CN109307663A - 一种微孔反应板制备方法、试剂盒以及试剂盒的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微孔反应板制备方法、试剂盒以及试剂盒的检测方法，包括由下步骤：步骤1）将试剂所需数量的微孔反应板条平衡至室温；步骤2）将上述浓缩洗液和去离子水按1：20混合成工作洗涤液；步骤3）将标准品、质控品用纯化水按标示体积复溶；步骤4）向每孔中分别加入100～200μl复溶试剂；步骤5）然后依次加入25～100μl标准品、质控品或待测标本；振荡孵育10～30分钟；步骤6）采用上述的工作洗涤液洗板4‑6次，拍干；步骤7）向每孔中加入50～200μl增强液,缓慢振荡5min，于荧光读数仪内进行荧光计数。本发明降低了操作失误了及因配制容器引入引起污染的风险；示踪物制作成微球后置于微孔板中，装量无需富余，减少了试剂的浪费，降低试剂成本。

Description

一种微孔反应板制备方法、试剂盒以及试剂盒的检测方法

技术领域

本发明涉及时间分辨免疫荧光测定技术的甲状腺功能的多联检测技术领域，尤其是一种微孔反应板制备方法、试剂盒以及试剂盒的检测方法。

背景技术

时间分辨免疫荧光测定技术(Time Resolved Immunofluorometric assay,TRIFMA)是八十年代初问世的一项新型的超微量免疫分析技术。荧光的时间分辨技术是利用荧光发射体的荧光寿命差别，将其荧光分开的荧光光谱技术。以镧系元素为示踪剂代替放射性同位素，用具有双功能基团的镧系元素来标记抗原或抗体，当解离下来的镧系元素与特制的扩增液形成新的螯合物时，其荧光明显增强而持久。用延迟测量的办法可消除标本自身的本底荧光，从而大大提高检测灵敏度。

根据国家食品药品监督管理局网站查新，现已获得国家或地区注册批件的同方法学的检测试剂盒，其示踪物均为独立包装，在实验时现配现用。

目前，运用时间分辨检测技术开发的试剂盒，大多为单一检测项目，而疾病的确诊往往是多指标联合评判。在实际使用中，一份标本的检测，往往需要拆多种试剂盒进行拼板操作，而独立配制相应的示踪物工作液不仅因为引入配制容器而造成污染，还容易在配制时发生混淆造成实验失败。因此，一种操作简单、能适用于多项目联合检测的试剂盒将有较大的市场前景。

上述技术存在以下缺陷或不足：

(1)目前大部分标准品和示踪物在试验前需提前30min进行复溶，而每个检测项目标准品和示踪物共7瓶试剂，5个项目就是35 瓶需要复溶，不仅浪费时间，还容易引起交叉污染，及出现因复溶不充分、不一致引起的实验结果异常；

(2)现有微孔板试剂多项目联合检测时需进行拼板操作，不仅操作繁琐，也容易因为试剂种类较多造成混淆；

(3)因示踪物工作液配制时需引入容器，易造成污染；

(4)因加液过程需要富余，导致实际配制示踪物工作液比理论用量均多，而自动化设备的富余量则更多，故厂家提供示踪物装量往往比实际用量多一些，自动化设备则更高，而每次实验的富余液体均弃掉，造成试剂浪费。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：为了克服上述中存在的问题，提供了一种微孔反应板制备方法、试剂盒以及试剂盒的检测方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种微孔反应板制备方法，所述的微孔反应板内部设置有示踪物微球，微孔反应板由以下步骤制成：

步骤1)、将多孔微板空白板的微孔反应板制备成包被板；

步骤2)、制备示踪物微球，将1mg～3mg目标抗原(抗体)加入 1mg的Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠中混匀，25℃反应24h；

步骤3)、反应液经Sephadex G－50柱(1×40cm)用50mmol/L、 pH7.8的Tris-HCl缓冲液洗脱，分离示踪结合物与游离Eu3+；

步骤4)、采用全自动部分收集器1ml/管进行液体收集；

步骤5)、于时间分辨荧光免疫分析仪上进行荧光计数，收集第一峰中荧光计数大于10000000的洗脱液,混匀后2～8℃保存；

步骤6)、采用棋盘滴定法确定铕标记工作液浓度，然后用稀释液再按一定的比例稀释后进行冻干成微球，将冻干后的微球转移至步骤1)中包被板中，密封，再转移至铝塑袋中，于2～8℃中保存。

优选的，所述步骤1)中的包被板由以下步骤制成：步骤1)采用含有1～10ppm防腐剂的缓冲液将目标抗原或抗体稀释成1～ 10μg/ml的包被液；

步骤2)，在多孔微板空白板中加入包被液100～200μl/孔，并且在35℃条件下孵育过夜；

步骤3)，孵育好的包被板用工作洗涤液洗板1次，拍干；

步骤4)，将洗涤过的包被板按250～280μl/孔加入封闭液， 25±2℃条件下孵育过夜；甩干，过夜晾干；

步骤5)，将权利要求1中制备示踪物微球加入包被板中；

步骤6)，用自封袋密封；置2～8℃条件下保存。

优选的，所述的缓冲液为含5ppm 的0.05mol/L、 pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。

优选的，所述的封闭液为含5.0g/L海藻糖、0.5％BSA，0.05mol/L、 pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。

优选的，所述的工作洗涤液为浓缩洗液和去离子水按1：20混合而成：所述的浓缩洗液为在含0.385mol/L NaCl,0.124mol/L、pH7.8 的Tris-HCl缓冲液中加入1.0ml/L～10.0ml/L的Tween-20而成。

本发明还提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括复溶试剂、浓缩洗液、增强液、标准品、质控品以及上述的微孔反应板。

优选的，所述的复溶试剂为在含0.01g/L的乙二胺四乙酸二钠的 50mmol/L、pH7.8的Tris-HCl溶液中加入1.0g/L～20.0g/L的牛血清白蛋白。

优选的，所述的浓缩洗液为在含0.385mol/L NaCl,0.124mol/L、 pH7.8的Tris-HCl缓冲液中加入1.0ml/L～10.0ml/L的Tween-20。

优选的，所述的增强液为在含有1ml/L TritonX-100、0.1mol/L 邻苯二甲酸氢钾-冰醋酸溶液中加入1～5mg/Lβ-萘甲酰三氟丙酮、 15～30mg/L的三正辛基氧化磷。

本发明还提供了一种试剂盒的检测方法，包括由下步骤：步骤1) 将试剂所需数量的微孔反应板条平衡至室温；

步骤2)将上述浓缩洗液和去离子水按1：20混合成工作洗涤液；

步骤3)将标准品、质控品用纯化水按标示体积复溶；

步骤4)向每孔中分别加入100～200μl复溶试剂；

步骤5)然后依次加入25～100μl标准品、质控品或待测标本；反应体系在37℃下，振荡孵育10～30分钟；

步骤6)采用上述的工作洗涤液洗板4-6次，拍干；

步骤7)向每孔中加入50～200μl增强液,缓慢振荡5min，于荧光读数仪内进行荧光计数；

步骤8)按测定参数进行拟合分析，得到定量结果。

本发明的有如下益效果：

(1)示踪物无需提前复溶，且在使用过程无需配制示踪物工作液，降低了操作失误了及因配制容器引入引起污染的风险；

(2)示踪物制作成微球后置于微孔板中，装量无需富余，减少了试剂的浪费，降低试剂成本；

(3)示踪物在配制前加入特定的色素，然后制作成微球置于微孔板中，明显的色差代表不同的实验项目，可以有效降低实验过程中因混淆导致的失误；

(4)该试剂盒实验流程简单，可配套自动化仪器，轻易的实现检测自动化；

(5)较现有市面产品，一个试剂盒实现多项目(2-8个项目)的检测。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是本发明试剂盒促甲状腺素标准品典型曲线图；

图2是本发明试剂盒三碘甲状腺原氨酸标准品典型曲线图；

图3是本发明试剂盒游离三碘甲状腺原氨酸标准品典型曲线图；

图4是本发明试剂盒甲状腺素标准品典型曲线图；

图5是本发明试剂盒游离甲状腺素标准品典型曲线图；

图6是本发明促甲状腺激素测定试剂盒与国内试剂盒对标本检测线性相关性图；

图7是本发明三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒与国内试剂盒对标本检测线性相关性图；

图8是本发明甲状腺素测定试剂盒与国内试剂盒对标本检测线性相关性图；

图9是本发明游离三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒与国内试剂盒对标本检测线性相关性图；

图10是本发明游离甲状腺素测定试剂盒与国内试剂盒对标本检测线性相关性图。

具体实施方式

实施例1

一种微孔反应板制备方法，所述的微孔反应板内部设置有示踪物微球，其微孔反应板用于甲状腺功能的多联检测试剂盒，微孔反应板由以下步骤制成：

步骤1)、将多孔微板空白板的微孔反应板制备成包被板；

步骤2)、制备示踪物微球，将1mg～3mg目标抗原(抗体)加入 1mg的Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠中混匀，25℃反应24h；本实施例中采用3mg目标抗原或抗体；

步骤3)、反应液经Sephadex G－50柱(1×40cm)用50mmol/L、 pH7.8的Tris-HCl缓冲液洗脱，分离示踪结合物与游离Eu3+；

步骤4)、采用全自动部分收集器1ml/管进行液体收集；

步骤5)、于时间分辨荧光免疫分析仪上进行荧光计数，收集第一峰中荧光计数大于10000000的洗脱液,混匀后2～8℃保存；

步骤6)、采用棋盘滴定法确定铕标记工作液浓度，然后用稀释液再按一定的比例稀释后进行冻干成微球，将冻干后的微球转移至步骤1)中包被板中，密封，再转移至铝塑袋中，于2～8℃中保存。本实施例中在5℃中保存。

其中，所述步骤1)中的包被板由以下步骤制成：步骤1)采用含有1～10ppm防腐剂的缓冲液将目标抗原或抗体稀释成1～ 10μg/ml的包被液；本实施例中采用了8ppm防腐剂的缓冲液将目标抗原或抗体稀释成6μg/ml的包被液；

步骤2)，在多孔微板空白板中加入包被液100～200μl/孔，并且在35℃条件下孵育过夜；

步骤3)，孵育好的包被板用工作洗涤液洗板1次，拍干；

步骤4)，将洗涤过的包被板按250～280μl/孔加入封闭液， 25±2℃条件下孵育过夜；甩干，过夜晾干；本实施例中采用250μl；

步骤5)，将权利要求1中制备示踪物微球加入包被板中；

步骤6)，用自封袋密封；置2～8℃条件下保存。本实施例中采用5℃。

其中，所述的缓冲液为含5ppm 的0.05mol/L、pH9.6 的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。

其中，所述的封闭液为含5.0g/L海藻糖、0.5％BSA，0.05mol/L、 pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。

其中，所述的工作洗涤液为浓缩洗液和去离子水按1：20混合而成：所述的浓缩洗液为在含0.385mol/L NaCl,0.124mol/L、pH7.8的Tris-HCl缓冲液中加入1.0ml/L～10.0ml/L的Tween-20而成。本实施例中的Tween-20为9ml/L。

其示踪物无需提前复溶，且在使用过程无需配制示踪物工作液，降低了操作失误了及因配制容器引入引起污染的风险。示踪物制作成微球后置于微孔板中，装量无需富余，减少了试剂的浪费，降低试剂成本；示踪物在配制前加入特定的色素，然后制作成微球置于微孔板中，明显的色差代表不同的实验项目，可以有效降低实验过程中因混淆导致的失误。

实施例2

一种试剂盒，所述的试剂盒包括复溶试剂、浓缩洗液、增强液、标准品、质控品以及上述的微孔反应板。

所述的复溶试剂为在含0.01g/L的乙二胺四乙酸二钠的 50mmol/L、pH7.8的Tris-HCl溶液中加入1.0g/L～20.0g/L的牛血清白蛋白。本实施例中，加入10g/L的牛血清白蛋白

其中，所述的浓缩洗液为在含0.385mol/L NaCl,0.124mol/L、 pH7.8的Tris-HCl缓冲液中加入1.0ml/L～10.0ml/L的Tween-20。本实施例中加入9ml/L的Tween-20。

其中，所述的增强液为在含有1ml/L TritonX-100、0.1mol/L邻苯二甲酸氢钾-冰醋酸溶液中加入1～5mg/Lβ-萘甲酰三氟丙酮、15～ 30mg/L的三正辛基氧化磷。本实施例中加入4mg/Lβ-萘甲酰三氟丙酮、20mg/L的三正辛基氧化磷。

实施例3

本发明还提供了一种试剂盒的检测方法，包括由下步骤：步骤1) 将试剂所需数量的微孔反应板条平衡至室温；

步骤2)将上述浓缩洗液和去离子水按1：20混合成工作洗涤液；

步骤3)将标准品、质控品用纯化水按标示体积复溶；

步骤4)向每孔中分别加入100～200μl复溶试剂；

步骤5)然后依次加入25～100μl标准品、质控品或待测标本；反应体系在37℃下，振荡孵育10～30分钟；

步骤6)采用上述的工作洗涤液洗板4-6次，拍干；

步骤7)向每孔中加入50～200μl增强液,缓慢振荡5min，于荧光读数仪内进行荧光计数；

步骤8)按测定参数进行拟合分析，得到定量结果。

本发明的有如下益效果：

(6)示踪物无需提前复溶，且在使用过程无需配制示踪物工作液，降低了操作失误了及因配制容器引入引起污染的风险；

(7)示踪物制作成微球后置于微孔板中，装量无需富余，减少了试剂的浪费，降低试剂成本；

(8)示踪物在配制前加入特定的色素，然后制作成微球置于微孔板中，明显的色差代表不同的实验项目，可以有效降低实验过程中因混淆导致的失误；

(9)该试剂盒实验流程简单，可配套自动化仪器，轻易的实现检测自动化；

较现有市面产品，一个试剂盒实现多项目(2-8个项目)的检测。

实施例4

本发明中甲状腺功能的多联检测试剂盒的整体制备如下：1)通用试剂的制备：复溶试剂为在含0.01g/L的乙二胺四乙酸二钠的 50mmol/L、pH7.8的Tris-HCl溶液中加入1.0g/L～20.0g/L的牛血清白蛋白；浓缩洗液为在含0.385mol/L NaCl,0.124mol/L、pH7.8的 Tris-HCl缓冲液中加入1.0ml/L～10.0ml/L的Tween-20；增强液为在含有1ml/LTritonX-100、0.1mol/L邻苯二甲酸氢钾-冰醋酸溶液中加入1～5mg/Lβ-萘甲酰三氟丙酮、15～30mg/L的三正辛基氧化磷。其中实验缓冲液的牛血清白蛋白为5～10.0g/L；浓缩洗液中的Tween-20为1～4.0ml/L。增强液中的β-萘甲酰三氟丙酮1～4.0mg/L、三正辛基氧化磷5～20mg/L、TritonX-100为1ml/L；

2)包被板的制备：将纯品目标抗原(抗体)用包被缓冲液稀释成浓度为1～10μg/ml的包被液；在多孔微板空白板中加入包被液 100～200μl/孔，35℃条件下孵育过夜；孵育好的包被板用工作洗涤液洗板1次，拍干；将洗涤过的包被板按250～280μl/孔加入封闭液，25±2℃条件下孵育过夜；甩干，过夜晾干；用自封袋密封；置 2～8℃条件下保存。

其中抗原(抗体)采用棋盘滴定法确定包被浓度，用缓冲液稀释成各浓度梯度，最终确定最佳包被效果的包被浓度。包被抗体稀释液为含5ppm 的0.05mol/L、pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液；封闭液为含5.0g/L海藻糖、0.5％BSA，0.05mol/L、pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液；包被板的热稳定性良好。

4)标准品、质控品的制备：以国家标准品为参照，用去激素阴性血清作为基质将目标抗原纯品稀释成5个适当浓度的标准品和低、高两个适当浓度的质控品，按1ml/瓶分装后进行冻干后得到标准品和质控品。

5)示踪物的制备：将1mg～3mg目标抗原(抗体)加入1mg的 Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠中混匀，25℃反应 24h；反应液经Sephadex G－50柱(1×40cm)用50mmol/L、pH7.8 的Tris-HCl缓冲液洗脱，分离示踪结合物与游离Eu3+，采用全自动部分收集器1ml/管进行液体收集；于时间分辨荧光免疫分析仪上进行荧光计数，收集第一峰中荧光计数大于10000000的洗脱液,混匀后 2～8℃保存；采用棋盘滴定法确定铕标记工作液浓度，然后用稀释液再按一定的比例稀释后进行冻干成微球，将冻干后的微球转移至2) 中包被板中，密封，再转移至铝塑袋中，于2～8℃中保存；

6)复溶试剂、浓缩洗液、增强液分装；

7)贴标签；

8)成品组装。

上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出3份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装试剂盒(时间分辨荧光免疫分析法)。组装完成后还需抽检合格后才能出厂。

目前常用的促甲状腺激素测定试剂盒(时间分辨荧光免疫分析法,96人份/盒为例，该型号的示踪物使用稀释比例为1:50，理论使用量为0.2ml(为便于计算，按100孔实验量计算)，其半自动试剂盒装量为0.5ml(0.3ml试剂浪费)，而其全自动试剂盒装量为1.0ml(0.8ml试剂浪费，浪费程度更显著)，其他项目的浪费情况基本一致；

现在市场上试剂盒种类的区别除了各组分上的标签外，大部分的厂家选择关联项目选用不同外形的反应板，或在反应板侧面印上项目名称，或在反应板上划上不同的颜色。却难见到示踪物工作液配制后，关联项目之间呈现明显的色差，也常听闻误将A的示踪物加入到B缓冲液中而导致实验失败的消息；

目前市场上时间分辨荧光免疫分析法的试剂盒基本按分析物进行包装，每盒产品内配约6个标准品点，1瓶示踪物及缓冲液，以甲功类检测项目为例，医院开展的检测项目为3～8项(大部分为五项)；这样检测一例标本就需复溶21～56瓶，不仅操作繁琐、浪费时间，还容易引起交叉污染，因此大部分医院为提高工作效率，采取标本集中后再进行检测的措施，然而该措施实施影响了标本的检测时效，同时难免出现急诊病人要求尽快出结果的情况。多年前，已见多厂家能提供甲功类多分析物质控品，因此配制一种含五种上述分析物的标准品已不存在技术难点。目前，自动化设备在分配标准品时，基本为一吸一分，而检测标本为一吸多分，不仅造成分液速度偏低，还容易因分液方式不一致产生差异。该技术的突破可以让标准品同标本一样实现一吸多分，提高分液速度，提高准确率。同时，因示踪物本就密封于微孔板内，在产品组装时，可提前进行拆板、拼板。组成不同人份、多分析物的联合试剂盒。

采用本发明检测的样本与现有血清样本为对象的检测结果具有高度的一致性。

本发明中的产品性能指标1)最低检测限：本发明促甲状腺激素的最低检测限不高于0.25μU/ml；甲状腺素的最低检测限不高于 10mmol/L；游离甲状腺素的最低检测限不高于10mmol/L；三碘甲状腺原氨酸的最低检测限不高于10mmol/L；游离三碘甲状腺原氨酸的最低检测限不高于10mmol/L；

2)线性：在线性区间内，五项指标的相关系数(r)均不低于0.9900；

3)准确度：在试剂盒规定的线性区间范围内检测国家标准品配制的企业标准品，其测量结果的相对偏差在±10％范围内；

4)批内精密度：平行测定试剂盒范围内的高、低质控品，测定结果的变异系数(CV)不高于10％；

5)批间精密度：在3个不同批次产品之间，平行测定试剂盒范围内的高、低质控品，测定结果的变异系数(CV)不高于15％；

6)特异性：促甲状腺激素测定250U/L黄体生成素、250U/L促卵泡激素、10000U/L绒毛膜促性腺激素的样本表观浓度不高于0.25μ U/ml；三碘甲状腺原氨酸与甲状腺素、反三碘甲状腺原氨酸的交叉反应率均不高于5％；甲状腺素与三碘甲状腺原氨酸、反三碘甲状腺原氨酸的交叉反应率均不高于5％；游离甲状腺素与游离三碘甲状腺原氨酸的交叉反应率不高于5％；

7)稳定性：试剂盒在37℃条件下放置6天，上述性能指标依然符合要求；

8)标准品典型曲线图，见说明书附图。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (10)

1.一种微孔反应板制备方法，其特征在于，所述的微孔反应板内部设置有示踪物微球，微孔反应板由以下步骤制成：

步骤1）、将多孔微板空白板的微孔反应板制备成包被板；

步骤2）、制备示踪物微球，将1mg~3mg目标抗原（抗体）加入1mg的Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠中混匀，25℃反应24h；

步骤3）、反应液经Sephadex G－50柱（1×40cm）用50mmol/L、pH7.8的Tris-HCl缓冲液洗脱，分离示踪结合物与游离Eu3+；

步骤4）、采用全自动部分收集器1ml/管进行液体收集；

步骤5）、于时间分辨荧光免疫分析仪上进行荧光计数，收集第一峰中荧光计数大于10000000的洗脱液,混匀后2~8℃保存；

步骤6）、采用棋盘滴定法确定铕标记工作液浓度，然后用稀释液再按一定的比例稀释后进行冻干成微球，将冻干后的微球转移至步骤1）中包被板中，密封，再转移至铝塑袋中，于2~8℃中保存。

2.根据权利要求1所述的一种微孔反应板制备方法，其特征在于，所述步骤1）中的包被板由以下步骤制成：

步骤1）采用含有1～10ppm防腐剂的缓冲液将目标抗原或抗体稀释成1～10μg/ml的包被液；

步骤2），在多孔微板空白板中加入包被液100～200μl/孔，并且在35℃条件下孵育过夜；

步骤3），孵育好的包被板用工作洗涤液洗板1次，拍干；

步骤4），将洗涤过的包被板按250～280μl/孔加入封闭液，25±2℃条件下孵育过夜；甩干，过夜晾干；

步骤5），将权利要求1中制备示踪物微球加入包被板中；

步骤6），用自封袋密封；置2～8℃条件下保存。

3.根据权利要求2所述的一种微孔反应板制备方法，其特征在于，所述的缓冲液为含5ppm Proclin300®的0.05mol/L、pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。

4.根据权利要求2所述的一种微孔反应板制备方法，其特征在于，所述的封闭液为含5.0g/L海藻糖、0.5%BSA，0.05mol/L、pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。

5.根据权利要求2所述的一种微孔反应板制备方法，其特征在于，所述的工作洗涤液为浓缩洗液和去离子水按1：20混合而成：所述的浓缩洗液为在含0.385mol/L NaCl,0.124mol/L、pH7.8的Tris-HCl缓冲液中加入1.0ml/L～10.0ml/L的Tween-20而成。

6.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括复溶试剂、浓缩洗液、增强液、标准品、质控品以及权利要求1-5中任意一项所述的微孔反应板。

7.根据权利要求6所述的一种试剂盒，其特征在于，所述的复溶试剂为在含0.01g/L的乙二胺四乙酸二钠的50mmol/L、pH7.8的Tris-HCl溶液中加入1.0g/L～20.0g/L的牛血清白蛋白。

8.根据权利要求6所述的一种试剂盒，其特征在于，所述的浓缩洗液为在含0.385mol/LNaCl,0.124mol/L、pH7.8的Tris-HCl缓冲液中加入1.0ml/L～10.0ml/L的Tween-20。

9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的增强液为在含有1ml/L TritonX-100、0.1mol/L邻苯二甲酸氢钾-冰醋酸溶液中加入1～5mg/Lβ-萘甲酰三氟丙酮、15～30mg/L的三正辛基氧化磷。

10.试剂盒的检测方法，其特征在于，包括由下步骤：步骤1）将试剂所需数量的微孔反应板条平衡至室温；

步骤2）将上述浓缩洗液和去离子水按1：20混合成工作洗涤液；

步骤3）将标准品、质控品用纯化水按标示体积复溶；

步骤4）向每孔中分别加入100～200μl复溶试剂；

步骤5）然后依次加入25～100μl标准品、质控品或待测标本；反应体系在37℃下，振荡孵育10～30分钟；

步骤6）采用上述的工作洗涤液洗板4-6次，拍干；

步骤7）向每孔中加入50～200μl增强液,缓慢振荡5min，于荧光读数仪内进行荧光计数；

步骤8）按测定参数进行拟合分析，得到定量结果。