CN101273096A - 生物分子用标记色素、标记试剂盒以及生物分子的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的生物分子用标记色素具有由有机EL色素形成的显色部、结合生物分子的结合部以及连接显色部和结合部的间隔部。可以获得对生物分子的高标记率和固体状态下的高荧光强度。

Description

生物分子用标记色素、标记试剂盒以及生物分子的检测方法
技术领域
本发明涉及由荧光色素形成，用于核酸、蛋白质、肽类以及糖类等生物分子的检测的生物分子用标记色素和标记试剂盒以及生物分子的检测方法。
背景技术
最近，人类基因组的所有序列被探明，进行着以基因治疗、基因诊断等为目的的后基因组的研究。例如，DNA分析是使固定在DNA微阵列板上的探针DNA和用荧光色素等标记了的样品DNA杂交而形成双链后，再进行样品DNA的检测。这是将用荧光色素标记了的核酸进行PCR扩增，在基板上进行杂交后进行测定的方法。最近，采用使用具有更多的氨基的引物的方法、在DNA中引入氨基的方法。
标记中广泛地使用荧光色素，要求具有高荧光强度、在干燥状态(固体状态)下也可以发光、且具有水溶性等特性。作为荧光色素，例如使用Cy3或Cy5(例如，参考非专利文献1)。
非专利文献1：《科学》283.1，1月，1999，93-87
发明的揭示
但是，以前的标记色素存在标记率低的问题。例如，相对于具有一个反应点的DNA使用200倍摩尔左右的荧光色素，但即使是在所述条件下标记率也只能达到50～60％左右。因此，存在如下的问题：因需要使用大量的标记色素而导致检测费用的成本增加，或者因需要除去未反应的标记色素的处理步骤而检测所需的时间较长。
为了解决上述课题，本发明人认真努力后结果发现，通过使用具有由有机EL色素形成的显色部、结合生物分子的结合部以及连接显色部和结合部的间隔部的标记色素，可以大幅度地提高对DNA的标记率，从而完成了本发明。即，本发明的生物分子用标记色素为用于基于荧光测定的生物分子检测的标记色素，其特征在于，具有由有机EL色素形成的显色部、结合生物分子的结合部以及连接显色部和结合部的间隔部。
在这里，上述有机EL色素可以使用由与包含一种以上的杂原子、硒原子或硼原子的五元环化合物和具有共轭体系的六元环化合物形成的稠合多环化合物。
另外，上述稠合多环化合物可以使用由以下的通式(1)、(2)或(3)的任一种表示的吡咯衍生物。
Figure A20068003521800081
在这里，式中，R1、R2、R3、R4分别独立地表示氢原子，卤素原子，可具有烷基、链烯基、炔基、烷氧基、羟基、氰基、磺酰基、芳族烃基、杂环基、环内包含杂原子的芳基等取代基的芳族烃基、烃基、杂环基或环内包含杂原子的芳基；X表示可具有取代基的氮原子、硫原子、氧原子、硒原子或硼原子；R’表示可含芳环的烷基或链烯基等脂肪族烃基或芳族烃基；An-表示Cl-、Br-、I-等卤化物离子，CF3SO3 -，BF4 -，PF6 -。
另外，上述的R2和R3可以使用选自噻吩衍生物、呋喃衍生物、吡咯衍生物、咪唑衍生物、噁唑衍生物、噻唑衍生物、吡唑衍生物以及吡啶衍生物的一种。
另外，上述的R2和R3可以使用具有磺酰基的苯基。
另外，上述稠合多环化合物可以使用由以下通式(4)、(5)、(6)、(7)或(8)表示的咪唑衍生物。
Figure A20068003521800091
在这里，式中，R1、R2、R3、R4、R5分别独立地表示氢原子，卤素原子，可具有烷基、链烯基、炔基、烷氧基、羟基、氰基、磺酰基、芳族烃基、杂环基、环内包含杂原子的芳基等取代基的芳族烃基、烃基、杂环基或环内包含杂原子的芳基，R1、R2、R3、R4、R5可相同或不同；R’、R”表示可含芳环的烷基或链烯基等脂肪族烃基或芳族烃基；An-表示Cl-、Br-、I-等卤化物离子，CF3SO3 -，BF4 -，PF6 -。
另外，上述的R2和R3可以使用选自噻吩衍生物、呋喃衍生物、吡咯衍生物、咪唑衍生物、噁唑衍生物、噻唑衍生物、吡唑衍生物以及吡啶衍生物的任意一种。
另外，上述的R2和R3可以使用具有磺酰基的苯基。
另外，本发明的标记色素的结合部可以使用选自羧基、异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、环氧基、卤代烷基、三嗪基、碳二亚胺基以及活性酯化的羰基的任意一种反应性基团。
另外，本发明的标记色素的间隔部可以使用含有至少一种选自-CH2-、-NHCOO-、-CONH-、-CH2NH-、-CH2NR-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(＝NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-(R为烷基)、-(CH2-CH2-O)n-(n为1～10的整数)、-CH＝CH-、-C≡C-、-Ar-以及-CO-Ar-NR-的官能团。
在这里，上述间隔部可以使用由以下的通式(I)表示的基团。
-(CHR′)p-X-(CHR″)q-    (I)
式中，X为直接结合或选自-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(＝NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-、-CH＝CH-、-C≡C-、-Ar-以及-CO-Ar-NR-的至少一种官能团；R′和R”分别独立地表示氢原子，或可含有芳环的烷基或链烯基等脂肪族烃基，或芳族烃基中根据需要取代有选自磺酰基、羟基、季铵基以及羧基的任意一种的带电基团的基团；Ar表示芳基；p和q分别独立地表示0～20的整数，p+q≥1。
另外，间隔部可以使用氨基酸或由2～20个氨基酸形成的肽连接基。
另外，可以间隔部使用氨基酸，该氨基酸使用天然氨基酸或合成氨基酸。
另外，氨基酸可以使用选自半胱氨酸、2-氨基-3-磺基硫代丙酸(2-アミノ-3-スルホサルフアニルプロパン酸)、2-氨基-3-磺酰基丙酸(2-アミノ-3-スルホキシプロパン酸)、酪氨酸、苏氨酸、4-氨基-2-羟基丁酸、高丝氨酸和丝氨酸的至少一种氨基酸。
另外，也可以间隔部使用肽连接基，该肽连接基使用具有选自磺酰基、羟基、季铵基以及羧基的至少一种带电基团的基团。
另外，肽连接基也可以使用包含半胱氨酸、2-氨基-3-磺基硫代丙酸、2-氨基-3-磺酰基丙酸、酪氨酸、苏氨酸、4-氨基-2-羟基丁酸、高丝氨酸和丝氨酸的至少一种氨基酸的基团。
另外，本发明的第1种生物分子用标记试剂盒为用于基于荧光测定的生物分子检测的生物分子用标记试剂盒，其特征在于，包含具有由有机EL色素形成的显色部、结合生物分子的结合部以及连接显色部和结合部的间隔部的标记色素。
另外，本发明的第2种生物分子用标记试剂盒为用于基于荧光测定的生物分子检测的生物分子用标记试剂盒，其特征在于，至少包含由有机EL色素形成的显色部，结合在该显色部且含有至少一种选自-CH2-、-NHCOO-、-CONH-、-CH2NH-、-CH2NR-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(＝NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-(R为烷基)、-(CH2-CH2-O)n-(n为1～10的整数)、-CH＝CH-、-C≡C-、-Ar-以及-CO-Ar-NR-的官能团的间隔部。
还有，第2种生物分子用标记试剂盒可以包含反应性基团引入试剂，该试剂用于向标记色素中引入选自羧基、异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、环氧基、卤代烷基、三嗪基、碳二亚胺基以及活性酯化的羰基的任意一种反应性基团。
另外，本发明的第1种生物分子的检测方法的特征在于，使具有由有机EL色素形成的显色部、结合生物分子的结合部以及连接显色部和结合部的间隔部的标记色素与生物分子试样反应，测定基于该标记色素标记的生物分子试样的荧光。在这里，上述生物分子试样可以使用选自核酸、蛋白质、肽类以及糖类的任意一种。还有，蛋白质包含抗体。
另外，本发明的第2种生物分子的检测方法的特征在于，使用具有由有机EL色素形成的显色部、结合生物分子的结合部以及连接显色部和结合部的间隔部的标记色素标记了的探针与生物分子试样反应，测定所述生物分子试样的荧光。在这里，可以所述生物分子试样使用核酸，所述探针使用与所述核酸的碱基序列互补的寡核苷酸或PNA。还有，可以所述寡核苷酸使用引物或终止子，扩增所述核酸而测定荧光。另外，可以在扩增所述核酸之前用有机EL色素标记引物。此外，所述寡核苷酸或PNA可以使用分子信标。
另外，本发明的第3种生物分子的检测方法为由生物分子形成的被检测体或被修饰物质修饰了的该被检测体的检测方法，其特征在于，将与被检测体特异结合的结合物质或与修饰物质特异结合的结合物质的一方，用具有由有机EL色素形成的显色部、结合生物分子的结合部以及连接显色部和结合部的间隔部的标记色素标记，测定发自标记了的结合物质的荧光。
在这里，上述的被检测体或修饰物质和上述结合物质的组合可以使用抗原-抗体、半抗原-抗半抗原抗体、生物素-抗生物素蛋白、标签(Tag)-抗标签抗体、凝集素-糖蛋白或激素-受体。
另外，本发明的第4生物分子的检测方法的特征在于，包含将生物分子试样通过电泳按大小分离的步骤，在该电泳之前或之后将生物分子试样用具有由有机EL色素形成的显色部、结合生物分子的结合部以及连接显色部和结合部的间隔部的标记色素标记。
在这里，可以上述生物分子试样使用核酸，根据电泳图确定核酸的碱基序列。另外，也可以上述生物分子试样使用蛋白质，根据电泳图将取出的蛋白质进行质量分析。
另外，本发明的组织或细胞的染色方法的特征在于，将组织或细胞试样中的生物分子用具有由有机EL色素形成的显色部、结合生物分子的结合部以及连接显色部和结合部的间隔部的标记色素标记。在这里，上述生物分子可以使用核酸或蛋白质。
另外，本发明的染色色素为用于组织或细胞试样的染色的染色色素，其特征在于，由具有由有机EL色素形成的显色部、结合生物分子的结合部以及连接显色部和结合部的间隔部的标记色素形成。
本发明的生物分子用标记色素的显色部使用有机EL色素，结合部和显色部之间设置间隔部，因此可以提供具有大致接近100％的标记率，且在赋予固体状态下的高荧光强度的标记色素。
即，认为通过设置间隔部，显色部和作为标记对象的生物分子之间的位阻被抑制，结合部和生物分子的标记部位的结合变得容易，因而可以获得高标记率。由此，如果利用本发明的标记色素，则可以通过控制间隔部的长度，在不受生物分子的标记部位的深度的影响的情况下，获得高标记率。由此，可以大幅度减少使用的标记色素的量，因此也能够大幅度降低靶分子的检测费用。
还有，有机EL色素在固体状态(包含固体以及半固体)下具有高的量子收率，因此在微阵列等的基板上或珠子上的干燥状态下也赋予高的荧光强度。另外，有机EL色素比Cy3或Cy5便宜，因此可以更低成本地进行生物分子的检测。另外，通过改变有机EL色素的取代基，可以改变激发波长以及发光波长，因此荧光波长的选择的自由度增加，可以使用橙、黄、绿、蓝等多种荧光波长。由此，能够使用斯托克斯移位大的(激发波长和荧光波长之差大)的2种以上的荧光色素，也能够同时检测出包含在一个试样中的多种靶核酸。另外，相对于需要冷冻保存的Cy3或Cy5，有机El色素在化学上稳定，在常温下可以长期保存，因此处理容易。
附图的简单说明
图1是表示本发明的检测方法中探针使用分子信标时的发光机理的模式图。
图2是表示本发明的检测方法中IgG抗体的Fab’片段的制备方法之一例的模式图。
图3是表示本发明的检测方法中在IgG抗体的Fab’片段中引入有机El色素的方法之一例的模式图。
图4A是本发明的实施例1中的用EL-OSu标记了的17mer DNA的HPLC图谱之一例。
图4B是本发明的实施例1中的用EL-OSu-Sp标记了的17mer DNA的HPLC图谱之一例。
图5A是本发明的实施例1中的用EL-OSu标记了的20mer DNA的HPLC图谱之一例。
图5B是本发明的实施例1中的用EL-OSu-Sp标记了的20mer DNA的HPLC图谱之一例。
图5C是本发明的实施例1中的用Alexa594标记了的20mer DNA的HPLC图谱之一例。
图6A是本发明的实施例1中的用EL-OSu标记了的40mer DNA的HPLC图谱之一例。
图6B是本发明的实施例1中的用EL-OSu-Sp标记了的40mer DNA的HPLC图谱之一例。
图7是表示本发明的实施例1中的EL-OSu-Sp的添加量和标记率的关系的图之一例。
图8A是本发明的实施例2中的用EL-OSu标记了的BSA的HPLC图谱之一例。
图8B是本发明的实施例2中的用EL-OSu-Sp标记了的BSA的HPLC图谱之一例。
图9A是本发明的实施例2中的用EL-OSu标记后的BSA的TOF MS图谱之一例。
图9B是本发明的实施例2中的标记前的BSA的TOF MS图谱之一例。
实施发明的最佳方式
以下，对本发明的实施方式进行详细说明。
本发明的生物分子用标记色素的特征在于，具有由有机EL色素形成的显色部、结合生物分子的结合部以及连接显色部和结合部的间隔部的标记色素。
用于本发明的标记色素的有机EL色素只要是在一对阳极和阴极之间以固体状态被夹持而通过自阳极注入的空穴和自阴极注入的电子再结合时的能量可发光的色素，则无特别限制。例如，可以使用四苯基丁二烯或苝等多环芳族化合物、环戊二烯衍生物、二苯乙烯基吡嗪衍生物、吖啶酮衍生物、喹吖啶酮衍生物、茋衍生物、吩噻嗪衍生物、吡嗪并吡啶衍生物、吡咯衍生物、咪唑衍生物、咔唑衍生物以及四苯基噻吩衍生物等。还有，较好是在分子内具有羧基或可引入羧基的色素。如下所述，这是因为可容易地进行用于与生物分子结合的反应性基团的引入。
用于本发明的标记色素的结合部具有与生物分子试样(以下称为靶分子)结合的反应性基团，该反应性基团可以使用与生物分子之间形成共价键或离子键的取代基或者亲核试剂或亲电子试剂。
与生物分子之间形成共价键时，反应性基团较好是可与靶分子的氨基、亚氨基、巯基或羟基反应的官能团。作为有机EL色素和靶分子之间的共价键，较好是形成酰胺键、酰亚胺键、氨基甲酸乙酯键、酯键或胍键。该官能团可以使用例如异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、环氧基、卤代磺酰基、酰氯基、卤代烷基、乙二醛基、醛基、三嗪基、碳二亚胺基或活性酯化的羰基等。理想的是，使用选自异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、环氧基、卤代烷基、三嗪基、碳二亚胺基以及活性酯化的羰基的任意一种。更为理想的是，使用选自异氰酸酯基、环氧基、卤代烷基、三嗪基、碳二亚胺基以及活性酯化的羰基的任意一种。这是因为可以与靶分子的氨基形成酰胺键，而且可以直接结合在靶分子内的亚氨基上。特别理想的是，三嗪基、碳二亚胺基或活性酯化的羰基。另外，这些有机EL色素具有羧基时，在碳二亚胺衍生物、三嗪衍生物的存在下，也可以直接修饰存在于靶分子中的氨基以及亚氨基。还有，包含可具有取代基的三嗪基、可具有取代基的碳二亚胺基的有机EL色素与DNA碱基中的鸟嘌呤、胸腺嘧啶的亚氨基直接反应，因此可以在不需要采用PCR法引入色素的情况下进行错配检测(未形成双链的碱基的检测)，能够作为SNP(单核苷酸多态)分析的试剂使用。
另外，与靶分子之间形成离子键的反应性基团可以使用阴离子性基团，例如磺酰基或羧基。这些阴离子性基团与生物分子的例如氨基等阳离子形成离子键。
另外，作为反应性基团，也可以同时使用形成共价键的反应性基团和形成离子键的反应性基团。由此，在靶分子之间可以形成更强的键。形成共价键的反应性基团和形成离子键的反应性基团的组合无特别限制，可例举上述的官能团和上述的磺酰基或羧基等阴离子性基团的组合。
还有，可以使反应性基团与靶分子为DNA时的在寡聚DNA末端被修饰的氨基残基、靶分子为蛋白质时的氨基残基、靶分子为肽类时的例如聚赖氨酸衍生物的氨基残基等多肽的氨基以及靶分子为糖类时的多糖类衍生物骨架内的氨基结合。
用于本发明的标记色素的间隔部为连接显色部和反应性基团的构成部分，是含有共价键或原子链的部分，可以使用含有一种以上选自-CH2-、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(＝NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-(R为烷基)、-(CH2-CH2-O)n-(n为1～10的整数)、-CH＝CH-、-C≡C-、-Ar-以及-CO-Ar-NR-的官能团的基团。
即，间隔部可以仅由选自上述官能团的一种构成，也可以是包含2种以上的官能团的结构。另外，也可以是包含两个以上所选择的一种官能团的结构。
例如，仅由一种官能团构成时，较好是-CONH-、-COO-、-CH2-O-R-、-CH2NH-等。另外，由两种以上官能团构成时，可以为如下结构。
(1)由两种官能团构成时
较好是-CONH-COO-、-CH2-O-、-CH2-NR-等。
(2)由三种以上官能团构成时
(i)较好是使用由下述通式(I)表示的基团。
-(CHR1)p-X-(CHR2)q-    (I)
式中，X可以是直接结合或可以使用选自-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(＝NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-、-CH＝CH-、-C≡C-、-Ar-以及-CO-Ar-NR-的至少一种官能团，较好是可以使用-COO-、-CONH-、-O-、-CH＝CH-、-C≡C-或-Ar-，更好是可以使用-COO-、-CONH-、-O-或-Ar-。另外，R1和R2可以分别独立地使用氢原子，或可含有芳环的烷基或链烯基等脂肪族烃基，或在芳族烃基中根据需要取代有选自磺酰基、羟基、季铵基以及羧基的任意一种带电基团的基团。另外，Ar为芳基，较好是亚苯基或亚萘基，根据需要可以使用被磺酰基取代的基团。p和q分别独立地表示0～20的整数，较好是0～10的整数，更好是0～5的整数，p+q≥1。
所述间隔部可具体例举-(CH2)p-CONH-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R1-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R1-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R1-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R1-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-(O-CH-)n-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R1-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R1-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R1-N′H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R1-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R1-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R1(-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R1(-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R1(-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R1(-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-Ar-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-COO)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-C≡C-(CH2)q-、-(CH2)p-C＝C-(CH2)q-、-(CH2)p-NR-(CH2)q-、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-(CH2)p-S-(CH2)q、-(CH2)p-HN-C(＝NH)-NH-(CH2)q-、-(CH2)p-CO-Ar-NR-(CH2)q-等。较好是-(CH2)p-CONH-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-(CH2)q-。
(ii)较好是使用由以下的通式(II)表示的基团。
-Y-(CHR3)r-Z-    (II)
在这里，Y以及Z分别独立地表示选自-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(＝NH)-NH-、-CH2NH-、-CH2NR-、-O-、-S-、-NR-、-CH＝CH-、-C≡C-、-Ar-以及-CO-Ar-NR-的至少一种官能团，理想的是-CONH-和-COO-、-COO-和-COO-、-COO-和-NR-等组合。另外，R3可以使用氢原子，或可含有芳环的烷基或链烯基等脂肪族烃基，或在芳族烃基中根据需要取代有选自磺酰基、羟基、季铵基以及羧基的任意一种带电基团的基团。另外，Ar为芳基，较好是亚苯基或亚萘基，根据需要可以使用被磺酰基取代的基团。r为0～20的整数，较好是0～10的整数，更好是0～5的整数。该间隔部的具体例子可例举-CONH-(CH2)r-COO-、-CONH-CH(-R3-OH)-COO-、-CONH-CH(-R3-COOH)-COO-、-CONH-CH(R3-SO3H)-COO-、-COO-(CH2)r-COO-等。
另外，间隔部也可以使用氨基酸或由2～20个氨基酸形成的肽连接基。氨基酸可以使用天然或合成的氨基酸。在这里，天然氨基酸包含甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、4-氨基-2-羟基丁酸、高丝氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、羟赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、2-氨基-3-磺基硫代丙酸、2-氨基-3-磺酰基丙酸、胱氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、脯氨酸以及4-羟基脯氨酸等。
合成氨基酸包含上述天然氨基酸的D体或在分子内至少含有氨基和羧基的修饰氨基酸。
修饰氨基酸可以由通式：H-N(R1)-(R2-CO)-OH表示。在这里，R1和R2分别独立地表示介以或未介以酯、醚、硫酯、硫醚、酰胺、脲或硫脲以选自磺酰基、羟基、季铵基以及羧基的任意一种的带电基团取代的烃基、芳基或杂环基。还有，烃基、芳基或杂环基分别可以被卤素原子、烷基、链烯基、炔基或烷氧基的至少一种取代。
用于本发明的间隔部的更理想的氨基酸选自作为具有磺酰基的氨基酸的半胱氨酸、2-氨基-3-磺基硫代丙酸、2-氨基-3-磺酰基丙酸，以及具有羟基的酪氨酸、苏氨酸、4-氨基-2-羟基丁酸、高丝氨酸、丝氨酸的任意一种。其原因是可以提高标记色素的水溶性。更好是半胱氨酸或丝氨酸。
作为肽连接基，较好是使用分别由-C(-R1)-CONH-C(-R2)-、-C(-R1)-CONH-C(-R2)-CONH-C(-R3)-、-C(-R1)-CONH-C(-R2)-C(-R3)-CONH-C(-R4)-表示的二肽、三肽、四肽。在这里，R1、R2、R3、R4表示氢原子、碳数1～6的烷基、醇基、吲哚基、羟苯基、苄基、胍基、硫醚基、烷硫基、咪唑基或烷基氨基等取代基。这些肽同聚或异聚肽。具体例举，可以使用Ala-Ser、Glu-Ala、Glu-Ala-Leu、Gly-Pro、Gly-Pro-Asn、Ile-Val、Ile-Val-Met等。
另外，肽连接基的一部分可以根据需要使用具有选自磺酰基、羟基、季铵基以及羧基的至少一种带电基团的基团。例如，可以使用包含一种以上的具有其中的任意一种带电基团的氨基酸的肽连接基。由此，可以提高标记色素的水溶性。例如，可以使用包含选自具有磺酰基的半胱氨酸，2-氨基-3-磺基硫代丙酸、2-氨基-3-磺酰基丙酸，以及具有羟基的酪氨酸、苏氨酸、4-氨基-2-羟基丁酸、高丝氨酸、丝氨酸的任意一种氨基酸的肽连接基。
通过改变间隔部的长度以及其结构，可以改变显色部和生物分子的标记部位之间的距离，抑制生物分子和标记色素之间的位阻。即，可以根据具有复杂结构的蛋白质、肽、DNA等生物分子的立体结构来进行标记色素的结构设计，从而抑制位阻，因此可以提高标记率。或者，通过在间隔部引入例如-CH＝CH-、-C≡C-、-Ar-以及-CO-Ar-NR-等赋予刚性的官能团，也可以使对于特定的标记部位、例如位于深部的标记部位的位阻增加。由此，通过仅选择性标记位阻小的标记部位、例如浅部，同时用位阻小的另一个标记色素标记深部的标记部位，从而可以识别深部和浅部的标记部位。
在本发明的标记色素中引入反应性基团时，例如可以采用示于流程图1的反应。反应式(I)表示反应性基团使用活性酯化的羧基，与反应性基团结合的间隔部的官能团使用-COO-的例子。活性酯化的羧基可以使用N-羟基琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺酯。通过使用N-羟基琥珀酰亚胺酯并使用DCC作为缩合剂使用DCC，从而经过N-羟基琥珀酰亚胺酯体，有机EL色素和靶分子通过酰胺键结合。
另外，反应式(II)表示活性酯化的羧基使用三嗪基衍生物，与反应性基团结合的间隔部的官能团使用-COO-的例子。
另外，反应式(III)表示反应性基团使用碳二亚胺基，与反应性基团结合的间隔部的官能团使用-COO-的例子。碳二亚胺基可以使用N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)或1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺等碳二亚胺试剂。可以经由碳二亚胺体，通过酰胺键使有机EL色素和靶分子结合。
另外，反应式(IV)表示在间隔部先引入碳二亚胺基、三嗪基的例子，即与反应性基团结合的间隔部的官能团兼作反应性基团的例子。由此，即使不另外在标记色素中引入反应性基团，也可以使标记色素直接与靶分子内的氨基、亚氨基结合。
Figure A20068003521800181
流程图1
使用于本发明的标记色素的理想的有机EL色素为包含具有共轭体系的五元环化合物的化合物，可例举该五元环化合物含有一种以上的杂原子、硒原子或硼原子的化合物。还有，具体可例举由具有共轭体系的五元环化合物形成的单环化合物和该五元环化合物与具有共轭体系的六元环化合物形成的稠合多环化合物。其原因为即使是固态状态，量子收率也大，显示强荧光。五元环化合物较好是吡咯衍生物或咪唑衍生物。还有，吡咯衍生物或咪唑衍生物较好是具有1个以上的季铵基。这是因为可以使水溶性提高。
以下，对稠合多环化合物的具体例子进行说明。
(单吡咯衍生物1)
Figure A20068003521800191
在这里，R1、R2、R3、R4、R5分别独立地表示氢原子，卤素原子，可具有烷基、链烯基、炔基、烷氧基、羟基、氰基、磺酰基、芳族烃基、杂环基等取代基的芳族烃基、烃基或杂环基。R1、R2、R3、R4、R5可相同或不同。上述烷基较好是碳数1～6的直链状或分支状的烷基。另外，上述链烯基较好是乙烯基、烯丙基、巴豆基、甲基巴豆酰基或异戊烯基。另外，上述炔基较好是乙炔基或炔丙基。另外，上述烷氧基较好是甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、戊氧基或苯氧基。另外，上述芳族烃基包含单环或多环，较好是苯基、甲苯基、二甲苯基或萘基，更好是苯基。另外，上述杂环基较好是吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、吡唑基、吡啶基或喹啉基，更好是呋喃基、咪唑基或噻吩基。另外，上述烃基较好是碳数1～6的直链状或分支状的烷基。
另外，R’表示可含有芳环的烷基或链烯基等脂肪族烃基或芳族烃基。在这里，烷基、链烯基、芳族烃基可使用与上述相同的基团。
另外，An-表示Cl-、Br-、I-等卤化物离子，CF3SO3 -，BF4 -，PF6 -。还有，在以下的通式中如果无特别说明则相同。
(单吡咯衍生物2)
Figure A20068003521800201
在这里，式中的R8、R9分别独立地表示氢原子，卤素原子，可具有烷基、链烯基、炔基、烷氧基、羟基、氰基、磺酰基、芳族烃基、杂环基等取代基的芳族烃基、烃基或杂环基，R8、R9可相同或不同。上述烷基较好是碳数1～6的直链状或分支状的烷基。另外，上述链烯基较好是乙烯基、烯丙基、巴豆基、甲基巴豆酰基或异戊烯基。另外，上述炔基较好是乙炔基或炔丙基。另外，上述烷氧基较好是甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、戊氧基或苯氧基。另外，上述芳族烃基包含单环或多环，较好是苯基、甲苯基、二甲苯基或萘基，更好是苯基。另外，上述杂环基较好是吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、吡唑基、吡啶基或喹啉基，更好是呋喃基、咪唑基或噻吩基。另外，上述烃基较好是碳数1～6的直链状或分支状的烷基。
还有，在以下的通式中，如果无特别说明则也相同。另外，n为1以上的整数，较好是1～5，在以下的通式中也相同。
(二唑衍生物1)
(二唑衍生物2)
Figure A20068003521800221
(二唑衍生物3)
Figure A20068003521800222
在这里，R1、R2、R3、R4分别独立地表示氢原子，卤素原子，可具有烷基、链烯基、炔基、烷氧基、羟基、氰基、磺酰基、芳族烃基、杂环基等取代基的芳族烃基、烃基或杂环基，R1、R2、R3、R4、R6、R7可相同或不同。R2、R3可以使用可具有取代基的芳族烃基，较好是苯基，其取代基可以使用碳数1～4的烷基或烷氧基或者溴原子。还有，烷基较好是使用甲基，烷氧基较好是使用甲氧基。另外，X为可具有取代基的氮原子、硫原子、氧原子、硒原子或硼原子，如果无特别说明，则在以下的通式中也相同。
(二唑衍生物4)
Figure A20068003521800231
(二唑衍生物5)
Figure A20068003521800232
在这里，N→O表示氮原子配位结合在氧原子上的状态。
(二唑衍生物6)
Figure A20068003521800241
(二唑衍生物7)
Figure A20068003521800242
(二唑衍生物8)
Figure A20068003521800251
在这里，式中，R10、R11分别独立地表示氢原子，卤素原子，可具有烷基、链烯基、炔基、烷氧基、羟基、氰基、磺酰基、芳族烃基、杂环基等取代基的芳族烃基、烃基或杂环基，R10、R11可相同或不同。上述烷基较好是碳数1～6的直链状或分支状的烷基。另外，上述链烯基较好是乙烯基、烯丙基、巴豆基、甲基巴豆酰基或异戊烯基。另外，上述炔基较好是乙炔基或炔丙基。另外，上述烷氧基较好是甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、戊氧基或苯氧基。另外，上述芳族烃基包含单环或多环，较好是苯基、甲苯基、二甲苯基或萘基，更好是苯基。另外，上述杂环基较好是吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、吡唑基、吡啶基或喹啉基，更好是呋喃基、咪唑基或噻吩基。另外，上述烃基较好是碳数1～6的直链状或分支状的烷基。另外R12为可具有取代基的链烯基或石蜡基，n为1～3的整数，较好是1。还有，在以下的通式中，如果无特别说明则也相同。
(二唑衍生物9)
Figure A20068003521800281
(三唑衍生物1)
Figure A20068003521800291
(三唑衍生物2)
Figure A20068003521800301
作为五元环化合物，也可以使用含有噻吩基的以下的衍生物。
(噻吩衍生物1)
Figure A20068003521800311
(噻吩衍生物2)
Figure A20068003521800321
(噻吩衍生物3)
另外，噻吩衍生物的情况下，也可以使用作为非聚合类化合物的由以下的通式表示的2，3，4，5-四苯基噻吩衍生物。
Figure A20068003521800322
在这里，式中，R13、R14、R15分别独立地表示氢原子或者直链、分支或环状的碳数1～6的烷基，优选苯基、甲苯基、二甲苯基或萘基的取代或未取代的芳基，或者优选苄基或苯乙基的取代或未取代的芳烷基；Ar1以及Ar2表示置换或未置换的芳基，较好是表示苯基、甲苯基、二甲苯基或萘基，还有，Ar1以及Ar2可以与结合了的氮原子共同形成含氮杂环。另外，Y1以及Y2表示氢原子，卤素原子，或直链、分支或环状的碳数1～6的烷基，或者优选甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、戊氧基或苯氧基的直链、支链或环状的烷氧基，或者优选苯基、甲苯基、二甲苯基或萘基的置换或未置换的芳基，或者优选苄基或苯乙基的置换或未置换的芳香烃基，或者置换或未置换的氨基。
(噻吩衍生物4)
另外，可以使用由以下的通式表示的2，3，4，5-四苯基噻吩衍生物。
Figure A20068003521800331
在这里，式中，Ar1～Ar6分别独立地表示置换或未置换的芳基，较好是表示苯基、甲苯基、二甲苯基或萘基，还有，Ar1和Ar2、Ar3和Ar4以及Ar5和Ar6可与结合了的氮原子共同形成含氮杂环。
另外，五元环化合物也可以使用咪唑，使用由以下的通式表示的咪唑衍生物。在这里，构成咪唑衍生物的的咪唑基较好是具有季铵基。其原因是可以提高水溶性。还有，包含吡啶基时，为了进一步提高水溶性，吡啶基也可以具有季铵基。还有，在以下的通式中，R”表示可含有芳环的烷基或链烯基等脂肪族烃或芳族烃基。
(咪唑衍生物1)
Figure A20068003521800332
(咪唑衍生物1)
Figure A20068003521800341
(咪唑衍生物2)
(咪唑衍生物3)
Figure A20068003521800361
在这里，咪唑骨架可以在中央的苯环R8、R9、R10、R11的任意位置上结合多个单元。另外，R12为可具有取代基的链烯基或石蜡基，n为1～3的整数，较好是1。
(咔唑衍生物)
另外，也可以使用由以下的通式表示的咔唑衍生物。
Figure A20068003521800371
另外，也可以使用作为具有共轭体系的五元环化合物的包含1种以上的杂原子、硒原子或硼原子的单环化合物。无特别限制，例如可以使用由以下的通式表示的吡咯衍生物。
Figure A20068003521800372
在这里，式中，R1、R4、R5分别独立地表示氢原子，卤素原子，可具有烷基、链烯基、炔基、烷氧基、羟基、氰基、磺酰基、芳族烃基、杂环基等取代基的芳族烃基、烃基或杂环基，R1、R4、R5可相同或不同。上述烷基较好是碳数1～6的直链状或分支状的烷基。另外，上述链烯基较好是乙烯基、烯丙基、巴豆基、甲基巴豆酰基或异戊烯基。另外，上述炔基较好是乙炔基或炔丙基。另外，上述烷氧基较好是甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、戊氧基或苯氧基。另外，上述芳族烃基包含单环或多环，较好是苯基、甲苯基、二甲苯基或萘基，更好是苯基。另外，上述杂环基较好是吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、吡唑基、吡啶基或喹啉基，更好是呋喃基、咪唑基或噻吩基。另外，上述烃基较好是碳数1～6的直链状或分支状的烷基。
用于本发明的标记色素的有机EL色素只要是以上说明的稠合多环化合物以及单环化合物，就无特别限制，但可以优选使用由以下的通式表示的二唑衍生物或咪唑衍生物。
Figure A20068003521800381
Figure A20068003521800391
还有，在上述二唑衍生物以及咪唑衍生物中，可以优选使用二唑并吡啶衍生物或咪唑并吡啶衍生物。
本发明的特别理想的标记色素在显色部包含上述的二唑并吡啶衍生物或咪唑并吡啶衍生物，可以由以下的通式表示。
Figure A20068003521800392
Figure A20068003521800401
-(CHR′)p-X-(CHR″)q表示前述的间隔部。另外，Z表示前述的反应性基团。
在这里，上述的R2和R3较好是使用可具有取代基的芳族烃基或烃基。可以获得对应于Cy3的绿色荧光色素。芳族烃基为苯基、甲苯基、二甲苯基或萘基，更好是苯基或甲苯基。还有，取代基较好是锍基。这是因为可以提高水溶性。
或者，上述的R2和R3也可以使用选自噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、吡唑基以及吡啶基的一种，更好是使用噻吩基、咪唑基以及呋喃基，它们可以具有取代基。可以获得对应Cy5的红色荧光色素。
标记色素可以通过反应性基团和间隔部的组合以各种方法合成。例如，反应性基团使用活性酯化的羧基时，预先合成二唑并吡啶衍生物或咪唑并吡啶衍生物的活性酯化体，使间隔部用化合物(例如甘氨酸、丙氨酸、4-氨基丁酸、半胱氨酸、丝氨酸等氨基酸)与该活性酯化体反应而获得羧酸体，使该羧酸体与N-羟基琥珀酰亚胺反应，从而可以获得引入了间隔部的活性酯化体。例如，间隔部用化合物使用甘氨酸时，可以获得具有-CONH-和-(CH2)-的间隔部。另外，使用β-丙氨酸时，可以获得具有-CONH-和-(CH2)2-的间隔部。另外，使用4-氨基丁酸时，可以获得具有-CONH-和-(CH2)3-的间隔部。另外，使用半胱氨酸时，可以获得具有-CONH-和-SO3 -的间隔部。另外，使用丝氨酸时，可以获得具有-CONH-和-OH的间隔部。通过使用半胱氨酸和丝氨酸，可以在间隔部分别引入锍基和羟基，可以提高标记色素的水溶性。
只要是测定标记了的固体或半固体状的生物分子的荧光的检测方法，则本发明的标记色素可以使用所有的生物分子的检测方法。通过以有机EL色素代替以前的荧光色素，可以提供高灵敏度、化学上稳定、操作性良好且低成本的检测方法。在本发明中，可以如前所述使有机El色素与生物分子试样直接反应而用有机EL色素标记生物分子试样，或也可以使用使生物分子试样和用有机El色素标记了的探针反应而用有机El色素标记生物分子试样的方法。另外，也可以使用利用特异结合的生物分子的检测方法。还有，还可以使用将用有机El色素标记的生物分子试样通过电泳进行大小分离的的方法。
例如，将核酸作为检测对象的DNA微阵列法可以按照以下的步骤进行。
(DNA微阵列法)
本检测方法中，使有机El色素与需要检测的靶核酸反应而用有机EL色素标记的同时，准备具有与靶核酸互补的碱基序列的单链的探针核酸，将使其成为单链了的靶核酸和探针核酸在基板上进行杂交，测定靶核酸的荧光。在该检测方法中，调查基因表达时，在基板上固定的探针核酸可以使用将cDNA等以cDNA文库、基因组文库或全部基因组作为模板以PCR法扩增而制成的核酸。另外，在调查基因的突变等时，可以使用以作为基准的已知的序列为基础合成对应于突变等的各种寡核苷酸而得的核酸。
探针核酸的在基板上的固定可以根据核酸的种类或基板的种类选择适当的方法。例如，也可以使用利用DNA的电荷使其结合于用多聚赖氨酸等的阳离子进行了表面处理的基板上的方法。另一方面，通过将变性为单链的靶核酸和有机El色素混合而使其反应，从而制成用有机EL色素标记了的靶核酸。较好是以反应温度为室温～60℃，反应时间为2～48小时的条件进行。
然后，将标记了的靶核酸滴加到基板上，进行杂交。杂交较好是在室温～70℃且2～48小时的范围内进行。通过杂交，具有与探针核酸互补的碱基序的靶核酸选择性地与探针核酸结合。之后，洗净基板，在室温干燥。然后，采用荧光激光扫描法测定干燥的基板的表面的荧光强度。通过荧光强度，可以监控基因表达水平。还有，上述杂交针对在基板上固定探针核酸的方法进行了说明，但也可以使用预先将用有机El色素标记的靶核酸固定在基板上，将探针核酸滴加到基板上的方法。
另外，同样将核酸作为检测对象，采用引物或终止子的PCR法可以按照以下的步骤进行。
(PCR法)
(PCR法)
本检测方法中，将与需要检测的靶核酸的碱基序列互补的探针用有机EL色素标记，靶核酸扩增之前或扩增之后，使靶核酸和探针反应，测定靶核酸的荧光。具体地，靶核酸的的延伸反应通过酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶)进行，这时酶识别靶核酸和由寡核苷酸形成的引物形成的双链核苷酸序列，从其识别的部位开始进行延伸反应，仅扩增作为目标的基因区域。酶进行合成时，以核苷酸(dNTP、NTP)为原料进行合成反应。这时，如果在通常的核苷酸(dNTP、NTP)中以任意的比例混合例如图27所示的具有色素的核苷酸，则可以合成引入了该比例的色素的核酸。或者，也可以通过PCR以任意的比例引入具有氨基的核苷酸后，使有机EL色素结合，合成引入了有机EL色素的核酸。
Figure A20068003521800421
酶进行合成时以核苷酸作为原料进行合成反应，但这时使用将核苷酸的3’的OH改为H的核苷酸时，不会再进行核酸的延伸反应，在该时间点上反应终止。该核苷酸，即双脱氧核苷三磷酸(ddNTP，dideoxynucleotide triphospate)被称为终止子。如果在通常的核苷酸中混合终止子进行核酸的合成反应，则以一定的概率引入终止子，反应终止，因此合成各种长度的核酸。如果通过电泳将这些核酸进行大小分离，则DNA按照长度的顺序排列。在这里，如果用根据终止子的各碱基的种类而不同的有机EL色素标记，则在合成反应的终点(3’端)观察到依赖于各碱基的倾向，通过以终止子上标记了的有机EL色素为基点读取荧光信息，从而可以获得该靶核酸的碱基序列的信息。另外，也可以利用预先用有机EL色素标记了的引物替代终止子与靶核酸进行杂交。
另外，探针也可以使用PNA(肽核酸)。PNA是将作为核酸的基本骨架结构的戊糖磷酸骨架替换为以甘氨酸为单元的聚酰胺骨架而得的化合物，因此具有类似于核酸的立体结构，对于具有互补的碱基序列的核酸，非常特异且牢固地进行结合。因此，不仅是原位杂交方法等已知的DNA分析方法，还可以通过应用在端粒PNA探针来作为端粒研究的试剂使用。
检测可以通过以下方法进行：例如，使双链DNA与具有同DNA的碱基序列的全部或一部分互补的碱基序列且用有机EL色素标记了的PNA接触而进行杂交，加热该混合物而生成单链DNA，将混合物缓慢地冷却至室温，制成PNA-DNA复合物，测定其荧光。
在上述的例子中，对于将靶核酸通过PCR法扩增而测定生成物的荧光的方法进行了说明，但在该方法中，需要通过电泳确认生成物的大小，之后测定荧光强度来检测扩增生成物的量。针对这一点，也可以使用利用荧光色素的能量传递而实现通过与PCR法的生成物杂交而使其产生荧光的探针，实时地测定生成物的量。该方法中可以使用例如标记了供体和受体的DNA。作为具体的检测方法，可例举确认特定序列的存在的分子信标法、TagMan-PCR法或循环探针法等。
例如，对于分子信标法的发光机理，对在基板上固定分子信标并与靶基因进行杂交的例子用图1进行说明。在具有特定DNA序列的DNA(探针)的一端上标记有机EL色素F，另一端标记猝灭剂Q。猝灭剂Q被固定在基板上，在靶基因引入前，猝灭剂Q和有机EL色素F接近而荧光色素被消光。如果向其中引入具有与标记了的DNA互补的序列的靶基因，则标记了的DNA和靶基因进行杂交，由此有机EL色素F和猝灭剂Q的距离变远，可以观察有机EL色素F的荧光。由此，可以观察DNA的杂交并测定杂交的量。
另外，以蛋白质为检测对象时，电泳后的蛋白质的检测中使用染色色素。通常，采用使例如考马斯亮蓝(CBB)等染色色素浸透于电泳后的凝胶中而将蛋白质染色，照射UV来使其发光的方法。但是，使用以前的染色色素的方法虽然简便，但灵敏度低达100ng左右，不适合微量蛋白质的检测。另外，由于隔着凝胶使染色色素浸透，因此还存在染色所需要的时间长的问题。
与此相对，在本发明中，将蛋白质通过电泳进行大小分离后，通过使有机EL色素结合于分离了的蛋白质来标记蛋白质。本发明的有机El色素具有反应性基团，与蛋白质迅速进行定量反应，灵敏度更高，适用于微量蛋白质的检测。还有，也可以将大小分离的蛋白质进行质量分析来鉴定。
在这里，蛋白质可以将白蛋白、球蛋白、谷蛋白、组蛋白、精蛋白以及胶原等单纯蛋白质，核蛋白、糖蛋白、核糖蛋白、磷蛋白、金属蛋白等复合蛋白质的任意一种作为检测对象。例如，可以对应于磷蛋白、糖蛋白、总蛋白的染色色素而使用三种有机EL色素，可以在通过平面电泳分离了的蛋白质试样中将磷蛋白、糖蛋白以及总蛋白染色。另外，可以通过进行TOP-Mass等质量分析来鉴定蛋白质，因此可以应用于生成特殊的蛋白质的癌症或病毒引起的感染症等疾病的诊断和治疗。另外，胶原为构成动物的结缔组织的蛋白质，具有独特的纤维状结构。即，由3条多肽链形成，其肽链聚在一起形成三重链。胶原通常是免疫原性极低的蛋白质，广泛地使用在食品、化妆品、医药品等领域。但是，即使在胶原的肽链上引入荧光色素，以前的荧光色素的稳定性能也并不充分，需要更加稳定的荧光色素。因此，通过标记胶原的荧光色素使用有机El色素，可以进行稳定且高灵敏度的检测。
另外，探针也可以使用适体。适体由寡核酸形成，可以呈根据碱基序列具有各种特征的立体结构，因此可以通过所述立体结构结合到包含蛋白质的所有生物分子上。利用该性质，使用有机El色素标记的适体结合在特定的蛋白质上，根据基于与被检测体的结合的该蛋白质的结构变化所带来的荧光变化，可以间接地检测被检测体。例如，提出了使用用荧光色素标记的适体，利用能量传递的可卡因检测用生物传感器。(J.Am.Chem.Soc.2001，123，4928-4931)。通过使用有机El色素代替该荧光色素，可以提供高灵敏度且处理容易的生物传感器。
另外，本发明的标记色素也可以适用于利用特异结合的生物分子的检测方法中。即，由生物分子形成的被检测体或被修饰物质修饰了的该被检测体的检测中，可以将与被检测体特异结合的结合物质或与修饰物质特异结合的结合物质的一方，用具有由有机EL色素形成的显色部、结合生物分子的结合部以及连接显色部和结合部的间隔部的标记色素标记，测定发自标记了的结合物质的荧光。
在这里，上述的被检测体或修饰物质和上述结合物质的组合可以使用抗原-抗体、半抗原-抗半抗原抗体、生物素-抗生物素蛋白、标签-抗标签抗体、凝集素-糖蛋白或激素-受体。
具体地，对存在于基板上、溶液中、珠上、抗体上的抗原或半抗原，使由有机EL色素标记的抗体等结合物质作用，利用该抗体的抗原或半抗原的特异性结合能力，检测特定的抗原或半抗原。抗原可例举蛋白质、多糖类、核酸、肽等，半抗原可例举FITC或二硝基苯基等低分子量的分子。作为抗原或半抗原与抗体的组合，可例举GFP和GFP抗体、FITC和抗FITC抗体等。
作为具体例子，可以使用以下的方法。
(1)使荧光标记了的抗体与存在于基板或溶液中的生物分子(抗原：蛋白质、多糖类、核酸、肽)结合，进行检测的方法。
(2)使荧光标记了的抗半抗原抗体与存在于基板或溶液中的修饰半抗原而得的生物分子(抗原：蛋白质、多糖类、核酸、肽)结合，进行检测的方法。
(3)使荧光标记了的抗生物素蛋白存在于基板或溶液中的修饰生物素而得的生物分子(抗原：蛋白质、多糖类、核酸、肽)结合，进行检测的方法。
(4)使抗体与存在于基板或溶液中的生物分子(抗原：蛋白质、多糖类、核酸、肽)结合，再使与该抗体特异结合的标记了荧光色素的抗体结合，进行检测的方法。
(5)使修饰半抗原而得的抗体与存在于基板或溶液中的生物分子(抗原：蛋白质、多糖类、核酸、肽)结合，再使与该半抗原特异结合的标记了荧光色素的抗体结合，进行检测的方法。
(6)使修饰生物素而得的抗体存在于基板或溶液中的生物分子(抗原：蛋白质、多糖类、核酸、肽)结合，再使与该生物素特异结合的标记了荧光色素的抗生物素蛋白结合，进行检测的方法。
(7)在存在于基板或溶液中的生物分子(抗原：蛋白质、多糖类、核酸、肽)上引入标签(组氨酸等)，利用由荧光色素标记了的抗标签抗体进行检测的方法。
这些标记物可以适用于免疫染色、ELISA、蛋白质印迹法、流式细胞术等各种测定手段。
还有，具体例子例如图2所示，如果将IgG抗体用胃蛋白酶处理，则可获得称为F(ab’)2的片段。如果将该片段用二硫苏糖醇还原，则可获得称为Fab’的片段。Fab’片段具有一个或两个巯基(-SH)。使马来酰亚胺基对该巯基作用，从而可以进行特异进行反应。即，如图3所示，通过使引入了马来酰亚胺基的有机El色素与片段的巯基反应，从而可以用有机El色素标记抗体。这时，不会失去抗体的生理活性(抗原捕获能力)。
另外，也可以使用本发明的标记色素进行金属离子的检测。金属离子参与体内的DNA或蛋白质等的稳定性或高级结构的维持、功能的发挥以及参与生物体内的所有化学反应的酶的活化等在生物体内发生的所有生命现象。因此，可以实时观察生物体内的金属离子的动向的金属离子传感器在以医疗领域为代表的领域中是非常重要的。以前，已知在生物分子中引入荧光色素的金属离子传感器。例如，提出了利用具有在K+离子的存在下摄取K+离子而形成特殊的结构的序列的核酸的金属离子传感器(J.AM.CHEM.SOC.2002，124，14286-14287)。将引起能量传递的荧光色素引入在核酸的两端。通常，色素之间存在距离，因此不会发生能量传递。但在K+离子的存在下核酸形成为特殊形态，因而通过荧光色素接近至引起能量传递的距离，可以观察到荧光。另外，也提出在肽上引入荧光色素的锌离子传感器(J.Am.Chem.Soc.1996，118，3053-3054)。通过使用由本发明的有机EL色素形成的标记色素代替这些以前的荧光色素，可以提供与以前相比高灵敏度且处理容易的金属离子传感器。还有，只要是存在于生物体内的金属离子，就可以检测所有的金属离子。
另外，也可以使用本发明的标记色素进行细胞内的信号的观察。对于内部信号或环境信息的细胞应答中，有从离子到酶的众多分子参与。已知在信号传递过程中特殊的蛋白激酶活化，引导特殊的细胞蛋白质的磷酸化，从而担负各种细胞应答的初始应答。核苷酸的结合和水解对它们的活性起到重大的作用，通过使用核苷酸衍生物，可以迅速观察到信号传递状态。例如，蛋白激酶C(PKC)在细胞膜的信号传递中起到重要的作用。该Ca+依赖性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在如甘油二酯或磷脂酰丝氨酸等构成膜的脂质上被激活，通过将存在于离子通道或细胞骨架蛋白质的丝氨酸或苏氨酸磷酸化，从而改变膜表面的电位，进行信号传递。通过对它们在活细胞中进行动态观察，由此可以进行细胞的信号传递的观察。
在这里，核苷酸衍生物被供作酶的底物或抑制剂，结合在孤立性蛋白质的结构和力学的探查、膜结合蛋白酶的再建、如线粒体等细胞器、如除膜肌纤维等组织的核苷酸结合蛋白质部分，进行其调节。另外，最近也逐步认识到如G蛋白的抑制剂或激活体等影响信号传递的化合物的存在。通过在该核苷酸衍生物中引入由本发明的有机EL色素形成的标记色素，可以高灵敏度且处理容易地进行它们的细胞内信号传递的动态观察。
另外，本发明的标记色素也可以使用在利用RNA干扰作用(RNAi)的基因表达状态的观察。RNAi是将RNA导入到细胞内后，具有与其相同的序列的基因的表达被敲减的现象。RNAi通过将双链RNA(dsRNA)导入到细胞内，分解靶基因的mRNA，抑制表达。已知在该过程中，最初长链dsRNA(double strand RNA)被具有核糖核酸酶活性的切酶剪切为21～23mer的短siRNA。生成的siRNA并入在中间复合物(RNA诱导的沉默复合物(RISC))中，该复合物进行对具有与并入的siRNA反义链互补的序列的mRNA的剪切。在该领域中，为了观察基因表达状况等也使用荧光色素。通过使用有机EL色素作为标记的荧光色素，可以进行稳定且高灵敏度的检测。
本发明的标记色素也可以用作在组织或细胞试样中的靶核酸或靶蛋白质的表达水平的研究中所使用的组织或细胞的染色色素。组织或细胞的染色可以如前所述通过介以反应性基团使有机El色素结合在靶核酸或靶蛋白质上。
即，本发明的染色色素，例如，如果将有机EL色素使用在真核细胞的染色，则在干燥状态下也可以发出荧光，因此在标记后的保存等方面表现出比以前的色素更好的性能。另外，不仅是在真核细胞，也完全可以用作细胞骨架用色素。除此之外，还可以用于线粒体、高尔基体、内质网、核糖体、脂质双层膜等的标记。这些标记了的细胞等可以在湿润或干燥的条件下进行观察，因此使用范围广。在观察时，可以使用荧光显微镜等。
另外，在临床阶段中从人体采取的组织用切片机等仪器切成薄膜后，进行染色。在这里，使用Cy色素以及Alexa色素。但是，目前的色素的稳定性非常差，因此复诊时需要重新制作样品。另外，制成的样品无法制成标本保存。但是，与上述的以前的色素相比，有机EL色素为非常稳定的色素，因此可以将染色了的组织制成标本来保存。
本发明的标记试剂盒包含具有由有机El色素形成的显色部、结合生物分子的结合部以及连接显色部和结合部的间隔部的标记色素，可以根据需要包含用于使色素与作为对象的生物分子进行反应的试剂、酶、溶剂等。作为对象的生物分子为核酸、蛋白质、肽类或糖类。
另外，本发明的另一种标记试剂盒包含至少具有由有机EL色素形成的显色部和结合在该显色部的前述的通式(I)表示的间隔部的标记色素前体，根据需要包含反应性基团引入试剂，该试剂用于在标记色素中引入选自羧基、异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、环氧基、卤代烷基、三嗪基、碳二亚胺基以及活性酯化的羰基任意一种反应性基团。
实施例
以下，利用实施例对本发明进一步进行详细说明，但本发明的范围不受限于以下的实施例。
合成例1
作为有机El色素，使用1，2，5-噁二唑-〔3，4-c〕吡啶衍生物。
以下，表示引入了作为间隔部的-COO-的噁二唑并〔3，4-c〕吡啶的活性酯体的反应例(流程图2和3)。还有，不具有间隔部的活性酯体略作EL-OSu，引入了间隔部的活性酯体略作EL-OSu-Sp。
Figure A20068003521800481
流程图2
然后，使噁二唑并吡啶活性酯体(6)在DMF中与丙氨酸反应，合成引入了间隔部的羧酸体(7)。之后，使羧酸体(7)在二噁烷中与N-羟基琥珀酰亚胺反应，合成引入了间隔部的噁二唑并吡啶活性酯体(8)。反应例示于下面。
Figure A20068003521800482
流程图3
每个步骤的反应都温和地进行，经由羧酸体(7)高收率地获得作为目标的活性酯体(8)。
(合成步骤)
(1)二酮衍生物(2)的合成
在500mL的三口烧瓶中，将37.5g(0.25mol)4-甲氧基苯乙酮(1)、0.15g亚硝酸钠溶解在100mL乙酸中。水浴中，用2小时滴入将100mL HNO3溶解在100mL乙酸中而得的混合物。其后，在室温搅拌2天。将反应混合物缓慢地投入到500mL的水中，使其生成沉淀。沉淀物过滤，溶解在氯仿中。用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤氯仿相，用10％NaCl溶液洗涤2次。用MgSO4脱水后，在减压下馏去氯仿，获得34.5g(收率78％)N-氧化噁二唑(2)。
(2)二酮衍生物(3)的合成
在500mL的三口烧瓶中，将17.7g(0.05mol)N-氧化噁二唑(2)溶解在400mL乙腈中。其中再添加12.0g Zn、7mL AcOH、20mL Ac2O。在水浴中以反应温度不超过30℃的条件下冷却。搅拌12小时后结束反应。过滤反应混合物，除去不溶成分。在减压下馏去乙腈，获得残渣。将残渣用氯仿重结晶，获得10.2g(收率60％)N-氧化噁二唑(3)。
(3)噁二唑并吡啶乙酯(4)的合成
500mL的三口烧瓶中，将15.6g(0.046mol)N-氧化噁二唑(3)溶解在300mL丁醇中，其中添加32.0g(0.23mol)甘氨酸乙酯盐酸盐。进行24小时的加热回流。在减压下馏去丁醇，获得残渣。将残渣溶解在200mL氯仿中，用10％HCl、饱和NaHCO3、10％NaCl洗净。用MgSO4干燥，馏去溶剂。将获得的残渣用氯仿重结晶，获得13.0g(收率70％)噁二唑并吡啶乙酯(4)。
(4)噁二唑并吡啶乙酯(4)的水解
在500mL三口烧瓶中，将3.0g(0.007mol)噁二唑并吡啶乙酯(4)溶解在200mL的乙醇中。其中添加0.62g(0.01mol)KOH。进行5小时的加热回流后，将反应混合物添加到200mL的水中，该水溶液中滴加浓盐酸至pH为1后，产生沉淀。过滤沉淀物，溶解在氯仿中。将氯仿相用10％NaHCO3水溶液、水洗净。馏去氯仿获得残渣。将残渣用水-乙醇(1∶1)重结晶，获得2.1g(收率81％)噁二唑并吡啶羧酸(5)。
(5)活性酯体(6)的合成
在50mL三口烧瓶中，将1.0g(0.0026mol)噁二唑并吡啶羧酸(5)和0.30g(0.0026mol)N-羟基琥珀酰亚胺溶解在20mL DMF中。向其中用30分钟滴入0.54g(0.0026mol)N，N’-二环己基碳二亚胺。滴入后，在室温搅拌30分钟。减压下，馏去DMF。将残渣采用硅胶柱色谱法(氯仿)分离提纯，获得0.76g(收率62％)噁二唑并吡啶活性酯体(6)。
(6)羧酸体(7)的合成
在50mL三口烧瓶中，将100mg(0.21mmol)噁二唑并吡啶活性酯体(6)和18.8mg(0.21mmol)丙氨酸溶解在20mL DMF中。然后，在室温搅拌12小时。反应结束后，减压下，馏去DMF。将残渣采用硅胶柱色谱法(氯仿-甲醇＝7∶3)分离提纯，获得83mg(收率88％)羧酸体(7)。
(7)活性酯体(8)的合成
接着，在50mL三口烧瓶中，将70mg(0.16mmol)噁二唑并吡啶羧酸体(7)和18.0mg(0.16mmol)N-羟基琥珀酰亚胺溶解在20mL DMF中。向其中用30分钟滴入32.2mg(0.16mmol)的溶解在5ml DMF中的N，N’-二环己基碳二亚胺。滴入后，在室温搅拌30小时。减压下，馏去DMF。将残渣采用硅胶柱色谱法(氯仿)分离提纯，获得75.8mg(收率89％)活性酯体(8)。
合成例2
作为有机El色素，使用咪唑并吡啶乙酯衍生物。以下表示引入了作为间隔部的-COO-的咪唑并吡啶乙酯的活性酯体的反应例(流程图4和5)。
Figure A20068003521800501
流程图4
接着，如合成例1的情况相同地，使咪唑并吡啶活性酯体(3)与丙氨酸反应，合成引入了间隔部的羧酸体(4)，使该羧酸体(4)在二噁烷中与N-羟基琥珀酰亚胺反应，合成引入了间隔部的咪唑并吡啶活性酯体(5)。反应例示于下面。
Figure A20068003521800511
流程图5
(1)咪唑并吡啶乙酯(1)的水解
在500mL三口烧瓶中，将0.5g(1.5mmol)酯体溶解在50mL乙醇中。其中添加0.12g(2.1mol)KOH。进行5小时的加热回流后，将反应混合物添加到50mL水中。在该水溶液中滴加浓盐酸至pH为1后，发生沉淀。过滤沉淀物，溶解在氯仿中。将氯仿相用10％NaHCO3水溶液、水洗净。馏去氯仿获得残渣。将残渣用水重结晶，获得0.3g(收率63％)的羧酸体(2)。
(2)活性酯体(3)的合成
在50mL三口烧瓶中，将0.2g(0.6mmol)羧酸衍生物(2)和0.07g(0.6mmol)N-羟基琥珀酰亚胺溶解在10mL DMF中。向其中用30分钟滴入0.12g(0.6mmol)N，N’-二环己基碳二亚胺。滴入后，在室温搅拌30小时。减压下，馏去DMF。将残渣采用硅胶柱色谱法(氯仿)分离提纯，获得0.14g(收率55％)活性酯体(3)。
(3)羧酸体(4)的合成
在50mL三口烧瓶中，将80mg(0.19mmol)咪唑并吡啶活性酯体(3)和17.3mg(0.19mmol)丙氨酸溶解在20mL DMF中。其后在室温搅拌10小时。反应结束后，减压下，馏去DMF。将残渣采用硅胶柱色谱法(氯仿-甲醇＝7∶3)分离提纯，获得58mg(收率78％)羧酸体(4)。
(4)活性酯体(5)的合成
接着，在50mL三口烧瓶中，将54mg(0.14mmol)咪唑并吡啶羧酸体(4)和16.1mg(0.14mmol)N-羟基琥珀酰亚胺溶解在20mL DMF中。向其中用30分钟滴入28.8mg(0.14mmol)的溶解在5ml DMF中的N，N’-二环己基碳二亚胺。滴入后，在室温搅拌30分钟。减压下，馏去DMF。将残渣采用硅胶柱色谱法(氯仿)分离提纯，获得62.2mg(收率92％)活性酯体(5)。
合成例3
作为有机El色素，使用合成例中使用的噁二唑并吡啶衍生物，间隔部使用半胱氨酸，作为反应性基团同时引入了活性酯化的羰基和作为阴离子性基团的锍基。使噁二唑并吡啶活性酯体(6)与半胱氨酸反应，合成引入了间隔部的羧酸体(9)。之后，使羧酸体(9)在二噁烷中与N-羟基琥珀酰亚胺反应，合成引入了间隔部的噁二唑并吡啶活性酯体(10)。反应例示于下面。
Figure A20068003521800521
流程图6
下面，仅表示与合成例1不同部分的合成步骤。
(1)羧酸体(9)的合成
在50mL三口烧瓶中，将100mg(0.21mmol)噁二唑并吡啶活性酯体(6)和39mg(0.23mmol)半胱氨酸溶解在20mL DMF中。然后，在室温搅拌12小时。反应结束后，减压下，馏去DMF。将残渣采用硅胶柱色谱法(氯仿-甲醇＝7∶3)分离提纯，获得98mg(收率88％)羧酸体(9)。
(2)活性酯体(10)的合成
接着，在50mL三口烧瓶中，将80mg(0.15mmol)噁二唑并吡啶羧酸体(9)和19mg(0.17mmol)N-羟基琥珀酰亚胺溶解在20mL DMF中。向其中用30分钟滴入35mg(0.17mmol)的溶解在5ml DMF中的N，N’-二环己基碳二亚胺。滴入后，在室温搅拌30分钟。减压下，馏去DMF。将残渣采用硅胶柱色谱法(氯仿∶甲醇＝10∶1)分离提纯，获得73mg(收率78％)活性酯体(10)。
合成例4
作为有机El色素，使用合成例1中使用的噁二唑并吡啶衍生物，间隔部使用丝氨酸。使噁二唑并吡啶活性酯体(6)与丝氨酸反应，合成引入了间隔部的羧酸体(11)。然后，使羧酸体(11)在二噁烷中与N-羟基琥珀酰亚胺反应，合成引入了间隔部的噁二唑并吡啶活性酯体(12)。
Figure A20068003521800531
流程图7
下面，仅表示与合成例1不同的部分的合成步骤。
(1)羧酸体(11)的合成
在50mL三口烧瓶中，将100mg(0.21mmol)噁二唑并吡啶活性酯体(6)和26mg(0.25mmol)丝氨酸溶解在20mL DMF中。然后，在室温搅拌12小时。反应结束后，减压下，馏去DMF。将残渣采用硅胶柱色谱法(氯仿-甲醇＝7∶3)分离提纯，获得79mg(收率81％)羧酸体(12)。
(2)活性酯体(12)的合成
接着，在50mL三口烧瓶中，将70mg(0.15mmol)噁二唑并吡啶羧酸体(11)和19mg(0.17mmol)N-羟基琥珀酰亚胺溶解在20mL DMF中。向其中用30分钟滴入35mg(0.17mmol)的溶解在5ml DMF中的N，N’-二环己基碳二亚胺。滴入后，在室温搅拌30分钟。减压下，馏去DMF。将残渣采用硅胶柱色谱法(氯仿∶甲醇＝10∶1)分离提纯，获得61mg(收率72％)活性酯体(12)。
合成例5
作为有机EL色素，使用合成例1中使用的噁二唑并吡啶衍生物，间隔部使用作为肽连接基的丙氨酰丝氨酸(Ala-Ser)。使噁二唑并吡啶活性酯体(6)与丙氨酰丝氨酸反应，合成引入了间隔部的羧酸体(13)。然后，使羧酸体(13)在二噁烷中与N-羟基琥珀酰亚胺反应，合成引入了间隔部的噁二唑并吡啶活性酯体(14)。反应例示于下面。
流程图8
下面，近表示与合成例1不同的部分的合成步骤。
(1)羧酸体(13)的合成
在50mL三口烧瓶中，将100mg(0.21mmol)噁二唑并吡啶活性酯体(6)和45mg(0.25mmol)丙氨酰丝氨酸溶解在20mL DMF中。然后，在室温搅拌10小时。反应结束后，减压下，馏去DMF。将残渣采用硅胶柱色谱法(氯仿-甲醇＝6∶4)分离提纯，获得72mg(收率64％)羧酸体(13)。
(2)活性酯体(14)的合成
接着，50mL三口烧瓶中，将60mg(0.11mmol)噁二唑并吡啶羧酸体(13)和14mg(0.12mmol)N-羟基琥珀酰亚胺溶解在20mL DMF中。向其中用30分钟滴入25mg(0.12mmol)的溶解在5ml DMF中的N，N’-二环己基碳二亚胺。滴入后，在室温搅拌15小时。减压下，馏去DMF。将残渣采用硅胶柱色谱法(氯仿∶甲醇＝8∶2)分离提纯，获得60mg(收率86％)活性酯体(14)。
合成例6
作为有机El色素，使用合成例1中使用的噁二唑并吡啶衍生物，间隔部使用乙醇酸。反应式示于下面。
Figure A20068003521800551
流程图9
(1)酰氯体(15)的合成
在50mL三口烧瓶中，将100mg(0.27mmol)噁二唑并吡啶羧酸体(5)混合在20mL SOCl2中，进行2小时的加热回流。冷却至室温，馏去SOCl2，获得94mg(Y.90％)酰氯体15。
(2)羧酸体(16)的合成
在100mL三口烧瓶中，将90mg(0.22mmol)噁二唑并吡啶酰氯体(15)混合在40mL THF中。向其中投入20mg(0.22mmol)的溶解在5mL THF的乙醇酸，搅拌1小时。然后，馏去THF。将残渣用甲醇重结晶，获得61mg(Y.62％)羧酸体16。
(3)活性酯体(17)合成
接着，在50mL三口烧瓶中，将100mg(0.22mmol)噁二唑并吡啶羧酸体(16)和29mg(0.24mmol)N-羟基琥珀酰亚胺溶解在25mL DMF中。向其中经30分钟滴入50mg(0.24mmol)的溶解在10mL DMF中的N，N’-二环己基碳二亚胺。滴入后，在室温搅拌15小时。减压下，馏去DMF。将残渣采用硅胶柱色谱法(氯仿∶甲醇＝7∶3)分离提纯，获得107mg(收率89％)活性酯体(17)。
合成例7
作为有机El色素，使用合成例1中使用的噁二唑并吡啶衍生物，间隔部使用氨基乙磺酸，合成合成例3的噁二唑并吡啶活性酯体(10)。
将0.48g[1.08mmol]噁二唑并吡啶活性酯体(6)和0.52g DCC等杂质、0.43g[3.44mmol]氨基乙磺酸(M.W.：125.15)放入至100mL的茄形烧瓶中，再添加50mL无水DMF。接着添加715μl[514mmol]三乙胺(TEA，M.W.：101.19、1L≈0.73kg)，搅拌4小时。这时，通过TLC[CHCl3∶MeOH＝6∶4，原料Rf＝0.89，目标物Rf＝0.69]、TLC[CHCl3∶MeOH＝7∶3，原料Rf＝0.89，目标物Rf＝0.49]确认，结果反应大致在2小时后结束。
减压馏去DMF后，采用硅胶柱色谱法(CHCl3∶MeOH＝3∶1)提纯并分取目标物后，分离的溶液中产生了结晶，因此加以过滤。将获得的结晶采用HPLC(图3)、TLC法确认，结果为目标物。收量为283mg(收率58％)。
实施例1
<寡聚DNA的色素标记以及检测(1)>
(寡聚DNA)
使用的寡聚DNA如下。
17mer DNA H2N-(C6)-5′-ACT CCA GTG GTA ATC TA-3′
20mer DNA H2N-(C6)-5′-ACT CCA GTG GTA ATC TAC TG-3′
40mer DNA H2N-(C6)-5′-ACT CCA GTG GTA ATC TAC TGG GACGGA ACA GCT TTG AGG T-3′
(标记步骤)
标记色素使用合成例1中合成的噁二唑并吡啶活性酯体8(EL-OSu-Sp)。对于寡聚DNA使用20mer DNA的例子进行说明。
在20μl的含有H2N-(C6)-5′-ACT CCA GTG GTA ATC TAC TG-3′(10mmol)硼酸缓冲液(pH8.5)中，加入80μl的含有12nmol(5.7μg)(1.2当量)活性酯体(EL-OSu-Sp)的DMSO溶液，在室温振荡6小时。振荡后，加入0.1M TEAA(三乙胺乙酸盐，triethylamine acetate)缓冲液(pH7.0)，使得总量达到1mL，用NAP-10柱(GE医疗集团(GE healthcare)Sephadex G-25)分取来源于寡聚核苷酸的成分。这时，NAP-10柱预先用15mL的0.1M TEAA缓冲液平衡后使用。将搅匀的试样填充在柱子中，使得总量达到1mL，洗脱1mL溶液后，填充1.5mL 0.1M TEAA缓冲液。分取紧接着的1.5mL洗脱液。将获得的100μl溶液采用反相HPLC法进行分析。
还有，为了进行比较，用不含间隔部的噁二唑并吡啶活性酯体(EL-OSu)进行寡聚DNA标记。另外，也将分子探针公司(Molecular Probe社)制的Alexa594的活性酯体用于部分比较。
(HPLC测定条件)
HPLC装置使用日本分光株式会社(日本分光(株))制的LC-2000plus系列。
柱：GL科技公司(GL Science)Inertsil ODS-3柱5μm，4.6mm×250mm
DNA梯度条件
洗脱溶剂A：0.1M TEAA水溶液(pH7.0)
洗脱溶剂B：90％CH3CN/0.1M TEAA水溶液(pH7.0)
梯度(B％)0分钟(10％)→30分钟(45％)→40分钟(100％)→50分钟(100％)→60分钟(10％)
流速  1mL/分钟
温度  40℃
(结果)
将用EL-OSu或EL-OSu-Sp标记的寡聚DNA的HPLC的结果，对应于17merDNA、20mer DNA、40mer DNA，示于图4A～4B、图5A～5C、图6A～6B。另外，将标记率的值示于表1～3。
[表1]
Figure A20068003521800571
[表2]
[表3]
Figure A20068003521800573
接着，用17mer DNA，考察使与EL-OSu-Sp的比例在以下范围内变化时的标记率的变化。结果示于图7。
通过使用引入了间隔部的标记色素EL-OSu-Sp，与不含间隔部的EL-OSu-Sp或Alexa594相比，可以提高标记率。特别是，如果是20mer左右长度的寡聚DNA，则以1.2倍添加量，相对于EL-OSu的约12％、Alexa的痕量(1％以下)，可以获得几乎达到100％的标记率。另外，17mer或40mer DNA难以用Alexa进行标记，但也可以对这些寡聚DNA大大提高标记率。即使是摩尔比为1.2左右，也可以获得几乎100％的标记率，因此引入了间隔部的标记色素EL-OSu-Sp可以对寡聚DNA进行定量标记。使用Alexa等以前的标记色素时，即使添加200倍摩尔左右也只能达到50％左右的标记率，若考虑到这一点，如果是20mer左右长度的寡聚DNA，则引入了间隔部的标记色素EL-OSu-Sp具有以大约1/200的添加量可以获得100％的标记率的显著效果。
实施例2
<寡聚DNA的色素标记以及检测(2)>
除了有机EL色素使用具有间隔部的咪唑并吡啶的活性酯体5(im-EL-OSu-Sp)以外，采用与实施例1相同的方法对20mer DNA进行色素标记。
(结果)
与使用噁二唑并吡啶活性酯体(EL-OSu-Sp)的情况相同，摩尔比为1.2左右也可以获得几乎100％的标记率。
实施例3
<寡聚DNA的色素标记以及检测(3)>
除了有机EL色素使用合成例3中合成的具有间隔部的噁二唑并吡啶活性酯体10，使用10μl的DMSO而使其占总试样溶液的10体积％以外，采用与实施例1相同的方法，进行对20mer DMA的色素标记。
(结果)
与使用噁二唑并吡啶活性酯体8的情况相同，以摩尔比1.2左右也可以获得几乎100％的标记率。还有，在实施例1中，为了溶解有机El色素，使DMSO占总试样溶液的80体积％，但在本实施例中10体积％也可以溶解有机El色素，表现出良好的水溶性。
实施例4
<寡聚DNA的色素标记以及检测(4)>
除了有机EL色素使用合成例4中合成的具有间隔部的噁二唑并吡啶活性酯体12，使用10μl的DMSO而使其占总试样溶液的10体积％以外，采用与实施例1相同的方法，进行对20mer DMA的色素标记。
(结果)
与使用噁二唑并吡啶活性酯体8的情况相同，以摩尔比1.2左右也可以获得几乎100％的标记率。另外，与实施例3的情况相同，表现出良好的水溶性。
实施例5
<寡聚DNA的色素标记以及检测(5)>
除了有机EL色素使用合成例5中合成的具有间隔部的噁二唑并吡啶活性酯体14，使用10μl的DMSO而使其占总试样溶液的10体积％以外，采用与实施例1相同的方法，进行对20mer DMA的色素标记。
(结果)
与使用噁二唑并吡啶活性酯体8的情况相同，以摩尔比1.2左右也可以获得几乎100％的标记率。还有，在实施例1中，为了溶解有机El色素，使DMSO占总试样溶液的80体积％，但在本实施例中10体积％也可以溶解有机El色素，表现出良好的水溶性。
实施例6
<蛋白质的色素标记以及检测(1)>
(标记顺序)
使BSA(牛血清白蛋白，Bovine Serium Albumin)的丝氨酸残基的氨基和含有间隔部的噁二唑并吡啶活性酯体8(EL-OSu-Sp)反应形成酰胺键，进行对BSA的色素标记。具体地，在100μl的含有1.0mg(15.05nmol)的BSA的碳酸缓冲液(pH9.0)中，添加400μl的含有35.82μg(75.25nmol)活性酯体的DMSO溶液，在室温振荡24小时。之后添加0.1M TEAA缓冲液(pH7.0)使得总量为1mL，用NAP-10柱(GE医疗集团(GE healthcare)Sephadex G-25)分取1.5mL来源于BSA的成分。将100μl获得的溶液采用反相HPLC法进行分析。
还有，通过MALDI TOF MS，进行用EL-OSu标记的BSA的鉴定。标记了的BSA(图9A)与原料(图9B)相比，分子量增加2200左右，得知结合了约5分子有机El色素。
(HPLC测定条件)
HPLC装置使用日本分光株式会社(日本分光(株))制的LC-2000plus系列。
柱：GL科技公司(GL Science)Inertsil ODS-3柱5μm，4.6mm×250mm
DNA梯度条件
洗脱溶剂A：0.1M TEAA水溶液(pH7.0)
洗脱溶剂B：90％CH3CN/0.1M TEAA水溶液(pH7.0)
梯度(B％)0分钟(5％)→20分钟(50％)→60分钟(70％)→70分钟(100％)→80分钟(100％)→90分钟(5％)
流速0分钟→20分钟、60分钟→90分钟：1mL/分钟、20分钟→60分钟：0.5mL/分钟
温度40℃
(结果)
将用不具有间隔部的EL-OSu和具有间隔部的EL-OSu-Sp标记的BSA的HPLC的结果分别示于图8A和图8B。标记率示于表4。
[表4]
Figure A20068003521800601
以BSA为对象时，通过使用具有间隔部的EL-OSu-Sp，与使用不具有间隔部的EL-OSu的情况相比，可以大大提高标记率。认为通过在作为反应性基团的活性酯和色素分子之间引入间隔部，BSA的标记部位和色素分子之间的位阻进一步被消除，因此标记率提高。另外，由TOF-MASS的测定结果确认，用EL-OSu-Sp标记的BSA上引入了5分子的有机EL色素。EL-OSu-Sp的情况下，为了引入5分子而使用5倍摩尔时，大体上可以进行定量标记。
实施例7
<蛋白质的色素标记以及检测(2)>
除了有机El色素使用合成例3中合成的具有间隔部的噁二唑并吡啶活性酯体10，使用10μl的DMSO而使其占总试样溶液的10体积％以外，采用与实施例5相同的方法，进行对BSA的色素标记。
(结果)
获得与实施例5相同的标记率。还有，在实施例5中，为了溶解有机El色素，使DMSO占总试样溶液的80体积％，但在本实施例中即使是10体积％也可以溶解有机El色素，表现出良好的水溶性。
实施例8
<蛋白质的色素标记以及检测(4)>
除了有机El色素使用合成例4中合成的具有间隔部的噁二唑并吡啶活性酯体12，使用10μl的DMSO而使其占总试样溶液的10体积％以外，采用与实施例5相同的方法，进行对BSA的色素标记。
(结果)
获得与实施例5相同的标记率。还有，在实施例5的情况相同，表现出良好的水溶性。
实施例9
<蛋白质的色素标记以及检测(5)>
除了有机El色素使用合成例5中合成的具有间隔部的噁二唑并吡啶活性酯体14，使用10μl的DMSO而使其占总试样溶液的10体积％以外，采用与实施例5相同的方法，进行对BSA的色素标记。
(结果)
获得与实施例5相同的标记率。还有，在实施例5中，为了溶解有机El色素，使DMSO占总试样溶液的80体积％，但在本实施例中即使是10体积％也可以溶解有机El色素，表现出良好的水溶性。
实施例10
<蛋白质的色素标记以及检测(6)>
除了有机El色素使用合成例6中合成的具有间隔部的噁二唑并吡啶活性酯体17，使用10μl的DMSO而使其占总试样溶液的10体积％以外，采用与实施例5相同的方法，进行对BSA的色素标记。
(结果)
获得与实施例5相同的标记率。还有，本实施例5中也表现出良好的水溶性。
如上所述，如果利用本发明的标记色素，则不仅在固体状态下也具有高荧光强度，还可以大幅度减少对靶分子使用的色素量。例如，使用以前的标记色素时，200倍摩尔左右为常识，但可以将其降低至1/200左右。由此，可以大幅度减少使用的标记色素的量，因此也可以大幅度降低靶分子的检测费用。另外，标记反应后，也可以不需要除去未反应的大量的色素的步骤，可以用更短的时间实施检测方法。

Claims (34)

1.生物分子用标记色素，它是用于基于荧光测定的生物分子检测的标记色素，其特征在于，具有由有机EL色素形成的显色部、结合生物分子的结合部以及连接显色部和结合部的间隔部。
2.如权利要求1所述的生物分子用标记色素，其特征在于，所述有机EL色素为由包含一种以上的杂原子、硒原子或硼原子的五元环化合物与具有共轭体系的六元环化合物形成的稠合多环化合物。
3.如权利要求2所述的生物分子用标记色素，其特征在于，所述稠合多环化合物为由下述通式(1)、(2)或(3)的任意一种表示的吡咯衍生物；
Figure A20068003521800021
式中，R1、R2、R3、R4分别独立地表示氢原子，卤素原子，可具有烷基、链烯基、炔基、烷氧基、羟基、氰基、磺酰基、芳族烃基、杂环基等取代基的芳族烃基、烃基或杂环基；X表示可具有取代基的氮原子、硫原子、氧原子、硒原子或硼原子；R’表示可含芳环的烷基或链烯基等脂肪族烃基或芳族烃基；An-表示Cl-、Br-、I-等卤化物离子，CF3SO3 -，BF4 -，PF6 -。
4.如权利要求3所述的生物分子用标记色素，其特征在于，所述的R2和R3分别独立地为选自噻吩衍生物、呋喃衍生物、吡咯衍生物、咪唑衍生物、噁唑衍生物、噻唑衍生物、吡唑衍生物以及吡啶衍生物的一种。
5.如权利要求3所述的生物分子用标记色素，其特征在于，所述的R2和R3为具有磺酰基的芳基。
6.如权利要求2所述的生物分子用标记色素，其特征在于，所述稠合多环化合物为由以下的通式(4)、(5)、(6)、(7)或(8)表示的咪唑衍生物；
Figure A20068003521800031
式中，R1、R2、R3、R4、R5分别独立地表示氢原子，卤素原子，可具有烷基、链烯基、炔基、烷氧基、羟基、氰基、磺酰基、芳族烃基、杂环基等取代基的芳族烃基、烃基或杂环基；R1、R2、R3、R4、R5可相同或不同；R’、R”表示可含有芳环的烷基或链烯基等脂肪族烃或芳族烃；An-表示Cl-、Br-、I-等卤化物离子，CF3SO3 -，BF4 -，PF6 -。
7.如权利要求6所述的生物分子用标记色素，其特征在于，所述的R2和R3分别独立地为选自噻吩衍生物、呋喃衍生物、吡咯衍生物、咪唑衍生物、噁唑衍生物、噻唑衍生物、吡唑衍生物以及吡啶衍生物的一种。
8.如权利要求6所述的生物分子用标记色素，其特征在于，所述的R2和R3为具有磺酰基的芳基。
9.如权利要求1～8中任一项所述的生物分子用标记色素，其特征在于，所述结合部具有选自羧基、异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、环氧基、卤代烷基、三嗪基、碳二亚胺基以及活性酯化的羰基的任意一种反应性基团。
10.如权利要求1～9中任一项所述的生物分子用标记色素，其特征在于，所述间隔部含有至少一种选自-CH2-、-NHCOO-、-CONH-、-CH2NH-、-CH2NR-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(＝NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-、-(CH2-CH2-O)n-、-CH＝CH-、-C≡C-、-Ar-以及-CO-Ar-NR-的官能团；R为烷基，n为1～10的整数。
11.如权利要求10所述的生物分子用标记色素，其特征在于，所述间隔部为由以下的通式(I)表示的化合物，
-(CHR′)p-X-(CHR″)q-    (I)
式中，X表示直接结合或选自-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(＝NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-、-CH＝CH-、-C≡C-、-Ar-以及-CO-Ar-NR-的至少一种官能团；R’和R”分别独立地表示氢原子，或者可含有芳环的烷基或链烯基等脂肪族烃基，或芳族烃基中根据需要取代有选自磺酰基、羟基、季铵基以及羧基的任意一种带电基团的基团；Ar表示芳基；p和q分别独立地表示0～20的整数；p+q≥1。
12.如权利要求10所述的生物分子用标记色素，其特征在于，所述间隔部为氨基酸或由2～20个氨基酸形成的肽连接基。
13.如权利要求12所述的生物分子用标记色素，其特征在于，所述间隔部为氨基酸，所述氨基酸为天然氨基酸或合成氨基酸。
14.如权利要求13所述的生物分子用标记色素，其特征在于，所述氨基酸为选自半胱氨酸、2-氨基-3-磺基硫代丙酸、2-氨基-3-磺酰基丙酸、酪氨酸、苏氨酸、4-氨基-2-羟基丁酸、高丝氨酸、丝氨酸的一种。
15.如权利要求12所述的生物分子用标记色素，其特征在于，所述间隔部为肽连接基，所述肽连接基具有选自磺酰基、羟基、季铵基以及羧基的至少一种带电基团。
16.如权利要求15所述的生物分子用标记色素，其特征在于，所述肽连接基包含选自半胱氨酸、2-氨基-3-磺基硫代丙酸、2-氨基-3-磺酰基丙酸、酪氨酸、苏氨酸、4-氨基-2-羟基丁酸、高丝氨酸、丝氨酸的至少一种氨基酸。
17.生物分子用标记试剂盒，它是用于基于荧光测定的生物分子的检测的生物分子用标记试剂盒，其特征在于，包含具有由有机EL色素形成的显色部、结合生物分子的结合部以及连接显色部和结合部的间隔部的标记色素。
18.生物分子用标记试剂盒，它是用于基于荧光测定的生物分子的检测的生物分子用标记试剂盒，其特征在于，包含至少具有由有机EL色素形成的显色部、结合在所述显色部的间隔部的标记色素前体，所述间隔部包含至少一种选自-CH2-、-NHCOO-、-CONH-、-CH2NH-、-CH2NR-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(＝NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-、-(CH2-CH2-O)n-、-CH＝CH-、-C≡C-、-Ar-以及-CO-Ar-NR-的官能团；R为烷基，n为1～10的整数。
19.如权利要求17或18所述的生物分子用标记试剂盒，其特征在于，还包含反应性基团引入试剂，所述试剂用于将选自羧基、异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、环氧基、卤代烷基、三嗪基、碳二亚胺基以及活性酯化的羰基的任意一种反应性基团引入至标记色素中。
20.生物分子的检测方法，其特征在于，使具有由有机EL色素形成的显色部、结合生物分子的结合部以及连接显色部和结合部的间隔部的标记色素与生物分子试样反应，测定通过所述标记色素标记了的生物分子试样的荧光。
21.如权利要求20所述的检测方法，其特征在于，所述生物分子试样使用选自核酸、蛋白质、肽类以及糖类的任意一种。
22.检测方法，其特征在于，使用具有由有机EL色素形成的显色部、结合生物分子的结合部以及连接显色部和结合部的间隔部的标记色素标记了的探针与生物分子试样反应，测定所述生物分子试样的荧光。
23.如权利要求22所述的检测方法，其特征在于，所述生物分子试样为核酸，所述探针使用与所述核酸的碱基序列互补的寡核苷酸或PNA。
24.如权利要求23所述的检测方法，其特征在于，所述寡核苷酸为引物或终止子，扩增所述核酸，测定荧光。
25.如权利要求24所述的检测方法，其特征在于，所述核酸扩增之前用有机EL色素标记引物。
26.如权利要求23所述的检测方法，其特征在于，所述寡核苷酸或PNA为分子信标。
27.生物分子的检测方法，它是由生物分子形成的被检测体或被修饰物质修饰了的所述被检测体的检测方法，其特征在于，将与被检测体特异结合的结合物质或与修饰物质特异结合的结合物质的一方，用具有由有机EL色素形成的显色部、结合生物分子的结合部以及连接显色部和结合部的间隔部的标记色素标记，测定发自标记了的结合物质的荧光。
28.如权利要求27所述的检测方法，其特征在于，所述的被检测体或修饰物质和所述结合物质的组合为抗原-抗体、半抗原-抗半抗原抗体、生物素-抗生物素蛋白、标签-抗标签抗体、凝集素-糖蛋白或激素-受体。
29.生物分子的检测方法，其特征在于，包含将生物分子试样通过电泳大小分离的步骤，在该电泳之前或之后将生物分子用具有由有机EL色素形成的显色部、结合生物分子的结合部以及连接显色部和结合部的间隔部的标记色素标记。
30.如权利要求29所述的检测方法，其特征在于，所述生物分子试样为核酸，根据电泳图确定所述核酸的碱基序列。
31.如权利要求29所述的检测方法，其特征在于，所述生物分子试样为蛋白质，根据电泳图对取出的蛋白质进行质量分析。
32.组织或细胞的染色方法，其特征在于，将组织或细胞试样中的生物分子用具有由有机EL色素形成的显色部、结合生物分子的结合部以及连接显色部和结合部的间隔部的标记色素标记。
33.如权利要求32所述的染色方法，其特征在于，所述生物分子为核酸或蛋白质。
34.染色色素，它是用于组织或细胞试样的染色色素，其特征在于，由具有由有机EL色素形成的显色部、结合组织或细胞中的生物分子的结合部以及连接显色部和结合部的间隔部的标记色素形成。
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