JP2002207043A - 免疫測定方法および免疫測定デバイス - Google Patents
免疫測定方法および免疫測定デバイスInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 高感度で視認性の高い免疫測定方法およびそ
れを利用した免疫測定デバイスを提供する。 【解決手段】 モノクローナル抗体、および複数の抗体
を用いるサンドイッチ測定法であって、該複数の抗体の
各々が、該モノクローナル抗体が認識する分析物の部位
とは異なる分析物の部位を認識して結合し、それによっ
て、分析物、モノクローナル抗体、および該複数の抗体
からなる複合体を形成する工程；および該複合体を検出
する工程、を包含する。
れを利用した免疫測定デバイスを提供する。 【解決手段】 モノクローナル抗体、および複数の抗体
を用いるサンドイッチ測定法であって、該複数の抗体の
各々が、該モノクローナル抗体が認識する分析物の部位
とは異なる分析物の部位を認識して結合し、それによっ
て、分析物、モノクローナル抗体、および該複数の抗体
からなる複合体を形成する工程；および該複合体を検出
する工程、を包含する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、免疫測定方法およ
び免疫測定デバイスに関し、測定対象物を、簡便、迅速
および高精度に分析する方法およびデバイスを提供す
る。
び免疫測定デバイスに関し、測定対象物を、簡便、迅速
および高精度に分析する方法およびデバイスを提供す
る。
【０００２】
【従来の技術】サンドイッチ型免疫測定法および免疫測
定デバイスでは、固相に固定化され、測定対象物を固相
に捕捉する固定化抗体、および測定対象物を標識する標
識抗体が用いられる。固定化抗体および標識抗体は、そ
れぞれ、測定対象物の異なる部位（エピトープ）を認識
する。従来のサンドイッチ型免疫測定法および免疫測定
デバイスでは、通常、固定化抗体として、測定対象物の
エピトープの１つを認識するモノクローナル抗体または
測定対象物の全エピトープを認識するポリクローナル抗
体を用い、そして標識抗体として、固定化抗体が認識す
るエピトープとは異なるエピトープを認識するモノクロ
ーナル抗体を使用することにより測定対象物を定量的あ
るいは定性的に測定していた。
定デバイスでは、固相に固定化され、測定対象物を固相
に捕捉する固定化抗体、および測定対象物を標識する標
識抗体が用いられる。固定化抗体および標識抗体は、そ
れぞれ、測定対象物の異なる部位（エピトープ）を認識
する。従来のサンドイッチ型免疫測定法および免疫測定
デバイスでは、通常、固定化抗体として、測定対象物の
エピトープの１つを認識するモノクローナル抗体または
測定対象物の全エピトープを認識するポリクローナル抗
体を用い、そして標識抗体として、固定化抗体が認識す
るエピトープとは異なるエピトープを認識するモノクロ
ーナル抗体を使用することにより測定対象物を定量的あ
るいは定性的に測定していた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来のサンドイッチ型
免疫測定法および免疫測定デバイスでは、測定対象物に
対して標識抗体は１つしか結合せず（つまり、測定対象
物中のエピトープ：標識＝１：１の比率)、標識抗体が
測定対象物のエピトープを完全に認識して結合したとし
ても測定対象物に１つの標識しか結合することが出来ず
検出感度が低いという問題がある。また、標識抗体とし
てポリクローナル抗体を使用した場合には、この標識抗
体によって測定対象物上の抗原が覆われ、場合によって
は測定対象物の凝集を引き起こし、測定対象物の固相へ
の結合が妨げられ測定感度が低下する欠点があった。
免疫測定法および免疫測定デバイスでは、測定対象物に
対して標識抗体は１つしか結合せず（つまり、測定対象
物中のエピトープ：標識＝１：１の比率)、標識抗体が
測定対象物のエピトープを完全に認識して結合したとし
ても測定対象物に１つの標識しか結合することが出来ず
検出感度が低いという問題がある。また、標識抗体とし
てポリクローナル抗体を使用した場合には、この標識抗
体によって測定対象物上の抗原が覆われ、場合によって
は測定対象物の凝集を引き起こし、測定対象物の固相へ
の結合が妨げられ測定感度が低下する欠点があった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、モノクローナ
ル抗体、および複数の抗体を用いるサンドイッチ型免疫
測定法に関し、この方法は、上記複数の抗体の各々が、
上記モノクローナル抗体が認識する分析物の部位とは異
なる分析物の部位を認識して結合し、それによって、分
析物、モノクローナル抗体、および該複数の抗体からな
る複合体を形成する工程；およびこの複合体を検出する
工程を包含する。
ル抗体、および複数の抗体を用いるサンドイッチ型免疫
測定法に関し、この方法は、上記複数の抗体の各々が、
上記モノクローナル抗体が認識する分析物の部位とは異
なる分析物の部位を認識して結合し、それによって、分
析物、モノクローナル抗体、および該複数の抗体からな
る複合体を形成する工程；およびこの複合体を検出する
工程を包含する。
【０００５】好ましくは、上記複数の抗体は標識され得
る。
る。
【０００６】好ましくは、上記複数の抗体の各々は異な
る標識で標識され得る。
る標識で標識され得る。
【０００７】好ましくは、上記分析物は、血清、血漿、
血液または微生物含有溶液に含まれ得る。
血液または微生物含有溶液に含まれ得る。
【０００８】好ましくは、上記分析物は、血中タンパク
質または低分子物質であり得る。
質または低分子物質であり得る。
【０００９】好ましくは、上記複数の抗体は、モノクロ
ーナル抗体、ポリクローナル抗体、およびそれらのフラ
グメントまたは改変体からなる群から選択され得る。
ーナル抗体、ポリクローナル抗体、およびそれらのフラ
グメントまたは改変体からなる群から選択され得る。
【００１０】好ましくは、上記標識は、色素、蛍光色
素、発光色素、酵素、粒状標識物、リポソームからなる
群から選択され得る。
素、発光色素、酵素、粒状標識物、リポソームからなる
群から選択され得る。
【００１１】本発明は、１つの局面で、抗体固定化部位
および試薬保持部位を備えた多孔性材料からなる層を備
えた免疫測定デバイスに関し、この免疫測定デバイス
は、上記抗体固定化部位に、モノクローナル抗体が固定
化され、そして上記試薬保持部位に、上記モノクローナ
ル抗体が認識する分析物の部位とは異なる分析物の部位
を各々認識して結合する複数の抗体が担持されている。
および試薬保持部位を備えた多孔性材料からなる層を備
えた免疫測定デバイスに関し、この免疫測定デバイス
は、上記抗体固定化部位に、モノクローナル抗体が固定
化され、そして上記試薬保持部位に、上記モノクローナ
ル抗体が認識する分析物の部位とは異なる分析物の部位
を各々認識して結合する複数の抗体が担持されている。
【００１２】本発明は、１つの局面で、上記の方法に用
いる免疫測定デバイスに関し、この免疫測定デバイス
は、上記モノクローナル抗体が固定化される抗体固定化
部位、および上記複数の抗体が担持される試薬保持部位
を備える。
いる免疫測定デバイスに関し、この免疫測定デバイス
は、上記モノクローナル抗体が固定化される抗体固定化
部位、および上記複数の抗体が担持される試薬保持部位
を備える。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態につ
いて、図面を参照しながら説明する。なお、ここで示す
実施の形態はあくまでも本発明の例示であって、本発明
は、必ずしもこの実施の形態に限定されるものではな
い。
いて、図面を参照しながら説明する。なお、ここで示す
実施の形態はあくまでも本発明の例示であって、本発明
は、必ずしもこの実施の形態に限定されるものではな
い。
【００１４】図１は、本発明のクロマトグラフィーを利
用した免疫クロマトデバイスを示す図である。
用した免疫クロマトデバイスを示す図である。
【００１５】図１に示されるように、本実施の形態によ
る免疫クロマトデバイスは、試料添加部２、収縮剤保持
部位８、試薬保持部位３（図１に示される実施の形態で
は、収縮剤保持部位８と重複して配置されている)、反
応領域４、この反応領域４の中にある抗体固定化部５、
および吸水部６を備えた第１の層、ならびにこの層を支
持する支持層１を備える。
る免疫クロマトデバイスは、試料添加部２、収縮剤保持
部位８、試薬保持部位３（図１に示される実施の形態で
は、収縮剤保持部位８と重複して配置されている)、反
応領域４、この反応領域４の中にある抗体固定化部５、
および吸水部６を備えた第１の層、ならびにこの層を支
持する支持層１を備える。
【００１６】試料添加部２は、吸水性の大きい多孔質性
材料（不織布、ガラス繊維濾紙層など）からなり、被検
体試料が添加または塗布される領域である。収縮剤保持
部位８は血球を収縮してフィルターをつまらせない作用
を有する塩化カリウムなどを含浸する、多孔質性材料
（不織布、ガラス繊維濾紙層など）からなる領域であ
る。試薬保持部位３は、被検体試料中の測定対象物（分
析物）と反応し、分析物を標識する標識試薬を担持する
（すなわち、被検試料中に溶解可能に保持する）多孔質
性材料（不織布、ガラス繊維濾紙層など）からなる領域
である。反応領域４は、代表的には、ニトロセルロース
などの多孔質性材料からなる領域であって、その一部の
領域に分析物と特異的に反応する、抗体が固定化される
抗体固定化部５が形成される。吸水部６もまた、多孔質
性材料から構成され、被検体試料中の水分を吸収するこ
とによって被検体試料のデバイス内の移動を促進する。
支持層１は、上記第１の層を支持するために設けられプ
ラスチック材料などからなる。
材料（不織布、ガラス繊維濾紙層など）からなり、被検
体試料が添加または塗布される領域である。収縮剤保持
部位８は血球を収縮してフィルターをつまらせない作用
を有する塩化カリウムなどを含浸する、多孔質性材料
（不織布、ガラス繊維濾紙層など）からなる領域であ
る。試薬保持部位３は、被検体試料中の測定対象物（分
析物）と反応し、分析物を標識する標識試薬を担持する
（すなわち、被検試料中に溶解可能に保持する）多孔質
性材料（不織布、ガラス繊維濾紙層など）からなる領域
である。反応領域４は、代表的には、ニトロセルロース
などの多孔質性材料からなる領域であって、その一部の
領域に分析物と特異的に反応する、抗体が固定化される
抗体固定化部５が形成される。吸水部６もまた、多孔質
性材料から構成され、被検体試料中の水分を吸収するこ
とによって被検体試料のデバイス内の移動を促進する。
支持層１は、上記第１の層を支持するために設けられプ
ラスチック材料などからなる。
【００１７】この免疫クロマトデバイスにおいて、試料
添加部２に添加または塗布された被験体試料は、多孔質
性材料中を拡散などによって移動し、収縮剤保持部位８
に到達する。この部位に含浸された収縮剤は、被検試料
と接触してそれに含まれる血球などを収縮してフィルタ
ーをつまらせない作用を有する。処理された被験体試料
は試薬保持部位３に到達し、その中に分析物が存在する
場合、標識試薬と反応して分析物が標識される。代表的
には、この試薬保持部位３には、後述する抗体固定化部
５にある固定化抗体が認識する分析物上の部位とは異な
る分析物上の部位をそれぞれ認識することが可能な、少
なくとも２種以上の抗体が担持されている。
添加部２に添加または塗布された被験体試料は、多孔質
性材料中を拡散などによって移動し、収縮剤保持部位８
に到達する。この部位に含浸された収縮剤は、被検試料
と接触してそれに含まれる血球などを収縮してフィルタ
ーをつまらせない作用を有する。処理された被験体試料
は試薬保持部位３に到達し、その中に分析物が存在する
場合、標識試薬と反応して分析物が標識される。代表的
には、この試薬保持部位３には、後述する抗体固定化部
５にある固定化抗体が認識する分析物上の部位とは異な
る分析物上の部位をそれぞれ認識することが可能な、少
なくとも２種以上の抗体が担持されている。
【００１８】分析物は、分析物と、２種以上の標識試薬
との複合体を形成することによって標識され得る。代表
的には、標識試薬として２種以上の標識抗体を用いるこ
とができ、測定目的に応じて分析物と特異的に反応する
２種以上の抗体を、それぞれ、当該分野で公知の標識で
標識して用いる。このような標識として、金コロイドな
どの金属ゾル、非金属ゾル、染料ゾル、着色粒子、粒状
標識物、色素、蛍光色素、発光色素、酵素、タンパク
質、ソポソームなどを用いることができる。この２種以
上の抗体は、同一の標識で標識してもよいし、それぞれ
異なる標識で標識してもよい。また、標識抗体は、分析
物との反応前に標識してもよいし、あるいは分析物との
反応後にも標識してもよい。
との複合体を形成することによって標識され得る。代表
的には、標識試薬として２種以上の標識抗体を用いるこ
とができ、測定目的に応じて分析物と特異的に反応する
２種以上の抗体を、それぞれ、当該分野で公知の標識で
標識して用いる。このような標識として、金コロイドな
どの金属ゾル、非金属ゾル、染料ゾル、着色粒子、粒状
標識物、色素、蛍光色素、発光色素、酵素、タンパク
質、ソポソームなどを用いることができる。この２種以
上の抗体は、同一の標識で標識してもよいし、それぞれ
異なる標識で標識してもよい。また、標識抗体は、分析
物との反応前に標識してもよいし、あるいは分析物との
反応後にも標識してもよい。
【００１９】次いで、反応領域４を通って抗体固定化部
位に達した標識試薬で処理された分析物（分析物−標識
抗体複合体）は、そこに固定化された抗体と反応してこ
の抗体に捕捉されることによりこの部位に固定化され
る。分析物−標識抗体複合体を捕捉する抗体として、例
えば、分析物に結合する標識抗体とは異なる抗体（代表
的にはモノクローナル抗体）を用いることができる。こ
のように、被検体試料中に分析物が存在する場合にの
み、分析物を介して抗体固定化部５に標識が捕捉され、
抗体固定化部５における標識バンドの強度によって試料
中に含まれる分析物の量が測定される。
位に達した標識試薬で処理された分析物（分析物−標識
抗体複合体）は、そこに固定化された抗体と反応してこ
の抗体に捕捉されることによりこの部位に固定化され
る。分析物−標識抗体複合体を捕捉する抗体として、例
えば、分析物に結合する標識抗体とは異なる抗体（代表
的にはモノクローナル抗体）を用いることができる。こ
のように、被検体試料中に分析物が存在する場合にの
み、分析物を介して抗体固定化部５に標識が捕捉され、
抗体固定化部５における標識バンドの強度によって試料
中に含まれる分析物の量が測定される。
【００２０】この実施の形態による免疫クロマトデバイ
スは、複数の部位からなる上記第１の層および支持層１
からなる積層構造を有する例を説明したが、本発明は、
これに限られるものではなく、試料添加部２、収縮剤保
持部位８と、試薬保持部位３と、抗体固定化部５とを、
ニトロセルロース等の多孔質性材料からなる単層構造で
あってもよい。
スは、複数の部位からなる上記第１の層および支持層１
からなる積層構造を有する例を説明したが、本発明は、
これに限られるものではなく、試料添加部２、収縮剤保
持部位８と、試薬保持部位３と、抗体固定化部５とを、
ニトロセルロース等の多孔質性材料からなる単層構造で
あってもよい。
【００２１】なお、本発明に用いられる上記抗体とし
て、目的とする分析物に応じて選択されたインタクトな
抗体に代えて、この分析物に対する結合特性を保持する
限り、機能性の抗体フラグメントまたはこれらの改変体
もまた用いられ得る。これらのフラグメントまたは改変
体は、それらが由来するインタクトな抗体と分析物に対
する特異的結合について競合し得、少なくとも１０7、
１０8、１０9Ｍ-1、または１０10Ｍ-1の親和性で目的の
分析物と結合し得る。この抗体のフラグメントは、免疫
グロブリンの重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（ａ
ｂ’）2、ＦａｂｃおよびＦｖを含み得る。この抗体の
フラグメントまたはこれらの改変体は、目的の分析物に
応じて選択されたインタクトな抗体（通常、免疫グロブ
リン）の酵素的または化学的分離によって得られ得る。
例えば、Ｆ（ａｂ’）2断片は、ＨａｒｌｏｗおよびＬ
ａｎｅ、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯ
ＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、ＣＯＬＤ ＳＰＲＩＮＧ ＨＡＲ
ＢＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１
９８８）に記載されたような標準的な方法を用い、ｐＨ
３．０〜３．５においてペプシンでタンパク質消化する
ことによってＩｇＧ分子から得ることができる。Ｆａｂ
断片は、限定的還元によってＦ（ａｂ’）2断片から、
あるいは還元剤の存在下パパイン消化によって全抗体か
ら得ることができる（Ｐａｕｌ、Ｗ．編、ＦＵＮＤＡＭ
ＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ第２版Ｒａｖａｎ
Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１９８９、第７章を参照のこ
と）。
て、目的とする分析物に応じて選択されたインタクトな
抗体に代えて、この分析物に対する結合特性を保持する
限り、機能性の抗体フラグメントまたはこれらの改変体
もまた用いられ得る。これらのフラグメントまたは改変
体は、それらが由来するインタクトな抗体と分析物に対
する特異的結合について競合し得、少なくとも１０7、
１０8、１０9Ｍ-1、または１０10Ｍ-1の親和性で目的の
分析物と結合し得る。この抗体のフラグメントは、免疫
グロブリンの重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（ａ
ｂ’）2、ＦａｂｃおよびＦｖを含み得る。この抗体の
フラグメントまたはこれらの改変体は、目的の分析物に
応じて選択されたインタクトな抗体（通常、免疫グロブ
リン）の酵素的または化学的分離によって得られ得る。
例えば、Ｆ（ａｂ’）2断片は、ＨａｒｌｏｗおよびＬ
ａｎｅ、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯ
ＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、ＣＯＬＤ ＳＰＲＩＮＧ ＨＡＲ
ＢＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１
９８８）に記載されたような標準的な方法を用い、ｐＨ
３．０〜３．５においてペプシンでタンパク質消化する
ことによってＩｇＧ分子から得ることができる。Ｆａｂ
断片は、限定的還元によってＦ（ａｂ’）2断片から、
あるいは還元剤の存在下パパイン消化によって全抗体か
ら得ることができる（Ｐａｕｌ、Ｗ．編、ＦＵＮＤＡＭ
ＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ第２版Ｒａｖａｎ
Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１９８９、第７章を参照のこ
と）。
【００２２】本発明の方法およびデバイスは、特に、蛋
白質、糖、核酸、脂質、微生物、ウイルスまたはそれら
の分解物および修飾物の測定に適している。用いられる
抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、お
よび上記そられのフラグメントまたは改変体を、分析
物、分析物が含まれる試料の状態などに応じて選択す
る。
白質、糖、核酸、脂質、微生物、ウイルスまたはそれら
の分解物および修飾物の測定に適している。用いられる
抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、お
よび上記そられのフラグメントまたは改変体を、分析
物、分析物が含まれる試料の状態などに応じて選択す
る。
【００２３】
【実施例】以下の実施例により、本発明をさらに詳細に
説明する。なお、以下の実施例は、本発明の例示であっ
て、本発明を制限するものではない。
説明する。なお、以下の実施例は、本発明の例示であっ
て、本発明を制限するものではない。
【００２４】（実施例１：金コロイドによる全血中ｈＣ
Ｇの分析）図１に示されるような形状の免疫クロマトデ
バイスを以下のように製造した。この免疫クロマトデバ
イスは、ニトロセルロース膜中に、試薬保持部位とし
て、抗ｈＣＧ−αモノクローナル抗体１と金コロイドと
の複合体、および抗ｈＣＧ−αモノクローナル抗体２と
金コロイドとの複合体を担持した広いバンド、および抗
体固定化部位として、抗ｈＣＧ−βモノクローナル抗体
を固定化したラインを含む。
Ｇの分析）図１に示されるような形状の免疫クロマトデ
バイスを以下のように製造した。この免疫クロマトデバ
イスは、ニトロセルロース膜中に、試薬保持部位とし
て、抗ｈＣＧ−αモノクローナル抗体１と金コロイドと
の複合体、および抗ｈＣＧ−αモノクローナル抗体２と
金コロイドとの複合体を担持した広いバンド、および抗
体固定化部位として、抗ｈＣＧ−βモノクローナル抗体
を固定化したラインを含む。
【００２５】ａ）免疫クロマトデバイスの調製 リン酸緩衝溶液にて希釈して濃度調整をした抗ｈＣＧ−
βモノクローナル抗体溶液を準備した。抗ｈＣＧ−βモ
ノクローナル抗体は市販のもの（ロート社製）を使用し
た。この抗体溶液を、溶液吐出装置を用いてニトロセル
ロース膜（幅５ｍｍ×長さ５０ｍｍ×厚さ０．１ｍｍ）
上のほぼ中央に約１ｍｍの幅で塗布した。これにより、
抗体固定化部位としてニトロセルロース膜上に検出用の
抗体固定化ラインを得た。このニトロセルロース膜を乾
燥後、１％スキムミルクを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝溶液中に浸漬して３０分間緩やかに振った。３０分
後、この膜を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液槽に移動し、
１０分間緩やかに振った後に、別のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝溶液槽に移してさらに１０分間緩やかに振り、膜の洗
浄を行なった。このような洗浄操作を２度行なった後
に、膜を溶液槽から取り出して、室温で乾燥させた。
βモノクローナル抗体溶液を準備した。抗ｈＣＧ−βモ
ノクローナル抗体は市販のもの（ロート社製）を使用し
た。この抗体溶液を、溶液吐出装置を用いてニトロセル
ロース膜（幅５ｍｍ×長さ５０ｍｍ×厚さ０．１ｍｍ）
上のほぼ中央に約１ｍｍの幅で塗布した。これにより、
抗体固定化部位としてニトロセルロース膜上に検出用の
抗体固定化ラインを得た。このニトロセルロース膜を乾
燥後、１％スキムミルクを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝溶液中に浸漬して３０分間緩やかに振った。３０分
後、この膜を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液槽に移動し、
１０分間緩やかに振った後に、別のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝溶液槽に移してさらに１０分間緩やかに振り、膜の洗
浄を行なった。このような洗浄操作を２度行なった後
に、膜を溶液槽から取り出して、室温で乾燥させた。
【００２６】金コロイド溶液を調製するために、まず、
０．０１％塩化金酸の還流中の１００℃溶液に１％クエ
ン酸溶液を加えた。還流を３０分間続けた後、室温に放
置して冷却した。得られた溶液に０．２Ｍの炭酸カリウ
ム溶液を添加することによってｐＨ９に調製した金コロ
イド溶液を得た。この金コロイド溶液に抗ｈＣＧ−αモ
ノクローナル抗体１と抗ｈＣＧ−αモノクローナル抗体
２（それぞれ、ロート社製）とを等量加えて数分間攪拌
した後に、ｐＨ９の１０％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
溶液を最終１％になる量だけ加えて攪拌することで、抗
体−金コロイド複合体（標識抗体）を調製した。この標
識抗体溶液を４℃、２００００Ｇで５０分間遠心分離す
ることによって、標識抗体をペレット化することにより
単離した。ペレット化した標識抗体を洗浄緩衝液（１％
ＢＳＡ・リン酸緩衝液）中に懸濁し、再度遠心分離を行
なうことにより標識抗体を洗浄単離した。この標識抗体
を洗浄緩衝液に懸濁して、０．８μｍのフィルタにて濾
過した後に、当初の金コロイド溶液量の１０分の１に調
製して、使用するまで４℃で貯蔵した。
０．０１％塩化金酸の還流中の１００℃溶液に１％クエ
ン酸溶液を加えた。還流を３０分間続けた後、室温に放
置して冷却した。得られた溶液に０．２Ｍの炭酸カリウ
ム溶液を添加することによってｐＨ９に調製した金コロ
イド溶液を得た。この金コロイド溶液に抗ｈＣＧ−αモ
ノクローナル抗体１と抗ｈＣＧ−αモノクローナル抗体
２（それぞれ、ロート社製）とを等量加えて数分間攪拌
した後に、ｐＨ９の１０％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
溶液を最終１％になる量だけ加えて攪拌することで、抗
体−金コロイド複合体（標識抗体）を調製した。この標
識抗体溶液を４℃、２００００Ｇで５０分間遠心分離す
ることによって、標識抗体をペレット化することにより
単離した。ペレット化した標識抗体を洗浄緩衝液（１％
ＢＳＡ・リン酸緩衝液）中に懸濁し、再度遠心分離を行
なうことにより標識抗体を洗浄単離した。この標識抗体
を洗浄緩衝液に懸濁して、０．８μｍのフィルタにて濾
過した後に、当初の金コロイド溶液量の１０分の１に調
製して、使用するまで４℃で貯蔵した。
【００２７】使用にあたっては、この標識抗体溶液を溶
液吐出装置にセットして、上記の抗ｈＣＧ−βモノクロ
ーナル抗体を固定化し乾燥したニトロセルロース膜の上
記抗体固定化部から離れた所定の位置に標識抗体溶液を
約５ｍｍの幅で塗布して膜を乾燥させた。これによって
ニトロセルロース膜上に試薬保持部位を得た。
液吐出装置にセットして、上記の抗ｈＣＧ−βモノクロ
ーナル抗体を固定化し乾燥したニトロセルロース膜の上
記抗体固定化部から離れた所定の位置に標識抗体溶液を
約５ｍｍの幅で塗布して膜を乾燥させた。これによって
ニトロセルロース膜上に試薬保持部位を得た。
【００２８】次いで、０．１５Ｍに調製された塩化カリ
ウム水溶液を、不織布（幅５ｍｍ×長さ２０ｍｍ×厚さ
０．５ｍｍ）に対して単位面積あたり０．１ｍｌ点着し
た後に、液体窒素にて直ちに凍結し、凍結乾燥を行なっ
た。これによって、塩化カリウムが含浸された収縮剤保
持部位を含む部材を得た。なお、塩化カリウム水溶液
は、不織布全体に点着してもよく、あるいは試料添加部
２として用いる領域を残して点着してもよい。
ウム水溶液を、不織布（幅５ｍｍ×長さ２０ｍｍ×厚さ
０．５ｍｍ）に対して単位面積あたり０．１ｍｌ点着し
た後に、液体窒素にて直ちに凍結し、凍結乾燥を行なっ
た。これによって、塩化カリウムが含浸された収縮剤保
持部位を含む部材を得た。なお、塩化カリウム水溶液
は、不織布全体に点着してもよく、あるいは試料添加部
２として用いる領域を残して点着してもよい。
【００２９】上記のように調製された試薬保持部位およ
び抗体固定化ラインを含むニトロセルロース膜を、プラ
スチック製の支持層上に貼付け、次いで収縮剤保持部位
および試料添加部として不織布を、上記のニトロセルロ
ース膜に隣接して貼り付け、さらにガラス繊維濾紙を吸
水部として、試薬保持部位の隣接して不織布と対向する
側に貼り付け、得られた積層体を、０．５ｃｍ幅の細片
に切断して、免疫クロマトデバイスを作製した。
び抗体固定化ラインを含むニトロセルロース膜を、プラ
スチック製の支持層上に貼付け、次いで収縮剤保持部位
および試料添加部として不織布を、上記のニトロセルロ
ース膜に隣接して貼り付け、さらにガラス繊維濾紙を吸
水部として、試薬保持部位の隣接して不織布と対向する
側に貼り付け、得られた積層体を、０．５ｃｍ幅の細片
に切断して、免疫クロマトデバイスを作製した。
【００３０】ｂ）試料の調製 抗凝固剤としてヘパリンを加えた人の血液を、ヘマトク
リット値４５％になるように調製した。この血液に既知
濃度のｈＣＧ溶液を加えることにより、種々の濃度（０
〜１０００ＩＵ／ｌ）のｈＣＧ溶液を調製した。
リット値４５％になるように調製した。この血液に既知
濃度のｈＣＧ溶液を加えることにより、種々の濃度（０
〜１０００ＩＵ／ｌ）のｈＣＧ溶液を調製した。
【００３１】ｃ）免疫クロマトデバイス上の呈色度合の
測定 免疫クロマトデバイス上の試料添加部にｈＣＧを含む上
記の人の全血を約１５０μｌ添加して、吸水部方向に展
開処理し、抗原抗体反応を行わせ抗体固定化部における
呈色反応を観察した。展開は試料添加後約５分で終了し
た。この免疫クロマトデバイスへの試料添加から５分後
の抗体固定化ラインにおける呈色状況を目視にて確認す
るとともに、展開後の免疫クロマトデバイスを反射吸光
度計（島津社製）に置き、反射吸光度を測定（波長：５
２０ｎｍ）した。図２は、全血における反射吸光度によ
るｈＣＧ測定結果を示す。
測定 免疫クロマトデバイス上の試料添加部にｈＣＧを含む上
記の人の全血を約１５０μｌ添加して、吸水部方向に展
開処理し、抗原抗体反応を行わせ抗体固定化部における
呈色反応を観察した。展開は試料添加後約５分で終了し
た。この免疫クロマトデバイスへの試料添加から５分後
の抗体固定化ラインにおける呈色状況を目視にて確認す
るとともに、展開後の免疫クロマトデバイスを反射吸光
度計（島津社製）に置き、反射吸光度を測定（波長：５
２０ｎｍ）した。図２は、全血における反射吸光度によ
るｈＣＧ測定結果を示す。
【００３２】展開５分後、免疫クロマトデバイスの抗体
固定化ラインには、ｈＣＧの濃度に応じて、標識である
金の赤いラインが観察され、反射吸光度によるｈＣＧ測
定結果に対応する結果を得た。
固定化ラインには、ｈＣＧの濃度に応じて、標識である
金の赤いラインが観察され、反射吸光度によるｈＣＧ測
定結果に対応する結果を得た。
【００３３】（実施例２：青色ラテックスおよび金コロ
イドによる全血中ｈＣＧの分析）試薬保持部位として、
抗ｈＣＧ−αモノクローナル抗体１と青色ラテックスと
の複合体、および抗ｈＣＧ−αモノクローナル抗体２と
金コロイドとの複合体を担持した広いバンドを調製した
ことを除いて、実施例１と同様に、免疫免疫クロマトデ
バイスを製造した。
イドによる全血中ｈＣＧの分析）試薬保持部位として、
抗ｈＣＧ−αモノクローナル抗体１と青色ラテックスと
の複合体、および抗ｈＣＧ−αモノクローナル抗体２と
金コロイドとの複合体を担持した広いバンドを調製した
ことを除いて、実施例１と同様に、免疫免疫クロマトデ
バイスを製造した。
【００３４】なお、青色ラテックスによる抗ｈＣＧ−α
モノクローナル抗体１の標識は、前述の金コロイドによ
って標識する方法に準じて公知の方法に従って行った。
モノクローナル抗体１の標識は、前述の金コロイドによ
って標識する方法に準じて公知の方法に従って行った。
【００３５】また、バイオセンサ上の呈色度合の測定
は、反射吸光度を波長：５２０ｎｍ＋６００ｎｍで測定
したことを除いて、実施例１と同様に行った。結果を図
３に示す。
は、反射吸光度を波長：５２０ｎｍ＋６００ｎｍで測定
したことを除いて、実施例１と同様に行った。結果を図
３に示す。
【００３６】展開５分後、免疫クロマトデバイスの抗体
固定化ラインには、ｈＣＧの濃度に応じて、標識である
金および青色ラテックスの赤いラインおよび青いライン
が観察され、反射吸光度によるｈＣＧ測定結果に対応す
る結果を得た。
固定化ラインには、ｈＣＧの濃度に応じて、標識である
金および青色ラテックスの赤いラインおよび青いライン
が観察され、反射吸光度によるｈＣＧ測定結果に対応す
る結果を得た。
【００３７】
【発明の効果】以上のように本発明は、高感度で視認性
の高い免疫測定方法及びそれを利用した免疫測定デバイ
スを提供できる。また、本発明の方法を利用することに
より高性能な環境測定キット、食品管理測定キット及び
医療診断キットを提供することができる。
の高い免疫測定方法及びそれを利用した免疫測定デバイ
スを提供できる。また、本発明の方法を利用することに
より高性能な環境測定キット、食品管理測定キット及び
医療診断キットを提供することができる。
【図１】本発明の免疫クロマトデバイスの概略を示す斜
視図。
視図。
【図２】本発明の方法によるｈＣＧの測定結果を示すグ
ラフを示す図。
ラフを示す図。
【図３】本発明の方法によるｈＣＧの測定結果を示すグ
ラフを示す図。
ラフを示す図。
１ 支持層 ２ 試料添加部 ３ 試薬保持部位 ４ 反応領域 ５ 抗体固定化部 ６ 吸水部 ８ 収縮剤保持部位
Claims (9)
- 【請求項１】 モノクローナル抗体、および複数の抗体
を用いるサンドイッチ型免疫測定法であって、 該複数の抗体の各々が、該モノクローナル抗体が認識す
る分析物の部位とは異なる分析物の部位を認識して結合
し、それによって、分析物、モノクローナル抗体、およ
び該複数の抗体からなる複合体を形成する工程；および
該複合体を検出する工程、を包含する、方法。 - 【請求項２】 前記複数の抗体が標識されている、請求
項１に記載のサンドイッチ型免疫測定法。 - 【請求項３】 前記複数の抗体の各々が異なる標識で標
識されている、請求項２に記載のサンドイッチ型免疫測
定法。 - 【請求項４】 前記分析物が、血清、血漿、血液または
微生物含有溶液に含まれる、請求項１〜３のいずれかに
記載の、サンドイッチ型免疫測定法。 - 【請求項５】 前記分析物が、血中タンパク質または低
分子物質である、請求項１〜３のいずれかに記載の、サ
ンドイッチ型免疫測定法。 - 【請求項６】 前記複数の抗体が、モノクローナル抗
体、ポリクローナル抗体、およびそれらのフラグメント
または改変体からなる群から選択される、請求項１〜３
のいずれかに記載の、サンドイッチ型免疫測定法。 - 【請求項７】 前記標識が、色素、蛍光色素、発光色
素、酵素、粒状標識物、リポソームからなる群から選択
される、請求項２〜６のいずれかに記載の、サンドイッ
チ型免疫測定法。 - 【請求項８】 抗体固定化部位および試薬保持部位を備
えた多孔性材料からなる層を備えた免疫測定デバイスで
あって、 該抗体固定化部位に、モノクローナル抗体が固定化さ
れ、そして該試薬保持部位に、該モノクローナル抗体が
認識する分析物の部位とは異なる分析物の部位を各々認
識して結合する複数の抗体が担持された、免疫測定デバ
イス。 - 【請求項９】 請求項１に記載の方法に用いる免疫測定
デバイスであって、 前記モノクローナル抗体が固定化される抗体固定化部
位、および前記複数の抗体が担持される試薬保持部位を
備えた、デバイス。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001001981A JP2002207043A (ja) | 2001-01-09 | 2001-01-09 | 免疫測定方法および免疫測定デバイス |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001001981A JP2002207043A (ja) | 2001-01-09 | 2001-01-09 | 免疫測定方法および免疫測定デバイス |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002207043A true JP2002207043A (ja) | 2002-07-26 |
Family
ID=18870552
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001001981A Withdrawn JP2002207043A (ja) | 2001-01-09 | 2001-01-09 | 免疫測定方法および免疫測定デバイス |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002207043A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004189665A (ja) * | 2002-12-11 | 2004-07-08 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 抗ｃ反応性タンパク質抗体、この抗体を用いたバイオセンサ、この抗体の作製方法、及びこの抗体を用いた免疫測定方法 |
-
2001
- 2001-01-09 JP JP2001001981A patent/JP2002207043A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004189665A (ja) * | 2002-12-11 | 2004-07-08 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 抗ｃ反応性タンパク質抗体、この抗体を用いたバイオセンサ、この抗体の作製方法、及びこの抗体を用いた免疫測定方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20080401 |