RU2677140C1 - Лейкоцидины staphylococcus aureus, терапевтические композиции и их применение - Google Patents
Лейкоцидины staphylococcus aureus, терапевтические композиции и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2677140C1 RU2677140C1 RU2018100393A RU2018100393A RU2677140C1 RU 2677140 C1 RU2677140 C1 RU 2677140C1 RU 2018100393 A RU2018100393 A RU 2018100393A RU 2018100393 A RU2018100393 A RU 2018100393A RU 2677140 C1 RU2677140 C1 RU 2677140C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- luka
- lukb
- aureus
- amino acid
- cells
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 80
- 108010014603 Leukocidins Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 title abstract description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title description 38
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 50
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 41
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 20
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 19
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 8
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 claims description 7
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 claims description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 4
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000002020 noncytotoxic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 16
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 206010041925 Staphylococcal infections Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000015339 staphylococcus aureus infection Diseases 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 121
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 40
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 37
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 33
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 33
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 29
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 25
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 21
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 21
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 20
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 19
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 18
- 210000003622 mature neutrocyte Anatomy 0.000 description 18
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 18
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 17
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 17
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 17
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 16
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 14
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 14
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 13
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 12
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 12
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 12
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 12
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 12
- 101000740205 Homo sapiens Sal-like protein 1 Proteins 0.000 description 11
- 102100037204 Sal-like protein 1 Human genes 0.000 description 11
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 11
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 11
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 11
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 11
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 10
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 10
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 10
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 9
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 8
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 8
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 8
- 230000034994 death Effects 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 7
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 7
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 7
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 7
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 7
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 7
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 6
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 6
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 6
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 6
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 6
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 6
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 5
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 5
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 5
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 4
- 101800000874 Small capsid protein Proteins 0.000 description 4
- 101800000996 Small capsid protein precursor Proteins 0.000 description 4
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 4
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000988 Lysostaphin Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- -1 cefadrin Chemical compound 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 3
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 231100000568 intoxicate Toxicity 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000035 BCA protein assay Methods 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- FBUKMFOXMZRGRB-UHFFFAOYSA-N Coronaric acid Natural products CCCCCC=CCC1OC1CCCCCCCC(O)=O FBUKMFOXMZRGRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010012442 Dermatitis contact Diseases 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001074035 Homo sapiens Zinc finger protein GLI2 Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 101710179585 Leukocidin-F subunit Proteins 0.000 description 2
- 101710081232 Leukocidin-S subunit Proteins 0.000 description 2
- 101710170970 Leukotoxin Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 208000037942 Methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection Diseases 0.000 description 2
- 101150008132 NDE1 gene Proteins 0.000 description 2
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 2
- 241000039731 Staphylococcus aureus LAC Species 0.000 description 2
- 108010001244 Tli polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 102100035558 Zinc finger protein GLI2 Human genes 0.000 description 2
- 206010000269 abscess Diseases 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 2
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960005475 antiinfective agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 2
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-KIIOPKALSA-N chembl3301825 Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)C(O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-KIIOPKALSA-N 0.000 description 2
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002227 clindamycin Drugs 0.000 description 2
- KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N clindamycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@H](C)Cl)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N 0.000 description 2
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011527 multiparameter analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 206010038351 renal abscess Diseases 0.000 description 2
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 238000012106 screening analysis Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000024033 toxin binding Effects 0.000 description 2
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 2
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,4r,5r,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,4r,5r,6s)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1[C@@H](CO)O[C@@H](OC2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002874 Acne Vulgaris Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 239000012116 Alexa Fluor 680 Substances 0.000 description 1
- 101710092462 Alpha-hemolysin Proteins 0.000 description 1
- 101710197219 Alpha-toxin Proteins 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 206010002153 Anal fissure Diseases 0.000 description 1
- 208000016583 Anus disease Diseases 0.000 description 1
- 239000010754 BS 2869 Class F Substances 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- GNWUOVJNSFPWDD-XMZRARIVSA-M Cefoxitin sodium Chemical compound [Na+].N([C@]1(OC)C(N2C(=C(COC(N)=O)CS[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)CC1=CC=CS1 GNWUOVJNSFPWDD-XMZRARIVSA-M 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- HZZVJAQRINQKSD-UHFFFAOYSA-N Clavulanic acid Natural products OC(=O)C1C(=CCO)OC2CC(=O)N21 HZZVJAQRINQKSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000037041 Community-Acquired Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 208000009531 Fissure in Ano Diseases 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 206010022714 Intestinal ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 206010023567 Labyrinthitis Diseases 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N Lincomycin Natural products CN1CC(CCC)CC1C(=O)NC(C(C)O)C1C(O)C(O)C(O)C(SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 208000010315 Mastoiditis Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 201000002481 Myositis Diseases 0.000 description 1
- 206010028885 Necrotising fasciitis Diseases 0.000 description 1
- 206010029240 Neuritis Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 206010029803 Nosocomial infection Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 206010034464 Periarthritis Diseases 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 201000007100 Pharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 101710124951 Phospholipase C Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920002565 Polyethylene Glycol 400 Polymers 0.000 description 1
- 206010036105 Polyneuropathy Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010038910 Retinitis Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000003589 Spider Bites Diseases 0.000 description 1
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010053950 Teicoplanin Proteins 0.000 description 1
- WKDDRNSBRWANNC-UHFFFAOYSA-N Thienamycin Natural products C1C(SCCN)=C(C(O)=O)N2C(=O)C(C(O)C)C21 WKDDRNSBRWANNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 206010044248 Toxic shock syndrome Diseases 0.000 description 1
- 231100000650 Toxic shock syndrome Toxicity 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 206010000496 acne Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 208000002029 allergic contact dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 239000002776 alpha toxin Substances 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 229940098164 augmentin Drugs 0.000 description 1
- 229940098166 bactrim Drugs 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003781 beta lactamase inhibitor Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940126813 beta-lactamase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 229940041011 carbapenems Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002612 cardiopulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- OLVCFLKTBJRLHI-AXAPSJFSSA-N cefamandole Chemical compound CN1N=NN=C1SCC1=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](O)C=3C=CC=CC=3)[C@H]2SC1 OLVCFLKTBJRLHI-AXAPSJFSSA-N 0.000 description 1
- 229960003012 cefamandole Drugs 0.000 description 1
- 229960002682 cefoxitin Drugs 0.000 description 1
- 229940106164 cephalexin Drugs 0.000 description 1
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- DDTDNCYHLGRFBM-YZEKDTGTSA-N chembl2367892 Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]1C(N[C@@H](C2=CC(O)=CC(O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)=C2C=2C(O)=CC=C(C=2)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2NC(=O)[C@@H]3C=4C=C(O)C=C(C=4)OC=4C(O)=CC=C(C=4)[C@@H](N)C(=O)N[C@H](CC=4C=C(Cl)C(O5)=CC=4)C(=O)N3)C(=O)N1)C(O)=O)=O)C(C=C1Cl)=CC=C1OC1=C(O[C@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O3)NC(C)=O)C5=CC2=C1 DDTDNCYHLGRFBM-YZEKDTGTSA-N 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 201000009151 chronic rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 229960003405 ciprofloxacin Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 208000010247 contact dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000009982 effect on human Effects 0.000 description 1
- 230000001614 effect on membrane Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 206010014665 endocarditis Diseases 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229940124307 fluoroquinolone Drugs 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000001046 green dye Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003709 heart valve Anatomy 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 229960002182 imipenem Drugs 0.000 description 1
- ZSKVGTPCRGIANV-ZXFLCMHBSA-N imipenem Chemical compound C1C(SCC\N=C\N)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@H]([C@H](O)C)[C@H]21 ZSKVGTPCRGIANV-ZXFLCMHBSA-N 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000003331 infrared imaging Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 description 1
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 1
- 231100000567 intoxicating Toxicity 0.000 description 1
- 230000002673 intoxicating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 1
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- HBLOFOWPCVDNCG-UHFFFAOYSA-N isotetrahydroauroglaucin Natural products CC=CCCCCC1=C(O)C=C(CC=C(C)C)C(O)=C1C=O HBLOFOWPCVDNCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- VNYSSYRCGWBHLG-AMOLWHMGSA-M leukotriene B4(1-) Chemical compound CCCCC\C=C/C[C@@H](O)\C=C\C=C\C=C/[C@@H](O)CCCC([O-])=O VNYSSYRCGWBHLG-AMOLWHMGSA-M 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229960005287 lincomycin Drugs 0.000 description 1
- OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N lincomycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 101150094164 lysY gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041033 macrolides Drugs 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229960002260 meropenem Drugs 0.000 description 1
- DMJNNHOOLUXYBV-PQTSNVLCSA-N meropenem Chemical compound C=1([C@H](C)[C@@H]2[C@H](C(N2C=1C(O)=O)=O)[C@H](O)C)S[C@@H]1CN[C@H](C(=O)N(C)C)C1 DMJNNHOOLUXYBV-PQTSNVLCSA-N 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- GPXLMGHLHQJAGZ-JTDSTZFVSA-N nafcillin Chemical compound C1=CC=CC2=C(C(=O)N[C@@H]3C(N4[C@H](C(C)(C)S[C@@H]43)C(O)=O)=O)C(OCC)=CC=C21 GPXLMGHLHQJAGZ-JTDSTZFVSA-N 0.000 description 1
- 229960000515 nafcillin Drugs 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 201000007970 necrotizing fasciitis Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000000879 optical micrograph Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 206010033072 otitis externa Diseases 0.000 description 1
- UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N oxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=CC=CC=C1 UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N 0.000 description 1
- 229960001019 oxacillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000005987 polymyositis Diseases 0.000 description 1
- 208000019629 polyneuritis Diseases 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 201000009259 purulent acute otitis media Diseases 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000008458 response to injury Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000000323 shoulder joint Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 201000009890 sinusitis Diseases 0.000 description 1
- 230000005808 skin problem Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- JLKIGFTWXXRPMT-UHFFFAOYSA-N sulphamethoxazole Chemical compound O1C(C)=CC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=N1 JLKIGFTWXXRPMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007460 surgical drainage Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 229960001608 teicoplanin Drugs 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 1
- 206010044008 tonsillitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 229960001082 trimethoprim Drugs 0.000 description 1
- IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N trimethoprim Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 description 1
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 229940126085 β‑Lactamase Inhibitor Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
- C07K16/1271—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Micrococcaceae (F), e.g. Staphylococcus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
- G01N33/5035—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on sub-cellular localization
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/56938—Staphylococcus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/305—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F)
- G01N2333/31—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к композиции и способу ингибирования начала инфекции Staphylococcus aureus с применением такой композиции. Указанная композиция содержит терапевтически эффективное количество аналога полипептида лейкоцидина А S. Aureus. Настоящее изобретение позволяет повысить эффективность лечения инфекции S. aureus благодаря получению раскрытой вакцинной композиции. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 21 ил., 5 пр.
Description
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Данная заявка претендует на дату приоритета временной патентной заявки США № 61/331550, поданной 5 мая 2010 г., раскрытие которой настоящим включено сюда в качестве ссылки.
ПЕРЕЧНИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Данная заявка содержит перечни последовательностей, которые были направлены на рассмотрение с помощью системы EFS-Web и настоящим целиком включены сюда в качестве ссылок. Указанная копия в формате ASCII, созданная 2 мая 2011 г., названа Sequence Listing_Staphylococcus Aureus Leucocidins_ST25.txt и имеет размер 102 килобайта.
ИЗВЕСТНЫЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Бактерии Staphylococcus aureus или стафилококки ("staph") обычно присутствуют на коже или в носовой полости людей и животных. Стафилококковые бактерии обычно являются безвредными, если только они не попадают в организм через порез или другую рану. Как правило, стафилококковые инфекции создают незначительные кожные проблемы для здоровых людей. Исторически, стафилококковые инфекции лечат антибиотиками широкого спектра действия, такими как метициллин. Однако в настоящее время появились определенные штаммы стафилококков, резистентные к метициллину и другим β-лактамовым антибиотикам, таким как пенициллин и цефалоспорины. Они называются метициллин-резистентным Staphylococcus aureus (также известным как Staphylococcus aureus с множественной лекарственной резистентностью, или "MRSA").
Стафилококковые инфекции, включая MRSA, обычно начинаются с появления маленьких красных бугорков, напоминающих прыщи, нарывы или укусы пауков. Такие бугорки или пятна могут быстро превращаться в глубокие, болезненные абсцессы, требующие хирургического дренирования. Иногда бактерии остаются в пределах кожи. В некоторых случаях, они могут проникать далеко вглубь тела, вызывая потенциально опасные для жизни инфекции в широком спектре человеческих тканей, включая кожу, мягкие ткани, кости, суставы, хирургические раны, кровоток, сердечные клапаны, легкие или другие органы. Таким образом, инфекции S. aureus могут приводить к потенциально смертельным болезням, таким как некротизирующий фасцит, пневмония, эндокардит, сепсис, токсический шок, и различные формы пневмонии. Инфекция MRSA создает особенно много проблем в условиях больницы или медицинских учреждений по уходу за инвалидами и престарелыми, где пациенты часто имеют открытые раны, подвергаются инвазивным процедурам с помощью разных приспособлений, и имеют ослабленные иммунные системы и, таким образом, подвержены большему риску инфекции, чем население в целом. Сотрудники, не придерживающиеся надлежащих санитарных процедур, могут переносить бактерии MRSA от одного пациента к другому.
S. aureus продуцирует широкий спектр вирулентных факторов и токсинов, позволяющих этой бактерии нейтрализовать и противостоять атакам разных видов иммунных клеток, конкретнее, субпопуляций белых кровяных клеток, образующих первичную защитную систему организма. Продуцирование таких вирулентных факторов и токсинов позволяет S. aureus поддерживать инфекционное состояние. См. Nizet, J. Allergy Clin. Immunol. 120:13-22 (2007). Наряду с этими вирулентными факторами, S. aureus продуцирует несколько бикомпонентных лейкотоксинов, которые повреждают мембраны защитных клеток хозяина и эритроцитов в результате синергичного действия двух неассоциированных белков или субъединиц. См. Supersac, et al., Infect. Immun. 61:580-7 (1993). Из таких бикомпонентных лейкотоксинов лучше всего исследованы гамма-гемолизин (HlgAB и HlgCB) и лейкоцидин Пантона-Валентайна (Pantone-Valentine Leukocidin, PVL).
Токсичность лейкоцидинов по отношению к клеткам млекопитающих связана с действием двух компонентов. Первая субъединица называется субъединицей класса S (т.е. "медленно элюирующаяся"), и вторая субъединица называется субъединицей класса F (т.е. "быстро элюирующаяся"). S- и F-субъединицы действуют синергично, образуя поры в белых кровяных клетках, включая моноциты, макрофаги, дендритные клетки и нейтрофилы (коллективно называемые фагоцитами). См. Menestrina, et al., Toxicol. 39:1661-1672 (2001). Механизм, по которому бикомпонентные токсины образуют поры в мембранах клетки-мишени, до конца не выяснен. Предложенный механизм действия этих токсинов включает связывание S-субъединицы с мембраной клетки-мишени, наиболее вероятно, через рецептор, с последующим связыванием F-субъединицы с S-субъединицей, с образованием при этом олигомера, который в свою очередь образует предпору (pre-pore), проникающую в мембрану клетки-мишени (Jayasinghe, et al., Protein. Sci. 14:2550-2561 (2005)). Поры, образованные бикомпонентными лейкотоксинами, типично являются катионселективными. Образование пор вызывает гибель клетки вследствие лизиса, который в тех случаях, когда мишенями являются белые кровяные клетки, как сообщалось, вызван нарушением осмотического баланса вследствие притока катионов (Miles, et al., Biochemistry 40:8514-8522 (2001)).
Известно, что в дополнение к PVL (также известным как лейкоцидин S/F-PV или LukSF-PV) и гамма-гемолизину (HlgAB и HlgCB), репертуар бикомпонентных лейкотоксинов, продуцируемых S. aureus, включает лейкоцидин E/D (LukED) и лейкоцидин M/F' (LukMF'). Таким образом, субъединицы S-класса таких бикомпонентных лейкоцидинов включают HlgA, HlgC, LukE, LukS-PV и LukM, и субъединицы F-класса включают HlgB, LukD, LukF-PV и LukF'-PV (Menestrina, et al., supra.). S- и F-субъединицы S. aureus не являются лейкоцидин-специфичными. Это означает, что они являются взаимозаменяемыми таким образом, что другие бикомпонентные комбинации могут создавать функциональные поры в белой кровяной клетке, значительно расширяя репертуар лейкотоксинов (Meyer, et al., Infect. Immun. 77:266-273 (2009)).
Разработка эффективной терапии для лечения инфекции MRSA является особенно сложной проблемой. Было обнаружено, что в дополнение к вышеупомянутой резистентности к метициллину и родственным антибиотикам, MRSA также проявляет значительные уровни резистентности к макролидам (например, эритромицину), комбинациям ингибитора бета-лактамазы (например, уназин, аугментин) и фторхинолонам (например, ципрофлоксацин), а также к клиндамицину, триметоприму/сульфаметоксизолу (Bactrim) и рифампину. В случае серьезной инфекции S. aureus, клинические врачи прибегают к использованию внутривенно ванкомицина. Однако имеются сообщения о резистентности S. aureus к ванкомицину. Таким образом, существует потребность в разработке новых препаратов антибиотиков, эффективно борющихся с инфекцией S. aureus.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Заявители обнаружили и охарактеризовали другой бикомпонентный член защитной системы нативного Staphylococcus aureus. Новый охарактеризованный полипептидный компонент нативной S-субъединицы, обозначенный здесь "LukA", охватывает нативные полипептиды и их аналоги, имеющие степень подобия последовательностей, по меньшей мере, 70% с последовательностями нативных полипептидов. Таким образом, один аспект настоящего изобретения касается изолированного и/или очищенного LukA. Другой аспект настоящего изобретения касается изолированного и/или очищенного полинуклеотида, кодирующего LukA, трансформированного хозяина (например, клетки), содержащего полинуклеотид, и способов получения рекомбинантного LukA путем экспрессии полинуклеотида в трансформированном хозяине.
Новый охарактеризованный полипептидный компонент F-субъединицы, обозначенный здесь "LukB", охватывает нативные полипептиды и их аналоги, имеющие степень подобия последовательностей, составляющую, по меньшей мере, 70% с последовательностями нативных полипептидов. Таким образом, другой аспект настоящего изобретения касается изолированного и/или очищенного LukB. Другой аспект настоящего изобретения касается изолированного и/или очищенного полинуклеотида, кодирующего LukB, трансформированного хозяина (например, клетки), содержащего полинуклеотид, и способов получения рекомбинантного LukB путем экспрессии полинуклеотида в трансформированном хозяине.
Еще один аспект данной заявки касается терапевтических композиций, пригодных для ингибирования начальных проявлений или лечения инфекции Staphyloccocus aureus, содержащих терапевтически эффективные количества LukA и/или LukB в композиции с фармацевтически приемлемым носителем. Таким образом, в одном варианте исполнения, терапевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество LukA. В другом варианте исполнения, терапевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество LukB. В еще одном варианте исполнения, терапевтическая композиция содержит терапевтически эффективные количества обоих LukA и LukB. В еще одних вариантах исполнения, композиция содержит аналог LukA с отсутствующими 10 C-концевыми остатками, являющийся нетоксичным (обозначается здесь LukAΔ10C или rLukAΔ10C). Такие композиции пригодны для комплексного терапевтического применения. В некоторых вариантах исполнения, композиции называются противовоспалительными композициями и могут быть использованы для лечения острых воспалительных состояний или расстройств, в частности, локализованных острых воспалительных состояний.
Такое применение использует сделанные заявителями дополнительные открытия того, что в физиологических условиях (т.е. LukAB продуцируется непосредственно S. aureus), комплекс LukAB обладает исключительной специфичностью к фагоцитам, но не к другим ядросодержащим клеткам, таким как эпителиальные клетки и эндотелиальные клетки. Это означает, что комплекс образует поры в мембранах таких видов клеток, тем самым вызывая гибель клетки, что называется здесь "LukAB-опосредованной цитотоксичностью". С другой стороны, LukAB обладает относительно небольшой или пренебрежимо малой специфичностью по отношению к другим ядросодержащим клеткам млекопитающих. Таким образом, противовоспалительные композиции по настоящему изобретению используют специфичность LukAB к человеческим фагоцитам в целях лечения острых воспалительных состояний, характеризующихся массивной инфильтрацией фагоцитов к месту воспаления.
В других вариантах исполнения, терапевтические композиции могут быть названы композицией (активной) вакцины. Композиции могут быть использованы для индукции продуцирования нейтрализующих антител к LukA и к LukB у субъекта с риском инфекции S. aureus или субъекта с диагностированной инфекцией S. aureus, такой как MRSA.
Другие аспекты настоящего изобретения касаются антител, которые специфически связывают LukA, антител, которые специфически связывают LukB, терапевтических композиций, содержащих антитела LukA и/или LukB, и их применения для лечения инфекционных состояний, связанных с S. aureus. Такие терапевтические композиции могут быть названы пассивными композициями вакцины. Таким образом, в одном варианте исполнения, терапевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество антител к LukA. В другом варианте исполнения, терапевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество антител к LukB. В еще одном варианте исполнения, терапевтическая композиция содержит терапевтически эффективные количества как антител к LukA, так и антител к LukB.
Пассивные и активные композиции вакцин по настоящему изобретению используют еще одно сделанное заявителями открытие - что инфекционные вирулентные штаммы S. aureus, такие как MRSA, экспрессируют LukA и LukB. Неизменность LukA и LukB для широкого спектра штаммов S. aureus позволяет вакцинам по настоящему изобретению обеспечивать полный спектр терапевтической эффективности. LukA, LukB, антитела к LukA и антитела к LukB также называются здесь активными агентами.
Другой аспект настоящего изобретения касается способов применения LukAB, LukA и/или LukB для идентификации потенциальных ингибиторов LukAB-опосредованной цитотоксичности. Такие способы могут использовать комплекс LukAB, per se, в комбинации с фагоцитом, или его часть, связывающуюся с мембраной фагоцита. Идентифицированные таким образом ингибиторы могут быть кандидатами для терапии с целью лечения инфекции S. aureus.
Еще один аспект настоящего изобретения касается способа прогнозирования или оценки тяжести инфекции S. aureus, предусматривающего детектирование присутствия или количества LukA и/или LukB, или детектирование соответствующих генов LukA и/или LukB, в биологическом образце, полученном от инфицированного субъекта. Этот аспект настоящего изобретения основан на еще одном сделанном заявителями открытии - того, что из многих цитотоксинов, продуцируемых S. aureus, LukAB проявляет сильную токсичность по отношению к человеческим фагоцитам. Таким образом, детектирование присутствия или относительно высоких количеств LukA и/или LukB, или их соответствующих генов (например, демонстрируемое штаммами S. aureus Newman, 4645 и штаммами MRSA USA300 и USA500) по сравнению с контролем (например, штаммами S. aureus USA100 и USA400), который продуцирует небольшие или недектируемые количества LukA и/или LukB, указывает на тяжелую инфекцию S. aureus.
Эти и другие аспекты настоящего изобретения более полно описаны ниже.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1 представляет собой выравнивание, содержащее аминокислотную последовательность мажоритарной (majority) последовательности LukA (обозначенной как SEQ ID NO:1) и полипептидов LukA от тринадцати (13) разных штаммов S. aureus, которым она соответствует (обозначенным как SEQ ID NO:2-14).
Фигура 2 представляет собой выравнивание, содержащее аминокислотную последовательность мажоритарной последовательности LukB (обозначенной как SEQ ID NO:15) и полипептидов LukB от двенадцати (12) разных штаммов S. aureus, которым она соответствует (обозначенным как SEQ ID NO:16-27).
Фигура 3. LukAB является сильным стафилококковым цитотоксином, который нацелен на и уничтожает первичные человеческие фагоциты. (a) Интоксикация первичных человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) фильтратом культуры (2,5% об./об.) S. aureus, штамм Newman (дикого типа, WT) и указанных изогенных мутантных штаммов. Жизнеспособность клеток контролируют с помощью CellTiter, где клетки, обработанные средой, принимались за 100%. Результаты представляют средние значения для трех параллельных образцов + стандартное отклонение (S.D.). (b) Интоксикация первичных человеческих моноцитов, макрофагов и дендритных клеток (DC) фильтратом культуры (2,5% об./об.) S. aureus, штамм Newman (WT) и указанных изогенных мутантных штаммов. Жизнеспособность клеток контролируют, как описано выше. Результаты представляют среднее для двух доноров, где клетки от каждого донора интоксицируют тремя независимыми препаратами экзопротеина, + S.E.M. (стандартная ошибка средней). (c) Интоксикация первичных человеческих PMN (полиморфоядерных нейтрофилов) различными разбавлениями фильтратов культур S. aureus штамм Newman (WT) и указанных изогенных мутантных штаммов. Жизнеспособность клеток контролируют, как описано выше. Результаты представляют среднее для PMN, выделенных у четырех доноров ±S.E.M. (d) Интоксикация первичных человеческих PMN очищенными rLukA, rLukB, или комбинацией rLukA и rLukB в указанных концентрациях. * указывает статистическую значимость при сравнении с вместе взятыми rLukA и rLukB, P<0,05. Для панелей (a-c) * указывает статистическую значимость при сравнении с WT, ** указывает статистическую значимость при сравнении с ΔLukAB/p, P<0,05 (t-критерий Стьюдента p<0,05).
Фигура 4. LukAB предпочтительно нацелен на человеческие фагоцитарные клетки. Интоксикация (a, c и d) PMN-HL60 или (b) клеток THP1 различными разведениями фильтрата культуры S. aureus WT штамм Newman, изогенных мутантных штаммов, не содержащих указанных генов/токсинов, (c) фильтратом культуры S. aureus WT, содержащей пустую плазмиду (WT/p), штамма, не содержащего LukAB, с пустой плазмидой (ΔLukAB/p) и штамма, не содержащего LukAB, с LukAB-комплементирующей плазмидой (ΔLukAB/pLukAB), или (d) очищенным рекомбинантным LukA (rLukA), LukB (rLukB) или комбинаций rLukA и rLukB (rLukA+rLukB) в указанных концентрациях. Для интоксикаций вместе взятыми rLukA и rLukB, общая концентрация белка складывается из равных количеств rLukA и rLukB (например, 2,8 мкг общего белка соответствует 1,4 мкг rLukA и 1,4 мкг rLukB). (e) Интоксикация указанных человеческих клеточных линий 10 мкг/мл rLukAB. Жизнеспособность клеток контролируют с помощью CellTiter, принимая клетки, обрабатываемые средой, за 100%. Результаты представляют среднее для трех параллельных образцов ±S.D. Символ звездочки (*) обозначает статистически значимое различие по сравнению с WT (однофакторный дисперсионный анализ).
Фигура 5. LukAB является важным токсином разных стафилококковых штаммов. (A) Экспрессия LukB различными штаммами S. aureus, определенная методом вестерн-блоттинга с использованием анти-LukB поликлональных сывороток. (B) Интоксикация PMN-HL60 разбавлениями экзопротеинов от разных штаммов S. aureus. Жизнеспособность клеток контролируют с помощью CellTiter, принимая клетки, обрабатываемые средой, за 100% жизнеспособности. (C) Экспрессия LukB и α-токсина WT и LukAB-изогенными штаммами, определенная методом вестерн-блоттинга с использованием токсин-специфичных сывороток. (D) Интоксикация PMN-HL60 экзопротеинами WT-штаммов Newman (New.) и 4645 и LukAB-изогенных штаммов. Жизнеспособность клеток контролируют, как на панели B. Результаты представляют среднее для трех параллельных образцов + S.D. * обозначает статистически значимое различие по сравнению с Newman (C) или с WT (E) (t-критерий Стьюдента p<0,05).
Фигура 6. LukAB разрушает плазматические мембраны клеток-мишеней. (a) Полученные методом световой микроскопии изображения клеток PMN-HL60, интоксицированных фильтратом культуры S. aureus, штамма дикого типа (WT), и изогенного штамма, не содержащего LukAB (ΔLukAB). (b-c) Интоксикация клеток PMN-HL60 фильтратами культур штамма WT (WT/p), изогенного штамма, не содержащего LukAB (ΔLukAB/p), комплементированного штамма (ΔLukAB/pLukAB), или псевдо-интоксикация средой. Клетки с нарушенными мембранами окрашивают SYTOX Green, визуализируют методом флуоресцентной микроскопии (c) и измеряют интенсивность зеленой флуоресценции (b). (d) PMN инфицировали ex vivo S. aureus, штамм Newman (MSSA) или штамм USA300 LAC (MRSA), и указанными изогенными мутантами с различными кратностями инфекции (MOI). Повреждение мембраны контролируют с помощью красителя SYTOX green. Результаты представляют среднее для трех параллельных образцов ±S.D. Символы звездочки (*) обозначают статистически значимое различие по сравнению с WT (t-критерий Стьюдента p<0,05).
Фигура 7. LukAB защищает S. aureus от медиируемой хозяином гибели путем нацеливания на фагоциты и их уничтожения. (a) Инфекция клеток PMN-HL60 S. aureus WT, штаммом, не содержащим IukAB, и штаммом, не содержащим IukAB, с IukAB-комплементирующей плазмидой (ΔlukAB/plukAB), при различных кратностях инфекции (MOI). Клетки млекопитающих с нарушенными мембранами контролируют с помощью SYTOX Green, как описано на Фигуре 6. Результаты представляют среднее для трех параллельных образцов + S.D. (b) Жизнеспособность указанных штаммов S. aureus при ex vivo инфицировании человеческой цельной крови. Результаты представляют среднее для цельной крови, полученной от 12 доноров + S.E.M. (c) Жизнеспособность указанных S. aureus штаммов Newman при инфицировании первичных человеческих нейтрофилов (PMN). Результаты представляют среднее для PMN, полученных от 12 доноров + S.E.M. (d) Интоксикация первичных человеческих PMN различными разбавлениями фильтрата культуры штаммов WT/p, ΔlukAB/p и ΔlukAB/plukAB. В качестве индикатора клеточного лизиса измеряют высвобождение LDH (лактатдегидрогеназы). Результаты представляют среднее для PMN, полученных от 6 доноров + S.E.M. Символы звездочки (*) обозначают статистически значимое различие по сравнению с WT штаммом Newman (t-критерий Стьюдента p<0,05).
Фигура 8. LukAB важен для патогенеза S. aureus in vivo, (a) Биолюминесцентные изображения почек мышей, инфицированных WT штаммом LAC S. aureus, содержащим pXen1 или pLukAB.Xen1. Показаны почки двух типичных мышей в каждой группе. (b) Бактериальная нагрузка, выделенная из почек мышей, инфицированных ретроорбитально указанными штаммами S. aureus LAC. Каждая точка данных представляет число бактерий (CFU, колониеобразующих единиц) на миллилитр гомогената ткани для отдельного животного. Пунктирная линия показывает предел детектирования. Для панелей (A-C и E) * указывает статистическую значимость при сравнении с WT, ** указывает статистическую значимость при сравнении с ΔLukAB/p, P<0,05.
Фигура 9. LukAB уничтожает человеческие фагоциты путем образования пор в клеточных мембранах. (a) Клетки PMN-HL60 интоксицируют rLukA+rLukB и связывание токсина контролируют методами ДСН-ПААГ (электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) и иммуноблоттинга с использованием антител, специфичных к LukA или LukB. (b) PMN-HL60 инкубируют с rLukAB и связывание токсина определяют методом FACS (сортировки клеток с активируемой флуоресценцией) с использованием кроличьего анти-His антитела, (c) Клетки PMN-HL60 интоксицируют rLukAB и образование олигомеров LukAB в плазматической мембране определяют методом ДСН-ПААГ и иммуноблоттинга с использованием антитела к LukB, (d) PMN-HL60 интоксицируют rLukAB или обрабатывают сапонином в присутствии или в отсутствие ПЭГ-400. Поры LukAB детектируют бромидом этидия. (e) Жизнеспособность PMN-HL60, обработанных как указано на панели, определяют с помощью CellTiter, принимая клетки, обрабатываемые средой, за 100%. Результаты на панелях (d) и (e) представляют среднее для трех параллельных образцов ±SEM. * обозначает статистически значимое различие с ПЭГ (панели d-e) (t-критерий Стьюдента p<0,05).
Фигура 10. Цитотоксичность LukAB может быть нейтрализована с помощью α-LukA поликлонального антитела. PMN-HL60, интоксицированные 5% (об./об.) фильтратом культуры S. aureus штамм Newman, инкубируют с указанными количествами α-LukA поликлональных антител или неиммунной сывороткой, полученной из разных порций крови (production bleeds) двух разных кроликов. Жизнеспособность клеток контролируют с помощью CellTiter, принимая клетки, обрабатываемые средой, за 100%. Результаты представляют среднее для трех параллельных образцов ± стандартное отклонение (S.D.).
Фигура 11. C-концевой выступающий участок LukA необходим для цитотоксичного эффекта LukAB, но не влияет на распознавание α-LukA поликлональным антителом. (a) Выравнивание аминокислотных последовательностей различных S-субъединиц лейкотоксина S. aureus (обозначенных как SEQ ID NO:44-49), проведенное с использованием метода MegAlign Clustal W прикладной программы Lasergene. N- и C-концевые выступающие участки, присутствующие только в последовательности LukA, обведены рамкой. (b) Окрашивание кумасси голубым 2 мкг рекомбинантного LukA (rLukA), LukB (rLukB), LukA, не имеющего C-концевого выступающего участка (rLukAΔ10C) и LukA, не имеющего N-концевого выступающего участка (rΔ33NLukA), выделенного из E. coli и разделенного методом ДСН-ПААГ, сопровождаемое интоксикацией PMN-HL60 различными количествами rLukA, rLukAΔ10C и rΔ33NLukA в комбинации с rLukB. Конечная концентрация белка состоит из равных количеств rLukA, rLukAΔ10C или rΔ33NLukA и rLukB. Результаты представляют среднее для трех параллельных образцов ±S.D. (c) Иммуноблот, демонстрирующий эквивалентность распознавания 6×His-меченого rLukAΔ10C как α-LukA, так и α-His поликлональными антителами.
ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ
Приведенное далее раскрытие касается, в последовательном порядке, полипептидов LukA, полипептидов LukB, полинуклеотидов LukA и LukB, антител к LukA и к LukB, терапевтических композиций, содержащих LukA и/или LukB, или антитела к LukA и/или к LukB, способов применения терапевтических композиций, способов идентификации ингибиторов LukAB-опосредованной цитотоксичности и способов прогнозирования или оценки тяжести инфекции S. aureus.
Полипептиды LukA
Полипептиды, нативные для Staphylococcus aureus, были изолированы и идентифицированы заявителями как проявляющие профиль активности известной S-субъединицы лейкоцидинов (например, LukS-PVL, LukE и HlgC). Такие полипептиды, обозначенные здесь коллективно как LukA, специфически нацелены на и связывают человеческие фагоциты (но не человеческие эпителиальные или человеческие эндотелиальные клетки, или мышиные клетки), и после связывания с мембраной фагоцита, LukA олигомеризуется с F-субъединицей лейкоцидина S. aureus (например, LukF-PVL, LukD и HlgB и LukB, раскрытые здесь), а после олигомеризации образуют трансмембранную пору (что обобщенно называется LukA-активностью). Выравнивание, приведенное на Фиг. 1, содержит аминокислотные последовательности мажоритарной (majority) последовательности LukA (обозначенной здесь SEQ ID NO:1) и полипептидов LukA от 13 разных штаммов S. aureus, которым они соответствуют (обозначены здесь SEQ ID NO:2-14).
N-концевые 27 аминокислотных остатков каждой из SEQ ID NO:1-14 представляют нативную секреторную/сигнальную последовательность. Таким образом, зрелая секретируемая форма LukA, представленная аминокислотными остатками 28-351 в каждой из SEQ ID NO:1-14, может быть обозначена здесь "LukA(28-351)" или "зрелый LukA". Соответственно, незрелая форма LukA может быть обозначена здесь "LukA(1-351)".
Консенсусная последовательность LukA, определенная на основании SEQ ID NO:2-14 (которые не являются исчерпывающими по отношению к нативному LukA S. aureus) будет, таким образом, включать различающиеся варианты минимум в 64 положениях LukA (где последовательно расположенные положения изменчивости обозначены X1-X64), определяемые следующим образом: 8 (X1=L или F), 16 (X2=A или V), 17 (X3=I или L), 24 (X4=T или Ν), 26 (X5=Q или E), 31 (X6=H или N), 38 (X7=N или T), 46 (X8=S или A), 50 (X9=E или D), 55 (X10=T или N), 56 (X11=N или D), 61 (X12=S или T), 62 (X13=T или P), 63 (X14=A, G или V), 73 (X15=I или V), 78 (X16=E или V), 77 (X17=T или S), 80 (X18=V или E), 83 (X19=E или K), 84 (X20=E или K), 105 (X21=V или I), 124 (X22=K или R), 125 (X23=E или N), 127 (X24=K, T или N), 129 (X25=S или A), 130 (X26=N или S), 135 (X27=K или Q), 146 (X28=R или S), 148 (X29=R или P), 173 (X30=S или N), 174 (X31=S или L), 181 (X32=T или V), 184 (X33=I или V), 195 (X34=T или S), 202 (X35=N или K), 208 (X36=S или I), 214 (X37=W или R), 221 (X38=I или V), 229 (X39=G или N), 231 (X40=V или I), 237 (X41=E или D), 239 (X42=L или F), 243 (X43=N или T), 246 (X44=I или L), 247 (X45=A или S), 278 (X46=L или I), 283 (X47=S или T), 285 (X48=E или D), 288 (X49=Q или R), 299 (X50=I или V), 303 (X51=R или K), 309 (X52=A или G), 310 (X53=P или Q), 315 (X54=K или Q), 318 (X55=D или E), 322 (X56=L или F), 325 (X57=T или V), 338 (X58=V или I), 339 (X59=D или E), 342 (X60=S или T), 344 (X61=D, E или Q), 347 (X62=P или S), 348 (X63=Y или F) и 349 (X64=K или R).
Полипептиды LukB
Полипептиды, нативные для Staphylococcus aureus, были идентифицированы заявителями как проявляющие профиль активности известной F-субъединицы лейкоцидинов (например, LukF-PVL, LukD и HlgB). Такие полипептиды, обозначенные здесь коллективно как LukB, специфически олигомеризуются с S-субъединицей лейкоцидина S. aureus (например, LukS-PVL, LukE и HlgC и LukA, раскрытыми здесь), связанной с человеческим фагоцитом; и после олигомеризации образуют трансмембранную пору в фагоците (что обобщенно называется LukB-активностью). Выравнивание, приведенное на Фиг. 2, содержит аминокислотные последовательности мажоритарной последовательности LukB (обозначенной здесь SEQ ID NO:15) и полипептидов LukB от 12 разных штаммов S. aureus, которым они соответствуют (обозначены здесь SEQ ID NO:16-27).
N-концевые 29 аминокислотных остатков каждой из SEQ ID NO:15-27 представляют собой секреторную/сигнальную последовательность. Таким образом, зрелая секретируемая форма LukB, представленная аминокислотными остатками 30-339 в каждой из SEQ ID NO:16-27, может быть обозначена здесь "LukB(30-339)" или "зрелая LukB". Соответственно, незрелая форма LukB может быть обозначена здесь "LukA(1-339)".
Консенсусная последовательность LukB, определенная на основании SEQ ID NO:15-28 (которые не являются исчерпывающими по отношению к нативному LukB S. aureus) будет, таким образом, включать различающиеся варианты минимум в 49 положениях LukB (где последовательно расположенные положения изменчивости обозначены X1-X49), определяемые следующим образом: 5 (X1=L или V), 6 (X2=C или Y), 13 (X3=S или T), 15 (X4=A или T), 16 (X5=L или I), 19 (X6=A или T), 20 (X7=L или F), 23 (X8=F или L), 26 (X9=S или T), 28 (X10=Y или F), 34 (X11=E или K), 36 (X12=K или T), 37 (X13=Q, T или A), 46 (X14=D или E), 59 (X15=S или T), 60 (X16=Q или E), 62 (X17=N или K), 64 (X18=T или S), 75 (X19=P или K), 95 (X20=K или R), 98 (X21=N, d или E), 126 (X22=S или делеция), 159 (X23=R или Q), 163 (X24=T или P), 170 (X25=S или K), 187 (X26=L или I), 190 (X27=S или P), 192 (X28=S или T), 193 (X29=S или T), 193 (X29=H или N), 197 (X30=G или A), 204 (X31=S или L), 222 (X32=D или N), 224 (X33=T или V), 247 (X34=N или D), 270 (X35=N или K), 272 (X36=K или E), 276 (X37=R, Q или K), 287 (X38=D или E), 290 (X39=L или I), 294 (X40=K или R), 309 (X41=Q или K0, 327 (X42=D или N), 329 (X43=L или F), 330 (X44=I или V), 332 (X45=t или V), 333 (X46=f, I или L), 336 (X47=K или N) и 338 (X48=K или Q).
Лейкоцидины LukA и LukB могут отличаться от нативных полипептидов, обозначенных как SEQ ID NO:2-14 и 16-27, соответственно, вследствие одной или нескольких дополнительных инсерций, замещений или делеций аминокислот, например, один или несколько аминокислотных остатков в SEQ ID NO:2-14 или 16-27 могут быть замещены на другую аминокислоту схожей полярности, которая выступает в роли функционального эквивалента, приводя к молчащему изменению. Это означает, что изменение по сравнению с нативной последовательностью существенно не ослабит основные свойства нативных LukA и LukB. Примеры включают SEQ ID NO:1 и 15. Любой такой аналог LukA или LukB может быть подвергнут скринингу в соответствии с протоколами, раскрытыми здесь (например, анализ клеточной токсичности и анализ повреждения мембраны) для определения того, сохраняет ли он активность нативного LukA или LukB. Замещения в таких лейкоцидинах могут быть выбраны из других членов класса, к которому принадлежит данная аминокислота. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженные (кислотные) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту.
В других вариантах исполнения, неконсервативные изменения (например, одно или аминокислотных замещений, делеций и/или аддиций) могут быть проведены с целью инактивации или детоксификации LukA и LukB. В одном варианте исполнения, нетоксичный аналог LukA отличается от нативных полипептидов тем, что C-концевые аминокислоты в положениях 342-351 подвергаются делеции. За исключением SEQ ID NO:4-6 (которые содержат 9 аминокислот в этих положениях), в аналоге отсутствуют 10 C-концевых аминокислотных остатков. Коллективно, такие аналоги обозначаются LukAΔ10C. Детоксифицированные LukA и LukB могут быть использованы в композициях активных вакцин, описанных здесь. Молекулярные изменения могут быть проведены способами, хорошо известными специалистам в данной области техники, включая метод удлинения праймера на плазмидной матрице с использованием одноцепочечных матриц (Kunkel, Proc. Acad. Sci., USA 82:488-492 (1985)), двухцепочечных ДНК-матриц (Papworth, et al., Strategies 9(3):3-4 (1996)), и ПЦР-клонирование (Braman, J. (ed.), IN VITRO MUTAGENESIS PROTOCOLS, 2nd ed. Humana Press, Totowa, N.J. (2002). Способы определения того, будет ли данное молекулярное изменение LukA или LukB уменьшать цитотоксичность LukAB, описаны здесь.
Таким образом, учитывая приведенное выше описание и в целях настоящего изобретения, LukA может быть более широко описан как любая из последовательностей SEQ ID NO:1-14 (например, SEQ ID NO:2, которая представляет собой полипептид LukA, нативный для штамма Newman S. aureus), или (нативный или ненативный) полипептид, имеющий, по меньшей мере, примерно 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% подобия с этими последовательностями.
Аналогично, с учетом приведенного выше описания и в целях настоящего изобретения, LukB может быть более широко описан как любая из последовательностей SEQ ID NO:15-27 (например, SEQ ID NO:27, которая представляет собой полипептид LukB, нативный для штамма Newman S. aureus), или (нативный или ненативный) полипептид, имеющий, по меньшей мере, примерно 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% подобия с этими последовательностями.
Таким образом, если не будет указано иное, как незрелая, так и зрелая формы нативных LukA и LukB, и последовательности, имеющие менее 100% подобия с нативной LukA (т.е. нативные последовательности и аналоги в равной степени, коллективно обозначаемые здесь "LukA" и "LukB"), могут быть использованы в композициях и способах, и для приготовления антител к LukA и к LukB по настоящему изобретению.
Полинуклеотиды, кодирующие LukA и LukB, и способы синтеза или изоляции LukA и LukB
Лейкоцидины LukA и LukB могут быть синтезированы методами рекомбинантных ДНК, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, нуклеотидная последовательность (обозначенная SEQ ID NO:28), кодирующая полипептид LukA S. aureus (Newman) (SEQ ID NO:2), приведена ниже. Вырожденные последовательности (например, такие, которые могут быть полезны с учетом предпочтительно используемых кодонов у хозяев, выбранных для рекомбинантной экспрессии), кодирующие этот полипептид, и полинуклеотиды, кодирующие другие полипептиды LukA, известны в данной области техники или могут быть сконструированы квалифицированными специалистами в данной области техники.
Нуклеотидная последовательность (обозначенная здесь SEQ ID NO:29), кодирующая полипептид LukB S. aureus (Newman), (SEQ ID NO:27), приведена ниже. Вырожденные последовательности (например, такие, которые могут быть полезны с учетом предпочтительно используемых кодонов у хозяев, выбранных для рекомбинантной экспрессии), кодирующие этот полипептид, и полинуклеотиды, кодирующие другие полипептиды LukB, известны в данной области техники или могут быть сконструированы квалифицированными специалистами в данной области техники.
Полинуклеотиды, кодирующие LukA и LukB, могут быть экспрессированы в хозяине, таком как бактерии (E. coli), растения и/или дрожжи, и затем выделены и очищены. Альтернативно, лейкоцидины LukA и LukB могут быть выделены из бактерий S. aureus (например, штамм Newman) в соответствии со стандартными методиками. Таким образом, такие лейкоцидины могут быть выделены (из нативной или ненативной среды). Они также могут быть очищены так, чтобы они по существу не содержали других белков и клеточных компонентов, с которыми LukA и LukB S. aureus ассоциированы в своем нативном состоянии (т.е. белков и клеточных компонентов, присутствующих в клетках S. aureus) или ненативном состоянии (т.е. белков и клеточных компонентов рекомбинантной клетки-хозяина). Пригодные схемы очистки, которые типично предусматривают комбинацию, по меньшей мере, двух последовательных процедур, известны специалистам в данной области техники. См. Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); и Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, N.Y. (1982), использующие одну или комбинацию двух или больше стандартных методик, таких как аффинная хроматография на колонке и катионообменная жидкостная хроматография.
Антитела к LukA и антитела к LukB
Аспекты настоящего изобретения касаются антител к LukA, которые специфически связываются с LukA, и антител к LukB, которые специфически связываются с LukB, терапевтических композиций, содержащих антитела, и способов их применения. В целях настоящего изобретения, термин "антитело" включает моноклональные антитела, поликлональные антитела, фрагменты антител и генетически модифицированные формы антител и их комбинации. Более конкретно, термин "антитело", который используется взаимозаменяемо с термином "иммуноглобулин", включает полноразмерные (т.е. встречающиеся в природе или полученные с помощью процессов рекомбинации фрагментов нормального гена иммуноглобулина) иммуноглобулиновые молекулы (например, IgG-антитело) и их иммунологически активные фрагменты (т.е. включая специфический связывающий участок полноразмерной молекулы иммуноглобулина), которые также могут быть природными или синтетическими по характеру. Соответственно, термин "фрагмент антитела" включает участок антитела, такой как F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv и т.п. Независимо от структуры, фрагмент антитела связывается с тем же самым антигеном, который распознается полноразмерным антителом и, в контексте настоящего изобретения, специфически связывается с LukA, LukB или комплексом LukAB. Способы получения и скрининга фрагментов антител хорошо известны специалистам в данной области техники.
В некоторых вариантах исполнения, антитела к LukA по настоящему изобретению могут обладать некоторой степенью перекрестной реактивности с другими S-субъединицами лейкоцидина Staphylococcus, такими как HlgC, LukS-PVL, HlgA, LukS-I, LukE, LukEv и LukM. Аналогично, в некоторых вариантах исполнения, антитела к LukB по настоящему изобретению могут обладать некоторой степенью перекрестной реактивности с другими F-субъединицами лейкоцидина Staphylococcus, такими как LukF'-PV, LukF-PV, LukDv, LukD, LukF-I и HlgB. Антитела к LukA и/или к LukB могут ингибировать или понижать активность LukA и активность LukB, соответственно. В некоторых вариантах исполнения, антитела к LukA и/или к LukB нейтрализуют (например, по существу устраняют) активность LukA и LukB, соответственно.
Природные антитела типично имеют две идентичные тяжелые цепи и две идентичные легкие цепи, причем каждая легкая цепь ковалентно связана с тяжелой цепью межцепной дисульфидной связью, и множество дисульфидных связей дополнительно связывают две тяжелые цепи друг с другом. Индивидуальные цепи могут укладываться в домены, имеющие близкие размеры (110-125 аминокислот) и структуры, но разные функции. Легкая цепь может включать один вариабельный домен (VL) и/или один константный домен (CL). Тяжелая цепь также может содержать один вариабельный домен (VH) и/или, в зависимости от класса или изотипа антитела, три или четыре константных домена (CHI, CH2, CH3 и CH4). У людей встречаются изотипы IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, причем IgA и IgG дополнительно делятся на подклассы или субтипы (IgA1-2 и IgG1-4).
В общем, вариабельные домены демонстрируют значительную изменчивость аминокислотных последовательностей разных антител, особенно на участке антигенсвязывающего сайта. В каждом VL и VH присутствуют три области, называемые гипервариабельными участками или участками, определяющими комплементарность (CDR), которые поддерживаются менее вариабельными участками, называемыми каркасными вариабельными областями. Антитела по изобретению включают IgG моноклональные антитела, но антитела по настоящему изобретению также включают фрагменты антител или генно-модифицированные формы. Они представляют собой, например, фрагменты или белки Fv, в которых CDR и/или вариабельные домены приведенных в качестве примеров антител сконструированы в виде одноцепочечных антигенсвязывающих белков генно-инженерными методами.
Часть антитела, состоящая из доменов VL и VH, обозначается Fv (вариабельный фрагмент) и образует антигенсвязывающий сайт. Одноцепочечный Fv (scFv или SCA) представляет собой фрагмент антитела, содержащий VL-домен и VH-домен в одной полипептидной цепи, причем N-конец одного домена и C-конец другого домена соединены гибким линкером. Пептидные линкеры, используемые для получения одноцепочечного антитела, типично являются гибкими пептидами, выбранными таким образом, чтобы обеспечить надлежащую трехмерную укладку доменов VL и VH. Линкер обычно содержит от 10 до 50 аминокислотных остатков и, в некоторых случаях, является более коротким, например, примерно от 10 до 30 аминокислотных остатков, или от 12 до 30 аминокислотных остатков, или даже от 15 до 25 аминокислотных остатков. Пример таких линкерных пептидов включает повторы четырех глициновых остатков с последующим сериновым остатком.
Одноцепочечные антитела не содержат некоторой части или всех константных доменов цельных антител, из которых их получают. Благодаря этому, они позволяют решить некоторые проблемы, ассоциированные с использованием цельных антител. Например, одноцепочечные антитела имеют тенденцию к отсутствию некоторых нежелательных взаимодействий между константными участками тяжелой цепи и другими биологическими молекулами. Дополнительно, одноцепочечные антитела значительно меньше цельных антител и могут обладать большей проницаемостью, чем цельные антитела, что позволяет одноцепочечным антителам более эффективно локализоваться и связывать антигенсвязывающие сайты-мишени. Кроме того, вследствие относительно малого размера одноцепочечные антитела будут с меньшей вероятностью вызывать нежелательный иммунный ответ у реципиента, чем цельные антитела.
Fab (фрагмент, антигенсвязывающий) относится к фрагментам антител, состоящим из доменов VL, CL, VH и CH1. Фрагменты, образующиеся после гидролиза папаином, называются просто Fab и не сохраняют шарнирный участок тяжелой цепи. После гидролиза пепсином образуются различные Fab, сохраняющие шарнирный участок тяжелой цепи. Такие фрагменты с интактными межцепными дисульфидными связями называются F(ab')2, а в тех случаях, когда дисульфидные связи не сохраняются, образуется одиночный Fab'. Фрагменты F(ab')2 обладают более высокой авидностью к антигену, чем моновалентные фрагменты Fab.
Fc (фрагмент, кристаллизующийся) используется для обозначения части или фрагмента антитела, включающего спаренные константные домены тяжелой цепи. В IgG-антителе, например, Fc содержит домены CH2 и CH3. Fc IgA- или IgM-антитела дополнительно включает домен CH4. Fc ассоциирован со связыванием Fc-рецептора, активацией комплемент-опосредованной цитотоксичности и антитело-зависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC). Для таких антител, как IgA и IgM, которые представляют собой комплексы множества IgG-подобных белков, для образования комплекса требуются константные домены Fc.
Наконец, шарнирный участок разделяет Fab- и Fc-участки антитела, обеспечивая подвижность Fab по отношению друг к другу и по отношению к Fc, а также включает множество дисульфидных связей для ковалентного связывания двух тяжелых цепей.
"Специфичность" антитела относится к селективному распознаванию антителом определенного эпитопа антигена. Термин "эпитоп" включает любую белковую детерминанту, способную специфически связываться с иммуноглобулином или T-клеточным рецептором, или иным образом взаимодействовать с молекулой. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или углеводы, или боковые цепи сахаров, и обычно обладают специфическими трехмерными структурными характеристиками, а также специфическими характеристиками заряда. Эпитоп может быть "линейным" или "конформационным". В линейном эпитопе все точки взаимодействия между белком и взаимодействующей молекулой (такой как антитело) расположены линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка. В конформационном эпитопе точки взаимодействия распределены по аминокислотным остаткам белка, расположенным на некотором расстоянии друг от друга, т.е. несмежным аминокислотам, сближающимся в результате укладки третичной структуры белка. Эпитопы, образованные смежными аминокислотами, типично сохраняются после воздействия денатурирующих растворителей, в то время как эпитопы, образующиеся при третичной укладке, типично исчезают после обработки денатурирующими растворителями. Эпитоп типично включает, по меньшей мере, 3 и, как правило, по меньшей мере, 5 или 8-10 аминокислот с уникальной пространственной конформацией. Антитела, распознающие один и тот же эпитоп, могут быть определены с помощью одного иммуноанализа, демонстрирующего способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью.
Моноклональные антитела по настоящему изобретению могут быть мышиными, человеческими, гуманизированными или химерными. Гуманизированное антитело представляет собой рекомбинантный белок, в котором CDR антитела одного вида; например, антитела грызуна, кролика, собаки, козы, лошади или курицы (или любого другого пригодного антитела животного), переносят из тяжелых и легких вариабельных цепей антитела грызуна в тяжелые и легкие вариабельные домены человека. Константные домены молекулы антитела берут из человеческого антитела. Способы получения гуманизированных антител хорошо известны специалистам в данной области техники. Химерные антитела предпочтительно имеют константные участки, полученные по существу или исключительно из константных участков человеческого антитела, и вариабельные участки, полученные по существу или исключительно из последовательности вариабельного участка млекопитающего, отличного от человека. Эффективность процесса химеризации можно также увеличить путем замены вариабельных участков - кроме гипервариабельных участков или участков, определяющих комплементарность (CDR), мышиного (или другого не являющегося человеком млекопитающего) антитела на соответствующие человеческие последовательности. Вариабельные участки, отличные от CDR, также известны как вариабельные каркасные участки (FR). Еще одни моноклональные антитела по настоящему изобретению являются биспецифичными, т.е. они обладают специфичностью по отношению к обоим LukA и LukB. Биспецифичные антитела предпочтительно являются человеческими или гуманизированными.
Вышеописанные антитела могут быть получены в соответствии со стандартными методиками. Например, LukA, LukB (в значении, в котором эти термины используются здесь, включают их нетоксичные аналоги, такие как LukAΔ10C) или иммунологически активный фрагмент LukA или LukB могут быть введены субъекту (например, млекопитающему, такому как человек или мышь). Лейкоцидины могут быть использованы сами по себе в качестве иммуногенов или они могут быть присоединены к белку-носителю или другим объектам, таким как бусины, например, сефарозные бусины. После продуцирования млекопитающим антител выделяют смесь антитело-продуцирующих клеток, таких как спленоциты, из которых могут быть получены поликлональные антитела. Моноклональные антитела могут продуцироваться путем изоляции индивидуальных антитело-продуцирующих клеток из смеси и их иммортализации, например, путем слияния с опухолевыми клетками, такими как клетки миеломы. Полученные гибридомы сохраняют в культуре и моноклональные антитела собирают из культуральной среды.
Методики приготовления рекомбинантных моноклональных антител хорошо известны специалистам в данной области техники. Рекомбинантные поликлональные антитела могут быть получены способами, аналогичными описанным в публикации патентной заявки США 2002/0009453, с использованием LukA, LukB или LukAB в качестве иммуногена (иммуногенов).
Терапевтические композиции
LukA и LukB могут быть включены в терапевтическую композицию, предназначенную для использования в качестве противовоспалительного агента при лечении острых воспалительных состояний, включая локализованные острые воспалительные состояния. LukA и LukB также могут быть включены в терапевтическую композицию для использования в качестве активной вакцины. Антитела к LukA и к LukB могут быть включены в терапевтическую композицию для использования в качестве пассивной вакцины. Пассивные и активные вакцины могут быть использованы профилактически для ингибирования начальных проявлений инфекции S. aureus, или терапевтически для лечения инфекций S. aureus, в частности, таких инфекций S. aureus, как MRSA, известная как резистентная, или в случае, когда определенный субъект окажется невосприимчивым к лечению другими обычными методами терапии антибиотиками.
В вариантах исполнения, в которых терапевтическая композиция предназначена для использования в качестве активной вакцины, LukA и/или LukB могут быть изменены таким образом, чтобы они проявляли пониженную токсичность. Молекулярные изменения описаны выше. Таким образом, могут быть использованы их нетоксичные аналоги, такие как LukAΔ10C. Заявители считают, что антитела, продуцируемые в ответ на нетоксичный иммуноген, будут нейтрализовать токсичные нативные LukA или LukAB. Другие изменения в целях снижения токсичности LukA и LukB включают химическую обработку (например, модифицирование определенных аминокислотных остатков) или конъюгирование с другим фрагментом (например, с другим бактериальным антигеном, таким как бактериальный полисахарид или бактериальный гликопротеин). Известны химические изменения других токсинов S. aureus в целях инактивации или детоксификации (или снижения токсичности). Способы определения того, будет ли данное изменение снижать токсичность LukA или LukB, известны специалистам в данной области техники и/или описаны здесь.
Терапевтические композиции по настоящему изобретению готовят путем составления композиций LukA и LukB, или антител к LukA и к LukB, с фармацевтически приемлемым носителем и, необязательно, фармацевтически приемлемым эксципиентом. В используемом здесь значении термины "фармацевтически приемлемый носитель" и "фармацевтически приемлемый эксципиент" (например, добавки, такие как разбавители, иммуностимуляторы, адъюванты, антиоксиданты, консерванты и солюбилизирующие агенты) являются нетоксичными для клетки или млекопитающего, которые подвергаются их воздействию в используемых дозировках и концентрациях. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают воду, например, забуференную фосфатом, цитратом и другой органической кислотой. Типичные примеры фармацевтически приемлемых эксципиентов, которые могут быть пригодны для использования по настоящему изобретению, включают антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота; низкомолекулярные (менее примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; адъюванты (выбранные так, чтобы избежать адъювант-индуцируемой токсичности, такие как β-глюкан, как описано в патенте США 6355625, или гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (GCSF)); гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахароспирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN®, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и PLURONICS®.
Как указано в другом месте данного описания, терапевтические композиции по настоящему изобретению могут дополнительно содержать, по меньшей мере, один дополнительный активный агент.
Терапевтические композиции по настоящему изобретению могут быть подготовлены для хранения путем смешения активного ингредиента (ингредиентов), имеющих желательную степень чистоты, с фармацевтически приемлемым носителем и, необязательно, эксципиентом и/или дополнительным активным агентом, в форме лиофилизированных композиций или водных растворов.
Применение терапевтических композиций -- Показания
Острые воспалительные состояния
Под воспалением обычно понимают защитную биологическую реакцию, направленную на удаление вредных инвазивных стимулов, таких как патогены (например, бактерии и вирусы), поврежденные клетки и раздражители, и на инициирование исцеления. Воспаление более конкретно понимают как реакцию васкуляризованной живой ткани на повреждение. По существу, воспаление представляет собой фундаментальный стереотипный комплекс цитологических и химических реакций пораженных кровеносных сосудов и прилегающих тканей в ответ на повреждение или аномальное раздражение, вызванное физическим, химическим или биологическим агентом. Воспаление обычно приводит к скоплению жидкости и кровяных клеток на месте повреждения и обычно является процессом заживления. Без воспалительного процесса раны и инфекции не излечивались бы и прогрессирующее разрушение ткани становилось бы угрожающим для жизни. Острое воспаление относится к начальной реакции организма на инвазивные стимулы и включает рекрутмент плазмы и белых кровяных клеток (лейкоцитов) к поврежденным или инфицированным тканям. Пролонгированное воспаление, также называемое хроническим воспалением, связано с постепенным изменением типа иммунных клеток, присутствующих на месте воспаления, и характеризуется одновременным разрушением и исцелением ткани от воспалительного процесса.
Однако воспаление иногда причиняет вред, обычно в результате нарушения нормального развития воспаления. Воспалительными являются болезни, относящиеся к, характеризующиеся, вызывающие, вызванные или подверженные влиянию воспаления. "Острые воспалительные состояния" как термин, используемый здесь, в соответствии с нормальной медицинской лексикой, относится к воспалительным состояниям с быстрым началом и тяжелыми симптомами. Длительность начального периода, от нормального состояния пациента до серьезных проявлений симптомов воспаления, обычно не превышает примерно 72 часов. Острые воспалительные состояния следует отличать от хронических воспалительных состояний, которые представляют собой воспалительные состояния большой продолжительности, характеризующиеся незначительными изменениями или медленным развитием болезни. Различие между острыми и хроническими состояниями хорошо известны специалистам в области медицины.
Основные иммунные клетки, принимающие участие в острой стадии воспаления, а также в острых воспалительных расстройствах, включают мононуклеарные клетки (например, моноциты, которые в ответ на воспаление дифференцируются в макрофаги), дендритные клетки и нейтрофилы (которые мигрируют к месту воспаления). Эти иммунные клетки способствуют проявлению воспалительного ответа путем высвобождения воспалительных медиаторов, таких как гистамин, интерферон-гамма, интерлейкин-8, лейкотриен B4, окись азота и т.д., и путем поглощения бактерий, вирусов и клеточных обломков (процесс, известный как фагоцитоз). Такие клетки известны специалистам в данной области техники коллективно как фагоциты.
Заявители обнаружили, что LukAB нацелен на и уничтожает человеческие фагоциты, и что такая LukAB-опосредованная цитотоксичность является по существу специфической по отношению к этим клеткам, но не к другим ядросодержащим клеткам млекопитающих. Без намерения ограничиваться какой-либо конкретной теорией действия, заявители считают, что комплекс LukA/LukB образует поры в плазматической мембране инфильтрующих фагоцитов, вызывая гибель клеток и тем самым уменьшая воспаление. Таким образом, противовоспалительные композиции по настоящему изобретению могут быть пригодны для лечения острых воспалительных состояний у млекопитающих, таких как человек, независимо от их причины, например, любой бактериальной или вирусной инфекции и, в предпочтительных вариантах исполнения, локализованных острых воспалительных состояний. Другие примеры таких состояний включают аллергический контактный дерматит, острую гиперчувствительность, острое неврологическое воспалительное поражение (например, вызванное острой инфекцией), острый инфаркт миокарда, острое нейрональное поражение, вызванное хирургией с использованием искусственного кровообращения, и острые локализованные противовоспалительные состояния, вызванные бактериальной или вирусной инфекцией.
В предпочтительных вариантах исполнения, острое воспалительное состояние представляет собой инфицированную рану на коже или в мягкой ткани. Раны, поддающиеся лечению по изобретению, могут иметь форму проколов, разрезов или разрывов живых тканей. Раны кожи могут проникать через эпидермис, дерму или, в случае глубоких ран, в подкожные ткани. Таким образом, раны, поддающиеся лечению терапевтическими композициями по настоящему изобретению, включают глубокие грудинные раны, например, после хирургии на открытом сердце, и послеоперационные раны после брюшной и любых других типов хирургии. Другие раны включают раны, причиненные травмами, такими как выстрелами из огнестрельного оружия, ножами или любыми другими предметами, способными причинять разрез или разрыв кожи. Раны, возникающие как побочные эффекты медикаментозного лечения или как симптомы различных патологий (например, язвы, ассоциированные с саркомой Капоши), а также внутренние раны (например, трещины заднего прохода и раны или поражения желудочно-кишечного тракта, такие как язвы желудка или кишечника) также могут поддаваться лечению с помощью настоящего изобретения.
Еще одни острые воспалительные состояния, которые могут поддаваться лечению терапевтическими композициями по настоящему изобретению, включают конъюнктивит, воспаление радужной оболочки глаза, увеит, центральный ретинит, наружный отит, средний гнойный острый отит, мастоидит, лабиринтит, хронический ринит, острый ринит, синусит, фарингит, тонзиллит (tonsillitio), контактный дерматит, дермонекроз, диабетический полиневрит, полимиозит, оссифицирующий миозит, дегенеративный артрит, ревматоидный артрит, периартрит плечевого сустава и деформирующий остит.
Инфекции S. aureus
Настоящее изобретение также предусматривает способ ингибирования начальных проявлений или лечения инфекции S. aureus путем введения композиций антитела субъекту-млекопитающему, нуждающемуся в этом. В целях настоящего изобретения, целевая популяция субъектов включает млекопитающих, таких как людей, инфицированных, или с риском инфицирования S. aureus. В некоторых вариантах исполнения, субъект, лечение которого должно проводиться, инфицирован S. aureus, включая MRSA, и/или уже получал лечение антибиотиками или другими терапевтическими агентами, но лечение оказалось безуспешным.
Терапевтически эффективные количества
В контексте лечения острых воспалительных состояний, количества LukA и LukB являются терапевтически эффективными в том смысле, что лечение позволяет достичь любой одной или нескольких целей из уменьшения числа симптомов, снижения тяжести, по меньшей мере, одного симптома или задержки дальнейшего развития, по меньшей мере, одного симптома, или даже полного облегчения острого воспалительного состояния.
В контексте использования терапевтических композиций в качестве пассивных или активных вакцин в связи с инфекцией S. aureus, терапевтически эффективные количества LukA и LukB, или антител к LukA и к LukB, также являются профилактически эффективными в том смысле, что введение композиции позволяет достичь любой одной или нескольких целей из ингибирования или профилактики инфекции S. aureus у субъектов, подверженных риску, и в случае субъектов-млекопитающих, инфицированных S. aureus, уменьшения числа симптомов, снижения тяжести, по меньшей мере, одного симптома или задержки дальнейшего развития, по меньшей мере, одного симптома, или даже полного облегчения инфекции.
В общем, терапевтически эффективные количества LukA, LukB и антител к LukA и к LukB могут быть определены в соответствии со стандартными процедурами, которые принимают во внимание многочисленные факторы, включая, например, концентрации этих активных агентов в композиции, способ и частоту введения, тяжесть острого воспалительного состояния или инфекции S. aureus, лечение которой должно проводиться (или которая должна быть предотвращена) и характеристики субъекта, такие как возраст, вес и общее состояние здоровья и иммунной системы. Общие рекомендации можно найти, например, в публикациях Международной конференции по гармонизации (International Conference on Harmonization) и REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Publishing Company 1990). Клинический врач может вводить LukA и LukB или антитела к LukA и к LukB до достижения дозировки, обеспечивающей желательный или требуемый профилактический или терапевтический эффект. Ход такого лечения можно легко контролировать с помощью обычных анализов.
Терапевтически эффективные количества LukA и LukB типично составляют 1-400 мкг каждого из LukA и LukB, на дозу или в сутки. Предпочтительно, количества LukA и LukB являются по существу одинаковыми. Терапевтически эффективные количества композиций антител типично составляют, по меньшей мере, 50 мг композиции на килограмм веса тела (мг/кг), включая по меньшей мере 100 мг/кг, по меньшей мере 150 мг/кг, по меньшей мере 200 мг/кг, по меньшей мере 250 мг/кг, по меньшей мере 500 мг/кг, по меньшей мере 750 мг/кг и по меньшей мере 1000 мг/кг, на дозу или в сутки. Дозировки композиций моноклональных антител могут быть ниже, такими как примерно одна десятая от композиций не-моноклональных антител, такими как, по меньшей мере, примерно 5 мг/кг, по меньшей мере, примерно 10 мг/кг, по меньшей мере, примерно 15 мг/кг, по меньшей мере, примерно 20 мг/кг или, по меньшей мере, примерно 25 мг/кг.
Способы введения
Перед введением терапевтические композиции по настоящему изобретению могут быть стерилизованы, что можно легко осуществить путем фильтрации через мембраны для стерильной фильтрации, перед или после лиофилизации и восстановления. Терапевтические композиции могут быть помещены в контейнер, имеющий стерильное входное отверстие, например, пакетик с раствором для внутривенного введения или флакон, имеющий пробку, которую прокалывают иглой для подкожных инъекций.
Противовоспалительная композиция может быть введена любым числом путей в соответствии с принятой медицинской практикой. Предпочтительные способы включают внутривенное, внутримышечное, подкожное и чрескожное введение, с использованием методик, известных специалистам в данной области техники. Могут быть предусмотрены другие пути введения. В случае лечения острых воспалительных состояний, которые являются локализованными, несистемное введение может быть предпочтительным, и в этом случае введение терапевтической композиции осуществляется в месте острого воспаления или вокруг него.
Комбинированная терапия
В некоторых вариантах исполнения, терапевтическую композицию вводят как часть комбинированной терапии в сочетании с другим активным агентом, в зависимости от характера острого воспалительного состояния или инфекции S. aureus, лечение которой проводится. Такие дополнительные активные агенты включают антиинфекционные агенты, антибиотические агенты и антимикробные агенты. Типичные примеры антиинфекционных агентов, которые могут быть пригодными для использования по настоящему изобретению, включают ванкомицин и лизостафин. Типичные примеры антибиотических агентов и антимикробных агентов, которые могут быть пригодными для использования по настоящему изобретению, включают пенициллиназа-резистентные пенициллины, цефалоспорины и карбапенемы, включая ванкомицин, лизостафин, пенициллин G, ампициллин, оксациллин, нафциллин, клоксациллин, диклоксациллин, цефалотин, цефазолин, цефалексин, цефадрин, цефамандол, цефокситин, имипенем, меропенем, гентамицин, тейкопланин, линкомицин и клиндамицин. Дозировки этих антибиотиков хорошо известны специалистам в данной области техники. См. например, MERCK MANUAL OF DIAGNOSIS AND THERAPY, Section 13, Ch. 157, 100th Ed. (Beers & Berkow, eds., 2004). Противовоспалительные, антиинфекционные, антибиотические и/или антимикробные агенты могут быть скомбинированы перед введением, или могут вводиться одновременно (как часть одной и той же композиции или с помощью разных композиций), или последовательно с терапевтическими композициями по настоящему изобретению.
В некоторых вариантах исполнения, композиция антитела к LukA и/или антитела к LukB является мультивалентной, поскольку также содержит антитело, которое специфически связывает другой бактериальный антиген (и которое необязательно нейтрализует другой бактериальный антиген). Антитела могут специфически связывать любые из антигенов, описанных здесь в контексте композиций вакцины. Таким образом, например, другое антитело может специфически связывать полисахариды или гликопротеины, включая S. aureus типа 5, S. aureus типа 8, S. aureus 336, компоненты лейкоцидинов, такие как PVL (включая индивидуальные субъединицы PVL, LukS-PV и LukF-PV), субъединицы гамма-гемолизина (HlgA, HlgB и HlgC), LukE или LukD S. aureus, LukM или LukF'-PV S. aureus, липотейхоевую кислоту (LTA) и белковые микробные поверхностные компоненты, распознающие адгезивные молекулы матрикса (MSCRAMM).
Схемы лечения
Терапевтические композиции по настоящему изобретению могут быть введены в виде разовой дозы или в соответствии с протоколом введения многократных доз. Например, вводят относительно небольшое число доз терапевтической композиции, такое как одна или две дозы. В вариантах исполнения, включающих обычную терапию антибиотиками, которая обычно предусматривает введение множества доз на протяжении нескольких дней или недель, антибиотики могут вводиться один, два или три или больше раз в день на протяжении периода времени, такого как, по меньшей мере, 5 дней, 10 дней или даже 14 или больше дней, в то время как композиция антитела обычно вводится всего один или два раза. Однако разные дозировки, время введения доз и относительные количества терапевтической композиции и антибиотиков могут быть выбраны и откорректированы рядовым специалистом в данной области техники.
Способы идентификации ингибиторов LukAB-опосредованной цитотоксичности и измененные формы LukA и LukB, обладающие меньшей токсичностью
Антитела к LukA и к LukB и их фрагменты, а также другие потенциальные терапевтические частицы (например, малые органические молекулы) могут быть использованы в различных способах (включая форматы анализов или скрининг) для оценки их способности ингибировать LukAB-опосредованную цитотоксичность. Как описано ниже, разработаны такие способы идентификации агентов, которые ингибируют определенный аспект каскада событий, приводящего к LukAB-опосредованной цитотоксичности и лизису человеческих фагоцитов. Также разработаны способы идентификации измененных форм LukA и LukB, обладающих пониженной токсичностью по сравнению с их нативными аналогами. События-мишени, являющиеся частью каскада, включают, например, связывание LukA с мембранами фагоцитов, связывание LukB с LukA (олигомеризация LukAB) и блокировка мембранной поры, образованной олигомером LukAB. Форматы анализов обычно требуют использования человеческих фагоцитов (или их LukAB мембранно-связывающего участка), пригодной культуральной среды и очищенного LukA или очищенных LukA и LukB.
Квалифицированному специалисту будет понятно, что приведенные далее протоколы являются только иллюстративными, и что различные рабочие параметры, такие как условия реакции, выбор детектируемой метки и аппаратура (например, инструменты для детектирования и количественного определения), могут меняться в зависимости от ситуации.
Приведенные далее способы обычно предназначены для идентификации агентов, ингибирующих LukAB-цитотоксичность, не обязательно позволяя точно определить задействованное событие каскада.
Для идентификации ингибиторов LukAB-цитотоксичности, человеческие фагоциты (например, клетки PMN-HL60) могут быть высеяны на 384-луночный черный обработанный планшет для тканевых культур с прозрачным дном (Corning) при 5×103 клеток/лунку в конечном объеме 50 мкл среды RPMI (Gibco) с добавкой 10% термоинактивированной сыворотки плода коровы (FBS). Клетки затем могут быть введены в контакт/смешаны с/введены в реакцию/обработаны тестируемым соединением/молекулой (около 5 мкл/разные концентрации) и затем интоксицированы LukA и LukB, которые в предпочтительных вариантах исполнения являются по существу очищенными (5 мкл около 0,001-2 мкМ раствора), предпочтительно добавляются вместе, в условиях культивации, позволяющих провести интоксикацию фагоцитов с помощью LukA и LukB, например, в течение 1 ч при 37°C, 5% CO2. В качестве контроля, клетки могут быть обработаны культуральной средой (100% жизнеспособные) и 0,1% об./об. Triton X100 (100% гибель).
В этих вариантах исполнения, клетки, обработанные как описано выше, могут затем инкубироваться с красителем для контроля жизнеспособности клеток, например, с помощью набора CellTiter (Promega) (который позволяет определять жизнеспособность клеток по оптической плотности путем измерения числа жизнеспособных клеток в культуре посредством количественного определения метаболической активности клеток), и инкубироваться в течение дополнительного периода времени (например, примерно 2 ч при 37°C, 5% CO2). Жизнеспособность клеток может быть затем определена, например, путем измерения колориметрической реакции при 492 нм с помощью планшет-ридера, например, Envision 2103 Multi-label Reader (Perkin-Elmer). Процент жизнеспособных клеток может быть рассчитан, например, с помощью приведенного ниже уравнения: % жизнеспособности=100×[(Аb492Образец-Ab492Triton X)/(Ab492Среда для тканевых культур). Увеличение 100% жизнеспособности позволяет предположить наличие ингибирования LukAB цитотоксичности.
Вариант этого анализа называется анализом повреждения мембраны. В таких вариантах исполнения, клетки, обработанные как описано выше (например, вплоть до и включая стадию обработки клеток тестируемым соединением/молекулой и затем интоксицирования клеток очищенным LukA, могут затем инкубироваться с не проникающим в клетку флуоресцентным красителем, таким как SYTOX green (зеленый) (0,1 мкМ; Invitrogen) (в соответствии с инструкциями производителя), и инкубироваться, например, в течение дополнительных 15 минут при комнатной температуре в темноте. Флуоресценция, как индикатор повреждения мембраны, может быть затем измерена с помощью планшет-ридера, такого как Envision 2103 Multilabel Reader (Perkin-Elmer) при длине волны возбуждения 485 нм, длине волны излучения 535 нм. Уменьшение флуоресценции позволяет предположить ингибирование LukAB-цитотоксичности.
Взятые вместе, эти анализы способствуют идентификации соединений, которые ингибируют или ослабляют цитотоксичные эффекты LukAB по отношению к клеткам человеческих фагоцитов.
Дополнительные способы могут быть использованы независимо или в сочетании со способами, описанными выше; в частности, если вышеописанные способы выявляют ингибирующую активность, то это позволит квалифицированному специалисту в данной области техники более точно определить, на какое именно событие биохимического каскада влияет или нацелен агент. Такие события включают связывание LukA с мембранами фагоцитов, связывание LukB с LukA (олигомеризация LukAB) и блокировку мембранных пор, образованных олигомером LukAB.
Скрининг связывания ингибиторов LukA с клетками-мишенями
Для скрининга ингибиторов, блокирующих или ослабляющих связывание LukA с клетками-мишенями, которое считается первой стадией процесса интоксикации, человеческие фагоциты (например, PMN-HL60 клетки) могут быть высеяны в 384-луночные плоскодонные обработанные планшеты для тканевых культур (Corning) в количестве 2,5×103 клеток/лунку в конечном объеме 50 мкл среды RPMI (Gibco) с добавкой 10% термоинактивированной сыворотки плода коровы (FBS). Клетки могут быть затем обработаны тестируемым соединением/молекулой (около 5 мкл/разные концентрации) и интоксицированы очищенным флуоресцентно меченым LukA (например, FITC, Cy3, Cy5, APC, PE) 5 мкл около 0,01-2 мкМ раствора в течение 1 ч при 37°C, 5% CO2. Для оценки эффективности тестируемых соединений/молекул, связанная с клетками флуоресценция может быть измерена в качестве индикатора связывания LukA с клетками, например, с помощью автоматической флуоресцентной системы микроскопической визуализации, предназначенной для многопараметрического скрининга и многопараметрического анализа (например, Cellomics ArrayScan HCS Reader (Thermo Scientific) (возбуждение 485 нм, излучение 535 нм)).
Скрининг ингибиторов олигомеризации/взаимодействия LukA-LukB
Для скрининга ингибиторов, блокирующих или ослабляющих взаимодействие LukA/LukB, которое считается второй стадией процесса интоксикации, человеческие фагоциты (например, клетки PMN-HL60) могут быть высеяны на 384-луночные плоскодонные обработанные планшеты для тканевых культур (Corning) в количестве 2,5×103 клеток/лунку в конечном объеме 50 мкл среды RPMI (Gibco) с добавкой 10% термоинактивированной сыворотки плода коровы (FBS). Клетки могут быть затем обработаны тестируемым соединением/молекулой и затем интоксицированы смесью очищенного LukA и очищенного LukB, где LukB является флуоресцентно-меченым флуоресцентной молекулой, такой как FITC, Cy3, Cy5, APC и PE, и оставлены до завершения процесса интоксикации (например, в течение 1 ч при 37°C, 5% CO2). Для оценки эффективности тестируемых соединений/молекул, связанная с клетками LukB-FITC флуоресценция может быть измерена в качестве индикатора взаимодействия LukA/LukB-FITC, с использованием, например, автоматической флуоресцентной системы микроскопической визуализации, предназначенной для многопараметрического скрининга и многопараметрического анализа (например, Cellomics ArrayScan HCS Reader (Thermo Scientific) (возбуждение 485 нм, излучение 535 нм)).
Скрининг ингибиторов образования пор LukAB
Для скрининга ингибиторов, блокирующих или ингибирующих образование пор LukAB, эффекторной молекулы, приводящей к клеточному лизису, человеческие фагоциты (например, клетки PMN-HL60) могут быть высеяны на 384-луночный черный обработанный планшет для тканевых культур с прозрачным дном (Corning) в количестве 2,5×103 клеток/лунку в конечном объеме 50 мкл среды RPMI (Gibco) с добавкой 10% термоинактивированной сыворотки плода коровы (FBS). Клетки могут быть затем обработаны тестируемым соединением/молекулой (около 5 мкл, с разными концентрациями) и затем интоксицированы очищенным LukAB (около 0,001-2 мкМ) в течение 10 минут при 37°C, 5% CO2. В качестве контроля, клетки PMN-HL60 могут быть обработаны культуральной средой (отрицательный контроль) и 0,1% об./об. Triton X100 (положительный контроль).
Для прямой оценки пор LukAB на поверхности клетки-хозяина может быть использован анализ притока бромида этидия (EB). EB представляет собой катионный краситель малого размера, не проникающий в здоровые клетки-хозяева. После образования катионных пор LukAB, EB поступает в клетки и связывается с ДНК, что приводит к флуоресценции. Клетка, обработанная таким образом, может быть затем инкубирована с EB (5 мкМ) в течение еще 5 минут при комнатной температуре в темноте. Для оценки эффективности тестируемых соединений/молекул при ингибировании образования LukAB-пор, флуоресценция может быть измерена в качестве индикатора порообразования, с использованием планшет-ридера, такого как Envision 2103 Multilabel Reader (Perkin-Elmer) при возбуждении 530 нм, излучении 590 нм. Этот анализ способствует идентификации молекул, которые могут блокировать или ингибировать LukAB-поры, снижая тем самым LukAB-опосредованную токсичность.
Способ определения продуцирования LukAB клиническими изолятами S. aureus для прогнозирования тяжести инфекции
Еще один аспект настоящего изобретения касается способа прогнозирования или оценки тяжести инфекции S. aureus, предусматривающего детектирование присутствия или количества LukA и/или LukB, или их соответствующих генов в биологическом образце, полученном от инфицированного субъекта. Таким образом, детектирование присутствия или относительно высоких количеств LukA и/или LukB, или детектирование их соответствующих генов (например, наблюдаемое для S. aureus штамм Newman, 4645 и штаммов MRSA USA300 и USA500) по сравнению с контролем (например, штаммы S. aureus USA100 и USA400), продуцирующим небольшие или недектируемые количества LukA и/или LukB, является показателем тяжелой инфекции. Что касается детектирования или присутствия относительных количеств LukA и/или LukB, можно сослаться на иллюстрации, приведенные на Фиг. 4A. Типичные примеры вариантов исполнения способа описаны ниже.
Иммуноблот-анализ для определения уровней LukA и LukB
Для определения уровней LukAB (т.е. продуцирования LukAB), биологический образец, например, жидкость (например, кровь) или образец ткани, получают от инфицированного субъекта, с последующим помещением культуры в пригодные условия культивирования для обеспечения роста S. aureus, получают супернатант культуры, выделяют из него бактериальные белки, идентифицируют LukA и/или LukB, и затем количественно определяют LukA и/или LukB. Более конкретно, в одном варианте исполнения, штаммы клинического изолята могут быть выбраны и выращены в пригодной культуральной среде, например, в культуральной среде Royal Park Memorial Institute 1640 (RPMI; Invitrogen) с добавкой 1% казаминовых кислот (RPMI+CAS) в пригодных условиях культивирования, например, в течение 12-18 часов при 37°C со встряхиванием при 180 об/мин. Бактерии могут быть затем осаждены путем центрифугирования, и собирают супернатанты культур. Супернатанты культур (около 30 мкл) могут быть затем смешаны с 10 мкл буфера ДСН-Лэммли и нагреты до 95°C в течение 10 минут. Белки могут быть затем разделены, например, с помощью 15% гелей ДСН-ПААГ и затем перенесены на твердую подложку, например, нитроцеллюлозную мембрану. Мембраны можно затем инкубировать с антителами, направленными против LukA или LukB (например, кроличьими поликлональными антителами), и присутствие LukA или LukB можно визуализировать путем детектирования комплексов антитело-LukA/антитело-LukB со вторичным антителом, конъюгированным с флуорофором (например, анти-кроличье антитело, конъюгированное с AlexaFluor-680; Invitrogen). Мембраны можно затем высушить и отсканировать, например, с помощью системы инфракрасной визуализации Odyssey (LI-COR Biosciences) для определения количества LukA и LukB.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для определения присутствия генов LukA и/или LukB
Для определения присутствия генов, кодирующих LukAB, получают от инфицированного субъекта биологический образец с последующим помещением культуры в пригодные условия культивирования для обеспечения роста S. aureus, экстрагируют нуклеиновую кислоту из культуры S. aureus и затем проводят, по меньшей мере, один цикл амплификации нуклеиновой кислоты с использованием ПЦР или другого пригодного протокола амплификации, используя LukA и/или LukB-специфичные праймеры и детектируя LukA и/или LukB. Таким образом, в одном типичном примере варианта исполнения, после подготовки исходного образца, штаммы клинического изолята могут выращиваться на твердой среде, например, триптиказо-соевом бульоне (TSB), отвержденном 1,5% агара, при 37°C. Колонии S. aureus могут быть затем выбраны и подвергнуты ферментативному гидролизу, например, с помощью 2 мг/мл лизостафина (AMBI PRODUCTS LLC) в TSM-буфере (100 мМ TRIS pH 7, 500 мМ сахарозы, 10 мМ MgCl2) в течение 10 минут при 37°C. Образцы затем можно центрифугировать, супернатант отбрасывают и осадок ресуспендируют в 100 мкл стерильной воды, с последующим кипячением в течение пяти минут при 100°C и центрифугированием. Супернатант обеспечивает исходный материал и ДНК-матрицу для реакции амплификации, такой как ПЦР, с использованием LukA и/или LukB-специфичных праймеров.
Рабочие примеры
Изобретение будет далее описано со ссылкой на приведенные ниже неограничивающие примеры. Если не указано иное, все доли определяются по весу.
Пример 1: Экспрессия и очистка рекомбинантного LukA и LukB в нативных условиях: система экспрессии pMAL
Гены LukA и LukB амплифицируют из ДНК S. aureus с помощью Taq-полимеразы в стандартных условиях ПЦР при температуре отжига 55°C с использованием указанных далее праймеров: 5'-ccc-GTCGAC-tta-TCCTTCTTTATAAGGTTTATTGTC-3' (SEQ ID NO:30) и 5'-ccc-GAAGGATTTCACATCATCATCATCATCACAATTCAGCTCATAAAGACTCTC-3' (SEQ ID NO:31) для LukA и 5'-CCCCGAAGGATTTCaCATCATCATCATCATCACAAGATTAATTCTGAAATCAAACAAG-3' (SEQ ID NO:32) и 5'-ccc-GTCGAC-tta-TTTCTTTTCATTATCATTAAGTACTT-3' (SEQ ID NO:33) для LukB. Генные продукты LukA и LukB гидролизуют Nde1 и Sal1 (New England BioLabs) и лигируют в вектор pMAL-c4X (New England BioLabs). Конструкты трансформируют в E. coli штамм DH5α и плазмидные вставки подтверждают путем секвенирования. Трансформанты выращивают в среде Terrific Broth со 100 мкг/мл ампициллина и 0,2% глюкозы при 37°C до достижения культурами значения A600, равного приблизительно 0,5. Экспрессию 6-his-меченого MBP-LukA или 6-his-меченого MBP-LukB индуцируют с помощью 0,3 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) при 16°C, в течение ночи, со встряхиванием при 180 об/мин.
После индуцирования клетки собирают центрифугированием при 4000 об/мин при 4°C в течение 20 мин и ресуспендируют в охлажденном на льду буфере для колонок (20 мМ Tris-HCl, 200 мМ NaCl и 1 мМ ЭДТА) с добавкой не содержащего ЭДТА ингибитора протеазы (Roche). Бактериальные клетки озвучивают на льду в течение 1 мин (импульсы 10 с). Образцы центрифугируют при 10000 об/мин при 4°C в течение 30 мин и супернатант собирают и наносят на колонку с амилозной смолой. Колонки промывают дважды буфером для колонок и очищенный 6-his-меченый MBP-LukA или 6-his-меченый MBP-LukB элюируют в 10 фракциях буфером для колонок с добавкой 10 мМ мальтозы.
Пример 2: Экспрессия и очистка рекомбинантных активных токсинов LukA, LukAΔ10C, Δ33NLukA и LukB: система экспрессии pET14b
Гены LukA, LukAΔ10C, Δ33NLukA и LukB амплифицируют из ДНК S. aureus с помощью полимеразы Vent (New England BioLabs) в стандартных условиях ПЦР при температуре отжига 55°C с использованием приведенных далее праймеров: 5'-cccc-CTCGAG-AATTCAGCTCATAAAGACTCTCAAG-3' (SEQ ID NO:34) и 5'-cccc-GGATCC-tta-TCCTTCTTTATAAGGTTTATTGTC-3' (SEQ ID NO:35) для LukA; 5'-cccc-CTCGAG-AATTCAGCTCATAAAGACTCTCAAG (SEQ ID NO:34) и 5'-cccc-GGATCC-tta-ATATTTATCAACGACTTTAACTG (SEQ ID NO:36) для LukAΔ10C; 5'-cccc-CTCGAG-TCAACAGCACCGGATGATATTG (SEQ ID NO:37) и 5'-cccc-GGATCC-tta-TCCTTCTTTATAAGGTTTATTGTC (SEQ ID NO:35) для Δ33NLukA; 5'-cccc-CTCGAG-AAGATTAATTCTGAAATCAAACAAG-3' (SEQ ID NO:38) и 5'-cccc-GGATCC-tta-TTTCTTTTCATTATCATTAAGTACTTT-3' (SEQ ID NO:39) для LukB. Генные продукты гидролизуют Xho1 и BamH1 (New England BioLabs) и лигируют в вектор pET14b (Novagen) со слиянием кодирующей последовательности гистидиновой метки с 5'-областью генов. Экспрессионные плазмиды трансформируют в E. coli штамм DH5α и плазмидные вставки подтверждают путем секвенирования. Плазмиды очищают и трансформируют в экспрессионный штамм E. coli T7 lysY/lq (New England BioLabs).
Для очистки в денатурирующих условиях трансформанты выращивают в среде Terrific Broth со 100 мкг/мл ампициллина при 37°C до достижения культурами величины A600, равной приблизительно 0,5. Экспрессию 6-his-меченого LukA или 6-hisLukB индуцируют с помощью 0,4 мМ IPTG при 37°C, в течение 3 ч, со встряхиванием при 180 об/мин. После индукции клетки собирают путем центрифугирования при 4000 об/мин при 4°C в течение 15 мин и затем ресуспендируют в 1× TBS (50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,5). Бактериальные клетки озвучивают на льду в течение 2 мин (импульсы по 10 с). Озвученные бактерии подвергают ультрацентрифугированию в течение 30 мин при 50000 об/мин. Осадки ресуспендируют в буфере для лизиса (100 мМ NaH2PO4, 10 мМ Tris, 8M мочевины, pH 8,0) и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин на ротаторе (rotisserie). Образцы центрифугируют при 13000 об/мин в течение 30 мин и супернатанты наносят на колонку, содержащую смолу Ni-NTA (Qiagen). Колонку дважды промывают буфером для промывки (100 мМ NaH2PO4, 10 мМ Tris, 8M мочевины, pH 6,3) и белок элюируют из колонки с помощью буфера для элюирования (100 мМ NaH2PO4, 10 мМ Tris, 8M мочевины) при pH 5,9 и при pH 4,5. Фракции, содержащие очищенный белок, определенные методом ДСН-ПААГ, объединяют, разводят 1:1 забуференным tris солевым раствором (TBS; 500 мМ Tris, 1,5 M NaCl, pH 7,5) и подвергают диализу в TBS при 4°C в течение ночи для удаления мочевины и обеспечения возможности повторной укладки. Очищенные 6-his-меченые LukA и LukB количественно определяют с помощью набора для анализа белков Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit.
Для очистки в нативных условиях трансформанты выращивают в бульоне Луриа-Бертани со 100 мкг/мл ампициллина при 37°C до достижения культурами величины A600, равной приблизительно 0,5. Экспрессию 6-his-меченого LukA, 6-his-меченого LukAΔ10C, 6-his-меченого Δ33NLukA или 6-hisLukB индуцируют с помощью 0,05-0,1 мМ IPTG при 25-30°C, в течение 3 ч, со встряхиванием при 220 об/мин. После индукции клетки собирают центрифугированием при 4000 об/мин при 4°C в течение 15 мин и затем ресуспендируют в 1× TBS (50 мМ Tris, 600 мМ NaCl, pH 7,5) с 10 мМ имидазола и коктейля HALT ингибиторов протеазы, не содержащего ЭДТА (Thermo Scientific). Бактериальные клетки озвучивают на льду. Озвученные бактерии центрифугируют в течение 20 мин при 20000 об/мин. Супернатанты инкубируют со смолой Ni-NTA (Qiagen) в течение 1 ч при 4°C на ротаторе. Образцы наносят на колонку и колонку промывают буфером для промывки 1× TBS (50 мМ Tris, 600 мМ NaCl, pH 7,5) с 25 мМ имидазола. Белок элюируют из колонки с помощью 50-500 мМ имидазола в буфере для элюирования 1× TBS (50 мМ Tris, 600 мМ NaCl, pH 7,5). Фракции, содержащие очищенный белок, определенные методом ДСН-ПААГ, объединяют, разводят 1:1 в 1× TBS (50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,5) и диализируют в 1× TBS при 4°C в течение ночи. Очищенные 6-his-меченые LukA и LukB количественно определяют с помощью набора для анализа белков Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit.
Пример 3: Экспрессия и очистка денатурированных рекомбинантных LukA и LukB
Гены LukA и LukB амплифицируют из ДНК S. aureus с помощью полимеразы Vent (New England BioLabs) в стандартных условиях ПЦР при температуре отжига 55°C с использованием следующих праймеров: 5'-ggg-CATATG- AATTCAGCTCATAAAGACTCTCAA-3' (SEQ ID NO:40) и 5'-ccc-GTCGAC- TCCTTCTTTATAAGGTTTATTGTC-3' (SEQ ID NO:41) для LukA, и 5'-ggg-CATATG-AAGATTAATTCTGAAATCAAACAAG-3' (SEQ ID NO:42) и 5'-ccc-GTCGAC-TTTCTTTTCATTATCATTAAGTACTT-3' (SEQ ID NO:43) для LukB. Генные продукты LukA и LukB гидролизуют Nde1 и Sal1 (New England BioLabs) и лигируют в вектор pET41b (Novagen). Конструкты сначала трансформируют в клетки DH5α и затем трансформируют в экспрессионный штамм E. coli ER2566 (New England BioLabs). Трансформанты выращивают в среде Terrific Broth с канамицином, 25 мкг/мл, в течение 2,5 ч при 37°C, и экспрессию LukA и LukB индуцируют с помощью 0,3 мМ IPTG при 37°C в течение 2 ч со встряхиванием при 180 об/мин. Клетки осаждают и ресуспендируют в 1× TBS (500 мМ Tris, 1,5 M NaCl, pH 7,5) и озвучивают на льду в течение 1 мин (импульсы по 10 с). Озвученные бактерии подвергают ультрацентрифугированию в течение 30 мин при 50000 об/мин.
Для очистки C-концевых 6-his-меченых LukA и LukB в денатурирующих условиях, осадки ресуспендируют в буфере для лизиса (100 мМ NaH2PO4, 10 мМ Tris, 8 M мочевины, pH 8,0) и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин на ротаторе. Образцы центрифугируют при 13000 об/мин в течение 30 мин и супернатанты наносят на колонку Ni-NTA. Колонки промывают дважды буфером для промывки (100 мМ NaH2PO4, 10 мМ Tris, 8 M мочевины, pH 6,3) и LukA и LukB элюируют из колонки с помощью буфера для элюирования (100 мМ NaH2PO4, 10 мМ Tris, 8 M мочевины) при pH 5,9 и при pH 4,5. Очищенные 6-his-меченые LukA и LukB количественно определяют с помощью набора для анализа белков BioRad DC Protein Assay.
Пример 4: Продуцирование поликлональных антител к LukA и к LukB
Денатурированный рекомбинантный LukA (250 мкг), эмульгированный в полном адъюванте Фрейнда (FCA), вводят инъекцией новозеландским белым кроликам. Животным вводят бустер-дозу рекомбинантного LukA (125 мкг), эмульгированного в неполном адъюванте Фрейнда (FCA), в день двадцать один (21) и в день сорок девять (49).
Денатурированный рекомбинантный LukB (250 мкг), эмульгированный в полном адъюванте Фрейнда (FCA), вводят инъекцией новозеландским белым кроликам. Животным вводят бустер-дозу рекомбинантного LukB (125 мкг), эмульгированного в неполном адъюванте Фрейнда (FCA), в день двадцать один (21) и в день сорок девять (49).
Пример 5: Лейкоцидин A/B несет основную ответственность за цитотоксин-опосредованную гибель человеческих фагоцитов вследствие разрыва мембраны
Использованные клеточные линии
В качестве модели для изучения, каким образом LukAB выбирает мишень и уничтожает клетки человеческих фагоцитов, была использована HL-60 (ATCC CCL-240, человеческая промиелоцитарная клеточная линия). Клетки HL-60 выращивают в среде RPMI (Gibco) с добавкой 10% термоинактивированной сыворотки плода коровы (FBS) при 37°C с 5% CO2. Для дифференцировки HL-60 в нейтрофилоподобные клетки (PMN-HL60), в культуры добавляют 1,5% (об./об.) диметилсульфоксида (ДМСО) и выращивают в течение 4 дней.
Использованные способы/анализы
Анализ клеточной токсичности
Для оценки жизнеспособности клеток млекопитающих после интоксикации лейкоцидином AB Staphylococcus aureus (LukAB), клетки PMN-HL60 высеивают на 96-луночные плоскодонные обработанные планшеты для тканевых культур (Corning) в количестве 1×105 клеток/лунку в конечном объеме 100 мкл RPMI (Gibco) с добавкой 10% термоинактивированной сыворотки плода коровы (FBS). Клетки интоксицируют в течение 2 ч при 37°C, 5% CO2 с серийными 2-кратными разбавлениями фильтрата культуры Staphylococcus aureus штамм Newman в интервале значений от 20% до 0,16% об./об. с тремя параллельными опытами. Эксперименты проводят с использованием экзопротеинов штамма дикого типа и экзопротеинов штамма, не содержащего LukAB (мутантный штамм). Контроли для 100% жизнеспособности включали 20% об./об. среды для тканевых культур (RPMI+10% термоинактивированной сыворотки плода коровы) и 20% об./об. питательной среды. S. aureus (RPMI+казаминовые кислоты). 0,1% об./об. Triton X100 был использован в качестве контроля для 100% гибели клеток. После интоксикации, 10 мкл CellTiter (Promega) добавляют в каждую лунку и клетки инкубируют дополнительно еще 3 ч при 37°C, 5% CO2. CellTiter контролирует метаболически активные клетки (изменение окраски), т.е. способность, которую утрачивают погибшие клетки. Колориметрическую реакцию измеряют при 492 нм с помощью прибора Perkin Elmer Envision 2103 Multilabel Reader. Процент жизнеспособных клеток рассчитывают по приведенному ниже уравнению: % жизнеспособности=100×[(Ab492Образец-Ab492Triton X)/(Ab492Среда для тканевых культур)].
Анализ повреждения мембраны
Альтернативным анализом с целью измерения LukAB-опосредованной цитотоксичности является оценка целостности мембраны клетки-хозяина. Для этого используют анализ проницаемости красителя SYTOX green (Invitrogen). Здоровые клетки являются непроницаемыми для SYTOX green, но становятся проницаемыми для красителя при нарушении целостности клеточной мембраны. Внутри клетки SYTOX green связывается с ДНК и проявляет сильную флуоресценцию.
Для оценки целостности мембраны клетки-хозяина после интоксикации LukAB или ex vivo инфекции штаммами S. aureus, клетки PMN-HL60 высеивают на 96-луночные плоскодонные обработанные планшеты для тканевых культур (Corning) в количестве 1×105 клеток/лунку в конечном объеме 100 мкл RPMI (Gibco) с добавкой 10% термоинактивированной сыворотки плода коровы (FBS). Клетки интоксицируют разбавлениями фильтрата культуры S. aureus штамм Newman в интервале значений от 20% до 0,16% об./об., или инфицируют с MOI (кратностями инфекции) в интервале значений 1-100 с тремя параллельными опытами в течение 2 ч при 37°C, 5% CO2. Эксперименты проводят с использованием штамма дикого типа и штамма, не содержащего LukAB (мутантный штамм). Контроли для определения фонового уровня флуоресценции включают 20% об./об. среды для тканевых культур (RPMI+10% термоинактивированной сыворотки плода коровы) и 20% об./об. питательной среды S. aureus (RPMI+казаминовые кислоты). После интоксикация или инфекции клетки переносят на 96-луночный планшет с v-образным дном лунок (Corning) и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 мин. Супернатант отбрасывают и осадки ресуспендируют в 100 мкл PBS + SYTOX green (0,1 мкМ; Invitrogen). Клетки затем переносят на 96-луночный черный обработанный планшет для тканевых культур с прозрачным дном (Corning) и инкубируют при комнатной температуре в темноте в течение 10 мин. Флуоресценцию измеряют с помощью прибора Perkin Elmer Envision 2103 Multilabel Reader (возбуждение 485 нм, излучение 535 нм).
Результаты
LukAB нацелен на человеческие первичные фагоциты и уничтожает их
Интоксикация первичных человеческих периферических мононуклеарных клеток (PBMC) (Фиг. 3a), моноцитов, макрофагов, дендритных клеток (Фиг. 3b) и полиморфноядерных клеток (PMN) (Фиг. 3c) фильтрованными супернатантами культур S. aureus штамм Newman приводит к сильной гибели клеток, по результатам определения с помощью анализа клеточной токсичности (Фиг. 3a-c). Интоксикация этих клеток фильтрованными супернатантами культур S. aureus штамм Newman, не содержащих гемолизина (hla), γ-гемолизина (hlg), лейкоцидина E/D (LukED) или лейкоцидина A/B (LukAB), продемонстрировала, что экзопротеины hla-, hlg- и LukED-негативных штаммов являются такими же цитотоксичными, как и штамм Newman дикого типа (WT) (при определении с помощью анализа клеточной токсичности), указывая на то, что ни один из вышеуказанных лейкотоксинов, продуцируемых Newman, не участвует в цитотоксин-медиируемой гибели этих клеток (Фиг. 3a-c). В отличие от них, очень низкая гибель клеток наблюдалась в тех случаях, когда клетки интоксицируют экзопротеинами штамма Newman, не содержащего LukAB (ΔlukAB). Отсутствие цитотоксичной активности у штамма Newman, не содержащего LukAB, устраняется путем введения генов IukAB в трансформант (trans) в плазмиде (ΔlukAB/pLukAB) (Фиг. 3c). Важно отметить, что этот фенотип является полностью зависимым от LukAB, по результатам определения путем интоксицирования PMN очищенными рекомбинантными LukA и LukB. Индивидуальные субъединицы не демонстрируют детектируемой цитотоксичности по отношению к PMN (Фиг. 3d). В отличие от них, комбинация обеих субъединиц приводит к сильной цитотоксичности по отношению к таким клеткам доза-зависимым образом (Фиг. 3d). В общем, эти результаты демонстрируют, что LukAB является ответственным за способность S. aureus нацеливаться на и уничтожать первичные человеческие фагоциты, ключевые иммунные клетки, необходимые для защиты хозяина от инфекционных агентов.
LukAB предпочтительно уничтожает человеческие фагоцитарные клетки
Интоксикация нейтрофилоподобной клеточной линии (PMN-HL60) и макрофагоподобной клеточной линии (THP1+PMA) фильтрованными супернатантами культур S. aureus штамм Newman приводила к сильной гибели клеток, по результатам определения с помощью анализа клеточной токсичности (Фиг. 3). Интоксикация этих клеток фильтрованными супернатантами культур S. aureus WT и мутантных штаммов с изогенными цитотоксинами (hla, hlgABC, LukED и LukAB) продемонстрировала, что LukAB отвечает за способность S. aureus уничтожать эти клетки, по результатам определения с помощью анализа клеточной токсичности (Фиг. 4a и 4b). Отсутствие цитотоксичной активности штамма Newman, не содержащего LukAB, устраняется путем трансформации штамма Newman, не содержащего LukAB, плазмидой, экспрессирующей LukAB (ΔlukAB/pLukAB) (Фиг. 4c). Экзопротеины этого штамма были чрезвычайно цитотоксичными по отношению как к клеткам PMN-HL60, так и клеткам THP-1+PMA, что является сильным доказательством того, что LukAB является сильным стафилококковым токсином, нацеленным на человеческие клетки и уничтожающим их.
Для того чтобы дополнительно исключить влияние других факторов, присутствующих в супернатантах культур S. aureus, клетки PMN-HL60 интоксицируют очищенными рекомбинантными LukA или LukB. Индивидуальные субъединицы не проявляют детектируемой цитотоксичности по отношению к PMN-HL60 (Фиг. 3d). В отличие от них, комбинация обеих субъединиц приводит к сильной цитотоксичности по отношению к этим клеткам доза-зависимого характера (Фиг. 3d). В дополнение к клеткам PMN-HL60 и THP-1+PMA, несколько других человеческих клеточных линий, включая миелоидного предшественника, из которого дифференцируются PMN-HL60 (HL60), моноцитарного предшественника, из которого дифференцируются THP-1+PMA (THP-1), лимфоциты (HuT и клетки Jurkat) и эпителиальные клетки (293T и HepG2) также интоксицируют рекомбинантным LukAB (Фиг. 4e). Эти результаты демонстрируют, что LukAB предпочтительно нацелен на и уничтожает человеческие фагоцитарные клетки, и не оказывает никакого влияния на человеческие лимфоциты или эпителиальные клетки. Взятые вместе эти результаты демонстрируют, что LukAB играет значительную роль в S. aureus-медиируемой гибели фагоцитов.
LukAB продуцируется клинически релевантными штаммами S. aureus
Иммуноблот-анализы с поликлональным антителом, индуцированным против LukB, показали, что LukB продуцируется рядом стафилококковых штаммов, включая штаммы MRSA, ассоциированные с госпитальными и внегоспитальными инфекциями (USA300, 400 и 500; Фиг. 5a). Важно, что уровни LukB ассоциированы с цитотоксичным фенотипом этих штаммов (Фиг. 5a и 5b). Штаммы, продуцирующие высокие уровни LukB (например, Newman, 4645, USA500 и USA300), были более цитотоксичными по отношению к клеткам PMN-HL60, чем штаммы, продуцирующие низкие или недектируемые уровни LukB (например, USA100 и USA400) (Фиг. 5b). Для изучения роли LukAB в штаммах MRSA был создан изогенный мутант LukAB в клиническом изоляте клона USA тип 300 LA (Фиг. 5c). Как и в случае штамма Newman, экзопротеины штамма USA300, не содержащего LukAB, были заметно менее цитотоксичными, чем экзопротеины родительского штамма (Фиг. d). Эти данные демонстрируют, что LukAB является важным цитотоксином, продуцируемым штаммами MRSA.
LukAB повреждает мембраны человеческих фагоцитов
Интоксикация PMN-HL60 экзопротеинами S. aureus приводит к округлению формы клетки и набуханию ядра, по фенотипу, зависимому от LukAB (Фиг. 6a). Такой фенотип округления клетки и набухания был ассоциирован с повышенной проницаемостью мембраны, определенной с помощью анализа повреждения мембран (Фиг. 6b и 6c). Важно, что экзопротеины LukAB-отрицательного штамма демонстрировали незначительный или отсутствие эффекта на проницаемость мембраны, по фенотипу, который можно было устранить путем продуцирования LukAB из плазмиды (Фиг. 6b), причем рекомбинантный LukAB, но не индивидуальные субъединицы токсина, вызывали доза-зависимое повреждение мембраны (Фиг. 6c). Кроме того, инфекция первичных человеческих PMN штаммом метициллин-чувствительного S. aureus (MSSA) и штаммом метициллин-резистентного S. aureus (MRSA) USA300 приводит к LukAB-зависимому повреждению мембраны (Фиг. 6d). Эти результаты демонстрируют, что LukAB повреждает плазматическую мембрану клетки-хозяина при ex vivo инфекции.
LukAB защищает S. aureus от хозяин-опосредованной гибели путем нацеливания на фагоциты и их уничтожения
Инфекция клеток PMN-HL60 S. aureus WT, ΔlukAB и ΔlukAB, содержащими экспрессионную плазмиду IukAB (ΔlukAB/pLukAB), показала, что LukAB является необходимым для обеспечения способности S. aureus разрывать мембрану фагоцитов в процессе взаимодействия стафилококк-фагоцит (Фиг. 7a), определяемой с помощью анализа повреждения мембраны. Важно, что S. aureus с перепродуцированием LukAB (ΔlukAB/plukAB) продемонстрировал более сильное повреждение мембраны, чем штамм дикого типа (WT) (Фиг. 7a), указывая на то, что LukAB сильно повреждает мембраны клетки-хозяина. Инфекция человеческой цельной крови (Фиг. 7b) и очищенных первичных человеческих нейтрофилов (PMN; Фиг. 7c) показала, что IukAB-отрицательный стафилококк уничтожался более эффективно по сравнению с WT-штаммом (Фиг. 7b и 7c). Важно, что ослабленный фенотип, проявляемый ΔlukAB-отрицательными стафилококками, можно было устранить с помощью экспрессионной плазмиды IukAB (Фиг. 7b и 7c). Интоксикация первичных человеческих PMN фильтратом культуры S. aureus WT, ΔlukAB и мутантным штаммом ΔlukAB, содержащим экспрессионную плазмиду IukAB, показала, что LukAB нацелен на и уничтожает первичные человеческие PMN (Фиг. 7d). Эти данные являются сильным свидетельством того, что LukAB представляет собой сильный стафилококковый цитотоксин, который нацелен на и уничтожает PMN путем разрыва мембраны, тем самым защищая S. aureus от PMN-медиируемой гибели.
LukAB способствует патогенезу S. aureus in vivo
Мыши, инфицированные ретроорбитально S. aureus, содержащим конструкт репортера люциферазы со слитым с ним промотором LukAB (pLukAB-Xen1), продемонстрировали активность промотора LukAB при почечных абсцессах, в то время как не содержащий промотора репортер (pXen1) не проявлял активности (Фиг. 8a). Эти данные демонстрируют, что LukAB экспрессируется in vivo в модели инфекции почечного абсцесса. В дополнение к этому, мыши, инфицированные ретроорбитально S. aureus WT, но не штаммом S. aureus, не содержащим LukAB, демонстрируют обширную колонизацию почек. Недостаточная колонизация, наблюдаемая для LukAB-отрицательного штамма, восстанавливается до уровней WT путем обеспечения LukAB у трансформантов (trans) (Фиг. 8b). Взятые вместе эти данные демонстрируют, что LukAB является важным стафилококковым цитотоксином, способствующим патогенезу бактерии.
LukAB образует поры в мембране клетки-мишени, которые могут быть заблокированы полиэтиленгликолем
Интоксикация клеток PMN-HL60 рекомбинантным LukAB (rLukAB) показала, что как rLukA, так и rLukB связываются с клетками-мишенями, при определении методом иммуноблоттинга с LukA и LukB специфичными антителами (Фиг. 9a). Связывание 6His-меченого rLukAB с PMN-HL60 было также подтверждено путем сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (FACS) и с помощью His-специфичного антитела (Фиг. 9b). Олигомеры rLukAB также детектируются методом иммуноблоттинга на мембранах PMN-HL60 после интоксикации рекомбинантным токсином, что указывает на образование структур LukAB более высокого порядка на мембранах клетки-мишени (Фиг. 9c). Важно отметить, что интоксикация PMN-HL60 rLukAB продемонстрировала, что LukAB образует на мембранах клеток-мишеней проницаемые для бромида этидия поры, которые могут быть заблокированы с помощью молекул полиэтиленгликоля (ПЭГ) (Фиг. 9d), и что блокировка LukAB-пор повышает жизнеспособность клеток (Фиг. 9E). Кроме того, ПЭГ специфически блокирует LukAB-поры, поскольку поры, образованные в мембранах PMN-HL60 сапонином, не блокировались ПЭГ и, в результате, эти клетки не были защищены от опосредованной порами гибели. Эти данные демонстрируют, что LukAB-поры могут быть заблокированы малыми молекулами, и блокирование LukAB-пор защищает клетки от LukAB-опосредованной гибели.
Нейтрализация цитотоксичности фильтрата культур S. aureus α-LukA поликлональным антителом
Интоксикация PMN-HL60 фильтратом культуры S. aureus, предварительно инкубированного с различными количествами α-LukA поликлональных антител, индуцированных у двух разных кроликов, приводит к доза-зависимому снижению токсичности фильтрата культуры (Фиг. 10). Этот нейтрализующий эффект не наблюдался, когда фильтрат культуры предварительно инкубировался с неиммунной сывороткой. Важно, что антитела, вырабатываемые двумя разными кроликами, вели себя очень похоже, и нейтрализующая способность антител возрастала с увеличением их степени зрелости, что видно при сравнении нейтрализующего эффекта антител из проб крови, взятых в более поздние моменты времени, с нейтрализующим эффектом антител из крови, взятой раньше (Фиг. 10). Эти данные показывают, что цитотоксичность, наблюдающаяся для фильтрата культуры S. aureus, может быть нейтрализована с помощью α-LukA поликлональных антител.
Идентификация нецитотоксичного LukA усеченного мутанта, который бы еще распознавался α-LukA поликлональным антителом
LukA отличается от других S-субъединиц стафилококкового лейкотоксина тем, что он имеет выступающие участки на обоих N- и C-концах. Эти выступы состоят из 33 аминокислот на N-конце и 10 аминокислот на C-конце (Фиг. 11a). Интоксикация PMN-HL60 очищенным рекомбинантным LukA, не имеющим N-концевого выступа (rΔ33NLukA) в комбинации с очищенным rLukB, приводит к сильной цитотоксичности по отношению к клеткам, сравнимой с показателями для очищенного rLukA+rLukB (Фиг. 11b). Однако интоксикация PMN-HL60 очищенным рекомбинантным LukA, не имеющим C-концевого выступающего участка (rLukAΔ10C) в комбинации с rLukB не вызывает цитотоксичного эффекта (Фиг. 11b). Эти данные демонстрируют, что N-концевой выступающий участок является несущественным для цитотоксичного эффекта LukA, но C-концевой выступающий участок необходим для токсичности. Важно, что α-LukA поликлональное антитело, нейтрализующее эффект LukAB (Фиг. 10), продолжает распознавать 6×His-меченый нецитотоксичный rLukAΔ10C мутант, так же как и α-His поликлональное антитело (Фиг. 11c). Эти данные позволяют предположить, что rLukAΔ10C могут быть использованы для in vivo получения α-LukA поликлональных антител, представляющих собой нейтрализующие антитела. Таким образом, rLukAΔ10C могут быть использованы в композиции активной вакцины.
Все патентные публикации и непатентные публикации указывают на уровень знаний квалифицированных специалистов в области техники, к которой относится данное изобретение. Все эти публикации настоящим включены сюда в качестве ссылок в такой же степени, как если бы для каждой индивидуальной публикации было конкретно и индивидуально указано, что она включается в качестве ссылки.
Хотя изобретение было описано здесь со ссылками на конкретные варианты исполнения, следует понимать, что эти варианты исполнения являются просто иллюстрациями принципов и применений настоящего изобретения. Следует понимать поэтому, что могут быть выполнены многочисленные модификации иллюстративных вариантов исполнения, и что могут быть разработаны другие схемы, не выходящие за пределы сущности и объема настоящего изобретения, определяемые приложенной формулой изобретения.
Claims (11)
1. Композиция, пригодная для ингибирования начала инфекции Staphyloccocus aureus, причем указанная композиция содержит:
терапевтически эффективное количество аналога полипептида лейкоцидина A Staphyloccocus aureus, содержащего аминокислотную последовательность аминокислотных остатков 28-351 SEQ ID NO:10 или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью аминокислотных остатков 28-351 SEQ ID NO: 10, где указанный аналог полипептида лейкоцидина А содержит одну или более неконсервативных аминокислотных замен или делеций в аминокислотных остатках 342-351 SEQ ID NO: 10, которые делают указанный аналог полипептида лейкоцидина А нецитотоксичным при комбинировании с полипептидом лейкоцидина B S. aureus.
2. Композиция по п. 1, где указанный аналог полипептида лейкоцидина A содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью аминокислотных остатков 28-351 SEQ ID NO:10.
3. Композиция по п. 1, где указанный аналог полипептида лейкоцидина A не содержит аминокислотную последовательность аминокислотных остатков 342-351 SEQ ID NO:10.
4. Композиция по п. 1, дополнительно содержащая терапевтически эффективное количество полипептида лейкоцидина B S. aureus, содержащего любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 15-27, или последовательность, имеющую по меньшей мере 90% сходства последовательности с любой из последовательностей SEQ ID NO: 15-27.
5. Композиция по п. 1, дополнительно содержащая терапевтически эффективное количество полипептида лейкоцидина B S. aureus, содержащего аминокислотную последовательность аминокислотных остатков 30-339 SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% сходство последовательности с аминокислотной последовательностью аминокислотных остатков 30-339 SEQ ID NO: 16.
6. Композиция по п. 5, где полипептид лейкоцидина B содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% сходство последовательности с аминокислотной последовательностью аминокислотных остатков 30-339 SEQ ID NO: 16.
7. Композиция по п. 1, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель.
8. Композиция по п. 5, дополнительно содержащая адъювант.
9. Способ ингибирования начала инфекции Staphyloccocus aureus, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту-млекопитающему композиции по п. 1.
10. Способ по п. 9, где инфекция S. aureus является инфекцией метициллин-резистентного S. aureus.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US33155010P | 2010-05-05 | 2010-05-05 | |
US61/331,550 | 2010-05-05 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012152086A Division RU2644237C2 (ru) | 2010-05-05 | 2011-05-05 | Лейкоцидины staphylococcus aureus, терапевтические композиции и их применение |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018146933A Division RU2795545C2 (ru) | 2010-05-05 | 2018-12-27 | Лейкоцидины staphylococcus aureus, терапевтические композиции и их применение |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2677140C1 true RU2677140C1 (ru) | 2019-01-15 |
Family
ID=44902083
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018100393A RU2677140C1 (ru) | 2010-05-05 | 2011-05-05 | Лейкоцидины staphylococcus aureus, терапевтические композиции и их применение |
RU2012152086A RU2644237C2 (ru) | 2010-05-05 | 2011-05-05 | Лейкоцидины staphylococcus aureus, терапевтические композиции и их применение |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012152086A RU2644237C2 (ru) | 2010-05-05 | 2011-05-05 | Лейкоцидины staphylococcus aureus, терапевтические композиции и их применение |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US8431687B2 (ru) |
EP (4) | EP3444268B1 (ru) |
JP (4) | JP6031029B2 (ru) |
KR (3) | KR102050078B1 (ru) |
CN (2) | CN107286224A (ru) |
AU (5) | AU2011247989C1 (ru) |
BR (1) | BR112012029521A2 (ru) |
CA (2) | CA3088918A1 (ru) |
DK (1) | DK3444268T3 (ru) |
ES (2) | ES2605476T3 (ru) |
HR (1) | HRP20220068T1 (ru) |
HU (1) | HUE058787T2 (ru) |
IL (2) | IL222874B (ru) |
LT (1) | LT3444268T (ru) |
MX (4) | MX2012012859A (ru) |
MY (1) | MY165618A (ru) |
PL (1) | PL3444268T3 (ru) |
RU (2) | RU2677140C1 (ru) |
SI (1) | SI3444268T1 (ru) |
WO (1) | WO2011140337A2 (ru) |
ZA (4) | ZA201208455B (ru) |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2677140C1 (ru) | 2010-05-05 | 2019-01-15 | Нью-Йорк Юниверсити | Лейкоцидины staphylococcus aureus, терапевтические композиции и их применение |
EP2720714B1 (en) * | 2011-06-19 | 2018-07-18 | New York University | Methods of treating and preventing staphylococcus aureus infections and associated conditions |
NZ700578A (en) | 2012-04-17 | 2017-03-31 | Arsanis Biosciences Gmbh | Cross-reactive staphylococcus aureus antibody |
AU2013257161B2 (en) * | 2012-05-02 | 2017-11-09 | New York University | Methods of treating and preventing Staphylococcus aureus infections and associated conditions |
KR101826538B1 (ko) * | 2012-05-30 | 2018-02-07 | 현대자동차 주식회사 | 차량용 글래스 몰딩 부착 장치 및 그 방법 |
RU2015154792A (ru) * | 2013-05-21 | 2017-06-22 | Арзанис Байэусайнсис ГмбХ | Выделенный антиген лейкоцидина Staphylococcus aureus, антитело, специфически связывающееся с субъединицей LukGH и способ определения связывания или токсичности двухкомпонентного цитолизина LukGH Staphylococcus aureus |
CN110420316A (zh) | 2013-06-18 | 2019-11-08 | 纽约大学 | 参与金黄色葡萄球菌杀白细胞素的细胞毒性的细胞因素:新型治疗靶点 |
CA2925071A1 (en) * | 2013-10-17 | 2015-04-23 | Arsanis Biosciences Gmbh | Cross-reactive staphylococcus aureus antibody sequences |
AU2014363987A1 (en) * | 2013-12-09 | 2016-06-30 | Janssen Biotech, Inc. | Compositions and methods for phagocyte delivery of anti-staphylococcal agents |
JP2017505758A (ja) * | 2013-12-19 | 2017-02-23 | アルサニス・バイオサイエンスズ・ゲゼルシャフト・ミト・ベシュレンクテル・ハフツング | 黄色ブドウ球菌のlukgh(lukab)毒素に対する抗体及び抗体配列 |
WO2016197071A1 (en) * | 2015-06-05 | 2016-12-08 | New York University | Compositions and methods for anti-staphylococcal biologic agents |
US10981979B2 (en) | 2017-03-06 | 2021-04-20 | Vanderbilt University | Human monoclonal antibodies to Staphylococcus aureus lukab toxin |
MX2019015007A (es) * | 2017-06-13 | 2020-08-06 | Integrated Biotherapeutic Vaccines Inc | Composiciones inmunogénicas que comprenden los polipéptidos derivados de la leucocidina de staphylococcus aureus luka y lukb. |
KR102061735B1 (ko) * | 2018-06-08 | 2020-01-02 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 황색포도알균 약독화 장독소 및 세포독소 재조합 단백질을 포함하는 백신 조성물 |
JP2021530244A (ja) | 2018-07-24 | 2021-11-11 | メディミューン,エルエルシー | S.アウレウス(S.aureus)クランピング因子A(ClfA)に対する抗体 |
MX2021004173A (es) | 2018-10-09 | 2021-09-08 | Medimmune Llc | Combinaciones de anticuerpos dirigidos contra staphylococcus aureus. |
MX2021004114A (es) * | 2018-10-09 | 2021-07-16 | Medimmune Llc | Anticuerpos dirigidos contra leucotoxinas de staphylococcus aureus. |
KR20220107166A (ko) | 2019-10-02 | 2022-08-02 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 스타필로코커스 펩티드 및 사용 방법 |
JP2023544300A (ja) * | 2020-09-28 | 2023-10-23 | ヤンセン ファーマシューティカルズ,インコーポレーテッド | バリアントstaphylococcus aureus luka及びlukbポリペプチド並びにワクチン組成物 |
WO2022212667A1 (en) * | 2021-04-02 | 2022-10-06 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Staphylococcus aureus vaccine compositions |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2122862C1 (ru) * | 1995-12-08 | 1998-12-10 | Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова | Бесклеточная антистафилококковая вакцина для лечения хронической стафилококковой инфекции |
WO2008068533A2 (en) * | 2006-12-06 | 2008-06-12 | Nature Therapeutics Limited | Antimicrobial composition |
WO2009111177A2 (en) * | 2008-03-05 | 2009-09-11 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Compositions and methods comprising genetically enhanced obligate and facultative anaerobic bacteria for oncopathic cancer therapy |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US400A (en) | 1837-09-25 | Mode of causing puppet valves to work lights | ||
US300A (en) | 1837-07-29 | Machine foe spinning woolen roving | ||
US6355625B1 (en) | 1998-09-14 | 2002-03-12 | Nabi | Compositions of β-glucans and specific IGIV |
WO2001070955A2 (en) | 2000-03-21 | 2001-09-27 | Elitra Pharmaceuticals, Inc. | Identification of essential genes in prokaryotes |
US6849259B2 (en) | 2000-06-16 | 2005-02-01 | Symphogen A/S | Polyclonal antibody composition for treating allergy |
AT410798B (de) | 2001-01-26 | 2003-07-25 | Cistem Biotechnologies Gmbh | Verfahren zur identifizierung, isolierung und herstellung von antigenen gegen ein spezifisches pathogen |
GB0107661D0 (en) * | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Staphylococcus aureus |
EP1575534B1 (en) | 2002-05-03 | 2013-04-10 | Massachusetts Institute Of Technology | D4,5 glycuronidase and uses thereof |
EP1915396A2 (en) | 2005-06-13 | 2008-04-30 | Nabi Biopharmaceuticals | Use of panton-valentine leukocidin for treating and preventing staphylococcus infections |
CN100485038C (zh) * | 2005-09-13 | 2009-05-06 | 四川大学华西医院 | 小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽及其应用与制备方法 |
EP1996231A4 (en) * | 2006-02-22 | 2010-09-15 | Texas A & M Univ Sys | ANTIBODIES RECOGNIZING A HIGHLY EXPRESS PUTATIVE ANTIGEN OF SARM-C AND METHODS OF USE |
EP2043690A1 (en) * | 2006-06-12 | 2009-04-08 | Nabi Biopharmaceuticals | Use of alpha-toxin for treating and preventing staphylococcus infections |
CN101535811B (zh) | 2006-10-18 | 2016-05-04 | 生物梅里埃公司 | 用于体外诊断产pvl金黄色葡萄球菌的方法 |
EP2666784B1 (en) * | 2007-08-31 | 2017-04-05 | University Of Chicago | Methods and compositions related to immunizing against staphylococcal lung diseases and conditions |
AU2008314485B9 (en) | 2007-10-15 | 2015-02-26 | Jingang Medicine (Australia) Pty Ltd | Expression system for modulating an immune response |
CN101182350A (zh) * | 2007-11-02 | 2008-05-21 | 山东省农业科学院奶牛研究中心 | 金黄色葡萄球菌α-溶血素及其编码序列 |
CN102089005A (zh) | 2008-05-12 | 2011-06-08 | 斯特罗克斯生物制药有限责任公司 | 金黄色葡萄球菌特异性抗体制剂 |
CA2735006A1 (en) | 2008-08-25 | 2010-03-11 | Amplimmune, Inc. | Pd-1 antagonists and methods of use thereof |
BRPI0919473A2 (pt) | 2008-09-26 | 2017-08-29 | Oncomed Pharm Inc | Agentes de ligação frizzled e usos dos mesmos |
BRPI1013780B8 (pt) * | 2009-04-14 | 2022-10-04 | Novartis Ag | Composição imunogênica útil para imunização contra staphylococcus aureus, seu método de preparação e composição farmacêutica |
RU2677140C1 (ru) * | 2010-05-05 | 2019-01-15 | Нью-Йорк Юниверсити | Лейкоцидины staphylococcus aureus, терапевтические композиции и их применение |
-
2011
- 2011-05-05 RU RU2018100393A patent/RU2677140C1/ru active
- 2011-05-05 CA CA3088918A patent/CA3088918A1/en active Pending
- 2011-05-05 EP EP18196549.2A patent/EP3444268B1/en active Active
- 2011-05-05 MX MX2012012859A patent/MX2012012859A/es unknown
- 2011-05-05 MY MYPI2012004840A patent/MY165618A/en unknown
- 2011-05-05 PL PL18196549T patent/PL3444268T3/pl unknown
- 2011-05-05 KR KR1020187036903A patent/KR102050078B1/ko active IP Right Grant
- 2011-05-05 ES ES11778343.1T patent/ES2605476T3/es active Active
- 2011-05-05 AU AU2011247989A patent/AU2011247989C1/en active Active
- 2011-05-05 LT LTEP18196549.2T patent/LT3444268T/lt unknown
- 2011-05-05 KR KR1020197034641A patent/KR20190133290A/ko not_active IP Right Cessation
- 2011-05-05 US US13/101,525 patent/US8431687B2/en active Active
- 2011-05-05 JP JP2013509265A patent/JP6031029B2/ja active Active
- 2011-05-05 US US13/696,245 patent/US9783582B2/en active Active - Reinstated
- 2011-05-05 HU HUE18196549A patent/HUE058787T2/hu unknown
- 2011-05-05 EP EP21213876.2A patent/EP4015523A1/en active Pending
- 2011-05-05 MX MX2015016666A patent/MX364642B/es unknown
- 2011-05-05 SI SI201132036T patent/SI3444268T1/sl unknown
- 2011-05-05 CN CN201710442942.9A patent/CN107286224A/zh active Pending
- 2011-05-05 ES ES18196549T patent/ES2904314T3/es active Active
- 2011-05-05 CN CN201180033386.0A patent/CN103025352B/zh active Active
- 2011-05-05 RU RU2012152086A patent/RU2644237C2/ru active
- 2011-05-05 EP EP11778343.1A patent/EP2566519B1/en active Active
- 2011-05-05 HR HRP20220068TT patent/HRP20220068T1/hr unknown
- 2011-05-05 CA CA2798355A patent/CA2798355C/en active Active
- 2011-05-05 EP EP16187485.4A patent/EP3121191B1/en not_active Not-in-force
- 2011-05-05 KR KR1020127031699A patent/KR101933226B1/ko active IP Right Grant
- 2011-05-05 BR BR112012029521-7A patent/BR112012029521A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2011-05-05 DK DK18196549.2T patent/DK3444268T3/da active
- 2011-05-05 WO PCT/US2011/035354 patent/WO2011140337A2/en active Application Filing
-
2012
- 2012-11-05 IL IL222874A patent/IL222874B/en active IP Right Grant
- 2012-11-05 MX MX2021003906A patent/MX2021003906A/es unknown
- 2012-11-05 MX MX2019005156A patent/MX2019005156A/es unknown
- 2012-11-09 ZA ZA2012/08455A patent/ZA201208455B/en unknown
-
2015
- 2015-02-23 AU AU2015200901A patent/AU2015200901B2/en active Active
-
2016
- 2016-05-09 ZA ZA2016/03107A patent/ZA201603107B/en unknown
- 2016-10-21 JP JP2016206490A patent/JP6253742B2/ja active Active
- 2016-11-22 AU AU2016262661A patent/AU2016262661B2/en active Active
-
2017
- 2017-09-08 US US15/699,482 patent/US10316067B2/en active Active
- 2017-11-28 JP JP2017227313A patent/JP6678634B2/ja active Active
-
2018
- 2018-05-08 ZA ZA2018/02995A patent/ZA201802995B/en unknown
-
2019
- 2019-05-06 US US16/404,374 patent/US11584782B2/en active Active
- 2019-08-27 AU AU2019222824A patent/AU2019222824A1/en not_active Abandoned
- 2019-12-03 JP JP2019218457A patent/JP7001661B2/ja active Active
-
2020
- 2020-04-21 IL IL274109A patent/IL274109A/en unknown
- 2020-05-06 ZA ZA2020/02470A patent/ZA202002470B/en unknown
-
2021
- 2021-09-21 AU AU2021236457A patent/AU2021236457B2/en active Active
-
2023
- 2023-01-12 US US18/153,727 patent/US20230295248A1/en active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2122862C1 (ru) * | 1995-12-08 | 1998-12-10 | Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова | Бесклеточная антистафилококковая вакцина для лечения хронической стафилококковой инфекции |
WO2008068533A2 (en) * | 2006-12-06 | 2008-06-12 | Nature Therapeutics Limited | Antimicrobial composition |
WO2009111177A2 (en) * | 2008-03-05 | 2009-09-11 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Compositions and methods comprising genetically enhanced obligate and facultative anaerobic bacteria for oncopathic cancer therapy |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
RAINARD P. et al., Leucotoxic activities of Staphylococcus aureus strain isolated from cows, ewes and goats with mastitis: importance of LukM/LukF´-PV leucotoxin, Clinical and diagnostic laboratory immunology, 2003, Vol.10, No.2, pp.272-277. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11584782B2 (en) | Staphylococcus aureus leukocidins, therapeutic compositions, and uses thereof | |
RU2795545C2 (ru) | Лейкоцидины staphylococcus aureus, терапевтические композиции и их применение |