CN110272822B - 一种基因扩增实时荧光定量检测装置及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因扩增实时荧光定量检测系统，涉及基因检测领域，包括：微流控检测管和加热模块，微流控检测管由透光材料制成且包括一凸出部；反应液进入微流控检测管后，填充到所述凸出部；加热模块设置有插入部；插入部包括用于通过激发光的激发光光路和用于通过发射光的发射光光路，激发光光路与发射光光路呈夹角；凸出部与插入部配合且表面相互接触；凸出部包括可位于光路中的凸出片；加热模块中还设置有用于加热的加热部件。本发明还公开了一种实时荧光定量检测方法，可以应用于PCR和恒温基因扩增检测中。本发明无需复杂的光路系统，即可实现荧光定量检测，还能精确控制温度，便于携带，扩展了应用场景。

Description

一种基因扩增实时荧光定量检测装置及检测方法

技术领域

本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种基因扩增实时荧光定量检测装置及检测方法。

背景技术

基因检测可以对样品中的目标基因的特异序列进行扩增和检测，被应用于生物学研究、分子医学检测、犯罪现场分析以及农畜牧业检测等诸多方面。相较于传统的检测方法，基因扩增检测通常具有更高的灵敏度和特异性。最具有代表性的基因扩增检测方法是由美国科学家Kary Banks Mullis在1985年发明了聚合酶链反应(Polymerase ChainReaction,PCR)，即简易DNA扩增法。PCR通常包括三步反应：1)利用双链DNA在95摄氏度高温时变性成为单链；2)低温时(50-65摄氏度)，引物(primer)会与单链DNA按碱基互补配对原则结合；3)温度升高至聚合酶反应温度(通常为72摄氏度)，聚合酶沿5’至3’的方向合成与单链DNA的互部链。一个循环完成后，目标基因序列的数量理论上会增加为2倍，但实际增加的数量取决于反应的扩增效率，当扩增效率为100％时，每个循环基因的拷贝数增加为反应前的2倍。一个循环完成后，可以从第一步开始下一个热循环，完成对目标基因的指数型扩增。PCR扩增的特异性通常依赖于引物的设计和引物-单链DNA结合温度的设计。有些改进的PCR方法可以将第二步和第三步结合，从而省略了扩增温度控制步骤。因此，PCR方法要求在至少两个温度区间循环变化，并且对温度控制要求较为严格。这就要求PCR仪器的设备提供精确的温度控制。

实时荧光定量PCR通过在PCR反应体系中加入特定的荧光染料，在PCR扩增反应的过程中对荧光强度进行检测从而对样品中目标核酸的浓度进行定量的方法。通过对反应体系中荧光信号强度的增加，与一系列具有已知浓度的核酸样品对比，实时荧光定量PCR可以对样品中的目标基因进行定量。

荧光检测对光学系统有较严格的要求。通常需要激发光的波长与发射光的波长不相互干扰，这就需要添加不同的光学滤光片。在一些应用中，需要对同一反应中的荧光信号进行多通道的检测，即检测不同的激发光。在这些多通道的荧光检测中，也经常会使用不同的激发光。激发光滤光模块通常与发射光模块成对匹配。例如FAM通道，其激发光的波段为450-490nm，发射光的波段为510-530nm；再如Cy5通道，其激发光的波段为620-650nm，发射光的波段为675-690nm。此类多通道检测通常可以用来检测一个样品中的不同目标基因，或者用来检测样品和对照组(例如用作荧光矫正)。

恒温基因扩增是近年来发展的一种新型的基因扩增技术。其特点是基因扩增反应可以在一个恒定的温度完成，不再需要PCR反复的热循环步骤。恒温基因扩增也可与实时荧光系统相结合，进行基因的定量检测。

现有的用于实时荧光基因检测的系统存在以下缺陷：

1、需要精密的温度控制系统，尤其是对于PCR扩增反应，温度的准确性会很大程度的影响扩增的效率和特异性。

2、需要精密的荧光检测系统，尤其是多通道检测，通常需要精密机械装置调整光学模块。现有的实验室和临床使用的实时荧光定量PCR仪通常使用锥形管，联排管，孔板(例如96孔板或384孔板)。现有的检测通常经过锥形管、联排管、孔板的顶端进行检测，即激发光从顶端照射人锥形管、联排管、孔板中，产生的发射光也通过锥形管、联排管、孔板的顶端通过设定的光路和滤光原件到达接受检测光学元件(例如光电转换原件或相机等)。

3、设备体积较大，适合于研究实验室或者大型医院检验科，不适用于急诊科，手术室，救护车，海关，二级医院，三级诊所，病人的床旁诊断等。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种基因扩增实时荧光定量检测装置及检测方法，通过设计一种新型的光路，不再需要锥形管、联排管、孔板等配件，激发光和模块充分接触，提高热传导效率；检测装置得以简化，更为小型化便携化，扩展了应用场景。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何设计一种新型光路及加热传导过程，使得装置更为小型化、便携化，且具备较高的检测精度。

为实现上述目的，本发明提供了一种基因扩增实时荧光定量检测系统，包括：

微流控检测管，所述微流控检测管由透光材料制成，所述微流控检测管包括一凸出部；反应液进入所述微流控检测管后，填充到所述凸出部；

加热模块，所述加热模块设置有插入部；所述插入部包括用于通过激发光的激发光光路和用于通过发射光的发射光光路，所述激发光光路与所述发射光光路呈夹角；

所述凸出部插入所述插入部内，并且表面相互接触；所述凸出部包括若干凸出片，所述凸出片在配合时分别位于所述激发光光路和所述发射光光路中；

所述加热模块中还设置有测温部件。

进一步地，所述插入部的结构为：多个光路从所述插入部的中心点向外延伸呈放射状，且所述光路分布在所述中心点的周向；多个所述光路中，至少设置一个所述光路作为所述激发光光路；至少设置一个所述光路作为所述发射光光路；所述激发光光路与所述发射光光路之间呈夹角。

进一步地，所述激发光光路设置为多个，所述发射光光路设置为多个，多个所述激发光光路与多个所述发射光光路分别组合成不同角度的排列。

进一步地，所述凸出片的数量与所述光路的数量相等。

进一步地，所述夹角的角度为30-90度。

进一步地，所述光路是缺口结构或孔状结构。

进一步地，所述加热模块由导热材料制成。

进一步地，所述测温部件为热电偶，用于测量所述加热模块的温度；所述加热模块采用电加热方式。

本发明还提供了一种基因扩增实时荧光定量检测方法，包括：

将反应液倒入微流控检测管；

控制加热模块在不同温度之间进行循环或保持在恒定温度；

周期性检测所述反应液的荧光信号；

分析基因扩增反应的过程。

进一步地，当所述加热模块在不同温度之间进行循环时，在每个所述循环中对所述荧光信号进行检测；当所述加热模块保持在恒定温度时，以固定的时间间隔为周期，对所述荧光信号进行检测。

本发明产生的技术效果如下：

1、通过微流控检测管及加热模块的新型结构设计，实现了一种新型的光路，可以方便的实现多重荧光检测，且不需要机械移动部件进行滤光片或光源的控制或切换，使得检测装置更为小型化便携化；并且激发光和发射光之间呈一定的夹角，可以尽量减少其相互干扰，提高了检测精度；

2、由于新型光路的设计，使得微流控检测管和加热模块接触面积可以尽可能的加大了，有利于提高热传导效率，实现温度的快速改变和准确控制；

3、本发明提供的检测装置不仅可以与PCR相结合，实现PCR反应的定量分析；还能与恒温基因扩增检测方法相结合，实现恒温基因扩增过程中的定量分析。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的实施例1的检测系统结构示意图；

图2是本发明的实施例1的检测系统组合示意图；

图3是本发明的实施例1的微流控检测管的角度仰视图；

图4是本发明的实施例1的微流控检测管的侧视图；

图5是本发明的实施例1的加热模块的结构示意图；

图6是本发明的实施例1的单一激发光和单一发射光的立体示意图；

图7是本发明的实施例1的单一激发光和单一发射光的光路示意图；

图8是本发明的实施例1的多个激发光和多个发射光的光路示意图；

图9是本发明的实施例2的第一种光路示意图；

图10是本发明的实施例2的第二种光路示意图；

图11是本发明的实施例3的第一种光路示意图；

图12是本发明的实施例3的第二种光路示意图。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

在附图中，结构相同的部件以相同数字标号表示，各处结构或功能相似的组件以相似数字标号表示。附图所示的每一组件的尺寸和厚度是任意示出的，本发明并没有限定每个组件的尺寸和厚度。为了使图示更清晰，附图中有些地方适当夸大了部件的厚度。

实施例1

如图1和图2所示，本实施例提供的基因扩增实时荧光定量检测系统，包括微流控检测管1和加热模块2，微流控检测管1向下凸出的部分即凸出部11可以插入到加热模块2的插入部21中。

如图3和图4所示，微流控检测管1的凸出部11呈“十”字形，往微流控检测管1中倒入用于基因扩增检测的反应液，在重力的作用下，反应液充分填充到微流控检测管1的下半部分即凸出部11中，凸出部11构成了反应检测单元。

如图5所示，加热模块2的插入部21呈“十”字形缺口，加热模块2的下部设置有插孔22，插孔22用于放置测温部件。本实施例中，测温部件优选为测温热电偶(图中未示出)。加热模块2采用导热材料加工而成，例如金属、陶瓷、塑料、聚合物、无机材料等，其加工方式包括但不限于激光雕刻、3D打印、热压成型、注塑成型、机械加工等。如图2所示，凸出部11可插入加热模块2的插入部21，并且两者相互接触，使凸出部11与加热模块2的接触面积大大增加，相互之间充分接触。因此，加热模块2在加热时，加热模块2与微流控检测管1之间的热传导效率得到提高，有利于反应温度的快速改变和准确控制。加热模块2的加热方式优选为电加热。

微流控检测管1由单一或者复合的透光材料加工而成，透光材料包括但不限于石英、玻璃、塑料及其他复合物材料，如PDMS(聚二甲基硅氧烷)、有机材料、无机材料等，其加工方式包括但不限于激光雕刻、3D打印、热压成型、注塑成型、机械加工等。

插入部21的“十”字形缺口，不仅能用于与凸出部11配合，还作为光路，用于通过激发光和发射光。“十”字形缺口构成四条光路，分别从插入部21的中心向外延伸，并环绕插入部21的中心周向均匀分布，每相邻两条光路之间呈90度夹角。凸出部11的“十”字形构成四个向外的凸出片，凸出片与光路配合，使得凸出部11可以插入到插入部21中，凸出片位于光路中。

在这四条光路中，可以将其中两条光路分别设置为用于通过激发光的激发光光路和用于通过发射光的发射光光路，如图6和图7所示，实线代表激发光，虚线代表发射光，为了避免激发光和发射光相互干扰，激发光和发射光之间呈一定夹角，在本实施例中夹角为90度。

为了实现多通道荧光检测，如图8所示，分别设置两条光路为第一激发光光路和第二激发光光路，分别设置两条光路为第一发射光光路和第二发射光光路，并且第一激发光光路与第一发射光光路组成一对，第二激发光光路与第二发射光光路组成一对，每对光路之间的夹角均为90度，从而形成两个方向的激发光和两个方向的发射光：实线A代表一个方向的激发光，虚线a代表一个方向的发射光，两者之间形成90度夹角；实线B代表另一个方向的激发光，虚线b代表另一个方向的发射光，两者之间形成90度夹角。

值得注意的是，光路不局限于缺口形状，还可使用孔状结构，用于激发光和发射光的通过。

凸出部11与插入部21配合时，微流控检测管1的反应检测单元即凸出部11均处于光路中，当反应液发生反应时，激发光和发射光通过光路，透过反应液，产生的荧光信号，通过检测这些荧光信号的相对变化，判断基因扩增反应的进程，并进行相对定量的分析。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于，凸出部11和插入部21的形状均为类似六菱柱状，即插入部21的缺口形状为：从插入部中心向外延伸，共延伸出6条缺口，相邻两条缺口之间的角度均为60度；如图9和图10所示，凸出部11包括与插入部21的缺口相对应的凸出片。由此形成了6条光路，可以设置其中一条为激发光光光路，设置多条发射光光路，使得激发光光路分别与多条发射光光路形成不同的角度，如60度、120度等。也可以设置多条激发光光路和多条发射光光路，并且激发光光路和发射光光路之间一一对应。如图9所示，每一组激发光光路与发射光光路之间的夹角均为60度：实线A代表的激发光与虚线a代表的发射光，实线B代表的激发光与虚线b代表的发射光，实线C代表的激发光与虚线c代表的发射光。如图10所示，每一组激发光光路与发射光光路之间的夹角为不同角度：实线A代表的激发光与虚线a代表的发射光之间的夹角为120度，实线B代表的激发光与虚线b代表的发射光之间的夹角为120度，实线C代表的激发光与虚线c代表的发射光之间的夹角为60度。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于，凸出部11和插入部21的形状为“米”字形，即插入部21的缺口形状为：从插入部中心向外延伸，共延伸出8条缺口，相邻两条缺口之间的角度均为45度；凸出部11包括与插入部21的缺口相对应的凸出片。由此形成了8条光路，可以设置其中一条为激发光光光路，设置多条发射光光路，使得激发光光路分别与多条发射光光路形成不同的角度，如45度、90度等。也可以设置多条激发光光路和多条发射光光路，并且相互之间一一对应。如图11所示，每一组激发光光路与发射光光路之间的夹角为90度：实线A代表的激发光与虚线a代表的发射光，实线B代表的激发光与虚线b代表的发射光，实线C代表的激发光与虚线c代表的发射光，实线D代表的激发光与虚线d代表的发射光。如图12所示，每一组激发光光路与发射光光路之间的夹角为45度：实线A代表的激发光与虚线a代表的发射光，实线B代表的激发光与虚线b代表的发射光，实线C代表的激发光与虚线c代表的发射光，实线D代表的激发光与虚线d代表的发射光。

值得注意的是，本发明的激发光光路与发射光光路之间的角度不局限于实施例1-3中的角度，还可以通过对加热模块2的插入部21及凸出部11的结构进行合理设计，根据实际需求设计不同数目的光路，从而形成各种角度的光路组合。

本发明提供的基因扩增实时荧光定量检测系统，由于插入部21及凸出部11的不同形状，可以形成呈多种角度的光路组合，用于通过荧光信号；由于插入部21和凸出部11配合，形成充分接触，通过对加热模块2进行加热控制，还可以实现温度快速变化及恒定温度控制。因此，本发明提供的检测系统不仅能够与PCR扩增反应相结合，也能够与恒温基因扩增反应相结合。

实施例4

对于实时荧光PCR检测，本发明提供的检测方法如下：

在微流控检测管1中加入反应液，反应液由于重力作用，填充在凸出部11；将凸出部11与插入部21配合，进行加热和荧光信号检测。

控制加热模块2的加热温度，使加热模块2的温度在裂解温度、退火温度、扩增温度之间往复循环，对目标基因序列进行扩增。如果有些PCR体系将退火步骤与扩增步骤结合，在一个温度完成，也可以将前述的3个温度变化减少为2个。

在每个热循环中，例如可以在扩增步骤的后期，对反应液的荧光信号进行检测。反应液在凸出部11中，凸出部11与插入部21相配合，由于凸出部11与插入部21的形状设计，形成多个互呈夹角的激发光光路与发射光光路；反应液处于这些光路中，检测荧光信号，根据荧光信号的变化判断基因扩增反应的进程，并进行相对定量的分析。

实施例5

对于恒温基因扩增反应与实时荧光检测相结合，本发明提供的检测方法如下：

在微流控检测管1中加入反应液，反应液由于重力作用，填充在凸出部11；将凸出部11与插入部21配合，开始进行加热和荧光信号检测。

控制加热模块2的加热温度，使加热模块2的温度恒定。

以一定的时间间隔，例如1分钟，对微流控检测管1中的荧光信号进行检测，并通过荧光信号的变化判断基因扩增反应的进程，并进行相对定量的分析。检测的时间间隔可以根据实际需求予以设置。

实施例6

本实施例中，加热模块2为机械加工的不锈钢材料制成，表面氧化处理为黑色；微流控检测管1的凸出部11采用十字设计，设置两个方向的激发光和两个方向的发射光；微流控检测管1采用注塑成型，材料采用对荧光干扰小的环烯烃类共聚物(COC)。凸出部11的体积为50微升。以定量检测金黄葡萄球菌nuc基因为例：

引物-1为：5’-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3’；

引物-2为：5’-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3’；

40微升的反应溶液包含：20微升的2X SsoFast EvaGreen预混PCR反应液(美国伯乐公司，Biorad)；1微升的引物-1(10微摩尔/升)；1微升的引物-2(10微摩尔/升)；15微升的PCR用清洁水；2微升的含有金黄葡萄球菌基因的样品；1微升ROX染料。

将反应物充分混合后，加入到本发明的微流控检测管1中。溶液由于重力作用，进入到凸出部11的十字形结构内。将微流控检测管1放置于具有十字形缺口的加热模块2中。加热模块2的温度为95℃ 1分钟，55℃ 30秒，72℃ 30秒，循环40次。在72℃进行到25秒时，打开ROX通道荧光检测，曝光时间0.5秒；随后打开FAM通道进行荧光检测，曝光时间为1秒。FAM和ROX荧光检测滤光片和相应的光学器件采购于ThorLabs和尼康公司。采集到的ROX和EvaGreen(FAM通道)的荧光信号强度可以进行后续分析，得到相应的定量结果。

本发明提供的基因扩增实时荧光定量检测系统及检测方法，可以方便地实现多重荧光检测，并且不需要机械移动部件进行滤光或光源的控制与切换，同时可以兼顾高效热传导，适用于PCR扩增和恒温基因扩增等方法中。本发明可以实现基因定量检测的小型化、便携化，对分级诊断、疾病监控、家庭检测等应用场景具有非常重大的意义。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种基因扩增实时荧光定量检测系统，其特征在于，包括：

微流控检测管，所述微流控检测管由透光材料制成，所述微流控检测管包括一凸出部；反应液进入所述微流控检测管后，填充到所述凸出部；

加热模块，所述加热模块设置有插入部；所述插入部包括用于通过激发光的激发光光路和用于通过发射光的发射光光路，所述激发光光路与所述发射光光路呈夹角；

所述凸出部插入所述插入部内，并且表面相互接触；所述凸出部包括若干凸出片，所述凸出片在配合时分别位于所述激发光光路和所述发射光光路中；

所述插入部的结构为：多个光路从所述插入部的中心点向外延伸呈放射状，且所述光路分布在所述中心点的周向；其中，多个所述光路的一半作为所述激发光光路，剩余的一半作为所述发射光光路；多个所述激发光光路与多个所述发射光光路分别组成不同角度的排列，其中，所述角度的范围为30-120度；所述凸出片的数量与所述光路的数量相等；

所述加热模块中还设置有测温部件。

2.如权利要求1所述的基因扩增实时荧光定量检测系统，其特征在于，所述光路是缺口结构或孔状结构。

3.如权利要求1所述的基因扩增实时荧光定量检测系统，其特征在于，所述加热模块由导热材料制成。

4.如权利要求1所述的基因扩增实时荧光定量检测系统，其特征在于，所述测温部件为热电偶，用于测量所述加热模块的温度；所述加热模块采用电加热方式。

5.一种使用如权利要求1-4任一项所述的基因扩增实时荧光定量检测系统的基因扩增实时荧光定量检测方法，其特征在于，包括：

将反应液倒入微流控检测管；

控制加热模块在不同温度之间进行循环或保持在恒定温度；

周期性检测所述反应液的荧光信号；

分析基因扩增反应的过程。

6.如权利要求5所述的基因扩增实时荧光定量检测方法，其特征在于，

当所述加热模块在不同温度之间进行循环时，在每个所述循环中对所述荧光信号进行检测；

当所述加热模块保持在恒定温度时，以固定的时间间隔为周期，对所述荧光信号进行检测。

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