JP2014221774A - 抗体媒介による細菌のクオラムセンシングの破壊 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】少なくとも1つのハプテンを備える免疫原性の分子実体であって、前記ハプテンは任意でリンカー部分を介して高分子担体と共役結合し、前記ハプテンは環状ペプチド又はその類似体を備え、前記環状ペプチド又はその類似体は大環状環を備え、前記環状ペプチド又はその類似体は、約4乃至19のアミノ酸残基を備える環状ペプチド。該免疫原性の分子実体を用いて、インビボでの腫瘍形成マウスモデルにおいて、クオラムセンシングを阻害し、細菌病原性を抑制し、さらに致死的な細菌の攻撃に対して保護することが可能に設計されたハプテンに対して誘発されたモノクローナル抗体を得る。
【選択図】図8
Description
ハイブリドーマを生じさせるために骨髄腫細胞と抗体を生産する細胞を融合する段階をさらに備え、ハイブリドーマは、環状ペプチドシグナル伝達分子及び/又は免疫原性の分子実体の環状ペプチドと特異的に結合する抗体を産生する。
本明細書で用いられているように、「免疫原性の」という用語は、脊椎動物(例えば、マウス、ラット、霊長類、又は、ヒトを含む哺乳類)において免疫反応を生じさせるための分子実体の適切性のことを言う。分子実体が十分な大きさであり、抗体が分子実体で抗原投与された動物によってもたらされるような免疫反応を生じさせるために、分子実体が必要な他の分子特性を有していれば、その分子実体は免疫原性である。免疫原性であるために、タンパク質などの分子実体が少なくとも約10kDaの分子重量でなければならないことは当該技術分野では周知のことである。
ファージディスプレイシステムが使用可能である。あるいは、高分子担体はビロソーム、(すなわち、膜貫通タンパク質が埋め込まれるとともにハプテンが結合する高分子担体として機能する場合のリン脂質形状のミセル構造)を備えてもかまわない。
本発明は少なくとも1つのハプテンを備える免疫原性の分子実体を提供し、このハプテンは任意でリンカー部分を介して高分子担体と共役結合し、このハプテンは環状ペプチド又はその類似体を備え、この環状ペプチド又はその類似体は大環状環を備える。このとき、環状ペプチド又はその類似体は約4乃至19のアミノ酸残基を備え、この環状ペプチド又はその類似体は以下の化学式(I)によって示される構造を有する。
本発明の抗体は、環状シグナル伝達ペプチドと特異的に結合する抗体である。本明細書で用いられているように、「環状シグナル伝達ペプチド」という用語は、クオラムセンシングを利用して病原性遺伝子の発現を制御するグラム陽性菌によって産生された環状ペプチドのことを言う。環状シグナル伝達ペプチドは膜結合型ヒスチジンキナーゼセンサー分子と結合し、その後、細胞内応答制御因子と相互作用するシグナル伝達分子である。
免疫原性の分子実体、その免疫原性の分子実体を含む超分子集合体、又は、本発明の抗体(本明細書では本発明の「活性薬剤」)は、哺乳類に投与するために、医薬組成物に組み込むことが可能である。本発明の医薬組成物は、本発明の1以上の活性薬剤(例えば、1以上の抗体、免疫原性の分子実体、超分子集合体、又はそれらの組み合わせ)を備えてもかまわない。本発明の医薬組成物は、他のポリペプチド又は抗体ワクチンと組み合わせて本発明の1以上の活性薬剤を同様に備えることもある。
本発明における活性薬剤あるいは医薬組成物は、使用指示書と共にコンテナやパック、ディスペンサーに含まれていてもよい。そのようなキットは、免疫原性分子実体や、抗体、または医薬組成物の計画的使用の必要に応じて、試薬を追加することができる。例えば、本発明の抗体は診断目的として使用することができるが、そのような場合において、検知と視覚化を可能にする1以上の試薬を、キットに、(本発明の抗体を保持するよう分けられたコンテナ、パック、ディスペンサーにあるのが望ましい)含むことができる。その製造キット及び製品は、下記に述べるように、診断や予防薬、及び/または治療の目的においてその使用指示書を含むことができる。
本発明は、グラム陽性菌、またはそれに関係する疾病や病気による感染を防ぐ方法と同様に、感染しやすい、またはグラム陽性菌感染に関係する疾病や病気を保持している哺乳動物を識別する方法を提供する。本発明はまた、哺乳動物において免疫反応を導き出す方法と、哺乳動物においてクオラムセンシングを防ぐ方法を提供する。
本発明の診断法は、必要としているあるいは免疫原性分子実体や本発明の抗体を使用する治療から利益を得ることができる哺乳動物を識別するのに使用することができる。必要としているあるいは免疫原生分子実体や本発明の抗体を使用する治療から利益を得ることができる哺乳動物は、グラム陽性菌感染している、あるいはグラム陽性菌感染やそれに関係する疾病や病気にかかりやすい哺乳動物である。そのような哺乳動物を識別するために、それらの哺乳動物から生体サンプルを得られる。
生体サンプルは、組織サンプルや細胞サンプル、尿やリンパ液といった体液がなりうる。本発明の抗体は、生体サンプルが環状ペプチドシグナル伝達分子を含むかどうかを決定するために使用することができ、その存在はその哺乳動物がグラム陽性菌感染しているか、あるいはグラム陽性菌感染症に関係する疾病や病気にかかりやすいか、かかっていることを示す。例えば、本発明の抗体、特に黄色ブドウ球菌AIP-IVシグナル伝達ペプチドと結合する抗体は、黄色ブドウ球菌に関係する疾病や病気にかかりやすい、あるいは感染していると疑われる哺乳動物から得た生体サンプル中の黄色ブドウ球菌AIP-IVの存在を検知するために使用することができる。サンプル内の黄色ブドウ球菌AIP-IVの存在は、その哺乳動物が黄色ブドウ球菌感染症にかかっている、あるいは黄色ブドウ球菌感染症に関係する疾病や病気にかかりやすいか、かかっていることを示す。このように本発明の抗体は、哺乳動物から得られた生体サンプル中の環状ペプチドシグナル伝達分子を、診断によってその存在を検知する、あるいはその量を決定するために使用できる。
本発明の免疫原性分子実体や抗体は、グラム陽性菌による哺乳動物の感染を防御あるいは治療するために使用できる。グラム陽性菌は、例えばブドウ球菌種などであり、これはクオラムセンシングにおいて環状ペプチドシグナル伝達分子を活用する。本発明の免疫原性分子実体や抗体を用いての治療から利益を得られる哺乳動物は、(1)グラム陽性菌により感染の危険にさらされている、あるいは感染しやすい哺乳動物、(2)感染しやすいグラム陽性菌との接触を行った哺乳動物、又は、(3)グラム陽性菌により感染している哺乳動物のいずれかである。グラム陽性菌感染を防御し治療するために、本発明の免疫原性分子実体を、免疫反応を導き出すためにその哺乳動物に投与できる。加えて、本発明の抗体は、環状シグナル伝達ペプチドの活性を阻害するために投与され、その結果、菌感染や菌感染に関係する疾病を促進する毒性遺伝子または毒素の産生を防ぐ。
本発明の免疫原性分子実体あるいは超分子集合体は、環状シグナル伝達ペプチドへの抗体を生成するのに使用できる。本発明の免疫原性分子実体あるいは超分子集合体は、組み換え免疫グロブリンライブラリーを選別して、特に選択された環状シグナル伝達分子と結合する抗体を識別するのに使用できる。組み換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーを生成し選別する方法は、Barbas, C.F., 3rd, D.R. Burton, J.K. Scott, and G.J. Silverman, Phage Display −A Laboratory Manual2001,Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,and Kontermann,R., Duebel, S., Antibody Engineering, 2001, Berlin, Heiderberg:Springer−Verlagで述べられている。
(実施例1−材料)
RN4850はDr. Richard P. Novick (Skirball Institute, New York University Medical Center) から入手した。純化されたモノクローナル抗体はTSRI Antibody Production Core Facility から入手した。臨床分離株NRS168は、Network on Antimicrobial Resistance in Staphylococcus aureus (NARSA) Program supported by NIAID/NIH (N01-AI-95359) から入手した。
以下の一般的手順を、すべての天然産物を合成するのに使用した。バッチ合成を、標準Boc固相ペプチド合成プロトコルに従い、DMF中で膨張した0.25 mmol のMBHA樹脂の下で実行した。4mLのDMF中にS−トリチル−3−メルカプトプロピオン酸 (2eq)、HBTU (3.9eq)、DIEA (0.5mL) が含まれた溶液を準備し、事前の活性化のため3分間放置した。その混合物を、カップリングのため樹脂に加えた。この工程は一般的に1時間で完了する。それからその樹脂をDMFで洗浄し、TFA中の5% TIS用いて(2×10 分)、トリチル基の脱保護にかける。一旦DMFで洗浄し、ペプチド配列は、4 eq Boc アミノ酸と3.9 eq HBTU、0.5 ml DIEAを使用して起こる結合反応によって完了した。合成が完了すると、その樹脂はDMF、それからCH2Cl2、最後にエーテルで洗浄し、デシケーターに収納した。
AIP4ハプテン5の合成のための配列を、下記化合式1で示す。直鎖ペプチドYSTSYFLM (SEQ ID NO:1、保護基は含まない) を、カップリング試薬としてDIC/HOBtを用いる標準Fmoc化学を使用することで、Fmoc−メチオニンで前負荷をかけた2−クロロトリチル樹脂の下で合成した。N末端ペンダントシステインは、共役のために運搬体タンパク質に取り込まれ、短いフレキシブルなリンカーはハプテンと運搬体タンパク質の間にスペーサーとして加えられた。保護された直鎖ペプチドは、クロロホルム中の4 % トリフルオロ酢酸を使用することで、樹脂から解放され、また選択的にセリンからトリチル保護基を取り除いた。希薄条件における分子内ラクトン化は、EDC/4−DMAPを使用して行われ、続いて起こる側鎖脱保護が、AP4ハプテン5を提供した。合成法の詳細は、以下に記述する。
すべてのN−α−Fmoc保護アミノ酸、カップリング試薬、そしてペプチド合成のための樹脂は、EMD Biosciences, Inc. (San Diego, CA) から入手した。すべての他の化学薬品は、Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, MO) で入手した。ESI−MS分析は、API150EX (PE SCIEX, Foster City, CA) を用いて行われ、HITACHI L-7300 や SHIMADZU SCL-10A はそれぞれ、分析のHPLC予備実験に使用された。
保護された直鎖ペプチド3を、最終的に1.0 mM以下の濃度になるように、1,2−ジクロロエタン(事前に無水MgSO4の上で乾燥させておく)に溶かした。その溶液を攪拌、80℃まで加熱し、EDCと4−DMAPを当量で3度加えた。反応液に、別途当量のEDCと4−DMAPそれぞれを24時間後と48時間後に加えた。その反応をHPLCにより観察した。4日後、その反応混合物を室温まで冷却し、2×200mLの0.2 M KHSO4(aq)で洗浄し、無水Na2SO4の上で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させる。環状ペプチド4は前処理したHPLCにより純化した。収率は、分析的HPLCによって決定されるように、30%から60%の範囲となる。
固体の純化されたペプチドを、2%TISを含むTFAに溶かし、1時間攪拌する。それから、その混合物を乾燥するまで蒸発させた。水を加え、混合物を冷凍、凍結乾燥した。それから、凍結乾燥した固形物を、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)を用いて、H2Oに溶かす。その混合物を1時間攪拌し、AP4ハプテン5の精製のため、前処理したHPLCの中へ直接投入する。採取した純留分を収集し、冷凍、凍結乾燥した。ESI-MS: m/z calcd for C57H80N10O17S2 (M + H), 1241.5; found, 1242.2. 図2I及びJを参照。
ハプテン5のKLH/BSAとの共役は、下記の概要2に描かれているように行った。その手順は、以下において述べる。
5mgの運搬体タンパク質を、pH7.4、0.9mLのPBS中で再懸濁する。この溶液へ、1mgのリンカースルホ−SMCC (スルホサクシニミジル−4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート)を加えた。その溶液を6−8時間攪拌し、タンパク質リンカー共役物は、4℃でのPBS中での透析によって純化される。
PBSにおけるタンパク質リンカー共役物に、2mgのハプテン5を含む100μLのDMFを加えた。その溶液を一晩中攪拌し、タンパク質−ハプテン5共役物を透析によって純化した。MALDI−TOF分析で、BSA分子当たり平均約6ハプテンの接着を確認する(BSA−AIP4共役物の分子量=75581ダルトン、BSA=67000ダルトン、ハプテン=1461.15ダルトン)。図2Kを参照。
免疫反応、活性ワクチン、モノクローナル抗体の生成の免疫化と誘出のために、AP1、AP2、AP3、AP4ラクトン類似体とハプテン−タンパク質担体共役物の形状の合成ハプテンを、上記AP4ハプテン5の調合のために説明されるような手順を用い調製する。調製図は以下の通りである。
タンパク質分解性の安定な環状ラクタム、ガルバミド、セミカルバジドAIPペプチドハプテンは、塩基不安定カイザー・オキシム・レジン上でのペプチド環化に関する頻繁に文書化された方法論を使用して調製される。(DeGrado et al., J. Org. Chem. 1980, 45, 1295-1300; DeGrado et al., J. Org. Chem. 1982, 47, 3258-3261; Nakagawa et al., J. Org. Chem. 1983, 48, 678-685;Nakagawa et al., J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 7087-7092;Kaiser et al., Science 1989, 243, 187-192.)を参照。この合成アプローチはBocを基盤とする固相ペプチド合成に基づいており、それによると、ペプチド環化は固体担体から離れた環状ペプチドの開裂と同時に起こり、(Osapay et al., J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 6966-6973;Taylor et al., Biopolymers 2002, 66, 49-75; and Li et al., Curr. Org. Chem. 2002, 6, 411−440.)環状カルバミドペプチドの合成は、論文で述べられているように、レトロインベルソ型モチーフ(retro-inverso motiv)を必要とする(Chorev et al., Biopolymers 2005, 80, 67-84.)。ブロックを形成する事前に必要な1−N−Boc−4−(メチルチオ)ブタン−1,2−ジアミンは、広く利用されているBoc−メチオニノールより合成され、論文の前例によると、ニトロフェニルカルバメートプロトコルを介し、ペプチド鎖に結合する。(Vince et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9, 853-856.) 以下の図は、タンパク質分解性において安定な環状ラクタム、カルバミド、AIP−4 ペプチドのセミカルバジド類似体の合成を概説する。これらの合成方法論は、AIP−1、AIP−2、AIP−3や他のブドウ球菌クオラムセンシングペプチドなどの他の環状ペプチドハプテンの調製に適用できる。
黄色ブドウ球菌(RN4850又はWood46)の単一コロニーを、37℃で一晩寒天プレートの上で増殖させた後、CYGP培地へ植菌し、一晩(18時間)増殖させた。(Novick, Methods Enzymol 204:587−636 (1991))を参照。一晩培養された細胞を、新たなCYGP培地にてOD600≒0.03まで希釈し、5mLポリスチレン細胞培養管へ分配した。各管は0.5mLの希薄細胞と適切な抗体(0.2mg/mL)を含む。37℃にて20乃至24時間、攪拌せずに湿った培養器の中で増殖させた後、微小遠心管へ送り(1.5mL)、5分間で13000rpmの速さで遠心分離した。上澄みをMillex−GVフィルター・ユニット(0.22μm:Millipore,Ireland)を用いたろ過によって殺菌し、SDS−PAGE(10 %のBis-Tris gel, Invitrogen, Carlsbad CA)によって分析した。α溶血素とタンパク質Aの発現を確認するために、HRP共役したヒツジポリクローナルα溶血素抗体(abcam Inc., Cambridge MA) と抗タンパク質マウスAモノクローナル抗体(Sigma-Aldrich, St. Louis MO)を用いてウェスタンブロット分析を行い、ネズミ mAb SP2−6E11(Park and Janda, unpublished data)を対照抗体として使用した。溶血作用を試験するために、黄色ブドウ球菌の上澄み(75 μL x 3)をヒツジ血液寒天プレートに加え、プレートを、37℃で18時間、そして室温でさらに24時間培養した。
バイオフィルムアッセイを、次の論文の手順を少し修正することによって、実施した。(O’Toole, Methods Enzymol 310:91-109 (1999))を参照。抗体(0.2 mg/mL)の有無にかかわらず、ポリスチレン96ウェルプレートの中に0.2%グルコースを含むトリプティックソイ血液(TSB)培地で、黄色ブドウ球菌細胞(200μL)を攪拌することなく、20−24時間増殖させた。その後、プレートを水の中に沈め洗浄し、乾燥させた。クリスタル・バイオレット溶液(200μL,aq 0.1%)をバイオフィルムに染色するために加え、その後、プレートを水で丁寧に洗浄した後、酢酸(250μL,aq 30%)を残ったクリスタル・バイオレットを可溶性にするために加えた。吸光度を、570nmで、Spectramax 250(Molecular Devices, Sunnyvale CA)を用い、測定した。
一晩培養された黄色ブドウ球菌RN4850細胞を、抗体を含む新たなCYGP培地 (1mL)で、OD600≒0.03まで希薄し、20乃至24時間(OD600≒2)、37℃で攪拌せずに増殖させる。その細胞からのRNAを、Rneasy(登録商標) Mini Kit (QIAGEN Inc., Valencia CA)を使用して、製造者指示に従い、単離する。単離されたRNAを、室温で30分間Rnase−Free Dnase (QIAGENE Inc.)を使用し、さらに純化する。ファーストストランドDNAを、RT−PCR用SuperScript(商標)ファーストストランド合成システム(Invitrogen)を用い、約300ngの純RNAを用いて合成した。RT−PCR試験を、少なくとも独立した2つのサンプルで行い、各試験は、LightCycler(登録商標) FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)を用い、正副2回行った。Generic SYBR Green Protocol (Roche)は、PCR法のために使用した。相対定量解析は、参照としてハウスキーピング・ジャイレース遺伝子を用いるLightCycler(登録商標)2.0 system (Roche Applied Science)を用いて行った。使用されるプライマーの配列は以下の通りである。
gyrA R: 5’-TGGGGAGGAATATTTGTAGCCATACCTAC-3’(SEQ ID NO:6);
rnaIII F: 5’-GCACTGAGTCCAAGGAAACTAACTC-3’(SEQ ID NO:7);
rnaIII R: 5’-GCCATCCCAACTTAATAACCATGT-3’(SEQ ID NO:8);
hla F: 5’-CTGAAGGCCAGGCTAAACCACTTT-3’(SEQ ID NO:9);
hla R: 5’-GAACGAAAGGTACCATTGCTGGTCA-3’(SEQ ID NO:10);
spa F: 5’-GCGCAACACGATGAAGCTCAACAA-3’(SEQ ID NO:11);
spa R: 5’-ACGTTAGCACTTTGGCTTGGATCA-3’(SEQ ID NO:12);
eta F: 5’-GTTCCGGGAAATTCTGGATCAGGT-3’(SEQ ID NO: 13);
eta R: 5’-GCGCTTGACATAATTCCCAATACC-3’(SEQ ID NO: 14);
sarA F: 5’-CTGCTTTAACAACTTGTGGTTGTTTG-3’(SEQ ID NO:15)
sarA R: 5’-CGCTGTATTGACATACATCAGCGA-3’(SEQ ID NO:16);
saeR F: 5’-CGCCTTAACTTTAGGTGCAGATGAC-3’(SEQ ID NO:17);
saeR R: 5’-ACGCATAGGGACTTCGTGACCATT-3’(SEQ ID NO:18).
マウスでのすべての試験は、TSRIガイドライン及びレギュレーションに従い行った。生後6乃至8週間のSKH1の寛解期の無毛マウスは、Charles River Laboratoriesから入手し、試験で使用する直前1週間は、生物学的飼育器に入れておく。脳−心臓浸出物寒天培地は、Novickの Methods Enzymol 204: 587-636 (1991)で説明されるように、1% カザミノ酸(Fisher BP1424)と1%酵母エキス(EMD 1.03753)、0.59%塩化ナトリウム、0.5 %ブドウ糖、60mMのβ−グリセロール酸ニナトリウム塩(Fluka 50020)を含んだBBR(♯211065)とCYGP培養液からなる。Cytodex1 ビーズ(GE Healthcare 17-0448-01)を、カルシウム/マグネシウム(Gibco)を含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水中で、20℃で一晩中懸濁する(50mL中に1グラム)。上澄みを別の容器に移し、ビーズをDPBS中で懸濁及び1G沈殿法によって3度洗浄し、高圧蒸気殺菌(121℃、15psi、15分)を行った。黄色ブドウ球菌 RN4850(AIP4)は、脳−心臓浸出物寒天培地プレート上で一晩35℃で、冷凍したストック(BHI + 20% グリセロール)から増殖させた。2mLのCYGP培養液を植菌するために3つの代表コロニーを組合せ、そして攪拌せずに一晩インキュベーションの後、0.25mLの培養物を用いて5mLのCYGPを植菌し、35℃にて3時間200rpmでインキュベーションした。培養物を1300×Gで、4℃で20分間、遠心分離機にかけ、上積みを捨て、菌ペレットを、カルシウム/マグネシウムを含まない1mLのDPBS中で懸濁した。SKH1マウスに、200μLの黄色ブドウ球菌(1×107 又は 1×108 細菌)、4μLの血中容積のCytodexビーズ、DPBS、抗AIP4抗体、あるいは対照IgG(0.6又は0.06mg)を含む皮内側腹注射を受けさせた。追加の対照動物に、Cytodexビーズあるいは抗体をプラスしたビーズを含む200μLの皮内側腹注射を受けさせた。注射後、マウスを4乃至7日間、少なくとも各3時間観測した。観測の終わりにあたり、マウスを安楽死させ、組織を細菌学、組織学的解析のために採取した。
黄色ブドウ球菌RN4850を−80℃で20%グリセロールBHI培地で保管し、解凍してから、BHI寒天培地プレート上で一晩増殖させた。そして、2mLのCYGP培地に植菌するために、3つの分けられたコロニー採取した。摂取培養物を、攪拌せずに1時間35℃で維持し、続いて3時間200rpmで攪拌した。新たに増殖した植菌培養物を、50mLの円錐ポリプロピレン管(1/20に希釈)中の5mLのCYGP培地に送り、200rpmで35℃、3時間攪拌した。菌を3000rpm(1300×G)で10分間、4℃で遠心分離機にかけ、沈殿させた。その菌ペレットをカルシウム/マグネシウムを含まないダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水(DPBS)中で再懸濁し、ペトロフハウザーカウンティングチャンバー(Petroff-Hausser counting chamber)を用いて数をカウントした。3×108の菌を0.5mL腹腔内投与するために、最後の希釈は、DPBS中で行った。生存能力を維持するために、菌は採取後2時間以内に投与した。
AP4−BSA共役物と各mAbの最適な濃度を測定した。96ウェルELISAプレートを、適切な量のAP4−BSA共役物でそれぞれ被覆した。プレートを、4%スキムミルクでブロック、洗浄し、mAbをあらかじめ決められた最適な濃度で加えた。プレートを洗浄し、フリーな抗原、すなわち天然AIPs1−4を、100μmで始まる濃度系列において、ウェルへ添加した。プレートは、1時間、37℃でインキュベーションし、よく洗浄し、ヤギ抗マウス西洋わさびペルオキシターゼ(HRP)共役物(Pierce, Rockford, IL)を加えた。RTで1時間インキュベーション後、プレートを再びよく洗浄し、HRP基質(TMB substrate kit; Pierce)を加え、反応が15分間進んだら、2MのH2SO4を追加することで反応を停止させた。450nmで吸光度が読み込み、その値がGrafit(Erithacus Software Ltd)を用いてプロットされる。吸光度値が最大値の50%となる抗原を含まない濃度は、その抗原にとっての抗体の解離定数と考えられる。
報告されているAIP−4(Mayville et al.,Proc. Natl.Ncad. Sci. U.S.A. 96:1218-1223 (1999))の構造情報に基づき、ハプテンAP4−5は、マウスにおいて、抗AIP−4抗体免疫反応を誘発するために設計及び合成された(概要1)。天然チオラクトンからラクトン含有ハプテンへの化学スイッチのための論拠は、ラクトンのアミノリシス安定度が大きくなることに基づいた。このストラテジーは、ハプテン共役物が免疫化プロセスと続く免疫反応の間、構造的に未変化のままであることを保証した。このようにして、他のQS分子にとって過去に把握できていないような未知の化学物質や生物学的性質を持った分解物の生成を避けた。この置換は、保護されたチオラクトンとペンダントシステインチオールの間での分子内チオール交換の可能性を防いだ。それゆえに、Fmoc-セリン(Trt)-OHは、天然システイン残基の位置において、4の位置で組み込まれた。
黄色ブドウ球菌においてα溶血素とタンパク質Aは2つの主要な病原性因子であり、これらタンパク質の発現は、AIPに基づくagr QSシステムを含む黄色ブドウ球菌シグナル伝達ネットワークによってしっかりと制御されている。agr QSシステムは、確実にα溶血素の発現を制御する一方、タンパク質A産生はQSシグナル伝達によって下方制御される。
AP4−24H11を用いたagr QS抑制をさらに試験するために、病原因子発現において観察される変化がagr QSシステム干渉によって確かに起こるかどうか、すなわち、AP4−24H11の存在が黄色ブドウ球菌において、rnaIIIの転写、agr自己誘導の即時生成物、そして主なQSエフェクターに影響を与えるかどうかを評価するために、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)分析を行った。予想通り、RN4850中の定常増殖段階間のrnaIII自己誘導レベルは、AP4−24H11によって著しく(50倍以上)減少した。このように、α溶血素とタンパク質Aの発現の変化は、AIP−4−媒介QSシグナル伝達の干渉に直接的な結果となる(図4D)。だが、エキソタンパク質発現全体における僅かな変化(図3参照)は、AP4−24H11がQSシグナル伝達を効果的にブロックしないことを意味すると誤解されるかもしれない。しかしながら、RT−PCR分析は、AP4−24H11が黄色ブドウ球菌RN4850中のAIPに基づくQSを著しく抑制する、という論拠を提供するものである。
AP4−24H11が、AIP−4との結合と細胞増殖培地からの隔離を通してagr QSを阻害したかどうか、あるいはAP4−24H11がagr QSネットワークに順に影響を与える直鎖ペプチドRNAIII−阻害ペプチド(RAP)を含む黄色ブドウ球菌中の他のシグナル伝達システムに影響を与えたかどうかを測定するために、次の試験を行い、AIP−4の外部添加が黄色ブドウ球菌中RN4850中のagr QSシグナル伝達ネットワークをAP4−24H11の存在下で修復できたかどうかを確認した。簡潔にいうと、AP4−24H11を等モル量の合成AIP−4で化学処理した後、AIP−4ペプチドとの抗体結合部位の飽和を確認するために、黄色ブドウ球菌増殖培地へ合成AIP−4を添加した。図4Eで示すように、合成AIP−4の添加はAP4−24H11のクオラムクエンチング効果を効果的に減らし、その結果、黄色ブドウ球菌RN4850中のα溶血素の発現を完全に回復した。この発見は、AP4−24H11が黄色ブドウ球菌増殖培地中のAIP−4を隔離し、完全にAIP−4依存した様式において、黄色ブドウ球菌中のAIP依存QSシグナル伝達を阻害するということを新たに確認した。
最近の研究によって、黄色ブドウ球菌培養によってできた上澄み液を用いたジャーカットT細胞のインキュベーションはアポトーシス誘導をもたらすということが示されてきている。ジャーカット細胞は、AP4−24H11の有無にかかわらず、黄色ブドウ球菌(RN4850やWood46)培養増殖の上澄み液を用いて化学処理される。上澄み液を用いた4時間のインキュベーションの後、アポトーシス誘導を指し示す生物学マーカーである、ポリ(ADPリボース)ポリメラーゼ(PARP)の開裂を、ジャーカット細胞抽出タンパク質において評価した。図5で示されるように、AP4−24H11は、ジャーカット細胞におけるRN4850上澄み(1%)誘導PARP開裂を防ぎ、また部分的にWood46上澄み液の効果を阻害した。その結果(図4A及び図5)は、α溶血素の発現と黄色ブドウ球菌誘導アポトーシスとの間の正相関を示している。
次に、mAb AP4−24H11がインビボで黄色ブドウ球菌誘導外傷を軽減する可能性を、マウス皮下感染モデルを用いて調査した。新たに増殖した対数期黄色ブドウ球菌を、Cytodexビーズ 、AP4−24H11又は対照IgGを含むPBS中で懸濁した。菌液の皮下注射または媒体制御は、7日間に亘り緊密な観測によって、SKH1無毛マウスの側腹に行った。投与量は、107あるいは108の菌(コロニー形成単位;cfu)と0.6または0.06mgのAP4−24H11あるいは対照IgGであった。107cfu を受け取ったマウスは、7日間に亘る限界硬化により、微小な充血/浮腫を発達させる(図6参照)。しかしながら、注射後6時間、生理食塩水中あるいは対照IgG中で攪拌された108cfuを受け取ったマウスは、注射を打った箇所に初期段階の充血/発赤を示し、これは側腹に沿って対角のパターンで3−5mm水平に、5−10mm垂直に広がっている(図7A)。18時間の再試験において、注射を打った周辺の同じ領域は生命力を奪われ、肌は脆性の、赤褐色の痂皮に変化した。7日間の観察期間中に、硬くなった痂皮が比較的正常に見える肌の周辺から脱離し始め、少量の化膿した滲出液が正常な/壊死性の接合部で観察された。反対に、肌外傷は0.6 mgのAP4−24H11を持った108の菌を受け取ったマウスでは抑制された(図7C)。予想されたように、低用量のAP4−24H11(0.06mg)は、保護に適したものではなく(図7B)、0.6mg対照IgGを持った108cfuを受け取った対照マウスは保護されなかった(図6参照)。PBS/Cytodexのみ、又は0.6mgのAP4−24H11を含む注射を受けたマウスは、観察期間中、偶発的局所硬化を例外として正常のままであった。黄色ブドウ球菌RN4850との組み合わせで0.6mgの保護量を受けた動物は、7日間の観察期間において重大な損傷を発症することはなかった。
致死的攻撃に対しAP4−24H11を用いる受動免疫化法の効果を評価するために、SKH1無毛マウスに1mlのAP4−24H11、対照IgGあるいは媒体(DPBS)の腹腔内注射を与え、2時間後、3×108黄色ブドウ球菌RN4850を含む0.5mL のDPBSで腹腔内注射した。図8で示すように、AP4−24H11を受けたすべてのマウス(6/6)は、8日間の観察期間を通して生き続けた。反対に、DPBSを投与された対照マウスは1匹(1/6)しか生存できず、対照IgGを投与されたマウスは1匹も(0/6)24時間以上生き続けられなかった。これらのデータは、さらに急性黄色ブドウ球菌感染症と戦うための私たちの免疫薬物治療学的(immunopharmacothereutic)アプローチを立証した。
AP−1、AP−3、AP−4ハプテンとこれらのハプテンに特定の抗体を、上記実施例4及び12にて説明したように調製した。
新しく得られた抗AIP抗体、例えば抗AIP1や抗AP3抗体のいくつかのクオラムクエンチング能力を評価した。グループIストレイン(RN6390BとWood46)のために、競合ELISAアッセイにおいてAIP−1に対し高い親和性を示す2つのモノクローナル抗体、AP1−2C2とAP1−15B4をテストした。図9は、抗AP1抗体が病原性因子の発現において変化をもたらすグループIストレインのクオラムセンシングも効果的に阻害していることを示している。加えて、グループIIIストレインの一つに対する抗AP3抗体であるRN8465をテストした。RN4850中のエキソタンパク質の発現が少なかったため、クオラムクエンチング効果は正確に測定されなかった。
環状ペプチドに基づくワクチンの効果を評価するために、以下の試験を行った。活性及び不活性ワクチン接種スケジュールは次の通りである。
初期力価: 前日(−1日)
初期免疫化: 当日(0日) 50−200μgタンパク質
力価事前追加1:6日
追加1: 7−14日(初期免疫化後1−2週間) 50−200μgタンパク質
力価事前追加2:20日
追加2: 21−28日(追加1の後、1−2週間)50−200μgタンパク質
攻撃前の力価: X日(攻撃前日)
攻撃: X日(追加2の前1週間)
(不活性ワクチン接種スケジュール)
初期力価: 前日(−1日)
免疫化: 当日(0日) 100−1000μgのIgG/マウス
攻撃前の力価: 1日
攻撃: 2日
アジュバントとしてオリゴデオキシヌクレオチド(CpG−ODNs)を含む非メチル−シトシン−グアノシン−ジヌクレオチド配列を含む菌DNAとともに、100μgの免疫抱合体を用いてマウスの腹腔内に免疫を与えた(Chuang et al., J Leukoc Biol 71:538-44 (2002).)。動物に初期のワクチン接種の7日と21日後に追加免疫を受けさせた。血清サンプルは、抗AIP−4抗体価分析のためにすべての動物から感染実験の前に取り除いた。
得られたすべての抗AIP1 mAbsを、再びグループI黄色ブドウ球菌ストレインRN6390Bに対してテストした。図10Bの結果は、多数の抗AP1抗体が、効果的に溶血素の発現の変化をもたらすグループI黄色ブドウ球菌のクオラムセンシングを阻害したことを示す。mAb AP1−15B4(#4)は、免疫化実験において最も強力な活性を示した。
Gao et al. (Proc Natl Acad Sci U S A. 99:12612-6 (2002))が説明する方法を用いて生成されるファージディスプレイライブラリーは、AP1−BSA、AP3−BSA、AP4−BSA共役物を用いてスクリーニングされ、ヒト抗AIP−1、AIP−3、及び、抗AIP−4scFv抗体を識別した。抗体ディスプレイングファージ粒子を、非特異バインダーと同様に、BSA特有クローンを除去するために最初にBSAに対して除去した。4周のパニングの後、選択されたクローンを、BSA、AP1−BSA、AP3−BSA、AP4−BSAに対してDNAシークエンシングとELISAによって分析した。scFv抗体のアミノ酸配列は、可変重鎖と可変軽鎖をコード化するDNA配列であり、またscFv抗体をコード化するDNA配列でもあるが、これを以下に示す。
抗体ファージディスプレイライブラリーをパニングして得られた20クローンのうち、最も強力なクローンであるAP4−4−20が大腸菌中のscFv抗体として発現した。発現したscFv抗体を純化し、黄色ブドウ球菌RN4850中のその溶血素発現の抑制能力を、以下の通り評価した。
私たちの受動免疫化法の効果は、致死ブドウ球菌攻撃マウスモデルにおいて、mAb AP1−15B4を用いて、暴露後のシナリオにおいて実証された。C57BL/6マウスは、少なくとも1×108黄色ブドウ球菌USA300(agr I MRSAストレイン)に感染した2時間後に、1mgのAP1−15B4(腹腔内)、アイソタイプ対照IgG又はPBSを受けた。(Diep et al., Lancet 2006, 367, (9512), 731-739.)を参照。USA300は事実、最も一般的な地域感染型のMRSA(CA−MRSA)ストレインの一つであり、一般人と軍人にとって危険な兆候が増えていることを示す(Hageman et al., Diagn Microbiol Infect Dis 2008; James et al., Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed 2008, 93, (1), F40-4;Tenover et al., J Clin Microbiol 2006, 44, (1), 108-18; Beilman et al., Surg Infect (Larchmt) 2005, 6, (1), 87-92.)。図12で示すように、AP1−15B4を受けたマウス6匹のうち4匹が、48時間の観察期間を通して生き延びた。一方、PBS治療を受けた対照マウスは6匹中2匹、対照IgG治療を受けたマウスでも24時間以上は生き延びたのは、6匹中2匹しかいなかった。これらのデータは、黄色ブドウ球菌においてクオラムセンシングストラテジーにとっての治療手段の存在を初めて証明するものである。これはさらに、我々のクオラムクエンチング抗体が患者の感染後に投与できることを示すものであるため、黄色ブドウ球菌感染を予防するための我々の免疫薬物治療学アプローチの正当性を立証するものである。
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Claims (5)
- 高分子担体に結合する少なくとも1つのハプテンを備える免疫原性の分子実体であって、
前記ハプテンは大環状を備える環状ペプチドを含み、
前記環状ペプチドは、GVNP(Xa+2)GGWF(SEQ ID NO: 96),KAKT(Xa+2)TVLY(SEQ ID NO: 97),KTKT(Xa+2)TVLY(SEQ ID NO: 98),GANP(Xa+2)OLYY(SEQ ID NO: 99),GANP(Xa+2)ALYY(SEQ ID NO: 100),GYST(Xa+2)SYYF(SEQ ID NO: 101),GYRT(Xa+2)NTYF(SEQ ID NO: 102),YNP(Xa+2)VGYF(SEQ ID NO: 103),GGKV(Xa+2)SAYF(SEQ ID NO: 104),SVKP(Xa+2)TGFA(SEQ ID NO: 105),DSV(Xa+2)ASYF(SEQ ID NO: 106),KYNP(Xa+2)SNYL(SEQ ID NO: 107),KYNP(Xa+2)ASYL(SEQ ID NO: 108),KYNP(Xa+2)ANYL(SEQ ID NO: 109),RIPT(Xa+2)TGFF(SEQ ID NO: 110),DI(Xa+2)NAYF(SEQ ID NO: 111),DM(Xa+2)NGYF(SEQ ID NO: 112),KYNP(Xa+2)LGFL(SEQ ID NO: 113),KYYP(Xa+2)FGYF(SEQ ID NO: 114),GARP(Xa+2)GGFF(SEQ ID NO: 115),GAKP(Xa+2)GGFF(SEQ ID NO: 116),YSP(Xa+2)TNFF(SEQ ID NO: 117),YSP(Xa+2)TNF(SEQ ID NO: 118),またはQN(Xa+2)PNIFGQWM(SEQ ID NO: 119)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
各配列の最後のアミノ酸残基はX1であり、X1はそれぞれのカルボニル基によってR基に共役結合したアミノ酸残基であり、
Xa+2は任意のアミノ酸であり、前記任意のアミノ酸のそれぞれの炭素原子はRと共役結合し、
Rは−CH2O−、−CH2CH2O−、−CH2CH(CH3)O−、−CH2−フェニル−O−、−CH2S−、−CH2CH2S−、または、−(CH2)nNH−を含み、ここでnは1乃至約4であり、
前記環状ペプチドのN−末端アミノ酸残基は、前記高分子担体と結合していることを特徴とする免疫原性の分子実体。 - 前記高分子担体がタンパク質、ポリマー、又はナノ粒子を備えることを特徴とする請求項1に記載の分子実体。
- 前記環状ペプチドまたはその類似体は、前記高分子担体に共役結合していることを特徴とする請求項1に記載の分子実体。
- 黄色ブドウ球菌による哺乳類の感染症を予防または治療する方法であって、
該方法は、
哺乳類に、前記黄色ブドウ球菌による哺乳類の感染症を予防または治療するのに有効な量で、請求項1記載の免疫原性の分子実体を投与する段階を含むことを特徴とする方法。 - スタフィロコッカス・インターメディウスによる哺乳類の感染症を予防または治療する方法であって、
該方法は、
哺乳類に、前記スタフィロコッカス・インターメディウスによる哺乳類の感染症を予防または治療するのに有効な量で、大環状環を備える免疫原性の分子実体を投与する段階を含み、
環状ペプチドは、アミノ酸配列RIPT(Xa+2)TGFF(SEQ ID NO: 110)を含み、各配列の最後のアミノ酸残基はX1であり、X1はそれぞれのカルボニル基によってR基に共役結合したアミノ酸残基であり、
Xa+2は任意のアミノ酸であり、前記任意のアミノ酸のそれぞれの炭素原子はRと共役結合し、
Rは−CH2O−、−CH2CH2O−、−CH2CH(CH3)O−、−CH2−フェニル−O−、−CH2S−、−CH2CH2S−、または、−(CH2)nNH−を含み、ここでnは1乃至約4であり、
前記環状ペプチドのN−末端アミノ酸残基は、前記高分子担体と結合していることを特徴とする方法。
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