスであり、おそらく
、他の分子との相互作用が関与している。Ｒａｆ−ＲＢＤとの相互作用について
ＯｍｐＡに呈示されたポリペプチドをスクリーニングするＣＩＳＴＥＭは、Ｒａ
ｆ活性化に関与するポリペプチドの同定を補助する。このＣＩＳＴＥＭは、次の
構成要素を含む：大腸菌ＯｍｐＡのループＩＶを用いて、ＲａｓおよびＲａｆを
発現している細胞から誘導されたｃＤＮＡのフラグメントから翻訳されたポリペ
プチドを呈示する（ＯｍｐＡの遺伝子への外来性オリゴヌクレオチドの挿入につ
いては後記する）；Ｒａｆ−ＲＢＤ（この標的化合物およびその調製についての
詳しい記載は前記参照）が標的化合物として働く；次いで、ファージＫ３が（病
原性）選択剤として働く。標的化合物および選択剤の適当な濃度は、本明細書を
読了後の当業者によって容易に決定することができ、後記ＯｍｐＡインプリンテ
ィングＣＩＳＴＥＭの実施例において述べる。
【００７３】 本発明は、２つの分子間の構造的相互作用の外観を解明するのに役立つ、エピ
トープマッピングにも有用である（Phizickyら、１９９５）。エピトープマッピ
ングのためのＣＩＳＴＥＭにおいては、標的化合物は、相互作用をマッピングさ
れる予定の２つの分子のうちの１つである。通常、それは、標的化合物として働
く、可溶体で非常に容易に製造される相互作用体である。したがって、もし、２
つの相互作用体のうちの１つが膜タンパク質であるならば、それが、標的として
働く他の分子であることが多い。ＲａｓとＲａｆ−ＲＡＢの間の相互作用のエピ
トープをマッピングするのに用いるＣＩＳＴＥＭにおいては、Ｒａｆ−ＲＡＢは
、標的化合物として働く。前述したように、それは、可溶体で容易に製造される
（Blockら、１９９６）。したがって、相互作用しているタンパク質のひとつは 、インプリントドメインに呈示される複数のより小さいドメインに切断され、他
の相互作用体に結合しうる能力についてＣＩＳＴＥＭによって選択される。
【００７４】 本発明のある具体例においては、複数の別々の分子が標的化合物を構成する。
各分子は、ＣＩＳＴＥＭのサイズ要件に合致しなければならず、高い親和性をも
って分子に結合するクローンにおいて保護を付与するに十分な濃度でＣＩＳＴＥ
Ｍ内に存在しなければならない。（標的化合物の有効濃度は、インプリントドメ
インが結合可能な各付加的化合物にともなって上昇するので、複数の別個の標的
分子をもつＣＩＳＴＥＭによる選択は、複数の別個の分子に対してインプリント
ドメインによる結合に非常に有利である。）標的化合物が分子のライブラリーで
あり、インプリントドメインが可変領域を呈示する場合、ＣＩＳＴＥＭは、分子
の相互作用ペアの同定を補助する：インプリントドメインに発現されたポリペプ
チドは、標的化合物を構成する分子のライブラリーの特定のメンバーに対するそ
の親和性について選択される。標的化合物中の１つまたはそれ以上の分子に結合
するインプリントポリペプチドを発現する細胞が選択され、一方、標的化合物の
いずれの構成要素をも結合しないインプリントポリペプチドを発現している細胞
が、ＣＩＳＴＥＭの選択剤によって排除される。後記の本発明のある具体例にお
いては、標的化合物は、ＣＩＳＴＥＭ細胞集団それ自体から分泌されるポリペプ
チドまたはファージ呈示ポリペプチドのライブラリーからなる。
【００７５】 本発明の具体例においては、標的化合物は、細胞外ドメインに呈示される天然
に生じる細胞表面受容体のセクションなどの所定の対象ポリペプチドとの相互作
用によって同定される予定である相互作用パートナーである。この場合、標的化
合物は細胞外ドメインである。この実施例においては、対象受容体ドメインを発
現している細胞を、基質のプールからの化学的化合物とともにインキュベートす
ることができる。生存する細胞は、これらの細胞と相互作用している化合物が、
受容体ドメインとの相互作用のための候補基質であることのインジケーターであ
る。 本発明のさらなる具体例においては、細胞は、インプリントドメインと細胞そ
れ自体から分泌されるポリペプチド標的との間の結合により、（病原性）選択剤
から保護される。この具体例においては、２つの別々の遺伝子のライブラリーか
ら発現された、２つの別々のポリペプチドのライブラリーが、互いにたいする相
互作用についてスクリーニングされる。まさに標準ＣＩＳＴＥＭ細胞集団のよう
に、細胞集団は、細胞表面に１つのライブラリーを呈示する。しかし、この具体
例においては、細胞集団は、第２の遺伝子ライブラリーも有している。これらの
遺伝子は、分泌ポリペプチドをコードするベクターに帰する。このようなベクタ
ーは、文献に記載されている（Mollenkopfら、１９９６）。オートクリン集団中
の各細胞は、１つの外来性ポリペプチドをその表面に呈示し、第２の外来性ポリ
ペプチドを細胞外培地へ分泌する。これらの２つのポリペプチドが互いに結合す
るイベントにおいて、細胞は、それ自体を病原性剤から保護し、したがってポジ
ティブに選択される。
【００７６】 前に記載したように、語句“ポリペプチド”は、宿主細胞によって合成可能な
すべてのタイプのペプチドまたはタンパク質に関する。本発明によってインプリ
ントされる予定のポリペプチドは、翻訳または細胞表面へのポリペプチドの輸送
を妨げることなく外来性オリゴペプチド挿入を受容する、少なくとも１つの細胞
外または細胞内ドメインを含まねばならない。この挿入を受容する能力は、運件
（Singer、１９９０；Cross、１９９０）に記載されている遺伝子工作されたア ンカーによって外膜に結合されうる多くの分泌ポリペプチド、ならびに遺伝子融
合技術によって位相学的にマッピングされている多くの細菌，酵母および哺乳類
膜ポリペプチドそれぞれにおいて観察される。大腸菌ＯｍｐＡおよび哺乳類ＩＣ
ＡＭ−１といったような、これらのポリペプチド、それらの特性および細胞ガイ
ドメインに外来性配列を呈示するそれらの能力は、文献に記載されている。
【００７７】 膜ポリペプチドは、細胞にとって自己由来または異種由来であってよい。膜ポ
リペプチドは、異種由来であるのが好ましい。本発明の好ましい具体例において
は、選択剤および／または標的化合物は、ポリペプチドの野生型コピーならびに
遺伝子工作されたコピーに結合できるので、遺伝子の染色体コピーが野生型のま
まであり、ＣＩＳＴＥＭによる適当な選択が妨害されるのに対し、たとえば、も
し、インプリントポリペプチドに対する遺伝子のプラスミド運搬コピーが、外来
性インサートをインプリントドメインにおいて生むならば、所定のクローンにお
ける膜タンパク質遺伝子のすべてのコピーは、何らかの方法で変更されなければ
ならない。細胞が自己由来の膜ポリペプチドを含むが、本発明の使用をするため
の所望の特性を有する場合、膜タンパク質をコードする遺伝子は、欠失などによ
って不活性化される。標準的分子法は当業者にとって入手可能である。 細胞外または細胞内ドメインにおける外来性挿入は、各ＣＩＳＴＥＭにおける
２つの段階に関連する。第一に、オリゴヌクレオチドタグがインプリントドメイ
ンに挿入され、このタグを呈示している細胞集団が、ＣＩＳＴＥＭを最適化する
ための予備的試行に用いられる。オリゴヌクレオチドタグ、インプリントドメイ
ンへのその挿入、およびタグを発現している細胞集団の構築は、すべてこのセク
ションに記載する。第二に、タグ付けされた細胞集団を用いる予備的試行を一旦
行うとすぐに、実際のＣＩＳＴＥＭ細胞集団を構築する：この集団においては、
オリゴヌクレオチドタグよりもむしろ、可変ペプチド配列がインプリントドメイ
ンに挿入される。ＣＩＳＴＥＭ細胞集団の構築における段階もまたここに記載す
る。
【００７８】 当業者にはよく知られている慣例の方法によって、インプリントポリペプチド
をコードする遺伝子を適当なベクターにクローニングする。ベクターの発現レベ
ルが、ＣＩＳＴＥＭ機能にとって重要である。ほとんどのＣＩＳＴＥＭ細胞集団
においては、細胞当たり、インプリントポリペプチドのおよそ１０００コピーが
呈示される。しかし、以下に記載するように、適当なＣＩＳＴＥＭ選択を達成す
るために発現を調節する場合もある。本発明の好ましい具体例においては、イン
プリントポリペプチドの発現レベルの調節は、イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオリゴ
ヌクレオチドガラクトピラノシドで誘発可能な原核ｌａｃ調節エレメント、また
は原核インターフェロンプロモーターといったような誘発可能なプロモーターを
含むベクターの使用によって可能になる。ベクターは、形質転換を促進するため
の、構成物質耐性遺伝子といったような選択可能なマーカーを含む（クローニン
グベクターにおける選択可能なマーカーおよびその用途は、文献に多数記載され
ている：Brown、１９９２；Freudl、１９８９など）。
【００７９】 原核タンパク質には、通例の発現プラスミドを用い、本発明の好ましい具体例
においては、インプリントポリペプチドは、すでに適当なプラスミドに組み込ま
れている。たとえば、本発明の特に好ましい具体例で用いたプラスミドであるｐ
ＥＶ２１８では、大腸菌ＯｍｐＡ（大腸菌外膜タンパク質Ａ）は、一般的高コピ
ー数プラスミドであるｐＵＣ９に存在するｌａｃ調節エレメントの誘発可能なコ
ントロール下に置かれている。ｐＥＶ２１８におけるｏｍｐＡの発現は、ポリペ
プチドのアミノ酸７に対応するＴＡＧ終止コドンの存在によってさらにコントロ
ールされる：プラスミドを用いて大腸菌ＵＨ２０３（ｓｕｐＦ）といったような
アンバーサプレッシング宿主を形質転換する場合、発現は、ＩＰＴＧを用いる誘
発によってのみならず、サプレッサーｔＲＮＡの濃度によっても調節される。プ
ラスミドはまたアンピシリン耐性遺伝子も含む。同様に、ｐＳＢ１６４９では（
Brown、１９９２）、一般的プラスミドｐＡＡＣ１上の誘発可能なｌａｃプロモ ーターによって大腸菌ｌａｍＢが調節される。真核ポリペプチドには、通例のウ
イルスベクターが適しており、多くのポリペプチドが適当なベクターにクローニ
ングされている。たとえば、本発明の好ましい真核具体例においてインプリント
される、ポリトピック哺乳類グリコプロテイン（ＩＣＭ−１）（細胞内接着分子
−１）には、ＣＤＭ８ ｃＤＮＡ発現ベクターであるｐＣＤ１．８をＣＯＳ細胞 発現系とともに用いる（Stauntonら、１９９０）。
【００８０】 インプリントポリペプチドの遺伝子を運ぶベクターを複製し、同定する。それ
らは、細胞集団、ＰＣＲ技術または文献に記載されている一般的に用いられる他
の方法のいずれかによって複製することができる。本発明の好ましい具体例にお
いては、１０8から１０10コピーのベクターが単離される。正確な数は、ＣＩＳ ＴＥＭ細胞集団を構成する予定の別個のクローンの数および下記の段階（ベクタ
ーへの可変オリゴヌクレオチドの挿入）において用いた技術に従属する。 十分に解明されたオリゴヌクレオチドの遺伝子タグを、ポリペプチドのインプ
リントドメインに対応するベクターの遺伝子部位に挿入する。別法として、オリ
ゴヌクレオチドタグを天然に生じる配列のヌクレオチド配列と置き換えてもよい
。置き換えは、天然のコーディング領域を切断し、その場所にオリゴヌクレオチ
ドタグを挿入することによって成し遂げられる。タグは、市販されているかまた
は文献に記載されている技術によって実験室で容易に産生しうる、高い親和性お
よび特異性をもってリガンドに結合するこたがわかっているペプチド配列であれ
ばいずれであってもよい。市販のタグ／リガンドペアの一例は、Ｔ７抗体に結合
するＴ７配列（Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ）である（ノバジーン、ＴＢ１５プロトコルから
入手可能）。文献に記載されているタグ／リガンドペアは、真核ポリペプチドＲ
ａｓおよびＲａｆのＲａｓ−結合ドメインアミノ酸配列３６−４１である（Bloc
kら、１９９６）。通例行われる技術によるＲａｓ−ＲＢＤの産生と精製は、文 献に記載されている（Blockら、１９９６）。特異的抗体に結合するペプチドと いったような多くの他のタグ／リガンドペアもまた文献に記載されており、当業
者に利用可能である（Phizickyら、１９９５）。オリゴヌクレオチドタグの遺伝
子をインプリントドメインをコードする遺伝子部位に挿入するために、ベクター
の特定の部位にオリゴヌクレオチドを挿入するための通例の技術であればいずれ
も用いることができる（Boyd、１９９４）。このような技術のいくつかは前述し
ているが、１つの好ましい方法をここに詳述する。
【００８１】 多くの膜ポリペプチドが位相学的にマッピングされており、これらのマップは
文献において入手可能である。膜ポリペプチド配列の位相学的マップを用いて、
ベクター内で独特であり、インプリントドメインをコードする遺伝子領域に位置
する２つの制限エンドヌクレアーゼ部位（Ｒ１部位およびＲ２部位）を同定する
。もし、２つの独特の制限部位が、挿入の所望の部位に存在しないならば、文献
に記載されている多くの方法のいずれかひとつを用いてそれらを工作することが
できる（所望の挿入部位で工作されている独特の制限部位の例が、Brown、１９ ９２;Freudl、１９８９に記載されている）。酵素の使用説明書にしたがって、 制限エンドヌクレアーゼＲ１およびＲ２を用いる消化により、２つの指定部位で
ベクターを切断する。これによって、非相補的付着末端（ＲＳ１およびＲＳ２）
をもつ直線化されたベクターならびに切断されたフラグメントが得られる。標準
的電気泳動サイズ分画によって直線化ベクターを単離する。
【００８２】 タグの遺伝子を含むオリゴヌクレオチドテンプレートは、ホスホラミチド化学
などの慣例の技術を用いて合成するか、または注文のオリゴヌクレオチドを提供
する商業的実験室から得ることができる。５’−Ｐ−−Ｒ１−−タグ遺伝子−−
Ｒ２−−３’[ここで、Ｐは、Ｖｅｎｔポリメラーゼ（ニューイングランド・バ イオラブス）などのプルーフリーディングポリメラーゼのためのプライマー配列
、Ｒ１およびＲ２は、前述の制限エンドヌクレアーゼ部位、および−−タグ遺伝
子−−は、オリゴヌペプチドタグをコードする遺伝配列である]というオリゴヌ クレオチドを合成する。（インプリントポリペプチドに関し、タグがフレーム内
に翻訳されるように、タグ遺伝子に隣接する１つまたは２つのエキストラーオリ
ゴヌクレオチドを含むことが必要である。）プライマーがＰであるポリメラーゼ
を用い、二本鎖オリゴヌクレオチドを生成するためにオリゴヌクレオチドテンプ
レートを使用する。このオリゴヌクレオチドを、酵素の使用説明書に従って、制
限エンドヌクレアーゼＲ１およびＲ２で消化し、付着末端ＲＳ１’およびＲＳ２
’をもつオリゴヌクレオチドを得る。直線化ベクターに相補的な付着末端をもつ
、このオリゴヌクレオチドを、当業者にはよく知られている通例のライゲーショ
ン操作によって、ベクター内にライゲートする。インプリントポリペプチドのベ
クターの遺伝子は、インプリントドメインに対応する遺伝子部位にオリゴペプチ
ドタグの遺伝子を運ぶ。
【００８３】 付着末端ＲＳ１’およびＲＳ２’をもつタグ遺伝子の構築のための別の方法を
、本発明の好ましい具体例において使用する。この方法においては、２つの半相
補的な一本鎖オリゴヌクレオチドは、慣例の技術によって合成するか、または注
文のオリゴヌクレオチドを提供する実験室から得ることができる。２つの一本鎖
オリゴヌクレオチドは、それらがアニーリングされるときに、ＲＳ１’−−タグ
遺伝子−−ＲＳ２’配列をもつ二本鎖オリゴヌクレオチドを形成するように合成
する。次いで、この二本鎖オリゴヌクレオチドを前記直線化ベクターにライゲー
トする。 この方法の例は、ＯｍｐＡのループＩＶにＴ７タグを呈示している大腸菌集団
（図９）の構築を含む本発明の好ましい具体例によって提供される。ｐＥＶ２１
８においては（Freudl、１９８９）、ｏｍｐＡ遺伝子は、制限エンドヌクレアー
ゼ部位のストリングを、ポリペプチドの細胞外ループＩＶに対応する遺伝子領域
にもつように工作されている（図９）。ＣＩＳＴＥＭ標準的ゲル電気泳動によっ
て直線化プラスミドを単離した。２つの一本鎖オリゴヌクレオチドを、慣例の技
術によって以下の配列で合成した： オリゴヌクレオチド１： ５’−ＣＧ［ＡＴＧＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＡＡＡＴＧ
ＧＧＴ］−３’ オリゴヌクレオチド２： ５’−ＣＴＡＧ［ＡＣＣＣＡＴＴＴＧＣＴＧＴＣＣＡＣＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＡ
ＧＣＣＡＴ］ＣＧＡＧＣＴ−３’ カッコ内の配列は、Ｔ７抗体によって認識されるオリゴペプチドをコードする
遺伝子セグメントを含む。これらの２つの一本鎖オリゴヌクレオチドをＭＢＩフ
ァーメンタスクレノー緩衝液中でアニーリングしてｐＥＶ２１８の付着末端に相
補的な付着末端をもつ二本鎖Ｔ７タグ遺伝子セグメントを形成し、先のパラグラ
フで述べたようにＳａｃＩおよびＸｂａＩによって直線化した。二本鎖オリゴヌ
クレオチドを直線化プラスミドにライゲートするときに、Ｔ７タグセグメントが
ｐＥＶ２１８上のｏｍｐＡ遺伝子をもつフレーム内に入った。新規構築物をｐＥ
Ｖ２１８Ｔ７と呼ぶ。
【００８４】 タグ遺伝子をベクターに挿入した後、ベクターを用いて、インプリントポリペ
プチドの遺伝子の染色体コピーが欠如している細胞集団の形質転換を行う。外膜
ポリペプチドの染色体遺伝子が欠如している菌株は、文献（Brown、１９９２；F
reudl、１９８９；およびStauntonら、１９９０など）ならびに後記の細胞系お よび培地に関連する一節に記載されている。慣例の形質転換方法を用い、ベクタ
ーが運ぶアンピシリン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーの発現によって形質
転換体の選択を行う。Ｔ７ポリペプチドタグをループＩＶに呈示するように大腸
菌ＯｍｐＡを工作する、本発明の特に好ましい具体例においては、以下に記する
通例の電気形質転換方法にしたがって、ｐＥＶ２１８Ｔ７を用いて大腸菌株ＵＨ
２０３の形質転換を行う（ｌａｃ、ｓｕｐＦ、ｏｍｐＡ、ｒｅｃＡ、ｐｒｏＡＢ
、ｒｐｓＬ）（Freudl、１９８９）。
【００８５】 ＵＨ２０３の一夜培養物（ルリアブロス、３７℃）２５ｍｌを１リットルのＬ
Ｂに懸濁した。細胞を震とうしながら３７℃で培養した。培養物がＯＤ600＝０ ．５に達したとき、細胞を１５分間氷冷し、次いで、４℃、４０００×ｇにて１
５分間冷ローターで遠心分離した。上清を除去した。１リットルの氷冷１０％グ
リセロールに沈降物をゆっくりと再懸濁させた。この洗浄操作を三回繰り返し、
細胞を１ｍｌの氷冷１０％グリセロールに再懸濁させた。４２μｌの細胞懸濁液
と２μｌのＤＮＡ（前記ｐＥＶ２１８Ｔ７）溶液（１ｐｇ／ＴＥ）を混合し、氷
上で１０分間インキュベートする。４０μｌのこの懸濁液をピペットで電気穿孔
キュベットに入れた（パルスコントローラーを備えたＢＩＯ−ＲＡＤジーン・パ
ルサーを用いた）。装置のセッティングは、以下の通りである：２，５ｋＶ；２
００Ｗ；２５μＦ；時間定数＝４．９ｍｓ。電気穿孔に続いてすぐに、細胞を６
００μｌのＳＯＣ培地で洗浄し、培養チューブに移した。次いで、３７℃にて１
時間、震とうフラスコ中で細胞を回復させた。最後に、細胞を１００μg／ｍｌ のアンピシリンを含むＬＢプレートに植えた。
【００８６】 ベクターに挿入され、そして最終的に、ＣＩＳＴＥＭ細胞集団によって呈示さ
れる可変領域に翻訳される可変オリゴヌクレオチドを生成する方法は幾つかある
。ベクターへの挿入を促進するために、前述のタグ遺伝子が一定末端ＲＳ１およ
びＲＳ２を付与されるように、可変オリゴヌクレオチドは、その末端に保存され
た領域をもたねばならない。たとえば、本発明の好ましい具体例においては、そ
の末端に一定配列をもつ可変オリゴヌクレオチドは、固相ホスホラミジト化学を
用いて容易に合成される（Brown、１９９２）：一定末端の位置では、４種のヌ クレオチドのうちの１つのみが、合成されているストランドへの付加にとって利
用可能になるが、可変領域では、複数のヌクレオチドの混合物がストランドに付
与される。別法として、制限無しの濃度の複数のヌクレオチドの存在下での末端
トランスフェラーゼによる塩基の末端付加は、一定末端に可変性の高い配列を追
加する。可変性の高い配列は、天然の細胞ＤＮＡまたはＲＮＡ試料から、一定長
さのフラグメントを選択することによっても得られる。
【００８７】 ｃＤＮＡライブラリーによってコードされるポリペプチドをスクリーニングす
るためのＣＩＳＴＥＭにおいては、可変オリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡライブ
ラリー遺伝子である。ｃＤＮＡライブラリー遺伝子とゲノムライブラリーに載っ
ている配列とを比較することによって決定されるのだが、このようなＣＩＳＴＥ
ＭによってスクリーニングされるｃＤＮＡライブラリーの大きさは、本発明のい
くつかの具体例においては、対象遺伝子のためだけにスクリーンを限定すること
によって縮小される。ガン抗原を同定するためのＣＩＳＴＥＭにおいては、ｃＤ
ＮＡは、文献に記載のプロトコルにしたがって、腫瘍細胞から調製される。 公知ポリペプチドと対象の第２の公知化合物との間の相互作用を分析するため
のＣＩＳＴＥＭにおいては、可変オリゴヌクレオチドは、公知ポリペプチドをコ
ードする遺伝子のセクションである。たとえば、真核細胞シグナリングタンパク
質−ＰａｓおよびＲａｆの間の相互作用が分析される、本発明の好ましい具体例
においては、ｐＥＶ２１８に挿入されたオリゴヌクレオチドが、配列をコードす
るＲａｓのセクションである。
【００８８】 本発明の好ましい具体例においては、インプリントポリペプチドのトランケー
ションを防止するために、可変オリゴヌクレオチドインサートから終止コドンが
排除される。これは、Ｄ１（ＮＮＰ）ｎＤ２（ここでＤ１およびＤ２は、ベクタ
ーへのオリゴヌクレオチドの挿入を促進する、一定配列を表し；ｎは各可変オリ
ゴヌクレオチドの可変セクションを構成するトリプレットコドンの数を表し；Ｎ
はそれぞれ等しい確率である、４種のヌクレオチドすべてを表し；Ｐはそれぞれ
等しい確率である、ヌクレオチドのサブセットを表す）となるようにオリゴヌク
レオチドを合成することによって達成される。ＮＮＰは、２０種のアミノ酸すべ
てをコードするが、ＣＩＳＴＥＭ細胞集団によって認識された終止コドンの出現
はあらかじめ除外される。したがって、ＰがＧ、ＣまたはＴである場合、終止コ
ドンＴＡＡおよびＴＧＡはオリゴヌクレオチドインサートから除外される。ＣＩ
ＳＴＥＭ細胞集団は、１つまたはそれ以上の終止コドンを翻訳することができる
、終止コドンサプレッシング突然変異体から構成されるので、挿入されたオリゴ
ヌクレオチドにおいて３種の終止コドンすべてをあらかじめ除外する必要はない
。多くのサプレッサー菌株は、文献に記載されている（Brown、１９９２；Freud
l、１９８９など）。
【００８９】 インプリントポリペプチドがグリコプロテインまたはプロテオグリカンである
場合、挿入されたオリゴヌクレオチドは、Ｎ−結合グリコシル化の共通配列を含
む（Chavezら、１９９１）。これらは、各オリゴヌクレオチドの可変配列を中断
する一定配列として合成される。構造的デザインのエレメントを組み込むＣＩＳ
ＴＥＭにおいては、可変オリゴヌクレオチドインサートは、一定または可変の位
置、固定モチーフをコードする配列、またはある配列もしくは構造を目指す統計
的偏りの混合体である。 可変オリゴヌクレオチドは、前記方法により構築され、増幅されたベクター内
の予定された部位に挿入される。正確に標的化された挿入のための２つの好まし
い方法をここに記載する。ひとつは、各ベクターに挿入されるオリゴヌクレオチ
ドの数が決まっているものであり、他方は、インサートの数が可変であるもので
ある。オリゴヌクレオチドを特異的ベクター部位へオリゴヌクレオチドを挿入す
るための利用しうる方法は、もちろん、上記の２つに限定されるものではない。
事実、リポーター部分をコードする遺伝子を膜タンパク質の遺伝子に挿入するた
めに用いられる、いずれの遺伝子融合技術を用いても、これから記載される方法
と同じ効果が得られる。
【００９０】 ベクターにおける挿入部位は、挿入されたオリゴヌクレオチドがインプリント
ドメインの部分として翻訳されるように配置される。インプリントドメインと標
的化合物の間の相互作用の特定の性質に対する構造的分析または処方にしたがっ
て、挿入の部位をさらに特定化することができる（すなわち、インプリントドメ
インをコードする配列内に）。オリゴヌクレオチドを挿入するために、ここに概
説した両方の操作は、ベクターに独特であって、挿入の予定された部位あるいは
その近くに位置する制限エンドヌクレアーゼ部位を使用する。もし、独特の制限
部位が挿入部位にもはや存在しないならば、文献に記載されている多くの操作の
うちのいずれか１つを用いて工作することができる（Boyd、１９９４；Brown、 １９９２；およびFreudl、１９８９など）。
【００９１】 ベクターにただ１つの可変オリゴヌクレオチドを挿入するためには、挿入の予
定された部位を含む短い制限フラグメントに隣接するように、それぞれベクター
に独特の２つの別個の制限部位を配置しなければならない。もし、その独特の部
位において１つのエンドヌクレアーゼ（Ｒ１）でベクターを切断することによっ
て残された付着末端がＲＳ１およびＲＳ１’であり、独特の部位における他のエ
ンドヌクレアーゼ（Ｒ２）での切断が付着末端ＲＳ２およびＲＳ２’を残すなら
ば、ステップ３において生成されたオリゴヌクレオチドは、規定され、保存され
た付着末端ＲＳ１およびＲＳ２’を付与される。ベクターは両方の制限エンドヌ
クレアーゼ（Ｒ１およびＲ２）によって消化され、それぞれ非相補的付着末端Ｒ
Ｓ１’およびＲＳ２を有するベクターを単離するために消化産物がサイズ分画さ
れる。制限−消化されたベクターの集団を、わずかに小さい可変オリゴヌクレオ
チドインサートの集団と合わせ（ベクター／インサートは１．５〜２の割合）、
ライゲーションさせる。ベクターの付着末端は互いに相補的でないので、各ベク
ターは閉じてライゲートすることも他のベクターにライゲートすることもできな
い。同様に、オリゴヌクレオチドインサートは相補的でない付着末端ＲＳ１とＲ
Ｓ２’を持たないので、それらは事故ライゲートしてループを作ることも、互い
にライゲートして複数のオリゴヌクレオチドのコンカテマーを形成することもで
きない。起こり得る唯一のライゲーションは、各ベクターへの可変オリゴヌクレ
オチドの挿入である。ライゲーションが起こった後、インサートを受けいれなか
ったベクターを捨てるためにベクター集団をサイズ分画する。得られるベクター
集団において、各ベクターは、インプリントドメインをコードする領域内の予定
された部位に１つの可変オリゴヌクレオチドを有する。
【００９２】 ベクターに唯一の可変オリゴヌクレオチドを挿入するための方法の一例が、本
発明の好ましい具体例によってもたらされ、そこでは大腸菌ｏｍｐＡのループＩ
Ｖにおいて可変オリゴヌクレオチドを呈示するように細胞集団が工作される。ｐ
ＥＶ２１８においては（Freudl、１９８９）、ポリペプチドの細胞外ループＩＶ
（図１４）に対応する遺伝子領域において制限エンドヌクレアーゼ部位が豊富な
ポリリンカーをもつように、ｏｍｐＡ遺伝子が工作されている。このプラスミド
を、使用説明書に従って、ＳａｃＩ（ニュー・イングランド・バイオラブズから
得た酵素および反応緩衝液）およびＸｂａＩ（ＭＢＩファーメンタスから得た酵
素および反応緩衝液）で消化して制限部位ポリリンカーのフラグメントおよび直
線化されたプラスミドを得る。標準的ゲル電気泳動により、直線化プラスミドを
単離する。５’ＧＧＴＣＴＡＧＡ（ＶＮＮ）ｎＣＧＡＧＣＴＣ３’という一本鎖
オリゴヌクレオチドを慣例のテクノロジーによって合成する（ここで、Ｎは、そ
れぞれ等しい確率で４種のヌクレオチドすべてを意味し；Ｖは、それぞれ等しい
確率でＣ、ＧまたはＡを意味する）。一本鎖テンプレート−から二本鎖オリゴヌ
クレオチドを作成するために通例用いられる方法においては、一本鎖テンプレー
トから二本鎖オリゴヌクレオチドを作成するために、５’プライマーおよびＶｅ
ｎｔポリメラーゼといったようなプルーフリーディングポリメラーゼが用いられ
る。次いで、これらの二本鎖で可変性の高いオリゴヌクレオチドを、使用説明書
に従って、ＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化して、非相補的付着末端５’−ＣＴＡ
ＧおよびＡＧＣＴ−３’をもつ可変性の高いオリゴヌクレオチドを得る。次いで
、可変性の高いオリゴヌクレオチドを直線化プラスミドにライゲートする（使用
説明書に従って、ＭＢＩライゲーション緩衝液）；それらはプラスミドあたり唯
１つのオリゴヌクレオチドにおいて、および唯一つの配向において、ライゲート
する。慣例の電気泳動サイズ分画により、インサートを含むライゲートされたプ
ラスミドを単離する。この方法の産物は、ＯｍｐＡのループＩＶに対応する遺伝
子部位に、ＴＡＡおよびＴＧＡ終止コドンを含まない可変性の高い外来性配列を
もっているプラスミド（ｐＥＶ２１８Ｉ）の集団である。
【００９３】 各ベクターが予定の部位に０からｎ個の可変オリゴヌクレオチドを収容する構
築するために、次の方法を用いる。第１に、挿入の予定部位、すなわち、インプ
リントポリペプチドのインプリントドメインに対応する遺伝子部位に、ベクター
に独特な制限部位を配置する。もし、独特な制限部位が所望の部位にもはや存在
しないならば、オリゴヌクレオチド−定方向突然変異といったような、文献に記
載されている慣例の方法により（Brown、１９９２およびFreudl、１９８９）、 工作することができる。もし、この独特な部位で切断するエンドヌクレアーゼ（
Ｒ）が相補的付着末端ＲＳおよびＲＳ’を残すならば、前述の方法で産生された
可変オリゴヌクレオチドは、明確な保存された相補的付着末端ＲＳおよびＲＳ’
を付与される。インプリントポリペプチドの遺伝子をもっているベクターは、Ｒ
によって切断される。次いで、ベクターを過剰の可変オリゴヌクレオチドインサ
ートと合わせる。第１に、相補的付着末端ＲＳおよびＲＳ’を含むベクターは、
他のベクターにライゲートしうるか、または自己ライゲートしてオリゴヌクレオ
チドなしに閉じることができる。第２に、相補的付着末端ＲＳおよびＲＳ’を含
む可変オリゴヌクレオチドは、ｉ）自己ライゲートしてループを形成するか、ｉ
ｉ) 相補的付着末端ＲＳおよびＲＳ’をもつベクターにライゲートするか、ｉｉ
ｉ）相互にライゲートして、それ自体がライゲーションｉ、ｉｉ、またはｉｉｉ
を行うことができるマルチオリゴヌクレオチドコンカテネーションを形成するこ
とができる。ライゲーションの後、サイズ分画によってベクターにライゲートし
なかったすべてのインサートおよびインサートを受け入れなかったすべてのベク
ターを除去する。これによって、インプリントポリペプチドをコードする遺伝子
における予定の部位に１個からｎ個の可変オリゴヌクレオチドをそれぞれ収容す
るベクターの集団が得られる。各ベクターが予定の部位に０からｎ個の可変オリ
ゴヌクレオチドを収容するベクターの集団を構築するこの方法の特定の例は、文
献に見出すことができる（このようなベクターのライブラリーの構築が、Brown 、１９９２に詳細に記載されている）。
【００９４】 可変オリゴヌクレオチドインサートをもっているベクターを用いてインプリン
トポリペプチドの遺伝子を欠く細胞集団を形質転換する。慣例の形質転換方法を
用いる。抗生物質耐性遺伝子といったような選択可能なマーカーをもつベクター
の発現によって形質転換細胞を選択する。（コンピテント原核細胞の有効な形質
転換は、１０9個の形質転換細胞／ｍｌに達する。）形質転換産物は、インプリ ントドメインにおけるポイントに対応する遺伝子部位に特有のオリゴヌクレオチ
ド挿入をそれぞれが収容する細胞の集団である。形質転換後、適当な培地におい
て成長させることにより細胞集団を増殖させる。 大腸菌ＯｍｐＡのループＩＶに可変オリゴヌクレオチドを呈示するようにＣＩ
ＳＴＥＭ細胞集団が工作されている本発明の好ましい具体例においては、形質転
換は、次の段取りで行われる。文献に記載されている通例の形質転換法にしたが
って（Freudl、１９８９）、前述したように構築されている可変プラスミド集団
ｐＥＶ２１８Ｉを用いて、大腸菌株ＵＨ２０３（ｌａｃ、ｓｕｐＦ、ｏｍｐＡ、
ｒｅｃＡ、ｐｒｏＡＢ、ｒｐｓＬ）を形質転換する。アンピシリン１００ｍｇ／
ｍｌを含むルリアブロス中でＵＨ２０３集団を成長させ、形質転換細胞のアンピ
シリン耐性に対して選択する。
【００９５】 インプリントポリペプチドの発現を、ベクターのプロモーターに適した化合物
で誘発する。したがって、たとえば、上記好ましい具体例においては、ｐＥＶ２
１８Ｉで形質転換されたＵＨ２０３の集団を、１ｍｌのＩＰＴＧで誘発させる。
これによって、前のステップにおいて形質転換細胞が存在したのと同じ程度の多
さのクローンを含む細胞の集団が得られる。各クローンは、インプリントドメイ
ンに、特有のオリゴペプチドを呈示する。もし、インプリントポリペプチドがグ
リコプロテインまたはプロテオグリカンならば、インプリントドメインにおける
グリコシル化部位は、多様で予想し得ないオリゴサッカリドを生む。（細胞外ド
メイン−この場合、インプリントドメイン−がグリコシル化されていることを証
明するために通例行われる方法は、文献に記載されている（Lisら、１９９３） 。）簡単にいうと、ＣＩＳＴＥＭ細胞集団は、ポリペプチドの広大な組合せライ
ブラリーを呈示する。
【００９６】 好ましい具体例においては、インプリントポリペプチドが、挿入を受け入れる
ドメインがＣＩＳＴＥＭにおいて用いるのに適した選択剤の接着ドメインに直接
隣接する、ポリトピックな膜タンパク質であるＣＩＳＴＥＭを構築する。この好
ましい配置を図５に示すが、この配置を呈するポリペプチド／選択剤の組合せの
幾つかが、表１および文献に挙げられている（Tylerら、１９９６）。これらの ポリペプチド／病源体（あるいはそのようなもの）の組合せを用いる場合、ＣＩ
ＳＴＥＭは、インプリントポリペプチドの遺伝子処理を最少にして組み立てられ
る；前述したように、唯一の必要な処理は、インプリントドメインへのオリゴペ
プチドタグならびに可変ペプチド配列の導入である。しかし、インプリントされ
うるポリペプチドのリストは、隣接する接着ドメインおよびインプリントドメイ
ンを呈示しているポリトピックなタンパク質に限定されるものではない。ＣＩＳ
ＴＥＭによってインプリントされうるポリペプチドの多様性をさらに拡張するた
めに、２つの遺伝子処理を採用する。
【００９７】 分泌タンパク質がインプリントされる場合、それらはまず、それらのグリコリ
ピド−または膜貫通−固定（anchored）イソ体に変換される。分泌タンパク質の
転移および内在性タンパク質の膜挿入は、同じ細胞機構によって統御されるので
（Singer、１９９０および上記参照）、多くの分泌タンパク質は、疎水性膜貫通
スパンまたはグリコリピド付加のためのシグナル配列のカルボキシ末端アタッチ
メントによって簡単に膜結合イソ体に変換される。たとえば、タンパク質を標的
とし、ヒト腸細胞系の先端の表面に固定するために、真核細胞グリコホスホリピ
ド−固定タンパク質である崩壊促進因子の第３７カルボキシ末端アミノ酸をコー
ドする遺伝子フラグメントを、ヒト成長ホルモンといったような分泌タンパク質
の遺伝子と融合することができる。分泌タンパク質をそのグリコリピド−固定イ
ソ体に変換するためのこの方法は、文献に記載されている（Cross、１９９０） 。膜貫通スパンによって固定されるイソ体への分泌ポリペプチドの変換もまた、
文献に記載されている。たとえば、ヘパリン結合表皮成長因子様成長因子（ＨＢ
−ＥＧＦ）は、分泌ポリペプチドと構造的に同一である細胞外ドメインを含む、
より長い膜スパニングイソ体（ＨＢ−ＥＧＦＴＭＩＩ）として発現される（Onu ら、１９９４）。膜貫通スパンによって固定されたイソ体への分泌ポリペプチド
の変換の他の例および技術は、文献に記載されている（Singer、１９９０）。
【００９８】 インプリントポリペプチドの第２の遺伝子処理は、インプリントされるべきド
メインが、隣接接着ドメインを欠いている場合に行う。このことは、たとえば、
インプリンティングのために選ばれたポリペプチドがポリトピックでない場合、
またはインプリントドメインに隣接するドメインに接着する選択剤が幹であるか
またはＣＩＳＴＥＭにおける使用にあまり適していない場合などに生じる。いず
れかの状況において、機能的接着ドメインのための配列を、細胞外または細胞内
ドメインの遺伝子に融合させて、機能的接着ドメインおよび可変ドメインの両方
を含むキメラポリペプチドの遺伝子を創生することができる。たとえば、大腸菌
ＯｍｐＦ由来のコリシンＡ接着ドメインは、もう１つの外膜タンパク質ＯｍｐＣ
由来の別のドメインに融合する場合、コリシンＡ受容体としての機能を残してい
る（Fourelら、１９９０）。文献に記載されている（Chuら、１９９５）真核ウ イルスシステムのグループは、機能的接着ドメインの挿入の例をさらに提供する
。本発明の具体例へのそれらの適用においては、これらのシステムは、以下のよ
うに機能する。文献に記載されているように（Chuら、１９９５）、抗体（ｓｃ Ａ）の抗原結合部位が、脾臓壊死ウイルスといったようなウイルスの表面に呈示
される。次いで、ｓｃＡによって認識される抗原が、インプリントポリペプチド
の接着ドメインとして働くことになる細胞外ドメインに外来性インサートとして
発現される。（外来性配列を細胞外または細胞内ドメインの標的部位に挿入する
ための技術は、本明細書においてこれまで詳細にわたって記載および引用されて
いる。）この方法で、インプリントドメインに直接隣接する所望の位置に、ウイ
ルスに対する機能的接着ドメインを作成する。 これまでに記載されているインプリントポリペプチドの操作を簡単に要約する
ために、分泌ポリペプチドを膜結合イソ体に変換し、本発明によってインプリン
トされる予定のドメインのそばに機能的接着ドメインを挿入することができる。
これらの操作のゆえに、図１に示された各ポリペプチドファミリーを本発明によ
ってインプリントすることができる。 本発明を用いて所定の標的化合物と相互作用するポリペプチドを同定する場合
、ＣＩＳＴＥＭのインプリントポリペプチドは、インプリンティングに適した外
膜ポリペプチドである。たとえば、真核細胞−シグナリングポリペプチドＲａｆ
と相互作用するポリペプチド配列を同定するＣＩＳＴＥＭにおいては、インプリ
ントポリペプチドは、大腸菌ＯｍｐＡである。ＯｍｐＡの細胞外ループＩＶは、
Ｒａｆ−ＲＢＤに対する高い親和性を呈示するようにインプリントされる。次い
で、Ｒａｆ−ＲＢＤに対する親和性のために選ばれた配列を用いて、活性なＲａ
ｓ−Ｒａｆ経路をもつ哺乳類細胞から、配列ライブラリーおよびｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングする。
【００９９】 同様に、本発明をエピトープマッピングに適用する場合、インプリントポリペ
プチドは、インプリンティングに適した外膜ポリペプチドである。たとえば、Ｒ
ａｆ−ＲＢＤに結合するようにＯｍｐＡをインプリントするＣＩＳＴＥＭを用い
て、細胞−シグナリングポリペプチドＲａｓおよびＲａｆの間の相互作用の外面
をマッピングする。Ｒａｓをコードする遺伝子のセクションを、大腸菌ＯｍｐＡ
のループＩＶをコードする遺伝子部位へ挿入する。次いで、ＣＩＳＴＥＭは、Ｒ
ａｆに対して高い親和性を示すＲａｓのセクションを呈示するクローンを選択す
る。この方法においては、ＣＩＳＴＥＭは、Ｒａｆに結合する、Ｒａｓ上のエピ
トープを同定する。 本発明のいくらかの具体例は、機能的活性を示すように、ポリペプチドをイン
プリントする。これらの中で、好ましい具体例は、ポリペプチドを、それに所望
される機能の実行に対して自然に十分に適当になるように、インプリントする。
（前記の詳述された構造的および機能的カテゴリーは、外膜ポリペプチドの別個
のファミリーによって呈示された傾向の概要を提供する。）たとえば、Ｉａ型の
ポリペプチドは、一般に、細胞外標的への高親和性接着および特異的結合を含む
機能について受容能がある。したがって、それらは特異性の高いマーカーとして
、または小ペプチドホルモンなどの小さいポリペプチドのアンタゴニストとして
の使用のためにインプリントされるのに十分に適している。一方、ＩＩ型のポリ
ペプチドは、グリコシルトランスフェラーゼなどの細胞外活性部位をもつ酵素で
あることが多い。さらに、ＩＩ型のポリペプチドには、酵素活性を示すようにイ
ンプリントされるのに十分適しているものもある。本発明を用いて、機能的に活
性なエフェクターとして働くようにポリペプチドをインプリントする場合、好ま
しいインプリントポリペプチドは、通常、ヒト成長ホルモンなどの分泌タンパク
質の膜結合イソ体である。
【０１００】 さらに、本発明の好ましい具体例においては、インプリントポリペプチドは、
該インプリントポリペプチドに所望された機能に、類似あるいは同一の機能を実
行する分子との機能的または構造的相同性を自然に示す分子である。たとえば、
大腸菌ＯｍｐＡとの構造的相同性が、ヘモフィルス、シゲラ、ナイセリア、ボル
デテラおよびストレプトコッカス属において見出されている。これらの毒性の細
菌においては、ＯｍｐＡ相同体は、宿主組織への接着において役割を演じ、宿主
の特異的免疫応答によって認識されることが多い。ＯｍｐＡとこれらの抗原性接
着体の間の構造的相同性によって、ＯｍｐＡは、相同性接着体の擬態を獲得する
適用において使用するのためのインプリンティングに十分に適当になる。２つの
このような適用は、微生物の接着および以下に詳述する予防接種の競合的阻害で
ある。 多くの他の形態の組合せ化学とは異なり、本発明は、真核細胞によって発現さ
れたポリペプチドのライブラリーをスクリーニングすることができる。このこと
は、本発明に利用できる分子特性の範囲を大きく拡張し、真核ポリペプチドは、
第２のきわめて複雑な化学的に特徴的な分子の１つの階層であるサッカリドによ
って装飾される。前述したように、ポリペプチドの特定の部位に結合したサッカ
リド分子はシンプルな機能の局所的アミノ酸配列ではないので、インプリントド
メインで装飾されているオリゴおよびポリサッカリドは、基礎となるポリペプチ
ド配列と同じシステム的作法では変化しない。その代わりに、ひとつの部位にお
けるグリコシル化が、局所的配列またはポリペプチドの他の場所の配列に対する
変化によって、複雑な予測できない方法において変更される（Lisら、１９９３ ）。したがって、インプリントドメイン内のグリコシル化部位は保存されるが、
直接に隣接する領域は上記方法によって変化する場合、セミランダムな多様性の
糖構造が、規則正しい多様性のポリペプチド配列に追加され、複雑なグリコプロ
テインまたはプロテオグリカンライブラリーが作製される。
【０１０１】 ＣＩＳＴＥＭの標的化合物が、加工（グリコシル化など）されたポリペプチド
と天然に相互作用する場合（すなわち、その天然のセッティングにおいて、標的
化合物は、グリコプロテインまたはプロテオグリカンなどの加工体に結合する）
、インプリントポリペプチドが加工、特にグリコシル化されるのが好ましい。こ
のことは、ＣＩＳＴＥＭ細胞集団が真核細胞であることを必要とする。炎症、血
液凝固、精子−卵子相互作用および細胞内認識を支持する接着は、すべてグリコ
プロテインまたはプロテオグリカンによって媒介される。したがって、これらの
プロセスにおいてアンタゴニストまたはアゴニストとして使用するための分子を
同定するためには、真核細胞集団およびグリコシル化されたインプリントドメイ
ンを含むＣＩＳＴＥＭが好ましい。
【０１０２】 ポリペプチドにおけるグリコシル化によるペプチド配列の変動の予想できない
影響は、警戒的注意に値する。ペプチド配列の変化によって、ポリペプチドの完
全に異なるドメインにおけるグリコシル化を変更することができるので、ＣＩＳ
ＴＥＭの選択剤（病原性）は、その接着ドメインにおける特異的グリコシル化を
必要としない。別な方法で、もし変化が標的化合物をそのインプリントドメイン
に結合しないならば、接着ドメインを装飾している糖における予期せぬ変化は、
幾つかの細胞に病原性剤に対する免疫を付与する。上述したように、ＣＩＳＴＥ
Ｍで用いられる選択部位、特に病原性剤の接着部位は、十分に特徴付けられてい
る。ほとんどの場合、この特徴付けは、作用剤が接着のためのグリコシル化を必
要とするか否かを表す。さらに、このことは、受容体からグリコシル化を除去し
、作用剤に対する罹患性をテストすることによって証明される；グリコシル化を
除去するための方法は文献に記載されている（Lisら、１９９３）。
【０１０３】 本発明の具体例においてインプリントポリペプチドとして使用するために、構
造的完全性を示すポリペプチドが好ましい。ポリペプチドが細胞表面から解放さ
れた時にそれらの特性を維持するばかりでなく、インプリントされた分子が最終
的に適用される環境、おそらくインビボ状況において安定性を示すのが特に好ま
しい。原核ポリペプチドの中で、β軸がひときわ安定である；それらは強力な界
面活性剤中で煮沸することによってのみ変性させることができる。真核ポリペプ
チドにおいては、他のすべての点で影響を受けやすいタンパク質構造に、グリコ
シル化が構造的安定性をもたらすことが多い（Lisら、１９９３）。幾つかの場 合においては、インプリントドメインの構造的完全性は、遺伝子操作によって高
められる。このような操作は、インプリンティングの前または後に行うことがで
き、該操作によって、膜に結合されるかまたは膜から解放される予定である構造
の安定性が増強される。
【０１０４】 インプリントポリペプチドの遺伝子操作は、ＣＩＳＴＥＭに合理的な構造デザ
インの要素を導入するためにも用いられる。標的化合物、その本来のリガンド、
あるいはインプリントポリペプチドに所望される機能と類似した機能を天然に実
行する分子の構造的分析は、インプリントポリペプチドへの予定されたモチーフ
の挿入を導く。αへリックスといったような特定の構造モチーフの形成への傾向
は、完全にはランダムでないが、所望のモチーフを形成する配列の方へ統計的に
偏っている可変オリゴヌペプチドの挿入によって、インプリントドメインに組み
込まれる。予定されたモチーフは、インプリントドメインの保存領域にも挿入す
ることができる。たとえば、ポリプロリンまたはαへリックスを用いて、可変領
域を細胞表面からはなれて伸張することができ、標的化合物上の埋もれたエピト
ープに対し、可変領域をさらに接近可能にする。構造分析によって通知された遺
伝子操作は、ＣＩＳＴＥＭにとって、もはや必要ではないが、それは、所望の機
能の実行に対して十分適当になっているポリペプチドを設計するためのＣＩＳＴ
ＥＭと組合せて利用することができる。
【０１０５】 好ましい具体例においては、ＣＩＳＴＥＭ細胞集団は、インプリントポリペプ
チドの遺伝子の染色体コピーを欠いているが、この遺伝子のエピソームコピーま
たはベクター運搬コピーによるトランスフェクションにおいて、膜におけるイン
プリントポリペプチドを翻訳し、搬出し、挿入することができる細胞からなる。
したがって、たとえば、幾つかの標的のいずれか１つに結合するように大腸菌Ｏ
ｍｐＡをインプリントする、幾つかの好ましいＣＩＳＴＥＭにおいては、大腸菌
株ＵＨ２０３（（Freudl、１９８９）、ｏｍｐＡ-である）がＣＩＳＴＥＭ細胞 集団を構成する。同様に、ひとつの標的に結合するように大腸菌ＬａｍＢをイン
プリントするＣＩＳＴＥＭにおいては、大腸菌株Ｓ１７５５（（Brown、１９９ ２）、ｌａｍＢ遺伝子を欠く）が細胞集団を構成する。真核の例は、幾つかの標
的のいずれか１つに結合するようにヒトＩＣＡＭ−１をインプリントする、幾つ
かの好ましい真核ＣＩＳＴＥＭによって提供される。これらのＣＩＳＴＥＭにお
いては、ＣＯＳ−７細胞が用いられる：この菌株は、ＩＣＡＭ−１を欠いている
が、ＣＤＭ８発現ベクター上にもたらされたＩＣＡＭ−１遺伝子で容易にトラン
スフェクトされる（ＣＯＳ−７／ＣＤＭ８発現系は、Stauntonら、１９９０に記
載されている）。
【０１０６】 ＣＩＳＴＥＭ細胞集団を構成する菌株は、終止コドンサプレッサーであるのが
好ましい；すなわち、それらは翻訳可能なコドンとしてＵＡＧといったような終
止コドンのひとつを認識する。この理由は、ＣＩＳＴＥＭ細胞集団を構成してい
る菌株によって認識された終止コドンのいずれもが、インプリントポリペプチド
のためにベクター運搬遺伝子に挿入される可変オリゴヌクレオチドから排除され
なければならないということである。（終止コドンを含まない可変オリゴヌクレ
オチドの合成およびインプリントポリペプチドのための遺伝子への挿入は前述し
ている。）したがって、ＣＩＳＴＥＭ細胞集団が終止コドンのひとつを認識しう
る場合に、可変オリゴヌクレオチドの合成は単純になる。たとえば、ＯｍｐＡを
インプリントするための幾つかの好ましいＣＩＳＴＥＭにおいて用いられる大腸
菌ＵＨ２０３は、ｓｕｐＦであり、すなわち、ＵＡＧ終止コドンを翻訳すること
が可能である。したがって、ＯｍｐＡベクター（ｐＥＶ２１８）に挿入された可
変オリゴヌクレオチドは、ＵＡＧではなくて、終止コドンＵＡＡおよびＵＧＡを
含まないことが必要である。このことは、前述の合成方法によって容易に達成さ
れる。同様に、ＬａｍＢをインプリントするＣＩＳＴＥＭにおいて用いられる菌
株であるＳ１７５５は、ｓｕｐＦであり、すなわち、ＵＡＧ終止コドンを翻訳す
ることが可能である。
【０１０７】 ＣＩＳＴＥＭ細胞集団を増殖させる培地は、集団を構成する菌株に単純に依存
する。たとえば、大腸菌ＵＨ２０３は、ルリアブロスまたは寒天で成長する。菌
株が抗生物質耐性遺伝子をもつプラスミドを含む場合、適当な抗生物質はを培地
または寒天に加える。通例用いられる原核および真核細胞の菌株すべてに対する
標準培地は、文献に記載されており、当業者には公知である。インプリントポリ
ペプチドをもつベクターでＣＩＳＴＥＭ細胞を形質転換するための条件もまた、
細胞のタイプに依存し、それらは前記に詳述されているか、または文献に記載さ
れている。インプリントポリペプチドの発現の誘導には、インプリントポリペプ
チドの誘発可能なプロモーターを活性化合物する化合物とともに細胞集団をイン
キュベーションすることをが必要である。しかし、前述したように、ｌａｃプロ
モーター／オペレーターエレメントといったような誘発可能なプロモーターは、
“漏れやすく”、いずれのインキュベーションも行うことなく、インプリントポ
リペプチドを適当なレベルで発現させる。
【０１０８】 ＣＩＳＴＥＭ細胞集団を標的化合物の懸濁液または溶液とともにインキュベー
トする場合、一般に、培地は、標的化合物に加えて、細胞維持ための最小限の必
要物のみを含む。標的化合物以外に巨大分子が豊富に存在すると、インプリント
ドメインが標的細胞ではなくて培地の成分の１つにむしろ結合するクローンが選
択される。したがって、たとえば、好ましいＣＩＳＴＥＭにおいては、インプリ
ントするＯｍｐＡ、大腸菌ＵＨ２０３を、ＡＴＣＣ５２培地中、数種の標的化合
物のいずれか１つの存在下でインキュベートする。しかし、幾つかのＣＩＳＴＥ
Ｍにおいては、ルリアブロスを用いる。ＩＣＡＭ−１をインプリントするための
幾つかの好ましいＣＩＳＴＥＭにおいては、ＣＯＳ細胞を、ＴＣ最小イーグル培
地または最小ＴＣ９９培地中、標的化合物とともにインキュベートする。その他
の通例用いられる原核および真核細胞系のための培地は、文献に記載されている
。標的化合物の濃度およびインキュベーション継続時間は、ＣＩＳＴＥＭの機能
にとって重要であり、以下に詳細に検討する。
【０１０９】 本発明を用いて、酵素または標的化合物の生物学的活性のインヒビターといっ
たような機能的に活性なポリペプチドの同定を行う場合、標的化合物とのインキ
ュベーションは、インプリントポリペプチドが最終的に適用される条件下とでき
るだけ類似した化学的および熱的条件下で行う。たとえば、１つのこのまし真核
ＣＩＳＴＥＭは、ＨＩＶｇｐ１２０と受容体ＣＤ−４との相互作用のアンタゴニ
ストとして働くようにＩＣＡＭ−１をインプリントする（Fantiniら、１９９７ ）。このＣＩＳＴＥＭにおいては、細胞集団を、ヒト細胞外液に近い温度および
イオン濃度で上記標的化合物ＨＩＶｇｐ１２０とともにインキュベートする（表
２）。本発明の相互作用分析またはエピトープマッピングへの適用においては、
インキュベーションは、研究された相互作用が天然に起こる条件にできるだけ類
似した化学的および熱的条件下で行う。
【０１１０】 それらが侵入する細胞を殺すか、あるいは増殖を妨げる多種多様な作用剤にと
って、多くの外膜ポリペプチドが、接着のポートである。これらの作用剤のそれ
ぞれが、ポリペプチド受容体上の別個の接着ドメインを認識する（図２および図
３）。本発明において選択剤として用いられる、このような広範な選択剤の接着
ドメインは、文献に詳細に特性を記載されている（表１、Tylerら、１９９６） 。これらの特性記載を用いて、接着ドメインがインプリントドメイン（図５に示
す）のそばにある選択剤を同定する。インプリントされる予定のポリペプチドが
バイトピックである場合、あるいはインプリントドメインに隣接する接着ドメイ
ンをもつ適当な選択剤がみつからない場合には、インプリントドメインの遺伝子
操作によって機能的接着ドメインを、追加または挿入する；これらの操作は前述
している。 インプリントドメインのそばに接着ドメインをもつ選択剤を同定したらすぐに
、次の手順を行って、インプリントドメインが標的化合物を結合する細胞のため
の作用剤の選択を確立し、最適化する。この手順は２つの機能を果たす。第１に
、それは、選択剤が、インプリントドメインが標的化合物を結合できない細胞に
、有意に損傷を与えるが、インプリントドメインが標的を有効に結合する細胞に
は影響を及ぼさないままであるということを確立する。表現を変えると、この手
順が、その作用剤がＣＩＳＴＥＭ選択を遂行することに有能であることを実証す
る。
【０１１１】 第２に、この手順を用いて、ＣＩＳＴＥＭ選択に信頼性を与える実験条件を決
定する。ＣＩＳＴＥＭ選択を調節するために、以下の多数のパラメーターを変化
させる：ＣＩＳＴＥＭ細胞集団とともにインキュベートする標的化合物の濃度（
[Ｔ]）；標的化合物とのインキュベーション継続時間；初期感染多重度（ＭｏＩ
）または選択剤の濃度；選択剤とのインキュベーション継続時間；温度；インプ
リントポリペプチドの発現レベル。これらのパラメーターそれぞれは、多くのＣ
ＩＳＴＥＭ試行においてパラメーターを変化させることによって最適化すること
ができるが、それについては後に記載する。しかし、すべてのパラメーターを、
本発明のすべての具体例に対して最適化する必要はない。本発明の好ましい具体
例においては、複数の試行によって、少なくとも２つのパラメーターを最適化す
るが、他のパラメーターについては、通例の実験室手順または本明細書で記載し
た先行技術によってセットする。本明細書で述べる最適化においては、標的化合
物の濃度[Ｔ]および初期感染多重度ＭｏＩが、複数の試行によって変えられる２
つのパラメーターである。後記実施例においては、２つの異なるパラメータ−す
なわち、インプリントポリペプチドの発現レベルおよび選択剤とのインキュベー
ション継続時間−を変化させる。
【０１１２】 選択剤がＣＩＳＴＥＭ選択を行うのに有能であることを実証するための手順お
よびＣＩＳＴＥＭパラメーターを最適化するための手順は、前述のように構築す
る細胞集団を利用する。この細胞集団においては、インプリントドメインにオリ
ゴペプチドタグが呈示される。このタグは、容易に入手し得るリガンドに対して
高い親和性と特異性をもって結合する。（Ｔ７タグ／Ｔ７抗体が、好ましいタグ
／リガンドペアの例である）。本明細書で述べる最適化においては、オリゴペプ
チドタグをもつインプリントポリペプチドの発現は、およそ１０００コピー／細
胞であると見積もられる、比較的低レベルに調節される。しかし、前に言及した
ように、後記実施例に記載するような本発明の幾つかの具体例の最適化において
は、インプリントポリペプチドの発現レベルは、変化されたパラメーターの１つ
である。インプリントポリペプチドの調節が達成される方法は、異種プロモータ
ーがインプリントポリペプチドの遺伝子を制御することに依存する。たとえば、
本発明の好ましい具体例で用いたｏｍｐＡプラスミドであるｐＥＶ２１８Ｔ７に
おいて、ｏｍｐＡは、イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴ
Ｇ）によって誘発されるｌａｃ調節エレメントの制御下にある。さらに、ｐＥＶ
２１８Ｔ７上のｏｍｐＡ遺伝子は、ポリペプチドの第７アミノ酸に対応するＴＡ
Ｇ終止コドンを含む（Freudl、１９８９）；したがって、アンバーサプレッシン
グ（ｓｕｐＦ）宿主大腸菌ＵＨ２０３において発現される場合、ｏｍｐＡの発現
は、ＩＰＴＧによる誘発レベルによってのみならず、プラスミドから発現される
サプレッサーｔＲＮＡの濃度によっても調節される。ＯｍｐＡの低レベルの発現
は、１．０ｍＭのＩＰＴＧ誘発により達成される。ｐＳＢ１６４９において、ｌ
ａｍＢは、ｌａｃ調節エレメントの制御下にあり、発現は、文献に記載されたよ
うに制御される（Brown、１９９２）。本発明の好ましい真核の具体例で用いら れたＣＤＭ８ベクター構築物であるｐＣＤ１．８からのＩＣＡＭ−１の発現の制
御もまた文献に記載されている（Stauntonら、１９９０）。
【０１１３】 インプリントドメインにオリゴペプチドタグを呈示している２つの細胞集団（
集団ＡおよびＢ）を、細胞のタイプおよび発現ベクターに適した培地中で成長さ
せる。（たとえば、本発明の特に好ましい具体例においては、ｐＥＶ２１８Ｔ７
によって形質転換された大腸菌ＵＨ２０３を３７℃にて１００μg／ｍｌのアン ピシリンを補足したルリアブロス中で成長させる。）細胞集団ＡおよびＢと同じ
ベクターで形質転換され、しかしオリゴペプチドタグをもたない、細胞集団Ａお
よびＢと同じ菌株の第３の細胞集団（Ｃ）を、同じ培地中で成長させる。（した
がって、たとえば、前記の特に好ましい具体例においては、ｐＥＶ２１８Ｔ７よ
りもむしろｐＥＶ２１８によって形質転換された大腸菌ＵＨ２０３を前記の培地
中で成長させる。）集団ＢおよびＣを成長させて、１０6個の細胞からなる３つ のクローンのサブ集団、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＣ１、Ｃ２、Ｃ３を作成する。
集団Ａを成長させて、それぞれ１０6個の細胞からなる９つのクローンのサブ集 団、Ａ１、Ａ２〜Ａ９を作成する。
【０１１４】 集団Ａ１〜Ａ９およびＣ１〜Ｃ３を、標的化合物とともにインキュベートし、
集団Ｂ１〜Ｂ３を、標的化合物なしで同じ条件下でインキュベートする。オリゴ
ペプチドタグおよび標的化合物の間の結合のために必要な最適条件および時間は
、タグ／標的システムの使用説明書、または文献において指示される（Phizicky
ら、１９９５）。大腸菌ＯｍｐＡのループＩＶにＴ７タグが呈示され、Ｔ７抗体
（ノヴァゲン）が標的化合物として働く、特に好ましい具体例においては、ｐＥ
Ｖ２１８Ｔ７を発現している細胞集団をｍＡｂＴ７とともに約６０分間インキュ
ベートする。ＣＩＳＴＥＭ選択のための最適濃度を同定するために、細胞ととも
にインキュベートする標的化合物の濃度は、細胞集団Ａ１〜Ａ９およびＣ１〜Ｃ
３を通して規則正しく変化させる（表３）。集団Ａ１〜Ａ３は、それぞれ最低濃
度の標的化合物とともにインキュベートする。この最小濃度は、作用剤の特性お
よび標的化合物の有効性に従属して変化するが、一般におよそ１０3×細胞の濃 度×細胞あたりのインプリントポリペプチドの数である。したがって、たとえば
、上記の条件下で成長させた１０6個の大腸菌集団が、細胞当たり約１０００コ ピーを発現するには、培地１ｍｌにつき０．００１ｍｇのｍＡｂＴ７を用いる。
これは、インプリントポリペプチド当たり約４×１０3個の標的分子である。集 団Ａ４〜Ａ６は、集団Ａ１〜Ａ３に用いた濃度の１０倍程度の高濃度の標的化合
物とともにインキュベートする。集団Ａ７〜Ａ９およびＣ１〜Ｃ３は、集団Ａ１
〜Ａ３に用いた濃度の１００倍程度の高濃度の標的化合物とともにインキュベー
トする。
【０１１５】 インキュベーションの後、集団Ａ１〜Ａ９、Ｂ１〜Ｂ３およびＣ１〜Ｃ３を選
択剤処理に付す。曝露の技術は、選択剤の性質に従属し、すべての公知の選択剤
については、文献に記載されている。原核細胞集団をバクテリオファージに曝す
方法は、Calendarによる記載がある（Calendar、１９８８）；原核細胞集団をコ
リシンに曝す方法は、Pattusによる記載がある（Pattus、１９９０）；および真
核細胞集団をウイルスに曝す方法は、文献に記載されている（Stauntonら、１９
９０；Tylerら、１９９６）。標的化合物の濃度と同様に、最適化においては、 ＣＩＳＴＥＭ選択のための最適濃度を同定するために、細胞集団を通して選択剤
の濃度を変化させる（表３）。（しかし、前に言及したように、本発明の具体例
それぞれを最適化するにあたり、すべてのパラメーターを変化させるのではない
。下記の最適化においては、たとえば、標的化合物の濃度は、変化させるパラメ
ーターの１つではない。その代わり、この濃度は固定し、他の２つのパラメータ
ーを変化させる）。集団Ａ１、Ａ４、Ａ７、Ｂ１およびＣ１は、最低濃度の選択
剤に曝す。この濃度は、選択剤の特性、曝露の方法および継続時間、ならびに標
的化合物の有効性（および濃度）に従属して、ＣＩＳＴＥＭ毎に変化するが、一
般に、それは、おおむね、ＣＩＳＴＥＭ実行中に十分に影響を受けやすい集団に
おいてすべての細胞に影響を及ぼすために必要な最小濃度である。したがって、
コリファージＫ３またはλといったような多くの細胞溶解性のバクテリオファー
ジにとって、曝露の方法が標準的なファージ感染であり（Calendar、１９８８）
、バクテリオファージとのインキュベーション継続時間が３７℃にて６０分間で
る場合、濃度は、２〜５×細胞濃度またはＭｏＩ＞＞２〜５である。細胞集団Ａ
２、Ａ５、Ａ８、Ｂ２およびＣ２は、２倍の濃度の選択剤に曝し、Ａ３、Ａ６、
Ａ９、Ｂ３およびＣ３は、さらに２倍の濃度の選択剤に曝す。表３はＣＩＳＴＥ
Ｍ選択を最適化するための手順における、細胞集団に関しての標的化合物および
選択剤濃度の変化をまとめたものである。
【０１１６】 この手順における濃度は、選択剤の性質および曝露方法に従属して変化する。
が、手順のいくつかの基本的な面は、ＣＩＳＴＥＭ毎に変化しない。第１に、コ
ントロール集団ＢおよびＣにおいては、選択剤は、その受容体へのアクセスをさ
またげられておらず、したがって、すべての細胞に影響を及ぼす。細胞はインプ
リントドメインにタグをもつけれども、集団Ｂは、タグのリガンドに曝されない
ので、集団は選択剤の影響を受けやすい。したがって、接着ドメインなどの選択
剤の部位は、曝されたままであり、機能的である。細胞集団Ｃはリガンドに曝さ
れるが、リガンドのタグをもたないインプリントポリペプチドによってリガンド
が結合されないので、集団Ｃは影響を受けやすい。集団ＢおよびＣにおいては同
様に、選択剤の接着ドメインが曝されたままであり、機能的なので、これらの集
団を選択剤に曝した結果は同じである。したがって、これらのコントロール試行
においては、選択剤への曝露は、集団Ｂ１およびＣ１；同じく集団Ｂ２およびＣ
２；ならびに集団Ｂ３およびＣ３において、同じ結果をもたらす。これらのコン
トロールは、ＣＩＳＴＥＭにとって重大な２つの結論を確立する：１．もし、リ
ガンドがインプリントポリペプチドに結合されないならば、標的リガンドの存在
は、選択剤の活性に影響を及ぼさず；２．もし、タグが標的リガンドに結合され
ないならば、インプリントドメインにおけるタグの存在は、選択剤の活性に影響
を及ぼさない。
【０１１７】 コントロール集団ＢおよびＣは、選択剤に対して完全に影響を受けやすいが、
集団Ａ１〜Ａ９は、五分五分から免疫までの範囲において耐性を示す。細胞集団
Ａにおいては、インプリントドメインは、インキュベーション中に標的リガンド
を結合するオリゴペプチドタグを収容している。結果として、隣接する接着ドメ
インが選択剤から遮断され、細胞は保護される。集団Ａ１〜Ａ９は、範囲をもっ
た濃度の標的リガンドにさらされるので、範囲をもった耐性を示す。濃度の範囲
が十分に広い場合、耐性の範囲は、“部分的な影響受けやすさ”から“完全免疫
”まで広がる。 これらの予備的試行に基き、機能的ＣＩＳＴＥＭ選択を行う選択剤の濃度を以
下のようにして見出す。文献に記載されたプロトコルにしたがって選択剤に細胞
集団を曝す場合、遍在性の病原性影響（すなわち、集団中のすべての細胞が選択
剤によって影響を及ぼされる状態）が容易に観察される。たとえば、原核集団を
毒性の細胞溶解性ファージに曝す場合、遍在性の病原性影響によって、生存コロ
ニーがゼロである、集団の集蜜的細胞溶解が起こる（Calendar、１９８８）。コ
ントロール集団（ＢおよびＣ）中のすべての細胞が選択剤によって影響を及ぼさ
れる選択剤の最低濃度が、ＣＩＳＴＥＭ選択にとって適当なレベルである。たと
えば、もし、Ｂ１およびＣ１からのいくつかの細胞(表３)は選択剤を免れるが、
Ｂ２およびＣ２の細胞はすべて選択剤によって影響を及ぼされるならば、ＣＩＳ
ＴＥＭのための選択剤の適当な濃度は、ＭｏＩ＝１０である。この例の場合、遍
在性の影響にとって必要な最小濃度は、ＭｏＩの範囲が５〜１０であるさらなる
試行によって、より正確に決定することができる。
【０１１８】 ＣＩＳＴＥＭの選択剤の濃度を見出した後、標的化合物の最適濃度を以下のよ
うにして決定する。各ＣＩＳＴＥＭは、インプリントドメインがこの閾値以下の
親和性（Ｋａ＜ｔ）をもって標的化合物を結合するクローンは選択剤によって集
団から除去されるが、インプリントドメインが閾値以上の親和性（Ｋａ＞ｔ）を
示すクローンは選択剤から保護される、すなわち選択されるような、およその閾
値親和性（Ｋａ＝ｔ）をもっている。ＣＩＳＴＥＭの閾値は、標的化合物の濃度
を調節することによって設定することができる。集団ＡおよびＢによって呈示さ
れるオリゴペプチドタグが、そのリガンドを現す親和性に閾値をおよそ設定する
ために、ＣＩＳＴＥＭに用いられる標的化合物の濃度は、ＣＩＳＴＥＭのＭｏＩ
において選択剤の存在下に集団Ａｉに完全な保護を提供する最低レベルである。
（細胞集団が、文献に記載された通例のプロトコルに従って選択剤に曝される場
合、選択剤に対する完全免疫が容易に観察される。）したがって、たとえば、も
し、前記のように決定されたＣＩＳＴＥＭの選択剤の濃度が、ＭｏＩ＝１０であ
り、集団Ａ５は選択剤に対して完全免疫を示すが、集団Ａ２は該選択剤によって
わずかに弱められるならば、ＣＩＳＴＥＭにおいて、インプリントポリペプチド
が、オリゴペプチドタグによって示されるそのリガンドへの親和性に等しいかま
たはそれ以上の親和性をもって標的を結合する細胞を選択するためにインプリン
トポリペプチド当たり１０4分子の標的化合物が用いられる。オリゴペプチドタ グによって示されるそのリガンドへの親和性よりも有意に高い標的に対する親和
性を示すインプリントポリペプチドをもつ細胞を選択するために、インプリント
ポリペプチド当たり１０3分子といったような、わずかに低い濃度の標的化合物 が用いられる。オリゴペプチドタグによって示されるそのリガンドへの親和性以
下にＣＩＳＴＥＭの閾値親和性を設定するために、インプリントポリペプチド当
たり１０5分子といったような、より高い濃度の標的化合物が用いられる。細胞 集団にＣＩＳＴＥＭを適用すると、対象ポリペプチドと標的間の相互作用の効能
によって選択手順に耐えて生き残る細胞クローンが得られる。対象ポリペプチド
の配列は、呈示ドメインに挿入されたＤＮＡ配列によってコードされる。生存す
る細胞集団は、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよい。後者
の場合、単細胞から誘導されたコロニーを回収するために、生存する細胞を固相
培地に植え替える必要がある（人工的細菌遺伝学の状態）。モノクローナル細胞
集団の増殖およびそれに続いてのそれらの関連するエピソームまたはベクターＤ
ＮＡの調製は、組換えＤＮＡメソドロジーの標準的プロトコルに従っておこなう
。エピソームＤＮＡは呈示タンパク質およびその挿入された対象ポリペプチドを
コードするので、挿入されたＤＮＡタグのＤＮＡ配列分析は（人工的組換えＤＮ
Ａテクノロジーの状態）、インサートのＤＮＡ配列を提供し、それによって、膜
タンパク質の膜内部分として表面に発現され、呈示された対象ポリペプチドのア
ミノ酸配列を予測することができる。挿入ＤＮＡは、ランダムに合成されたオリ
ゴヌクレオチドのプ−ルから、または天然のｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡから
誘導されたＤＮＡフラグメント（ｃＤＮＡ）から誘導される。選択されたＤＮＡ
および同種ポリペプチド配列を、公知のタンパク質およびその同種遺伝子の配列
に適合するように細かく吟味することができる。したがって、配列分析は、対象
ポリペプチドを同定すること、およびその組成を公知の遺伝子またはＤＮＡ配列
およびその予測されたタンパク質に関連付けることに利用することができる。
【０１１９】 基本的ＣＩＳＴＥＭの変更および練り上げは、以下に挙げるように、その能力
をいろいろ拡張することによって達成される：ｉ．選択されたポリペプチドの標
的化合物に対する最大親和性の増大；ｉｉ．多価インプリントポリペプチドを標
的化合物に連結する結合部位の数の特定化；ｉｉｉ．標的化合物に対する高い親
和性および第２の化合物に対する低い親和性の両方を示すインプリントポリペプ
チドの選択；ｉｖ．親和性に対するのみならず機能的活性に対する選択；ｖ．標
的化合物に結合するための、ｃＤＮＡライブラリーから発現されたポリペプチド
のスクリーニング；ｖｉ．１つまたはそれ以上の一組の複数の別個の標的化合物
に対する親和性を示す、インプリントポリペプチドの選択。
【０１２０】 ＣＩＳＴＥＭにおいて達成されうる最大の親和性を増大するために、反復のＣ
ＩＳＴＥＭランを行う（図１０）。標的化合物に対する親和性を示しているクロ
ーンの集団がＣＩＳＴＥＭによって選択されると、ベクターに適した、文献に記
載されている通例の技術によってこの集団からインプリントポリペプチドの遺伝
子をもつベクターが単離される。次いで、これまでに述べたような新規な可変オ
リゴヌクレオチドを、ベクターのもとの可変挿入部分のそばに挿入する。これは
、インプリントドメインに対応する遺伝子部位に、もとの可変オリゴヌクレオチ
ドの挿入を達成するのに用いたのと同じ手順によって行われる。（このような手
順の１つは前述している）。別法としては、変異は、もとのオリゴヌクレオチド
インサートの伸張としてではなく、もとのインサートのオリゴマー的再配列とし
て誘導すること（オリゴヌクレオチドインサートのオリゴマー的再配列は、Brow
n、１９９２に記載されている）、またはもとのインサートの限定された突然変 異誘発である（オリゴヌクレオチドインサートの限定された突然変異誘発のため
のテクニックは、Balintら、１９９３に記載されている；突然変異オリゴヌクレ
オチドの挿入は、ベクター内の標的部位への可変オリゴヌクレオチドの挿入のた
めの上記の手順にしたがって行われる）。換言すれば、オリゴペプチド“配列空
間”は、多くの方策によって調査することができ、そのうちの幾つかは他の組合
せライブラリーのスクリーニングに適用される（Balintら、１９９３；Brown、 １９９２；Janda、１９９４）。）次いで、上記引用された通例のプロトコルに したがって、インプリントドメインに対応する部位に新たな変異をもつベクター
を用いて細胞集団を形質転換し、新規なＣＩＳＴＥＭ細胞集団を創造する。次い
で、この集団を、ＣＩＳＴＥＭによって、さらにもう１つの選択ラウンドに付す
（図１０）。変異を導入し、標的化合物に対する親和性を選択し、次いで選択さ
れたクローンを増殖させる、このサイクルを、インプリントドメインと標的化合
物の間の結合が、親和性の所望の度合いに到達するまで繰り返す。 標的化合物に対する親和性についてＣＩＳＴＥＭによってスクリーニングされ
たオリゴペプチド配列の数は、ＣＩＳＴＥＭを平衡して行うこと、ＣＩＳＴＥＭ
をハイスループットロボット方策と組み合わせること、大規模にＣＩＳＴＥＭを
行うこと、または持続性スループットケモスタットにおいて行うことによって増
加する、すなわち配列空間が増大する。
【０１２１】 標的化合物の多価結合を示すインプリントポリペプチドを創造するために、連
続ＣＩＳＴＥＭランによって、多数の可変領域をインプリントすることができる
（図１１）。先ず最初に、インプリントポリペプチドの単一領域またはドメイン
を、標的化合物を結合するようにインプリントする。次に、予めインプリントド
メインを呈示する選択された細胞集団を、インプリントポリペプチドにおいて他
の場所（予めインプリントドメインの非インプリント領域または全く別のドメイ
ンのいずれか）に可変領域を呈示するように工作する。これは、以下のように達
成される。先ず最初に、インプリントポリペプチドの遺伝子をもつベクターを、
ベクターに適した、文献に記載された通例の技術によって、選択された細胞集団
から単離する。次に、遺伝子の特定の部位への可変オリゴヌクレオチドの挿入の
ために前述した手順のひとつを用いて、インプリントポリペプチドの細胞外ドメ
インに対応する遺伝子部位に可変配列を挿入する。しかし、この部位は、ＣＩＳ
ＴＥＭ選択の第１ラウンドにて挿入された可変オリゴヌクレオチドの挿入部位と
は別個である。いまや、１つの部位に選択された配列をもち、もう１つの部位に
可変オリゴヌクレオチドをもつベクターを用いて、細胞集団を形質転換し、新規
なＣＩＳＴＥＭ細胞集団を創造する。この集団をＣＩＳＴＥＭ選択のもう１つの
ラウンドに付す。このラウンドにおいて、標的化合物の濃度は、その前のラウン
ドにおける濃度よりも低く、選択のための閾値親和性ｔは高くなる。この理由は
、選択の第１ラウンドの後、ＣＩＳＴＥＭ集団におけるすべての細胞が標的化合
物に結合し、ＣＩＳＴＥＭは、複数の異なるエピトープにおいて標的化合物を結
合するインプリントポリペプチドを発現する細胞のみを選択しなければならない
からである。インプリントされるインプリントポリペプチドの各新たな領域に、
標的化合物上の新たなエピトープが結合される。
【０１２２】 本発明のある具体例は、高率で標的化合物を結合するインプリントポリペプチ
ドを選択する。これらのＣＩＳＴＥＭにおいては、選択剤の導入前に、ＣＩＳＴ
ＥＭ細胞集団を標的化合物とプレインキュベートしない。むしろ、選択剤は、標
的化合物と同時に導入する。本明細書において他の場所で詳述した最適化手順に
おいて記載したように、選択剤と標的化合物の濃度は、多数の試行毎に変える。
ＣＩＳＴＥＭ細胞集団に選択剤と標的化合物を同時に導入するに際し、インプリ
ントポリペプチドが標的化合物に相対的に急速に結合するクローンが保護され、
インプリントポリペプチドが標的化合物に、より遅く結合するクローンが選択剤
によって排除されるように、濃度を調節する。
【０１２３】 標的化合物に対しては高い親和性を示すが、本明細書において“忌避化合物（
repelled compound）”と称する第２の化合物に対しては非常に低い親和性を示 すようにポリペプチドをインプリントするＣＩＳＴＥＭは、次のように構築する
。標的化合物のサイズ、忌避化合物のサイズおよびインプリントドメインと接着
ドメインの間の距離は、以下の条件に適合するように、必要に応じて変更される
：標的化合物は、インプリントドメインに結合する場合、接着ドメインをさまた
げるが、忌避化合物は、インプリントドメインに結合する場合、接着ドメインを
妨げるには小さすぎる。もし、この判断基準が偶然に適合しない場合（すなわち
、もし忌避化合物が偶然にきわめて小さいなら）、標的化合物の直径およびドメ
イン間の距離は、以下のように変更される。標的化合物は多量体の創生によって
大きくすることができる。（多量体を創生するための手順は、標的化合物の性質
によって変わるが、多数コピーの化合物を連結する多くの技術が、通例行われて
おり、文献に記載されている。）インプリントドメインと接着ドメイン間の距離
は、位相学的に他方のドメインから離れたインプリントポリペプチド上の部位へ
おのおののドメインを動かすことによって大きくすることができる。インプリン
トドメインの移動は、前記手順にしたがって、インプリントポリペプチドの異な
る細胞外ドメインに対応する遺伝子部位に可変オリゴヌクレオチドを挿入するこ
とを含む。本発明の多くの原核および真核細胞の具体例においては、インプリン
トポリペプチドの異なる細胞外ドメインへ、その選択剤受容体としての機能に影
響を及ぼすことなく、接着ドメインを移動させることができる。接着ドメインを
移動させる手順は、前記ならびに文献に記載されている（Chuら、１９９５）。 もし、接着ドメインおよびインプリントドメインの互いからの移動の結果として
、１つまたはそれ以上のＣＩＳＴＥＭの機能に関与しない細胞外または細胞内ド
メインが、ＣＩＳＴＥＭの機能にとって重大な２つの位相学的に分離されたドメ
インの間に発生するならば、インプリントドメインに結合する標的化合物による
接着ドメインの適当な妨害を、細胞外または細胞内構造が妨げないように、余分
のドメインをポリプロリンリンカーによって置き換えることができる。
【０１２４】 ３つの重大な距離（インプリントドメインと接着ドメインの間の距離、標的化
合物の直径および忌避化合物の直径）が、上記判断基準に一致するならば、ＣＩ
ＳＴＥＭ細胞集団を、標的化合物と忌避化合物の両方とともにインキュベートす
る。次いで、ＣＩＳＴＥＭの選択剤を導入し、２つの選択圧力を創生する。１つ
の圧力は、標的化合物に対して高い親和性をもつインプリントポリペプチドを発
現する細胞に有利であり（図１２）：インプリントドメインに結合した標的化合
物は、隣接する接着ドメインを妨げ、したがって選択剤から基礎をなす細胞を保
護するように働く。標的化合物に対してある程度の親和性を示す細胞のうち、第
２の圧力は、忌避化合物に対して、より低い親和性をもつ細胞に有利である；イ
ンプリントドメインに結合した忌避化合物は、隣接する接着ドメインを妨げるこ
とができないばかりでなく、標的化合物による結合を防ぐ（図１２）。短く言う
と、忌避化合物に対するインプリントポリペプチドの親和性が、標的化合物に対
するその親和性を低下させる。したがって、選択は、標的化合物に対して高い親
和性をもち、忌避化合物に対して低い親和性をもつインプリントドメインを呈示
する細胞に有利である。
【０１２５】 インプリントポリペプチドの親和性ばかりでなく、機能的活性を選択するため
に、基本的ＣＩＳＴＥＭに二次的活性スクリーニングを連結させる。連結選択の
第１のステップにおいては、ＣＩＳＴＥＭは、指示された様式で、インプリント
ポリペプチドが標的化合物を結合するクローンを選択する。このクローン集団ま
たはそのような集団から引き出されたインプリントドメインから、二次的スクリ
ーニングが、標的化合物への結合が所望の機能的活性を呈示する構造を選択する
。界面活性剤によって、または分泌同形体（同形体およびそれらの相互転換につ
いては先述している）としての発現によって、細胞表面から解放されたインプリ
ントドメインを、通例行われる活性スクリーニングまたはアッセイもしくは標的
化合物の活性の変更に付す。たとえば、１つのＣＩＳＴＥＭは、高い親和性をも
って可溶性ＩＬ−６−受容体（この標的化合物については、すでに詳述している
）に結合するように、大腸菌ＯｍｐＡをインプリントする。次いで、ＯｍｐＡを
変性しないことがわかっている慣例の穏やかな界面活性剤によって細胞膜から解
放されたインプリントポリペプチドを、細胞結合性機能的ＩＬ−６−受容体をア
ゴナイズする能力について第２のスクリーニングに付す。このアゴニスト活性ス
クリーニングは、文献に記載されている(Hibiら、１９９０)。別法として、機能
的活性についての極めて強い選択が、ＣＩＳＴＥＭの選択されたセットの細胞ク
ローンに行使されるが、これは、細胞膜からのインプリントドメインの解放を必
要としない。事実、まさに、複製する細胞集団が得られるので、遺伝子的相補性
に非常に類似した選択レジメにＣＩＳＴＥＭを連結することができる。これらの
選択レジメにおいては、栄養素などの生命維持に必要な化合物の各細胞への供給
は、インプリントドメインに所望される機能の能力に依存する。換言すれば、イ
ンプリントドメインの機能的活性は、基礎をなす細胞に対して生命維持に必要な
化合物に標的化合物を変換するか、または細胞にとって生命維持に必要な化合物
を確保するか、のいずれかである。
【０１２６】 本発明のある具体例においては、標的化合物は、別個の相異する分子のライブ
ラリーからなり、これを“標的ライブラリー”と称する。標的ライブラリー（単
一の標的化合物よりもむしろ）が用いられるＣＩＳＴＥＭは、各選択されたペア
の１つのメンバーが、保護されたクローンのインプリントドメインに呈示された
オリゴペプチドであり、他方のメンバーが、このオリゴペプチドに結合する標的
ライブラリー分子である相互作用ペアを選択するように働き、したがって、クロ
ーンを保護するように働く。もし、標的ライブラリー内の各分子が、ＣＩＳＴＥ
Ｍ機能のサイズ必要条件に適合するに十分大きく、インプリントポリペプチドが
標的ライブラリー内の１つまたはそれ以上の分子に結合する細胞に保護を付与す
るのに適切な濃度で培地中に存在するならば、標的ライブラリーは、所望される
程度に多数の異なる分子を含み、ライブラリーの分子を作成または単離するため
の公知の手順のいずれかに従って構築することができる。
【０１２７】 標的ライブラリーに関連するＣＩＳＴＥＭにおいては、標的ライブラリー内の
各分子の濃度を、効果的なＣＩＳＴＥＭ選択にとって必要な最小レベルまで増加
するために、すなわち、インプリントポリペプチドが標的ライブラリー内の１つ
またはそれ以上の分子に結合する細胞に、選択剤からの保護を付与するに必要な
濃度を達成するために、必要に応じて２つの方策が用いられる。１つの方策にお
いては、ＣＩＳＴＥＭ細胞集団および標的ライブラリーをそれぞれ増殖させ、フ
ラクションに分割し、次いで、マイクロタイターウエルにて互いに接触させる。
これによって、標的分子の濃度が、インプリントポリペプチドが標的ライブラリ
ー内の１つまたはそれ以上の分子に結合する細胞に、選択剤からの保護を付与す
るに十分高くなる。
【０１２８】 標的ライブラリー内の各分子の濃度を増加するための第２の方策においては、
標的ライブラリーは、ＣＩＳＴＥＭ細胞集団それ自体によって分泌される。前述
したように、可変オリゴペプチドのライブラリーは、大腸菌繊維状ファージの遺
伝子タンパク質３への融合体として呈示されうる（繊維状ファージ−呈示テクノ
ロジーは、Janda、１９９４およびPhizickyら、１９９５に記載されている）。 繊維状ファージは、排出によってファージ粒子が宿主細胞から解放され、細胞が
無傷のままにである、相対的に無毒の感染を作り出す。したがって、それ自体の
標的ライブラリーを分泌するＣＩＳＴＥＭ細胞集団は、以下のように工作するこ
とができる。 前述の基本的ＣＩＳＴＥＭのように、可変オリゴヌクレオチドがインプリント
ドメインに対応する遺伝子部位に挿入されている、この遺伝子の外来性コピーの
ライブラリーで、インプリントポリペプチドの遺伝子が欠如している細胞集団を
形質転換する。たとえば、上記大腸菌ＣＩＳＴＥＭ細胞集団の構築においては、
膜タンパク質の細胞外ループＩＶに対応する遺伝子部位に可変オリゴヌクレオチ
ドをもつｏｍｐＡプラスミドのライブラリーであるｐＥＶ２１８Ｉで、大腸菌Ｕ
Ｈ２０３を形質転換する。得られる細胞集団は、インプリントドメインに外来性
オリゴペプチドのライブラリーを呈示する。基本的ＣＩＳＴＥＭの拡張において
は、次いで、オリゴペプチドの分泌ライブラリーをコードする第２の染色体外遺
伝エレメントで形質転換する。たとえば、ＯｍｐＡインプリンティング細胞集団
を、遺伝子タンパク質３において外来性オリゴペプチドを呈示するように工作さ
れた繊維状バクテリオファージのライブラリーでトランスフェクトさせる。（多
くのこのようなライブラリーは、文献に記載されている。Janda、１９９４およ びPhizickyら、１９９５参照）。集団内の各細胞は、いまや２つの染色体外遺伝
エレメントを有している：１つは、細胞外ループが外来性オリゴペプチドを呈示
するＯｍｐＡをコードする；他方は、ｇｐ３が、細胞表面に呈示されたものとは
異なる、第２の外来性オリゴペプチドを呈示する安定に排出されたＭ１３ファー
ジをコードする。
【０１２９】 次いで、２つの染色体外遺伝エレメントを発現しているＣＩＳＴＥＭ細胞集団
を、基本的ＣＩＳＴＥＭで記載したものと同じ曝露プロトコルにしたがって、Ｃ
ＩＳＴＥＭの選択剤にさらす。選択剤に曝露するに際し、クローンによって分泌
される標的ライブラリー分子が、クローンのインプリントドメインに特異的に結
合する場合のみ、ＣＩＳＴＥＭの集団内のクローンが保護される。すなわち、ク
ローンは、自己分泌ループによって保護される。大腸菌がＯｍｐＡライブラリー
を呈示し、Ｍ１３ライブラリーを分泌する特別のＣＩＳＴＥＭにおいては、Ｋ３
は、選択剤として働く（図１３）。ＯｍｐＡのループＩＶに呈示された外来性ポ
リペプチドが、クローン自体が分泌するＭ１３に特異的に結合する場合のみ、Ｋ
３から大腸菌クローンが保護される。この相互作用ペアのオリゴペプチドの両方
のメンバーの遺伝子は、保護細胞から容易に回収される。要するに、クローンの
自己分泌保護を通して、標的ライブラリーをもつＣＩＳＴＥＭは、特異的に相互
作用するペアのオリゴペプチドならびにそれらをコードする遺伝子について選択
する。 別の自己分泌保護の例においては、ファージＭ１３ライブラリーの代わりに溶
血素ライブラリーを用いる以外は、記載した手順に従って、ＣＩＳＴＥＭを構築
する。溶血素は、外来性挿入に寛容な分泌細菌ポリペプチドである。したがって
、溶血素遺伝子を用いて、次いで細胞から分泌されるポリペプチドをコードする
外来性遺伝子を運ぶことができる。
【０１３０】 細胞内ＣＩＳＴＥＭについての２つの可能性が図２０に描かれている。両方の
可能性においては、保護的パートナー：パートナー相互作用が細胞内に起こる。
バージョンＡは、代表的なＣＩＳＴＥＭである；ここでは、２つのパートナーは
、細胞表面に輸送される。バージョンＢにおいては、２つのパートナーを細胞表
面へ輸送できず、たとえば、細胞内に蓄積する、および／またはタンパク質分解
経路のための基質となるので、ポジティブな選択が起こる。
【０１３１】 本発明のある具体例を用いて、腫瘍に関連する抗原を同定する。ガン抗原の同
定および単離のためのＣＩＳＴＥＭは、以下のように構築する：先ず、ｃＤＮＡ
ライブラリーを患者の腫瘍細胞から誘導する。細胞の単離およびｃＤＮＡライブ
ラリーの誘導のためのプロトコルは文献に記載されている。腫瘍誘導ｃＤＮＡは
、ＣＩＳＴＥＭ細胞集団の構築におけるインサートとして働く：それらは、ポリ
ペプチドのインプリントドメインに対応する遺伝子部位においてインプリントポ
リペプチドベクターへ挿入される。腫瘍関連ポリペプチドがＣＩＳＴＥＭ細胞集
団によって発現されることを保証するために、ｃＤＮＡは３つの読み取り枠すべ
てに挿入される。ｃＤＮＡをベクターに挿入する方法は当業界で公知である。こ
れらのベクターを用いて、インプリントされたポリペプチドの遺伝子の外来性コ
ピーが欠如している細胞集団を形質転換する。ベクター運搬遺伝子の発現が誘発
されるとき、ＣＩＳＴＥＭ細胞集団内の各クローンは、細胞表面のインプリント
ドメインに融合した１つの腫瘍関連ポリペプチドを呈示する。
【０１３２】 腫瘍抗原の同定のためのＣＩＳＴＥＭにおける標的化合物は、通常、ｃＤＮＡ
ライブラリー源として細胞を用いた同じ患者から単離されたポリクローナル抗体
からなるのが好ましい。換言すると、ｃＤＮＡを供給する腫瘍細胞および標的化
合物を含む抗体が、自己由来であるのが好ましい。ガン患者の血清の採集方法お
よびＣＩＳＴＥＭの標的化合物として用いるポリクローナル抗体の単離方法は、
文献に記載されている。 ＣＩＳＴＥＭ細胞集団と標的抗体をインキュベートした後、選択剤を加える。
インプリントドメインが、自己由来抗体を結合する腫瘍関連ポリペプチドを呈示
するクローンはいずれも、選択剤に関して、そのような結合をもたない細胞とは
異なる状態である。たとえば、結合の場合、これらの細胞は、選択剤から保護さ
れる。逆に、インプリントドメインが、自己由来抗体によって認識されない腫瘍
ポリペプチドを呈示するクローンはいずれも、排除される。したがって、このＣ
ＩＳＴＥＭは、自己由来抗体と特異的に相互作用する腫瘍関連ポリペプチドを同
定する。このようなポリペプチドが免疫原性であり、腫瘍特異的液性および細胞
性免疫を顕在化させることが文献に示されている。
【０１３３】 本発明のある具体例を用いて、ある分子が、可変オリゴペプチドの挿入によっ
て変更されていないインプリントドメインと特異的に相互作用するかどうかを決
定する。前述の操作によって工作されたポリペプチドなどの病原性剤によって受
容体として用いられる外膜ポリペプチドを、本発明のこのような具体例にもちい
ることができる。可変性の高いオリゴペプチドを呈示するようにインプリントポ
リペプチドが工作されていないので、“インプリントドメイン”は存在せず、選
択剤の接着ドメインは、インプリントポリペプチドのどこにあってもよい。前記
の基本的ＣＩＳＴＥＭ細胞集団においては、インプリントポリペプチドは、誘発
可能なプロモーターから発現される。前述の標的ライブラリーの構築法およびＣ
ＩＳＴＥＭの導入法にしたがって、インプリントポリペプチドを発現するように
誘発された細胞集団を標的ライブラリーに曝露する。マイクロタイターウエルま
たは自己分泌ループ法のいずれかを用いて、標的ライブラリー分子の濃度を増加
させる。次いで、基本的ＣＩＳＴＳＭのための手順にしたがって、ＣＩＳＴＥＭ
の選択剤を導入する。標的ライブラリー内の分子がインプリントポリペプチドに
結合し、それによって選択剤による接着を防止する場合のみ、細胞は保護される
。したがって、本発明のこれらの具体例は、インプリントポリペプチドに対する
分子の親和性をアッセイするための容易で簡単な方法を提供する。 したがって、本発明方法が特に適している好ましい分野は、ワクチン、腫瘍、
に用いる新規な抗原、治療的介入のための新規な標的、新規な診断マーカーまた
は治療効率をモニターするために有用な分子の発見および単離である。本発明方
法によって同定，単離および調製された、このような新規生成物もまた本発明の
範疇である。
【０１３４】 別の態様として、本発明は、 ａ）細胞外または細胞内ドメインに対象ポリペプチドをもつ膜ポリペプチド、
および ｂ）選択剤に対して特異的である選択部位 [標的化合物の対象ポリペプチドへの結合に基いて、標的化合物の対象ポリペプ チドへの結合を呈示する細胞の選択部位は、該結合を呈示しない細胞から該結合
を呈示する細胞を選択するために選択剤を用いるという作法によって、変更され
る] をもつ、本発明に用いる細胞／細胞集団に関する。
【０１３５】 また本発明は、本発明の細胞／細胞集団、標的分子（および／または標的化合
物のライブラリー）および１つまたはそれ以上の選択剤を含むキットに関する。
これらのキットは、容易に定義できるプロジェクトのために特に提供され、免疫
学的方法によるガンの治療、非常に変化しやすい病原体による感染からの感染性
疾患の治療といったような医療目的などのために標準化される。
【０１３６】 さらに別の態様として、本発明は、本発明のＣＩＳＴＥＭ法による、新規な医
薬的活性化合物の同定および単離というステップを特徴とし、緩衝物質、安定剤
、アジュバントといったような医薬的に許容しうる補助成分を付加し、医薬調製
品を完成する、医薬調製品を製造する方法に関する。単離された化合物の新規性
は、の単離された化合物の構造データ（アミノ酸または核酸配列、化学式、ＮＭ
Ｒ（または他の分光学的データ）など）を、公知化合物のデータベースと比較す
ることによって容易に決定することができる。 以下の実施例および添付の図面によって本発明をさらに詳しく説明するが、半
発明はそれらに制限されるものではない。
【０１３７】 （実施例） ｉ．実施例１：大腸菌ＯｍｐＡ／コリファージ／ｍＡｂＴ７ＣＩＳＴＥＭ ａ）大腸菌外膜タンパク質Ａ 大腸菌外膜タンパク質Ａは、４つの細胞外ドメイン、３つの周縁細胞質ループ
および約１５０残基の周縁細胞質カルボキシ末端部分をもつアミノ末端８ストラ
ンドβバレルを含む３２５残基のポリペプチドである（図３）（Freudl、１９８
９；Moronaら、１９８５）。βバレルコンホーメーションは、非常に安定であり
、強い界面活性剤中で煮沸することによってのみ変性することができる。天然に
、細胞当たり約２〜３×１０5コピー存在するＯｍｐＡは、大腸菌外膜において 最も豊富なタンパク質のひとつである。細菌の進化において広範に保存されたも
のでもある。 本明細書に記載したように、ポリペプチドの細胞外ドメインに対応する部位に
おいてｏｍｐＡ遺伝子に挿入された外来性オリゴヌクレオチドは、該ポリペプチ
ドの部分として正常に翻訳され、外膜におけるポリペプチドの挿入を妨げない。
さらに、これらの外来性遺伝子挿入によってコードされるオリゴペプチドは、細
胞の表面に呈示され、安定な折り畳まれた構造を採用し、酵素、アゴニストまた
はアンタゴニスト活性を示すことができる。
【０１３８】 ｂ）ＣＩＳＴＥＭ選択をテストし、最適化するための細胞集団の構築 ＣＩＳＴＥＭ選択をテストし、最適化するための細胞集団を構築するために、
ポリペプチドの細胞外ループＩＶが、市販のＴ７抗体（ノバジーン）に結合する
Ｔ７タグオリゴペプチド（Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ）を呈示する、プラスミドでコードさ
れたＯｍｐＡのコピーを発現するように、野生型ＯｍｐＡが欠如した大腸菌集団
を工作した。ｐＥＶ２１８（Freudl、１９８９）において、ｌａｃプロモーター
のＩＰＴＧ誘発可能な制御下にある、ｏｍｐＡ遺伝子は、ポリペプチドの細胞外
ループＩＶに対応する遺伝子領域における制限エンドヌクレアーゼ部位において
リッチなポリリンカーを運ぶように工作されている（図９）。このプラスミドを
、ＳａｃＩ（ニューイングランド・バイオラブズから酵素および反応緩衝液を入
手）およびＸｂａＩ（ＭＢＩファーメンタスから酵素および反応緩衝液を入手）
によって消化し、制限酵素によって置いていかれた付着末端をもつ制限部位ポリ
リンカーと直線化プラスミドのフラグメントを得た。標準的ゲル電気泳動によっ
て付着末端をもつ直線化プラスミドを単離した。２つの一本鎖オリゴヌクレオチ
ドを、慣例の技術によって以下の配列で合成した（注文のオリゴヌクレオチドが
、商業的実験室から入手可能であり、一本鎖オリゴヌクレオチドの合成方法は、
通例用いられ、文献に記載ているものである）： オリゴヌクレオチド１： ５’−ＣＧ［ＡＴＧＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＡＡＡＴＧ
ＧＧＴ］−３’ オリゴヌクレオチド２： ５’−ＣＴＡＧ［ＡＣＣＣＡＴＴＴＧＣＴＧＴＣＣＡＣＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＡ
ＧＣＣＡＴ］ＣＧＡＧＣＴ−３’ カッコ内の配列は、Ｔ７遺伝子配列を含む。これらの２つの一本鎖オリゴヌク
レオチドをクレノー反応緩衝液（ＭＢＩカタログ）中でアニーリングしてｐＥＶ
２１８の付着末端に相補的な付着末端をもつ二本鎖Ｔ７タグ遺伝子を形成し、先
のパラグラフで述べたようにＳａｃＩおよびＸｂａＩによって直線化した。二本
鎖オリゴヌクレオチドを直線化プラスミドにライゲートするときに（ＭＢＩファ
ーメンタスライゲーション緩衝液）、Ｔ７タグ遺伝子がｐＥＶ２１８上のｏｍｐ
Ａ遺伝子をもつフレーム内に入った。新規構築物をｐＥＶ２１８Ｔ７と呼ぶ。 前に詳述した通例の形質転換方法にしたがって、プラスミドｐＥＶ２１８Ｔ７
を用いて大腸菌株ＵＨ２０３の集団の形質転換を行った（ｌａｃ、ｓｕｐＦ、ｏ
ｍｐＡ、ｒｅｃＡ、ｐｒｏＡＢ、ｒｐｓＬ）（Freudl、１９８９）。
【０１３９】 ｃ）コリファージによるＣＩＣＴＥＭ選択の予備的最適化 コリファージＫ３は、ＯｍｐＡのループＩ、ＩＩおよびＩＩＩに結合すること
によって大腸菌に侵入する。ループＩＶは、ファージによって用いられず、事実
、ループＩＶにおける外来性オリゴペプチドは、細胞のＫ３感染性に影響を及ぼ
さない（Ｋ３接着ドメインを図３に示す；バクテリオファージについては、本明
細書に簡単にレビューしており、バクテリオファージＫ３ならびにその受容体に
ついては、Freudl、１９８９およびMoronaら、１９８５に記載されている）。次
の手順は、２つの目的を満たすために行った：ａ）インプリントポリペプチドが
標的化合物を結合する細胞は、Ｋ３の攻撃から保護され、インプリントポリペプ
チドが標的を結合することができない細胞は、ファージによって排除されるとい
うことを決定的に実証すること、およびｂ）ＣＩＳＴＥＭ細胞集団とＫ３とのイ
ンキュベーションの継続時間の予備的最適化を達成すること。この実験の原理を
図１４に示す。
【０１４０】 カナマイシン耐性、ｏｍｐＡ野生型菌株である大腸菌ＭＣ４００（ｐＥＧＦＰ
−Ｎ１）（本明細書においては、“Untagged”の意味でＵと称する）を、２５μ
gのカナマイシン／ｍｌを補足したルリアブロス（ＬＢ）中で一夜培養した。大 腸菌ＵＨ２０３（ｐＥＶ２１８Ｔ７）（本明細書においては、“Tagged”の意味
でＴと称する）は、本明細書に記載したように、Ｔ７タグ配列をポリペプチドの
第４ループにもつＯｍｐＡをコードするプラスミドによって形質転換されている
、アンピシリン耐性、ｏｍｐ-菌株である。ｐＥＶ２１８Ｔ７の発現を誘発する ために、この菌株を、アンピシリン１００μg／ｍｌおよび５ｍＭのＩＰＴＧを 補足したＬＢ中で一夜培養した。各一夜培養物をＯＤ600＝０．００１になるま でＬＢで希釈した。２つの混合集団を作成するために、Ｕ培養物の５０μｌのア
リコートをＴ培養物の５０μｌのアリコートに組み合わせた。１つの混合集団は
２０μｌのＰＢＳのみを加えて３７℃にて２０分間インキュベートし、もう１つ
の集団は２０μｌのＰＢＳおよび０．１μgの抗Ｔ７タグｍＡｂ（ノバジーン ｍ
ＡｂＴ７）を加えて同条件下にてインキュベートした。（表４において、ｍＡｂ
Ｔ７の存在または不在は、＋と−で示す。）次いで、感染多重度（ＭｏＩ）＝１
０にて、１ｍｌのＬＢで希釈したファージＫ３を各混合集団に導入した。（Ｔ偶
数ファージの調製のための慣例の方法によって、ファージストックを調製した（
Calendar、１９８８）。）表４に示す指定の時点、すなわち、ファージの導入直
前（表中、Ｔ＝０，ファージ−）、ファージの導入直後（表中、Ｔ＝０，ファー
ジ＋）、ならびにファージ導入後２分、１０分、３０分、６０分、９０分、１２
０分、１８０分および２４０分の時点で、サンプルアリコート１００μｌを各集
団から取り出した。１００μgのアンピシリン／ｍｌを補足したＬＢプレートお よび２５μgのカナマイシン／ｍｌを補足したＬＢプレートにアリコートを植え た。３７℃にて一夜インキュベートした後、コロニーを計数した。
【０１４１】 この実験の結果から、ＯｍｐＡのループＩＶにおけるｍＡｂＴ７とＴ７タグの
間の相互作用が細胞をＫ３から保護することが実証された。この結論を表５に簡
潔にまとめている。ＯｍｐＡのループＩＶにＴ７タグを呈示している細胞は、フ
ァージＫ３から保護され、この保護は、細胞とｍＡｂＴ７のインキュベーション
に従属する。ｍＡｂＴ７の有無にかかわらず、ＯｍｐＡ−Ｔ７融合体よりもむし
ろ野生型ＯｍｐＡを発現する細胞が、ファージＫ３に対して感染性であった。し
たがって、インプリントドメインが標的化合物を結合する細胞はＫ３の攻撃から
保護され、インプリントドメインが標的化合物を結合することができない細胞は
ファージによって排除される。 この実験は、ファージＫ３によるＣＩＳＴＥＭ選択の予備的最適化でもある。
表４および図１５に示されるように、ｍＡｂＴ７とインキュベートされたＵおよ
びＴ細胞の混合集団においては、Ｕ細胞は、ファージＫ３との３０分間のインキ
ュベーション後、完全に排除された。反対に、Ｔ細胞は、ファージと３０分以上
インキュベートしても概ね安定した集団が維持された。このことは、ＭｏＩ＝１
０で出発した場合、標的を結合することができない細胞すべてを排除するための
最小時間が３０〜６０分であることを示唆した。
【０１４２】 Ｔ細胞における初期の急激な落下およびそれに続く突然の安定化（図１５参照
）は、Ｔ７タグとの結合において抗体は、ファージ導入時にただちには平衡にな
らないことを示唆した。抗体とのプレインキュベーションは、継続時間２０分で
あり、Ｔ細胞の完全な保護は、ファージ導入後約３０分の時点で明らかに達成さ
れ、抗体がタグとの結合において平衡になるのに必要な時間が、約５０分である
ことを示唆している。この示唆は、以下に記載する細胞集団と標的とのインキュ
ベーション継続時間の予備的最適化によって確認された。 菌株ＵおよびＴを上記と同条件下で一夜培養する。Ｕ培養物の５０μｌのアリ
コート（ＯＤ600＝０．００１）をＴ培養物の５０μｌのアリコート（ＯＤ600＝
０．００１）に組み合わせることにより、それぞれ５つのＵおよびＴ細胞混合集
団を作成した。表６および図１６に示すように、各混合集団を、ＰＢＳで希釈し
た７ｎＭのｍＡｂＴ７とともに３７℃にて、種々の時間インキュベートした：１
分；１０分；２０分；３０分；または６０分。ＬＢで希釈して１ｍｌ、ＭｏＩ＝
１０にしたファージＫ３ストックを、抗体と集団をインキュベートした直後に、
各混合細胞集団に加えた。各集団をファージとともに３０分インキュベートした
。ついで、アリコートを作成し、前述のように、それらのＵおよびＴ細胞の組成
を決定した。表６に示されるように、ｍＡｂＴ７とのインキュベーション継続時
間にかかわらず、野生型のＯｍｐＡを提示してる細胞は、ファージから保護され
ないままであった。反対に、ＯｍｐＡのループＩＶにＴ７タグを呈示している細
胞は、インキュベーション継続時間が長くなるにつれて増加する抗体からの保護
を受けた。ファージＫ３インキュベーションの予備的最適化の結果（上記）から
予測されるように、インキュベーション時間が３０分〜６０分の間である場合に
のみ、抗体はＴ細胞に完全な保護を付与した。
【０１４３】 ｄ）ＣＩＳＴＥＭ選択の初期テスト ｍＡｂＴ７とのインキュベーション時間およびＫ３選択の継続時間の予備的単
一パラメーター最適化によって、ＣＩＳＴＥＭの能力の初期テストが、インプリ
ントポリペプチドが標的を結合することができない細胞のバックグラウンドから
、インプリントポリペプチドが標的を結合する希少細胞を選択することができる
ようになる。 大腸菌菌株Ｕ（Untagged）およびＴ（Tagged）は、前述のとおりである。Ｕは
、２５μgのカナマイシン／ｍｌを補足したＬＢ中で一夜培養した。Ｔは、ポリ ペプチドのループＩＶにＴ７をもつＯｍｐＡをコードするプラスミドであるｐＥ
Ｖ２１８Ｔ７を誘発するために、１００μgのアンピシリン／ｍｌおよび１ｍＭ のＩＰＴＧを補足したＬＢ中で、一夜培養した。各一夜培養物をＯＤ600＝０． ００５になるまでＬＢで希釈した。混合集団を作成するために、Ｕ培養物の５０
μｌのアリコートをＴ培養物の５０μｌのアリコートに組み合わせた。表７に示
すように、混合集団は、ＵおよびＴ培養物の等しいサイズのアリコートで作成さ
れたけれども、その組成はＵ細胞が優勢であった。この理由は、おそらく、標準
的培養条件下で、Ｔ菌株（１ｍＭのＩＰＴＧのみを用いた）において誘発された
非常に低いレベルのＯｍｐＡの発現が、この菌株の生存率をＵ菌株よりも極めて
低下させるということであった。混合集団を、ＰＢＳで希釈した（前述）６８ｎ
ＭのｍＡｂＴ７とともに３７℃にて６０分インキュベートした。インキュベート
に続いて、１００μｌのアリコートの細胞集団を、２５μgのカナマイシン／ｍ ｌまたは１００μgのアンピシリン／ｍｌを補足したＬＢプレートに植えた。一 夜成長させた後、コロニーを計数すると、集団は、１２０個のＵ細胞毎に１つの
Ｔ細胞からなることがわかった（表７）。次いで、ＬＢで希釈したファージＫ３
ストックを、ＭｏＩ＝２にて、総体積が１ｍｌとなるように、細胞集団に加えた
。細胞をファージとともに３７℃にて１２０分インキュベートした。ファージと
のインキュベーション後、２５μgのアリコートの細胞集団を、２５μgのカナマ
イシン／ｍｌまたは１００μgのアンピシリン／ｍｌを補足したＬＢプレートに 植えた。一夜成長させた後、コロニーを計数した。
【０１４４】 表７に示すように、ｍＡｂＴ７なしてＰＢＳを加える、および／またはファー
ジＫ３なしでＬＢを加える以外は、同じプロトコルにしたがって、対照実験を行
った。表７に示す結果から、標的を結合するインプリントドメインを呈示する希
少細胞（１ ｉｎ＞１００）は、ファージＫ３から完全に保護されるが、標的を 結合することができないすべての細胞は、集団からすばやく排除されることが実
証された。 標的を結合することができない非常に過剰な細胞から、標的を結合する希少細
胞を選択することにおけるＣＩＳＴＥＭの感受性の系統的テストを以下のように
行った。大腸菌の菌株Ｕ（Untagged）およびＴ（Tagged）の一夜培養については
前述している。ＵおよびＴの一夜培養物の５０μｌ〜１ｍｌのアリコートを合わ
せて、それぞれＵ細胞およびＴ細胞の比率が異なる４つの集団を作成した：１０ 8 Ｕおよび１０4Ｔ；１０8Ｕおよび１０3Ｔ；１０8Ｕおよび１０2Ｔ；および１０ 9 Ｕおよび１０2Ｔ。各集団を１０ｎＭのｍＡｂＴ７とともに３７℃にて６０分イ
ンキュベートする。集団の組成（すなわち、ＵおよびＴ細胞の数）をモニターす
るために、３０分毎（すなわち、３０分、６０分）に、５μｌのアリコートを２
つ取りだし、１つは１００μgのアンピシリン／ｍｌを補足したＬＢプレートに 植え、他方は、２５μgのカナマイシン／ｍｌを補足したＬＢプレートに植えた 。次いで、プレートを一夜インキュベートし、集団の組成を決定するためにコロ
ニーを計数した。６０分の時点でのアリコートを取り出した直後に、バクテリオ
ファージＫ３（前述）をＭｏＩ＝２にて細胞集団に導入する。混合物を３７℃で
１８０分インキュベートする。再度、集団組成をモニターするために、２０分毎
に５μｌのサンプルアリコートをマイクロピペットで取り出し、前述のように、
プレートに植付け、成長させ、次いでＵおよびＴ細胞の数を計数する。ファージ
とともにインキュベーションした後、約１０００個の細胞のサンプルを取り出し
、前述のように、プレートに植付け、成長させ、次いでその組成を決定する。
【０１４５】 標的を結合することができない少なくとも１００倍多い細胞のバックグラウン
ドから、標的化合物を結合する希少細胞を選択するＣＩＳＴＥＭの能力の実証に
よって、ＣＩＳＴＥＭ性能の最終的な２パラメーター最適化を行う。５つのＴ集
団それぞれを、培地中の濃度が異なるＩＰＴＧによって、１５分間誘発する：０
ｍＭ；０．２５ｍＭ；０．５ｍＭ；１．０ｍＭ；または２．０ｍＭ。前述のアリ
コート組合せ方法によって、それぞれ異なるレベルのＴ細胞の誘発を呈示してい
る１０5Ｕおよび１０3Ｔの５つの集団を作成する。各集団に１０ｎＭのｍＡｂＴ
７を加え、集団を３７℃にて６０分間インキュベートする。６０分間のインキュ
ベーション中、前述のように、５μｌのサンプルアリコートを２０分毎に取り出
し、プレートに植え付け、成長させ、次いでＵおよびＴ細胞の数を計数すること
によって集団の組成をモニターする。６０分の時点でアリコートを取り出した後
、コリファージＫ３をＭｏＩ＝２で導入する。次の１８０分にわたって、２０分
毎に５μｌのアリコートをサンプリングすることによって集団をモニターする。
最少数のＴ細胞の付随的排除をともなって、すべてのＵ細胞が排除される[ＩＰ ＴＧ]およびＫ３とのインキュベーション継続時間が、ＣＩＳＴＥＭに用いるた めの最適パラメーター値である。 ここで述べた最適化試行によって、ＣＩＳＴＥＭが、排除する高親和性細胞を
できるだけ少くすると同時に、標的を結合することができないすべての細胞を破
壊するようにさせるパラメーター値（[ＩＰＴＧ]、Ｋ３とのインキュベーション
継続時間、[ｍＡｂＴ７]）が提供される。
【０１４６】 ｅ）ＯｍｐＡインプリンティングＣＩＳＴＥＭ細胞集団の構築 ＯｍｐＡプラスミドｐＥＶ２１８（前述；図９参照；Freudl、１９８９によっ
て記載された構築）は、ポリペプチドの細胞外ループＩＶに対応する遺伝子領域
に制限酵素部位が豊富なポリリンカーをもっている。このプラスミドを、使用説
明書に従って、ＳａｃＩ（ニュー・イングランド・バイオラブズから得た酵素お
よび反応緩衝液）およびＸｂａＩ（ＭＢＩファーメンタスから得た酵素および反
応緩衝液）で消化して制限部位ポリリンカーのフラグメントおよび直線化された
プラスミドを得る。標準的ゲル電気泳動により、直線化プラスミドを単離する。
５’ＮＮＧＧＴＣＴＡＧＡ（ＶＮＮ）20ＣＧＡＧＣＴＣＮＮ３’という１０6個 の別個の一本鎖オリゴヌクレオチドを慣例のテクノロジーによって合成する（こ
こで、Ｎは、それぞれ等しい確率で４種のヌクレオチドすべてを意味し；Ｖは、
それぞれ等しい確率でＣ、ＧまたはＡを意味する）。 （大腸菌ＵＨ２０３は、ｓｕｐＦであり、ＵＡＧ終止コドンを翻訳することが可
能である。したがって、ＯｍｐＡベクター（ｐＥＶ２１８）に挿入された可変オ
リゴヌクレオチドは、ＵＡＧではなくて、終止コドンＵＡＡおよびＵＧＡを含ま
ないことが必要である。）文献（Brown、１９９２）に記載された標準的プロト コルを用い、５’プライマーおよびプルーフリーディングポリメラーゼ（Ｖｅｎ
ｔポリメラーゼなど）を用いて、一本鎖テンプレート−から二本鎖オリゴヌクレ
オチドを作成する。次いで、これらの二本鎖で可変性の高いオリゴヌクレオチド
を、使用説明書に従って（それぞれ、ニュー・イングランド・バイオラブズおよ
びＭＢＩファーメンタス）、ＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化して、非相補的付着
末端をもつ可変性の高いオリゴヌクレオチドを得る。次いで、可変性の高いオリ
ゴヌクレオチドを、先のパラグラフで直線化されたプラスミドｐＥＶ２１８にラ
イゲートする（使用説明書に従って、ＭＢＩライゲーション緩衝液）。ＳａｃＩ
およびＸｂａＩの付着末端は、非相補的なので、それらはプラスミドあたり唯１
つのオリゴヌクレオチドにおいて、および唯一つの配向において、ライゲートす
る。慣例の電気泳動サイズ分画により、インサートを含むライゲートされたプラ
スミドを単離する。この方法の産物は、ＯｍｐＡのループＩＶに対応する遺伝子
部位に、ＴＡＡおよびＴＧＡ終止コドンを含まない可変性の高い外来性配列をも
っているプラスミド（集合的にｐＥＶ２１８Ｉと呼ばれる）の集団である。 可変プラスミド集団ｐＥＶ２１８Ｉを用いて、大腸菌株ＵＨ２０３（ｌａｃ、
ｓｕｐＦ、ｏｍｐＡ、ｒｅｃＡ、ｐｒｏＡＢ、ｒｐｓＬ）を形質転換する（この
菌株、その増殖およびその形質転換は、前記およびFreudl、１９８９にさらに完
全に記載されている）。アンピシリン１００μg／ｍｌを補足したルリアブロス 中でＵＨ２０３集団を成長させ、１０6個のクローン(それぞれｐＥＶ２１８Ｉ集
団の別個のメンバーをもつ)を含む１０8個の細胞からなる集団を得る。
【０１４７】 ｆ）ｍＡｂＴ７に対して高い親和性を呈示するＯｍｐＡに対するＣＩＳＴＥＭ
選択 前記の最適化試行で決定したように、１０8個のＵＨ２０３（ｐＥＶ２１８Ｉ ）細胞集団＋約１００個のＵＨ２０３（ｐＥＶ２１８Ｔ７）細胞を、１００μｇ
のアンピシリン／ｍｌおよび０．２５〜２．０ｍＭのＩＰＴＧを補足したＬＢ倍
地中、３７℃で１５分間インキュベートする。これによって、ＯｍｐＡのループ
ＩＶにそれぞれ別個の外来性オリゴペプチド配列を呈示する１０6個の別個のク ローンを含む１０8個の細胞からなる集団が得られる。これらのクローンの１つ は、Ｔ７タグ配列を呈示する。最初の１５分間のｐＥＶ２１８Ｉ／ｐＥＶ２１８
Ｔ７発現誘発の後、１０ｎＭのｍＡｂＴ７を１００ｍｌの細胞に加える。細胞を
ｍＡｂとともに３７℃にて６０分インキュベートする。次いで、コリファージＫ
３をＭｏＩ＝２で導入する（Ｋ３の増殖および処理の手順は、前記およびFreudl
、１９８９、１２６およびMoronaら、１９８５）。Ｋ３とのインキュベーション
は、前記最適化試行で決定された必要最小限の時間で行う。ファージとのインキ
ュベーションに続いて、ファージおよび溶菌産物から細胞を分離するために遠心
分離を行い、Ｋ３による感染の完全な停止を保証するために、１００ｍＭのＮａ
Ｃｌサプリメントを含まないＮＢ１００ｍｌに細胞を懸濁する。この細胞集団は
、標的化合物ｍＡｂＴ７についてＣＩＳＴＥＭによって選択された一組のクロー
ンを意味する。 選択されたクローンの数を増やすために、選択された細胞集団を、１００ｍｌ
のＮＢ中、３７℃にて１０6個の細胞に成長させる。次いで、２．５ｍＭのＩＰ ＴＧによって１５分間ＯｍｐＡの発現を誘発する。誘発後、選択された集団から
の１０4個の細胞を、０．５％デオキシコール酸ナトリウムを含むＮＢ寒天に植 付ける。（デオキシコール酸ナトリウムは、外膜にＯｍｐＡを挿入する混合物と
ができない細胞の成長を妨げる；このような細胞は、それらのＯｍｐＡのループ
ＩＶのｍＡｂＴ７を結合する能力によってではなく、単にＯｍｐＡを呈示しない
のでＣＩＳＴＥＭによって選択された“偽ポジティブ”である。デオキシコール
酸ナトリウム補足は、Ｋ３の感染も妨げ、継続感染に対するさらなる保証を提供
する。）ＯｍｐＡのループＩＶが標的化合物に対する高い親和性をもつ外来性オ
リゴペプチドを含む細胞で構成されるコロニーが形成されるまで、植え付けた細
胞を３７℃にてインキュベートする。
【０１４８】 ｉｉ．実施例２：大腸菌ＯｍｐＡ／コリファージＫ３／ナイセリア・メニンギチ
ジス抗体ＣＩＳＴＥＭ ａ）大腸菌外膜タンパク質ＡおよびナイセリアＯｐａタンパク質 幾つかの最近の研究結果によると、ポリペプチドのこのような高レベルの発現
および進化における保存を説明するＯｍｐＡのひとつの重要な機能は、宿主組織
への接着および侵入である。大腸菌ＯｍｐＡが、新生児の大腸菌髄膜炎の病気の
発生における危険な段階である、脳微小血管内皮細胞への侵入に深く寄与するこ
とが最近実証されている。同様に、ＯｍｐＡの相同体は、微生物の接着、宿主細
胞へ侵入およびヘモフィルス・インフルエンザ、ナイセリア・メニンギチジス、
ナイセリア・ゴノロエアおよびその他の毒性微生物による病気の発生に直接関連
する。ＯｍｐＡと広範囲な抗原性アドヘシンの間の構造的相同性によって、Ｏｍ
ｐＡは、相同的アドヘシンの擬態を必要とする適用における使用のためのインプ
リンティングに非常に適したものになる。このような適用の１つは、予防接種で
ある。ポリペプチド（この場合、ＯｍｐＡ）が、抗原に対して活性化された血清
を構成する抗体に結合するようにインプリントされる場合、インプリントされた
ポリペプチドは、抗原によって引き起こされた免疫応答に非常に類似した応答を
顕在化する（Folgoriら、１９９４）。ナイセリア・メニンギチジスＯｐａタン パク質（Olyhoekら、１９９１）を擬態するように、大腸菌ＯｍｐＡをインプリ ントするためのＣＩＳＴＥＭにおける標的化合物として用いるのに適した抗体は
、すべてのＯｐａタンパク質と反応するｍＡｂ Ｂ３３、Ｏｐａタンパク質の広 いサブセットと反応するｍＡｂｓ Ｐ３２２およびｐ５１４、およびｍＡｂ Ｂ３
０６ならびに文献に記載されたその他などである。
【０１４９】 ｂ）ナイセリア・メニンギチジスＯｐａタンパク質に対する抗体について高い
親和性を示すＯｍｐＡのためのＣＩＳＴＥＭ選択 ＣＩＳＴＥＭ選択をテストし、最適化するための細胞集団の構築、ＣＩＳＴＥ
Ｍ機能の最適化ならびに実証、およびＯｍｐＡインプリンティングＣＩＳＴＥＭ
細胞集団の構築を正確に前述にしたがって行う：実施例１で述べたＣＩＳＴＥＭ
のように、このＣＩＳＴＥＭは、ＯｍｐＡのループＩＶに長さ２０アミノ酸の可
変インサートを呈示している細胞集団から選択するためにファージＫ３を使用す
る。しかし、実施例１は、ｍＡｂＴ７に結合するようにＯｍｐＡをインプリント
するが、このＣＩＳＴＥＭは、ナイセリア・メニンギチジスＯｐａタンパク質に
対する抗体に結合するようにＯｍｐＡをインプリントする。したがって、実施例
１のｆで記載したプロトコルは、１０ｎＭのｍＡｂＴ７を要求するが、このＣＩ
ＳＴＥＭは、それぞれ１０ｎＭの以下の抗体を要求する：Ｂ３３；Ｐ３２２；Ｐ
５１４；Ｂ３０６；およびＡ２２２／５ｂ。この置換を除いては、抗Ｏｐａ抗体
を結合するようにＯｍｐＡをインプリントするためのプロトコルは、実施例１の
ｆの記載と同様である。
【０１５０】 iii．実施例３：ＣＩＳＴＥＭ選択の変遷のモニタリング 標的化合物を結合することができない細胞は排除されるが、標的化合物を結合
する細胞は特異的に選択されるプロセスをモニターするために、次の実験を行う
。大腸菌株Ｕ（Untagged）およびＴ（Tagged）は前述のとおりである（実施例１
）。Ｕは、２５μｇのカナマイシン／ｍｌを補足したＬＢ培地中で一夜培養する
。Ｔは、成熟ポリペプチドの細胞外ループＩＶにＴ７タグをもつＯｍｐＡをコー
ドするプラスミドであるｐＥＶ２１８Ｔ７の発現を誘発するために、１００μｇ
のアンピシリン／ｍｌおよび２ｍＭのＩＰＴＧを補足したＬＢ培地中で一夜培養
する。各一夜培養物をＬＢで希釈してＯＤ600＝０．００５にする。それぞれ３ つの混合集団を作成するために、Ｔ細胞：Ｕ細胞の比率が約１：２００である細
胞集団を構成するように、２つの培養物のアリコートを合わせる。サンプルアリ
コートを集団から取り出し、１００μｇのアンピシリン／ｍｌを補足したＬＢプ
レートおよび２５μｇのカナマイシン／ｍｌを補足したＬＢプレートに植え込む
。一夜インキュベートした後、コロニーを計数すると、Ｔ細胞とＵ細胞の比率は
、約１Ｔ：１９０Ｕであった（表８、ｔ＝−６０）。３つの混合集団のうち２つ
をｍＡＢなしで３７℃にて６０分インキュベートし、３つめの集団を同条件下で
６８ｎＭのｍＡｂＴ７を加えてインキュベートした（前述）。（表８では、ｍＡ
ｂの有無は、それぞれ＋または−で示す。）インキュベーションの１時間後（す
なわち、表Ａ１におけるｔ＝０の時点）、３つの混合集団のうち２つにファージ
Ｋ３を感染多重度６にて導入した。（表８では、ファージＫ３の有無は、それぞ
れ＋または−で示す。）次の１８０分間にわたって、表８に示した時点、すなわ
ち、ファージ添加直前、次いでその後は１５分毎にサンプルアリコートを集団か
ら取り出した。アリコートを用いてファージ力値を評価し、ＵおよびＴ細胞の数
を決定するために、適当な抗生物質を含むプレートに植え込んだ。
【０１５１】 図１７は、ファージ力値の変遷およびＣＩＳＴＥＭ選択の過程におけるＭｏＩ
を示す。図１８は、ＣＩＳＴＥＭ選択中の細胞成長および死の変遷を示す。ファ
ージの急速な指数増殖の結果として、ｍＡｂの有無にかかわらず、Ｕ細胞の単調
な減衰がみられる。逆に、ｍＡｂＴ７の存在下では、Ｔ細胞は、非常に高いＭｏ
Ｉから保護され、その結果として、それらは数が増える。したがって、抗体およ
びＯｍｐＡループＩＶに呈示されたエピトープ間の特異的相互作用の結果として
、エピトープを呈示する細胞が選択され、エピトープを呈示しない細胞が排除さ
れた。この結果を表１９にまとめる。
【０１５２】 ｉｖ：実施例４：ヘルパー細胞の使用によるバックグラウンドの減少 語句“バックグラウンド”は、標的化合物を結合することはできないが、それ
にもかかわらず選択された集団中に残存する細胞を意味するために用いる。一般
に、ＣＩＳＴＥＭが、インプリントドメインが標的化合物を結合することができ
ない細胞を確実に排除し、インプリントドメインが標的化合物を結合する細胞を
選択するために、バックグラウンド細胞の数を最小化することが望ましい。次の
実験は、バックグラウンドを減少するための１つの方策を説明する。ＣＩＳＴＥ
Ｍ細胞集団に、その機能が選択剤の伝播および増幅である“ヘルパー細胞”を補
足する。この選択剤の増幅が、選択の強度を増大し、それによって残留バックグ
ラウンド細胞が減少される。ヘルパー細胞は、ＣＩＳＴＥＭ細胞集団の残りに存
在する選択可能なマーカーを欠いている；このことによって、ヘルパー細胞は、
選択剤の増幅という目的を果たした後、効率よく排除される。
【０１５３】 ＵＨ２０３（ｐＥＶ２１８Ｔ７）、すなわち“Ｔ”菌株を、１００μｇのアン
ピシリンおよび１ｍＭのＩＰＴＧを補足したＬＢ中で一夜培養して、ｏｍｐＡプ
ラスミドの発現を誘発する。ＯｍｐＡのループＩＶにＴ７エピトープを呈示しな
いバックグラウンド菌株、ＵＨＦ１（ｐＥＶ２１８）を用いた。ＵＨＦ１は、ク
ロラムフェニコール耐性遺伝子を持つこと以外は、ＵＨ２０３と実質的に同質遺
伝子型である。プラスミドｐＥＶ２１８は、Ｔ７タグの遺伝子の位置に制限酵素
部位ポリリンカーを持つこと以外は、ｐＥＶ２１８Ｔ７と同一である。ＵＨＦ１
（ｐＥＶ２１８）、すなわち“Ｕ”菌株を、１００μｇのアンピシリンおよび１
ｍＭのＩＰＴＧを補足したＬＢ中で一夜培養して、ｐＥＶ２１８の発現を誘発す
る。３つの混合集団を作成するために、Ｔ細胞：Ｕ細胞の比率が約１：１００で
ある細胞集団を構成するように、ＴおよびＵ菌株のアリコートを合わせる（表９
）。ヘルパー細胞として、ＭＣ４１００（ｐＥＧＦＰＮ１）を用いた。ＯＤ600 ＝０．５の１００μｌのＭＣ４１００（ｐＥＧＦＰＮ１）を２つの混合集団に加
えた。他の２つの混合集団にはヘルパー細胞を加えなかった。１つのヘルパー細
胞を加えた集団および１つのヘルパー細胞を加えない細胞は、６８０ｎＭのｍＡ
ｂＴ７とともに３７℃で１時間インキュベートし、他の２つの集団は、抗体なし
で同条件下でインキュベートした。インキュベーション後(すなわち、表９にお けるｔ＝０の時点)、ファージＫ３をＭｏＩ＝２ですべての集団に加える。次い で、すべての集団を２時間インキュベートした。アリコートを取り出し、アンピ
シリン単独、またはアンピシリンとクロラムフェニコールを補足した寒天に植え
込む。ＣＩＳＴＥＭ選択の最後におけるＵおよびＴ細胞の数を表Ｂ１に示す。Ｕ
細胞数／（Ｕ細胞数＋Ｔ細胞数）で定義されるバックグラウンド集団は、ヘルパ
ー細胞がない場合３４％であるが、１００μｌのヘルパー細胞をＯＤ600にて加 えると１６％へと減少する。したがって、この実験は、ヘルパー細胞の原理を明
らかにする：それらをＣＩＳＴＥＭ細胞集団に加えると選択剤の活性が変更され
る。
【０１５４】 ｖ．実施例５：ＣＩＳＴＥＭの感受性 ＣＩＳＴＥＭ選択の感受性を解明するために以下の実験を行った。Ｔ細胞と呼
ぶ大腸菌株ＵＨ２０３（ｐＥＶ２１８Ｔ７）およびＵ細胞と呼ぶＵＨＦ１（ｐＥ
Ｖ２１８）を、１ｍＭのＩＰＴＧとともに一夜培養してｏｍｐＡプラスミドの発
現を誘発した。混合集団を作成するために、Ｔ培養物を１０、１００、１０００
または１００００倍に希釈し、次いでＵ培養物の未希釈アリコートを合わせて、
表１０に示すＴ：Ｕの比率の集団を構成した。前の実施例の記載にしたがってヘ
ルパー細胞を加えた。Ｔ細胞の連続希釈物からなる一組の５個の混合集団（表１
０参照）を、３４０ｎＭのｍＡｂＴ７とともに３７℃にて１時間インキュベート
した。５個の混合集団二組（Ｔ細胞の連続希釈物二組からなる合計１０個の集団
）を、抗体が無いこと以外は上記と同条件下でインキュベートした。インキュベ
ーション後すぐに、抗体とともにインキュベートした一組の５個の混合集団およ
び抗体なしでインキュベートした二組の５個の集団のうちのひとつにＫ３ファー
ジを加えた。表１０においては、抗体またはファージが存在する場合を＋で、存
在しない場合を−で示す。前述したように、２時間のインキュベーション後、各
集団からのアリコートを適当な抗生物質を含む寒天に植え込む。一夜培養後、コ
ロニーを計数して、ＣＩＳＴＥＭ細胞集団の組成を決定した。 表１０は、最終的な細胞の数のみならず、Ｕ細胞のバックグラウンドからＴ細
胞を選択することにおけるＣＩＳＴＥＭの能力の幾つかの指針を示す。標的化合
物を結合するクローンを増殖するが、結合しない細胞を排除することについての
選択システムの能力の指針であるエンリッチメントは、選択後の（Ｔ細胞数／Ｕ
細胞数）／選択前の（Ｔ細胞数／Ｕ細胞数）として定義される。ＣＩＳＴＥＭに
よって首尾よく選択される、標的化合物を結合するすべての細胞の割合の指針で
ある収率は、Ｋ３−集団中のＴ細胞の数を、Ｋ３＋、ｍＡｂ＋集団中のＴ細胞の
数と比較することによって評価される。収率は、Ｋ３＋、ｍＡｂ＋の（Ｔ細胞数
）／Ｋ３−の（Ｔ細胞数）として定義される。
【０１５５】 ｖｉ．実施例６：ｍＡｂＴ７によって認識されたエピトープのマッピング ＣＩＳＴＥＭの１つの適用は、タンパク質−タンパク質相互作用に関連するエ
ピトープをマッピングすることである。この適用を説明するために、ＣＩＳＴＥ
Ｍを用いて、Ｔ７ポリメラーゼ特異的ｍＡｂＴ７（前述）によって認識されるフ
ァージＴ７ポリメラーゼエピトープを呈示する細胞を選択する。プラスミドｐＥ
Ｔ１７ｘｂ（ノバジーン）は、ファージＴ７ポリメラーゼの全遺伝子を含む。こ
のプラスミドを、使用説明書に従って、ミクロコッカスヌクレアーゼによって消
化して約５０塩基対（ｂｐ）から３００塩基対の大きさのフラグメントを得た。
長さが６０〜７５ｂｐのフラグメントに対応するバンドを剃刀で切断し、フラグ
メントを再懸濁した。フラグメントをＳ１ヌクレアーゼ（使用説明書に従って）
で処理してミクロコッカスヌクレアーゼによって残された３’リン酸末端を除去
した。次いで、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによって、フラグメントをリン酸
化した。ｏｍｐＡプラスミドｐＥＶ２１８（前述）を、制限酵素Ｅｃｌ１３６Ｉ
ＩおよびＳａｌＩによって（使用説明書に従って）、成熟ポリペプチドの第４細
胞外ループに対応する遺伝子領域中のユニーク部位において切断した。直線化し
たベクターをウシ腸ホスファターゼによって脱リン酸化した。１００ｎｇの直線
化ベクターと２０ｎｇのフラグメントを合わせ、Ｔ４リガーゼを用いる標準的平
滑末端ライゲーションによって、フラグメントを直線化ベクターにライゲートし
た。ライゲーション緩衝液にＰＥＧを加えて環化を補助する。フラグメントの挿
入なしのベクターの環化は、ＳａｌＩ部位を作成する。したがって、ライゲーシ
ョン産物をＳａｌＩで処理してフラグメントを含まないベクターを直線化した。
フラグメントを含む環化ベクターを電気泳動によって単離し、高度にコンピテン
トな市販の菌株ＸＬ−１ブルーの形質転換に使用した。１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを補足したＬＢ培地に細胞を植え込んだ。アンピシリンならびにｏｍｐ
Ａプラスミドの低レベルの発現の異化抑制のためのグルコースを補足したＬＢ２
５０ｍｌ中で、コロニーを成長させた。キアジーンキットを用いてプラスミドＤ
ＮＡを抽出した。７μｇのプラスミドＤＮＡをＳａｌＩによって切断し、電気穿
孔およびＣａＭｇ形質転換によるＵＨ２０３（前述のｏｍｐＡ欠失菌株）の形質
転換に用いた。細胞を１００μｇのアンピシリンを補足したＬＢ中で成長させ、
形質転換体を選択した。この形質転換体集団をＵＨ２０３（ｐＥＶ２１８Ｔ７Ｌ
）と呼ぶ。 ＵＨ２０３（ｐＥＶ２１８Ｔ７Ｌ）を１ｍＭのＩＰＴＧとともに一夜成長させ
て、ｏｍｐＡプラスミドの発現を誘発する。６８０ｎＭのｍＡｂＴ７とともに細
胞を１時間インキュベートして、モノクローナル抗体と細胞集団のあるメンバー
によってＯｍｐＡのループＩＶに呈示されたエピトープを結合させた。インキュ
ベーションに続いて、ファージＫ３をＭｏＩ＝２で加え、細胞をファージととも
に２時間インキュベートした。次いで、細胞を植え込んだが、選択（図２１参照
）の結果を、表１１にまとめる。２５個のコロニーをサンプルとし、それらのプ
ラスミドを上述のようにして単離し、制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩによって
切断した。ｍＡｂＴ７によって認識されたエピトープをコードする遺伝子配列（
すなわち、Ｔ７タグ）は、ＮｈｅＩ部位を含む；ｐＥＶ２１８には、他のＮｈｅ
Ｉ部位はみられない。したがって、対象のエピトープをコードする配列を含むプ
ラスミドのみが、ＮｈｅＩに対して受攻性である。サンプルにした２５個のクロ
ーンのうち２４個がＮｈｅＩに対して受攻性であった。
【０１５６】 表 表１：各ポリペプチド（Ａ欄）、ＣＩＳＴＥＭにおいて該ポリペプチドをイン
プリントするのに用いる選択剤（Ｂ欄）；選択剤の接着ドメインを構成する各ド
メイン（Ｃ欄；番号付けはアミノ末端において始まる）；接着ドメインと相互作
用（立体配置的理由などから）しており、標的化合物を結合するようにインプリ
ントされうるドメイン（Ｄ欄）を列挙する。
【表１】
【表２】
【表３】 ＣＩＳＴＥＭ選択の予備的最適化における選択剤および標的の連続希釈物濃度。
表に挙げた細胞集団は本文中に記載されている。 縦欄：[標的化合物]／[インプリントポリペプチド] 横欄：Ｍｏｌまたは[選択剤]／[細胞数]
【表４】
【表５】 縦欄：ＯｍｐＡのループＩＶにおけるＴ７タグの有無 横欄：培地におけるｍＡｂＴ７の有無
【表６】
【表７】
【表８】
【表８続き】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【０１５７】 （参考文献）
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｉ−ＩＶ型のポリペプチドを示す。
【図２】 膜ポリペプチドの接着ドメインを示す。
【図３】 膜ポリペプチドの接着ドメインを示す。
【図４】 ＩＣＡＭ−１タンパク質を示す。
【図５】 ＣＩＳＴＥＭの成分を示す。
【図６】 インプリントドメインと標的分子間の結合相互作用を示す。
【図７】 バクテリオファージを用いるＣＩＳＴＥＭ選択を示す。
【図８】 ＣＩＳＴＥＭにおける選択および増殖を示す。
【図９】 ＯｍｐＡプラスミドｐＥＶ２１８を示す。
【図１０】 相互に作用するＣＩＳＴＥＭランを示す。
【図１１】 相互に作用するＣＩＳＴＥＭランを示す。
【図１２】 インプリンティングの例を示す。
【図１３】 大腸菌／ＯｍｐＡ−ＣＩＳＴＥＭを示す。
【図１４】 バクテリオファージＫ３を用いるＣＩＳＴＥＭを示す。
【図１５】 ファージＫ３によるＣＩＳＴＥＭ選択の予備的最適化を示す。
【図１６】 ファージＫ３によるＣＩＳＴＥＭ選択の予備的最適化を示す。
【図１７】 ＣＩＳＴＥＭ選択の変遷のモニタリングを示す。
【図１８】 ＣＩＳＴＥＭ選択の変遷のモニタリングを示す。
【図１９】 ＣＩＳＴＥＭ選択の変遷のモニタリングを示す。
【図２０】 細胞内ＣＩＳＴＥＭの２つの可能性を示す。
【図２１】 ＣＩＳＴＥＭ選択の変遷のモニタリングを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/48 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 33/50 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 アーロン・ハーシュ アメリカ合衆国94306カリフォルニア州パ ロ・アルト、アマースト・ストリート2035 番 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 JA01 4B024 AA11 BA80 CA07 DA02 DA05 GA11 HA01 4B063 QA01 QA13 QA17 QQ02 QQ20 QR55 QR62 QS34 4B065 AA01X AA90X AA90Y AB01 BA02 CA24 CA46 4C084 AA27 NA14 ZB352

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも１つの対象ポリペプチド、標的化合物または対象
    ポリペプチドの遺伝子、または標的化合物の遺伝子（ここで、対象ポリペプチド
    および標的化合物の少なくとも１つは未知である）を同定および単離する方法で
    あって、 ａ）細胞外または細胞内ドメインに対象ポリペプチドを有する膜ポリペプチド
    を発現するように細胞集団を工作することによって、細胞集団を構築し [ここで、細胞外または細胞内ドメインは、直接または間接的に選択剤特異的選 択部位と相互作用する各細胞の表面上の１つまたはそれ以上のコピーに呈示され
    ており、対象ポリペプチドへの標的化合物の結合に基いて、対象ポリペプチドへ
    の標的化合物の結合を呈示する細胞の該選択部位は、該結合を呈示しない細胞か
    ら該結合を呈示する細胞を選択するために選択剤を用いるという作法によって、
    変更される]； ｂ）細胞集団を、標的化合物が対象ポリペプチドへ結合するのに十分な時間だ
    け、標的化合物または標的化合物の集団に曝露し； ｃ）細胞集団を、選択剤が選択部位と相互作用するに十分な時間だけ、段階ｂ
    と同時またはその後に選択剤に曝露し； ｄ）標的化合物の対象ポリペプチドへの結合を示すクローンを選択すること； ｅ）必要に応じて、選択されたクローンを増殖させる；次いで、 ｆ）対象ポリペプチドおよび／または標的化合物および／または対象ポリペプ
    チドの遺伝子および／または標的化合物の遺伝子を単離する、 ステップを含む方法。
  2. 【請求項２】 対象ポリペプチドを有する細胞外または細胞内ドメインと選
    択部位との間の相互作用が、空間的相互作用、特に標的化合物が対象ポリペプチ
    ドに結合した後に、選択剤が選択部位と相互作用するのを許可しない空間的相互
    作用である、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 選択部位が、対象ポリペプチドを有する細胞外または細胞内
    ドメインに直接に隣接する請求項１または２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 選択剤が毒性剤である請求項１から３のいずれか１つに記載
    の方法。
  5. 【請求項５】 選択部位が、選択剤の接着ドメインである請求項１から４の
    いずれか１つに記載の方法。
  6. 【請求項６】 膜ポリペプチドが、糖脂質−アンカーポリペプチド、αへリ
    ックスポリトピック受容体、バイトピック膜内ポリペプチド、ポリトピック膜内
    ポリペプチドまたは分泌ポリペプチドの膜結合イソ体から選ばれる請求項１から
    ５のいずれか１つに記載の方法。
  7. 【請求項７】 対象ポリペプチドが同定および単離される請求項１から６の
    いずれか１つに記載の方法。
  8. 【請求項８】 膜ポリペプチドの細胞外または細胞内ドメインが、標的化合
    物への結合に基いて、対象ポリペプチドまたはそのセクションとして同定および
    単離される可変性の高い領域を含む請求項１から７のいずれか１つに記載の方法
    。
  9. 【請求項９】 可変性の高い領域が、ｃＤＮＡライブラリーまたはそのセク
    ションによってコードされるポリペプチドを含む請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 膜ポリペプチドが、細胞にとって異種体である請求項１か
    ら９のいずれか１つに記載の方法。
  11. 【請求項１１】 膜ポリペプチドが、細胞外または細胞内ドメインおよび選
    択部位が細胞表面上互いに隣接するように遺伝子工作されている請求項１から１
    ０のいずれか１つに記載の方法。
  12. 【請求項１２】 標的化合物が、化合物の混合物から構成される請求項１か
    ら１１のいずれか１つに記載の方法。
  13. 【請求項１３】 多数の標的化合物に細胞集団が曝露されることにより、対
    象ポリペプチドに対する未知の結合パートナーが同定および単離される、ハイス
    ループットスクリーニングアッセイの形態で実施されることを特徴とする請求項
    １から１２のいずれか１つに記載の方法。
  14. 【請求項１４】 標的化合物が、膜ポリペプチドを発現している細胞によっ
    て分泌される請求項１から１３のいずれか１つに記載の方法。
  15. 【請求項１５】 選択剤が、病原性剤である請求項１から１４のいずれか１
    つに記載の方法。
  16. 【請求項１６】 選択剤が、ウイルス、好ましくはバクテリオファージであ
    る請求項１から１５のいずれか１つに記載の方法。
  17. 【請求項１７】 病原性剤が、対応する天然に見出される病原性剤とは異な
    る効果、好ましくは天然に見出される病原性剤よりも強い効果をもつ変更された
    病原性剤である請求項１５または１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 ステップｂからｅを、少なくとも１回反復、好ましくは反
    復ステップにおいて選択圧力が増加するまで反復する請求項１から１７のいずれ
    か１つに記載の方法。
  19. 【請求項１９】 ステップｂからｅを、細胞集団が所望の数の別個のクロー
    ンを含むまで反復する請求項１から１８のいずれか１つに記載の方法。
  20. 【請求項２０】 ステップｄで選ばれたクローンの可変領域における新規配
    列変異を、ステップｂからｅを反復する前に導入する請求項１８または１９に記
    載の方法。
  21. 【請求項２１】 可変ドメインと選択部位の両方に隣接し、選択部位と付加
    的ドメインもまた標的化合物と相互作用する（好ましくは結合する）付加的ドメ
    インを細胞表面上に膜タンパク質が呈示する請求項１から２０のいずれか１つに
    記載の方法。
  22. 【請求項２２】 ステップｄで選ばれ、ステップｅで増殖されたクローンが
    呈示するポリペプチドを、標的化合物の機能に影響を及ぼすその能力によって、
    スクリーニングすることを特徴とする、対象ポリペプチドが標的化合物に結合し
    、その機能に影響を及ぼす請求項１から２１のいずれか１つに記載の方法。
  23. 【請求項２３】 各細胞の生命維持に必要な化合物の供給が、標的化合物に
    類似しているが同一ではない化合物において酵素的に作用する細胞の可変領域に
    依存する栄養培地中に細胞集団が置かれるステップを特徴とする、対象ポリペプ
    チドが酵素活性を呈示する請求項１から２２のいずれか１つに記載の方法。
  24. 【請求項２４】 膜ポリペプチドが、αへリックスポリトピック受容体、糖
    脂質−アンカータンパク質、グリコプロテインまたはプロテオグリカンである請
    求項１から２３のいずれか１つに記載の方法。
  25. 【請求項２５】 細胞のライブラリーを特徴とする請求項１から２４のいず
    れか１つに記載の方法に用いる細胞集団であって、 ａ）細胞外または細胞内ドメインに対象ポリペプチドをもつ膜ポリペプチド、
    および ｂ）選択剤に対して特異的である選択部位 [対象ポリペプチドへの標的化合物の結合に基いて、対象ポリペプチドへの標的 化合物の結合を呈示する細胞の選択部位は、該結合を呈示しない細胞から該結合
    を呈示する細胞を選択するために選択剤を用いるという作法によって、変更され
    る] を各細胞が呈示する細胞集団。
  26. 【請求項２６】 ａ）請求項２５に記載の細胞集団、ｂ）標的分子および／
    または標的化合物のライブラリーおよびｃ）１つまたはそれ以上の選択剤を含む
    キット。
  27. 【請求項２７】 請求項１から２４のいずれか１つに記載の方法に従って、
    新規な医薬的活性化合物を同定および単離し、医薬的に許容しうる補助成分を付
    加し、医薬調製品を完成することを特徴とする医薬調製品の製造方法。
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