CN109765684B - 多光路多方位实时显微成像系统 - Google Patents
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Abstract
多光路多方位实时显微成像系统，属于分析检测技术领域。该成像系统由三个独立的光路：上左光路，上右光路和下光路组成。通过多光路对样品进行实时多角度成像。本发明旨在解决普通显微镜单视角所带来的局限信息量和无法精准显微操作等问题。利用多光路实时观测时，可迅速得出样品的整体结构信息，实现了对同一微小样品的实时空间结构信息的提取，提高了显微镜的实时空间分辨率，提高了对样品显微操作的成功率。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及多光路实时显微成像系统。
背景技术
17世纪晚期，荷兰显微镜的先驱人物列文虎克发明了第一台真正意义上的显微镜，显微镜技术自此之后得到了迅速的发展。光学显微成像技术是目前科学研究观测微小样品的常用技术，可应用于生物学，医学，化学，物理学等多种科学领域。由于目前普通显微镜仅拥有单一视角，造成人们无法实时判断微小样品的整体结构和无法对样品进行精准的显微操作。如何实现对样品整体结构的实时观测和精准的显微操作是生物，医学等领域急需解决的问题。
针对上述问题，现存的解决方式为：景深扩展拓展技术(ExtendedDepth ofFocus),首先拍摄一组不同Z轴位置的图像，由于每个位置都只有一部分图像是聚焦清楚的，分析后进行处理，得到一张全聚焦图像或者生成立体图像和3D表面图像，但该技术的缺点在于该技术仅仅是图像处理技术，牺牲了大量时间分辨率才可以得到三维结构图，且对于非透明样品观测依然无法得出其完整结构。激光扫描共聚焦显微镜(Laser ScanningConfocal Microscopy)虽然可以对样品进行高空间分辨成像，但还是牺牲了大量的时间分辨率，该技术提升样品成像的空间分辨率的前提是：必须对样品进行荧光标记。LSCM面临着高分辨率和低光毒性间相互矛盾难以平衡的问题，提高图像分辨率需要加强荧光信号，增强激光照射功率和时间，这种光的强度通常比一般宽场荧光显微镜荧光的强度超过1000倍以上，从而造成光漂白导致的光毒性，降低染料荧光寿命和样品的存活率等。
采用多光路显微成像系统可对样品实现多角度的实时观察，从而避免了普通显微镜单视角所带来的局限信息量和无法精准显微操作等问题，可迅速得出样品的整体结构信息以及对样品更为精准的空间定位，实现了对样品的实时空间信息的提取，提高了显微镜的时空分辨率。
发明内容
本发明的目的是为了克服普通显微镜单一视角固有的视觉局限性问题，发明一种多光路显微成像装置，通过物镜和相机从三个不同维度对样品进行观察，从而实时获取样品更多的空间结构信息，从而提高显微镜的时空分辨率。
所述的多光路多方位实时显微成像系统，由三个独立的显微成像光路：左上光路、右上光路及下光路组成；左上光路：第一物镜(1)安装在第一镜筒(4)的下底面端，第一镜筒(4)的侧面设有第一孔径光阑(6)，第一镜筒(4)上底面端固定连接着第一滤光块(7)，第一滤光块(7)再与第一相机(2)固定连接，第一镜筒(4)另一侧面依次采用第一转接板(8)和第一三维调节架(3)进行调节固定，第一三维调节架(3)固定在第一支撑架(27)上，第一支撑架(27)固定在机架(28)上；第一物镜(1)、第一镜筒(4)、第一滤光块(7)、第一相机(2)依次在同一中心光轴上；第一孔径光阑(6)通过光纤与第一光源(5)连接；
右上光路的结构和左上光路的结构相同且沿着竖直轴对称，且他们各自的中心光轴与竖直轴的夹角均为45°；在右上光路的结构和左上光路的结构中两物镜之间设有第三光源(10)，进行照明。
下光路：第三物镜(18)安装在物镜适配器(21)上方，物镜适配器(21)竖直下方是第三滤光块(22)，第三滤光块(22)竖直下方是反光三棱镜(25)，反光三棱镜(25)和第三相机(24)在一水平面上进行光路连接，第四光源(23)通过光纤连接到光路通道上与滤光块(22)进行光路连接；第三物镜(18)、第三滤光块(22)、反光三棱镜(25)依次位于竖直中心光轴上；
样品放置在XY平移台(19)上的载物台(20)上，XY平移台(19)安装在机架(28)上，整个机架放置在主动隔离工作站(26)上；左上光路、右上光路及下光路的中心光轴汇聚于一点即汇聚点，汇聚点位于待测物质上。
第一光源(5)、第二光源(17)为辅助照明光源，第三光源(10)为照明光源，第四光源(23)为激发光光源或/和辅助聚焦光源。
所述的多光路多方位实时显微成像系统，其特征在于：明场模式下，调节物镜前端的第三光源(10)的功率，给予样品稳定充足的照明，左上光路光线依次经过第一物镜(1)、第一镜筒(4)、第一滤光块(7)到达第一相机(2)的靶面，右上光路光线依次经过第二物镜(9)、第二镜筒(13)、第二滤光块(15)到达第二相机(16)的靶面，下光路光线依次经过第三物镜(18)、第三滤光块(22)、反光三棱镜(25)到达第三相机(24)的靶面，在电脑上实时显示出样品的多维观测图像；荧光模式下，对于荧光染料标记的样品，第三光源(23)的激发光经过第三滤光块(22)到达样品，样品受激发的发射光向周围散射，经过左上光路的第一滤光块(7)、右上光路的第二滤光块(15)和下光路的第三滤光块(22)分别到达第一相机(2)、第二相机(16)和第三相机(24)的靶面，在电脑上实时显示出样品的多维荧光图像。
多光路多方位显微成像系统的优点是实现了对同一个微小样品的实时多角度明场观察或者对样品染料标记后的多角度荧光观察。与传统的显微成像相比，增加了对样品的实时空间结构信息的提取，提高了显微镜的时空分辨率。
附图说明
图1是多光路多方位显微成像系统的结构示意图。
其分别为第一物镜(1)、第一相机(2)、第一三维调节架(3)、第一镜筒(4)、第一光源(5)、第一孔径光阑(6)、第一滤光块(7)、第一转接板(8)、第二物镜(9)、第三光源(10)、第二三维调节架(11)、第二转接板(12)、第二镜筒(13)、第二孔径光阑(14)、第二滤光块(15)、第二相机(16)、第二光源(17)、第三物镜(18)、XY平移台(19)、载物台(20)、物镜适配器(21)、第三滤光块(22)、第四光源(23)、第三相机(24)、反光三棱镜(25)、主动隔离工作站(26)、第一支撑架(27)、机架(28)、第二支撑架(29)。
图2是三光路成功聚焦时界面显示的光斑图。
图3是硅胶粉的三光路100倍实时放大图。
图4是单细胞的三光路100倍实时放大图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图1所示，是多光路实时显微成像系统的结构示意图，由三个独立的显微成像光路：左上光路、右上光路及下光路组成。
第一物镜(1)安装在第一镜筒(4)的下底面端，第一镜筒(4)的侧面设有第一孔径光阑(6)，第一镜筒(4)上底面端固定连接着第一滤光块(7)，第一滤光块(7)再与第一相机(2)固定连接，第一镜筒(4)另一侧面依次采用第一转接板(8)和第一三维调节架(3)进行调节固定，第一三维调节架(3)固定在第一支撑架(27)上，第一支撑架(27)固定在机架(28)上；第一物镜(1)、第一镜筒(4)、第一滤光块(7)、第一相机(2)依次在同一中心光轴上；第一孔径光阑(6)通过光纤与第一光源(5)连接；
右上光路的结构和左上光路的结构相同且沿着竖直轴对称，且他们各自的中心光轴与竖直轴的夹角均为45°；在右上光路的结构和左上光路的结构中两物镜之间设有第三光源(10)，进行照明。
下光路：第三物镜(18)安装在物镜适配器(21)上方，物镜适配器(21)竖直下方是第三滤光块(22)，第三滤光块(22)竖直下方是反光三棱镜(25)，反光三棱镜(25)和第三相机(24)在一水平面上进行光路连接，第四光源(23)通过光纤连接到光路通道上与滤光块(22)进行光路连接；第三物镜(18)、第三滤光块(22)、反光三棱镜(25)依次位于竖直中心光轴上；样品放置在XY平移台(19)上的载物台(20)上，XY平移台(19)安装在机架(28)上，整个机架放置在主动隔离工作站(26)。
实施例2
如图2所示，是三光路成功聚焦时界面显示的光斑图。
利用分光片替代盖玻片，将分光片置于载物台(20)上，并通过XY平移台(19)移至中央，打开第三相机(24)和第四光源(23)，通过调节下光路的焦距和光阑，在分光片上形成直径几微米的光斑。打开左上光路的第一相机(2)和第一光源(5)，右上光路的第二相机(16)和第二光源(17)，可在分光片上形成另外两个微小光斑，通过调节左上光路的第一三维调节架(3)和右上光路的第二三维调节架(11)，将三光斑位置粗调至重合，此时关闭上二光路第一光源(5)和第二光源(17)，通过调节下光路的孔径光阑的大小和上二光路的第一三维调节架(3)、第二三维调节架(11)，直至下光路光斑显示在各界面的中央即完成了三光路聚焦。
实施例3
如图3所示，是硅胶粉的三光路100倍实时放大图。
三光路聚焦后，将硅胶粉样品放置于分光片上并固定在载物台(20)上，调节物镜前端的第三光源(10)，给予样品稳定充足的照明，通过X-Y载物台(19)的移动找出载物台(20)上的样品，并分别利用左上光路的第一三维调节架(3)和右上光路的第二三维调节架(11)对样品进行微调聚焦，使同一样品在显示界面中呈现出清晰的像。
实施例4
如图4所示，是单细胞的三光路100倍实时放大图。
三光路聚焦后，将单细胞样品放置于分光片上并固定在载物台(20)上，调节物镜前端的第三光源(10)，给予样品稳定充足的照明，通过X-Y载物台(19)的移动找出载物台(20)上的样品，并分别利用左上光路的第一三维调节架(3)和右上光路的第二三维调节架(11)对样品进行微调聚焦，使同一样品在显示界面中呈现出清晰的像。
Claims (1)
1.多光路多方位实时显微成像系统，由三个独立的显微成像光路：左上光路、右上光路及下光路组成；左上光路：第一物镜(1)安装在第一镜筒(4)的下底面端，第一镜筒(4)的侧面设有第一孔径光阑(6)，第一镜筒(4)上底面端固定连接着第一滤光块(7)，第一滤光块(7)再与第一相机(2)固定连接，第一镜筒(4)另一侧面依次采用第一转接板(8)和第一三维调节架(3)进行调节固定，第一三维调节架(3)固定在第一支撑架(27)上，第一支撑架(27)固定在机架(28)上；第一物镜(1)、第一镜筒(4)、第一滤光块(7)、第一相机(2)依次在同一中心光轴上；第一孔径光阑(6)通过光纤与第一光源(5)连接；
右上光路的结构和左上光路的结构相同且沿着竖直轴对称，且他们各自的中心光轴与竖直轴的夹角均为45°；在右上光路的结构和左上光路的结构中两物镜之间设有第三光源(10)，进行照明；
下光路：第三物镜(18)安装在物镜适配器(21)上方，物镜适配器(21)竖直下方是第三滤光块(22)，第三滤光块(22)竖直下方是反光三棱镜(25)，反光三棱镜(25)和第三相机(24)在一水平面上进行光路连接，第四光源(23)通过光纤连接到光路通道上与滤光块(22)进行光路连接；第三物镜(18)、第三滤光块(22)、反光三棱镜(25)依次位于竖直中心光轴上；
样品放置在XY平移台(19)上的载物台(20)上，XY平移台(19)安装在机架(28)上，整个机架放置在主动隔离工作站(26)上；载物台(20)中间设有孔或为透明物质，可用于卡住待测样品或负载待测样品；左上光路、右上光路及下光路的中心光轴汇聚于一点即汇聚点，汇聚点位于待测物质上；
第一光源(5)、第二光源(17)为辅助照明光源，第三光源(10)为照明光源，第四光源(23)为激发光光源和辅助聚焦光源；
明场模式下，调节物镜前端的第三光源(10)的功率，给予样品稳定充足的照明，左上光路光线依次经过第一物镜(1)、第一镜筒(4)、第一滤光块(7)到达第一相机(2)的靶面，右上光路光线依次经过第二物镜(9)、第二镜筒(13)、第二滤光块(15)到达第二相机(16)的靶面，下光路光线依次经过第三物镜(18)、第三滤光块(22)、反光三棱镜(25)到达第三相机(24)的靶面，在电脑上实时显示出样品的多维观测图像；荧光模式下，对于荧光染料标记的样品，第四 光源(23)的激发光经过第三滤光块(22)到达样品，样品受激发的发射光向周围散射，经过左上光路的第一滤光块(7)、右上光路的第二滤光块(15)和下光路的第三滤光块(22)分别到达第一相机(2)、第二相机(16)和第三相机(24)的靶面，在电脑上实时显示出样品的多维荧光图像。
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