TW201525142A - 關於用於溶酶體儲積症之測試的化合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供受質，其包括適用於偵測諸如溶酶體儲積酶之酶的活性的化合物，其中受質包括：糖部分；使糖部分與受質之其餘結構結合的連接子部分；及兩個或兩個以上脂肪酸鏈或其衍生物，其中至少一者經足夠結構化以提供水性或有機溶劑系統中之改良溶解性。亦提供受質使用方法，其係用於使用本發明受質偵測酶活性。

Description

關於用於溶酶體儲積症之測試的化合物及方法 相關申請案之交叉引用
本申請案依附於2013年3月15日申請之美國臨時申請案第61/789,985號且主張其優先權，該案之全部內容以引用的方式併入本文中。
本發明係關於用於偵測溶酶體酶活性之偵測酶活性的分析試劑。
溶酶體儲積症為一組遺傳病症，其特性在於體內特定酶缺乏，從而導致身體不能分解代謝物質。作為一實例，法布里病(Fabry disease)為一種每40,000人中可見一例之溶酶體儲積症。其由酶α-半乳糖苷酶缺乏引起，從而導致身體不能分解稱為神經醯胺三己糖苷之特定脂肪物質。第二實例為高歇病(Gaucher disease)，一種由不能分解稱為葡糖神經醯胺(亦稱為葡糖腦苷脂)之脂肪物質或脂質引起的溶酶體儲積症。患有高歇病之個體不製備葡糖腦苷脂酶，一種為分解此等脂肪物質所需之酶。此等脂肪物質隨後在肝、脾及骨髓之細胞中積累。第三實例為龐貝病(Pompe disease)，一種由酶酸性α-葡糖苷酶缺乏引起的溶酶體儲積症，該酶為分解稱為肝糖之某些糖所需。當酶酸性α-葡糖苷酶損失時，肝糖在體內各種組 織及器官中積累。
在大多數情況下，溶酶體儲積症為兒童病症，但一些亦在成人中表現。在其中大多數情況下，患者在出生時正常且在某一後續時間開始發生進行性神經劣化。臨床表型取決於生物化學缺陷之類型及嚴重性。此等溶酶體病症中有一些(諸如龐貝病及克拉伯病(Krabbe disease))主要在幼兒期表現。正努力開發在臨床症狀發作前偵測該等病症以使得可起始治療性介入之方法。
在過去十年中，測試代謝失調之實驗室向其新生兒篩檢程式中引入串聯質譜。串聯質譜繼續在臨床中盛行，因為此技術使得可分析單一樣品中之諸多代謝物。舉例而言，此技術已作為常規臨床實踐實施以使用乾血點樣品偵測新生兒之遺傳性代謝失調。儘管溶酶體酶活性可使用串聯質譜定量，但已公開之分析方法由於溶解性問題及需要併入外標而有點難以適應於臨床環境。
由此，仍需要改良用於偵測溶酶體病症之方法及組成物。
提供以下發明內容以有助於理解本發明獨特之一些創新特徵且不欲為完整描述。完全瞭解本發明之各種態樣可藉由將整個說明書、申請專利範圍、圖式及摘要視為整體獲得。
提供使用偵測系統(諸如質譜)偵測酶促反應之改良組成物及方法。此等組成物提供於水性溶劑系統中之改良溶解性及/或與目標酶之改良反應性，從而改良分析效率、再現性及準確度。
本發明提供適用於評定樣品中溶酶體酶活性水準之化合 物。測試溶酶體酶活性適用於例如篩檢新生兒之代謝失調以及評定患有影響酶活性之醫學病狀的個體或進行醫學治療(諸如酶替代療法、基因療法或骨髓移植)之個體。本文所述之化合物包括目標酶之受質及適用作酶分析中之對照或標準物的相關分子。
本發明之一個目的為提供適用於偵測酶(說明性實例為缺乏會引起溶酶體儲積症之酶)之活性的受質。提供具有如下通式之受質：
其中A為單醣或二醣；B1為：C1-C20烷基；含有雜原子之C1-C20烷基、C2-C20烯基；含有雜原子之C2-C20烯基、經取代或未經取代之C6-C20芳基；B2為：C2-C7胺甲酸乙酯；C2-C7醯胺基、C2-C7酯、C2-C7脲基(uriedo)；C2-C7胺甲醯基；C2-C7羰基；C1-C7烷基；含有雜原子之C1-C7烷基；具有取代基N、O或S之C1-C7烷基；C2-C7烯基；含有雜原子之C2-C7烯基；具有取代基N、O或S之C2-C7烯基；且B3為：C1-C20烷基、含有雜原子之C1-C20烷基；具有取代基N、O或S之C1-C20烷基；C4-C20醚；C1-C20酯；C1-C20烯基；含有雜原子之C1-C20烯基；具有取代基N、O或S之C2-C20烯基；C1-C20炔基；含有雜原子之C1-C20炔基；具有取代基N、O或S之C2-C20炔基；C6-C20芳基；及含有雜原子N、O或S之C6-C20雜環。取代基N、O或S視情況獨立地為羥基、胺基、硫醇、醚、硫醚或二級胺。在一些具體實例中，A為醛己醣或酮己醣，其視情況經由α或β糖苷鍵連接於分子之其餘部分。視情況，A為D-葡萄糖或D-半乳糖。B1部分視情況為亞甲基或C2烷基。B2部分視情況為C2-C7醯胺基。B3部分視情況為具有取代基N、O或S之C2-C20烯基。 在一些具體實例中，受質中所包括之A為D-葡萄糖或D-半乳糖；B1為亞甲基；B1為C2-C7醯胺基；且B3為具有以羥基形式存在之取代基O的C13-C20烯基。
亦提供通式II化合物，
其類似地適用作偵測溶酶體儲積症之受質。根據式II，A為醛己醣或酮己醣；R1為C1-C6烷基或C2-C20烯基；且R2為C1-C20烷基、具有取代基N、O或S之C1-C20烷基、C1-C20烯基或具有取代基N、O或S之C1-C20烯基。應瞭解，R1或R2可為視情況含有N、O或S之取代或取代基N、O或S之C1-C20炔基。在一些具體實例中，式II之受質所包括之A為D-葡萄糖或D-半乳糖，R1為C4-C6烷基，且R2為C13-C20烷基、具有取代基N、O或S之C13-C20烷基、C13-C20烯基或具有取代基N、O或S之C13-C20烯基。視情況，R2為C13烷基。
亦提供適用於偵測溶酶體儲積症之存在或不存在或簡單地偵測酶之存在或不存在的受質，其包括式III之結構：
其中A為單醣或二醣；B1為：C1-C20烷基；含有雜原子之C1-C20烷基、C2-C20烯基；含有雜原子之C2-C20烯基；及經取代或未經取代之 C6-C20芳基；R1'為經取代或未經取代之C或N；R2'為經取代或未經取代之C、經取代或未經取代之N、O或S；R3'為經取代或未經取代之C、N或O；R4'為不存在、經取代或未經取代之C1-C2、O或S；R1為：C1-C6烷基；含有雜原子之C1-C7烷基：具有取代基N、O或S之C1-C7烷基；C2-C7烯基；含有雜原子之C2-C7烯基；具有取代基N、O或S之C2-C7烯基；R5'為不存在、經取代或未經取代之C1-C2；O或S；且R6'為C1-C20烷基、含有雜原子之C1-C20烷基；具有取代基N、O或S之C1-C20烷基；C4-C20醚；C1-C20酯；C1-C20烯基；含有雜原子之C1-C20烯基；具有取代基N、O或S之C2-C20烯基；C6-C20芳基；及含有雜原子N、O或S之C6-C20雜環。A視情況為醛己醣或酮己醣，其視情況經由α或β糖苷鍵連接於分子之其餘部分。視情況，A為D-葡萄糖或D-半乳糖。在一些具體實例中，式III之受質為： ，其中R2'為經取代或未經取代之C或經取代或未經取代之N； ；其中R2"為H或甲基且R2'''為H或甲基；或，其中R3'為經取代或未經取代之C；且R4'為不存在、經取代或未經取代之C1-C2、O或S。
應瞭解，在上文或其他部分中之任一者中包括的本發明受質中，A視情況為醛己醣或酮己醣，其視情況經由α或β糖苷鍵連接於分子之其餘部分。視情況，A為D-葡萄糖或D-半乳糖。
在一些具體實例中，式III之受質包括：，其中R2'為經取代或未經取代之C或經取代或未經取代之N；且R6'為C1-C20烷基、含有雜原子之C1-C20烷基；具有取代基N、O或S之C1-C20烷基；C4-C20醚；C1-C20酯；C1-C20烯基；含有雜原子之C1-C20烯基；具有取代基N、O或S之C2-C20烯基；C6-C20芳基；及含有雜原子N、O或S之C6-C20雜環； ，其中R2'為經取代或未經取代之C或經取代或未經取代之N；R2為C13-C20烷基、含有雜原子之C13-C20烷基、具有取代基N、O或S之C13-C20烷基；C13-C20烯基、含有雜原子之C13-C20烯基；或具有取代基N、O或S之C13-C20烯基；或，其中R2為C13-C20烷基、含有雜原子之C13-C20烷基、具有取代基N、O或S之C13-C20烷基；C13-C20烯基、含有雜原子之C13-C20烯基；或具有取代基N、O或S之C13-C20烯基。在上文或其他部分中之任一者中包括的本發明受質中，A視情況為醛己醣或酮己醣，其視情況經由α或β糖苷鍵連接於分子之其餘部分。視情況，A為D-葡萄糖或D-半乳糖。
亦提供如下受質，其包括：，其中n為0、1、2、3、4或5。A視情況為醛己醣或酮己醣，其視情況經由α或β糖苷鍵連接於分子之其餘部分。視情況，A為D-葡萄糖或D-半乳糖。
任何本發明受質視情況包括元素之穩定次級分佈同位素或其他標記物。在一些具體實例中，穩定次級分佈同位素在每次出現時選自由2H、13C、15N、17O、18O、31P或34S組成之群。
本發明之另一目的在於提供可用作酶功能抑制劑、用作偵測酶活性之方法的內標或用作治療劑的分子。該等分子視情況包括式V之結構：
其中B1選自由以下組成之群：C1-C20烷基、含有雜原子之C1-C20烷基、C2-C20烯基、含有雜原子之C2-C20烯基、經取代或未經取代之C6-C20芳基；B2選自由以下組成之群：C2-C7胺甲酸乙酯；C2-C7醯胺基；C2-C7酯；C2-C7脲基；C2-C7胺甲醯基；C2-C7羰基；C1-C7烷基；含有雜原子之C1-C7烷基；具有取代基N、O或S之C1-C7烷基；C2-C7烯基；含有雜原子之C2-C7烯基；具有取代基N、O或S之C2-C7烯基；且B3選自由以下組成之群：C1-C20烷基、含有雜原子之C1-C20烷基；具有取代基N、O或S之C1-C20烷基；C4-C20醚；C1-C20酯；C1-C20烯基；含有雜原子之C1-C20烯基；具有取代基N、O或S之C2-C20烯基；C1-C20炔基；含有雜原子之C1-C20炔基；具有取代基N、O或S之C2-C20炔基；C6-C20芳基；及含有雜原子N、O或S之C6-C20雜環。在一些具體實例中，B1為亞甲基。視情況，B2為C2-C7醯胺基。B3視情況為具有取代基N、O或S之C2-C20烯基。在一些具體實例中，B1為亞甲基，B2為C2-C7醯胺基，且B3為具有以羥基形式存在之取代基O的C13-C20烯基。
任何本發明分子視情況包括元素之穩定次級分佈同位素或 其他標記物。在一些具體實例中，穩定次級分佈同位素在每次出現時選自由3H、13C、15N、17O、18O、31P或34S組成之群。
亦提供用於偵測酶之存在、不存在或水準；偵測個體中酶缺乏之存在或不存在的方法。酶視情況為如下酶，其中該酶之缺乏引起溶酶體儲積症。在用於偵測酶之存在、不存在或水準的方法中使用式I-VI之組成物可因酶在水性溶劑系統中之溶解性改良而改良分析結果之可靠性。偵測酶活性之方法包括使含有目標酶之樣品與本文所述之受質中之任一者或其等效物在目標酶能夠作用於受質而產生酶促產物的條件下接觸；及偵測酶促產物。視情況，該目標酶為酸性β-葡糖腦苷脂酶且該受質具有式I，其中該B2為C2-C7醯胺基，且B3為具有取代基N、O或S之C2-C20烯基。視情況，目標酶為酸性半乳糖腦苷脂β-半乳糖苷酶或酸性-β-葡糖腦苷脂酶且其中B2為C2-C7醯胺基，且B3為具有以羥基形式存在之取代基O的C13-C20。
視情況，適用於偵測酶活性之方法的受質為化合物1至80中之任一或多者、視情況化合物1或7或其任何組合的受質。視情況，方法包括在接觸步驟期間或之後向反應溶液中添加內標。該內標視情況為組成物81-86之任何標準物。
偵測步驟視情況藉由質譜、視情況藉由諸如在MS/MS中監測之多個反應進行。偵測步驟視情況藉由免疫分析、HPLC、質譜或用於偵測分子量小於1000道爾頓(Dalton)之分子的其他適合方法進行。
圖1A說明一個具體實例之受質的NMR分析；圖1B說明一個具體實例之第二受質的NMR分析；圖2為突顯結構部分之例示性受質結構；圖3為突顯結構部分之例示性受質結構；圖4說明例示性受質結構及相應例示性內標結構；圖5為使用例示性受質進行之通用酶促反應流程；及圖6為比較本發明受質在用於偵測溶酶體儲積症之分析程序中之效能(散列狀)與先前技術受質在其中之效能(方格狀)的實驗結果之圖。
特定具體實例之以下描述本質上僅為例示性的且決不意欲限制本發明之範疇，其應用或用途當然可變化。組成物或方法係關於本文所包括之非限制性定義及術語描述。此等定義及術語不應設計成充當對本發明範疇或實踐之限制，而是僅出於說明及描述目的提供。儘管該等方法或組成物描述為一定次序之個別步驟或使用特定物質，但應瞭解此等步驟或物質可互換以使得本發明之描述可如熟習此項技術者可容易地瞭解包括以多個方式排列之多個部分或步驟。因此，應瞭解以下組成物之各種成分視情況可彼此替代，諸如任何A成分可與任何其他A成分互換，任何B1成分可用任何其他B1成分替代，任何B2成分可用任何其他B2成分替代；任何B3成分可用任何其他B3成分替代，任何R1成分可用任何其他R1成分替代，任何R2成分可用任何其他R2成分替代，任何R1'成分可用任何其他R1'成分替代，任何R2'成分可用任何其他R2'成分替代，任何R3'成分可用任何其他R3'成分替代，任何R4'成分可用任何其他R4'成分替代，任何R5'成分可用 任何其他R5'成分替代，或任何R6'成分可用任何其他R6'成分替代。應瞭解，如一般技術者可容易地瞭解本文包括A、B1、B2、B3、R1、R2、R1'、R2'、R3'、R4'、R5'或R6'之所有組合。
本文所用術語僅出於描述特定具體實例之目的且並不意欲限制本發明。除非內容另外明確表明，否則如本文所用之單數形式「一(a/an)」及「該(the)」意欲包括複數形式，包括「至少一個(at least one)」。「或(or)」意謂「及/或(and/or)」。如本文所用之術語「及/或」包括一或多個相關列出項之任何及所有組合。此外，應瞭解，術語「包含(comprise)」及/或「包含(comprising)」或「包括(include)」及/或「包含(including)」在用於本說明書中時表示存在所述特徵、區域、整數、步驟、操作、成分及/或組分，但不排除存在或添加一或多個其他特徵、區域、整數、步驟、操作、成分、組分及/或其群組。術語「或其組合(or a combination thereof)」意謂包括上述要素中之至少一者的組合。
除非另外定義，否則本文所用之所有術語(包括技術及科學術語)均具有與一般熟習本發明所屬之技術者通常所瞭解相同之含義。此外，應瞭解，術語(諸如常用辭典中所定義之術語)應說明為具有與其在相關技術及本發明之情形下之含義一致的含義，且不應在理想或過度形式之意義上說明，除非本文明確如此定義。
所提供組成物具有作為用於偵測水解酶酶活性(諸如與溶酶體儲積症有關之溶酶體酶活性)之分析試劑的效用。經由施用相較於先前鑑別組成物更加容易溶解於適用於諸如質譜、HPLC及免疫分析之分析方法之溶液中的酶受質及適用作實驗對照或標準物之相關化合物，偵測與溶酶 體儲積症有關之酶活性更易於實踐且更不繁瑣。
組成物係關於以溶酶體酶為目標之受質，該等溶酶體酶視情況包括：酸性β-葡糖腦苷脂酶(acid β-glucocerebrosidase；ABG)、半乳糖腦苷脂β-半乳糖苷酶(galactocerebroside β-galactosidase；GALC)。使用此等酶對受質之作用量測樣品中之相應酶活性，由此此等受質可用於偵測以下溶酶體儲積症：高歇病(ABG)；及克拉伯病(GALC)。
一種受質具有如下通式
其中A為單醣或二醣；B1為：C1-C20烷基；含有雜原子之C1-C20烷基、C2-C20烯基；含有雜原子之C2-C20烯基、經取代或未經取代之C6-C20芳基；B2為：C2-C7胺甲酸乙酯；C2-C7醯胺基、C2-C7酯、C2-C7脲基；C2-C7胺甲醯基、C2-C7羰基、C1-C7烷基、含有雜原子之C1-C7烷基、具有取代基N、O或S之C1-C7烷基、C2-C7烯基、含有雜原子之C2-C7烯基、具有取代基N、O或S之C2-C7烯基、且B3為：C1-C20烷基、含有雜原子之C1-C20烷基；具有取代基N、O或S之C1-C20烷基；C4-C20醚；C1-C20酯；C1-C20烯基；含有雜原子之C1-C20烯基；具有取代基N、O或S之C2-C20烯基；C1-C20炔基；含有雜原子之C1-C20炔基；具有取代基N、O或S之C2-C20炔基；C6-C20芳基；及含有雜原子N、O或S之C6-C20雜環。取代基N、O或S視情況獨立地為羥基、胺基、硫醇、醚、硫醚或二級胺。
受質對特定溶酶體酶之特異性部分由糖部分A中之結構變化(諸如A為單醣或二醣)提供，且在一些具體實例中由所用特定糖部分 提供。例示性糖部分包括用於偵測高歇病之β-D-葡萄糖及用於偵測克拉伯病之β-D-半乳糖。單醣視情況藉由α或β糖苷鍵連接於分子之其餘部分。其他例示性糖部分包括(但不限於)阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔羅糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖及塔格糖，各呈D或L構型。
B1為用於使糖部分A結合於受質其餘結構的連接子部分。B1亦充當糖部分A與受質其餘結構之間的間隔基以使目標酶可撓性接近。連接子臂B1可設計成可控制物質之極性從而控制其溶解特性。在一些情況下，連接子臂B1可具有氫酚(hydrophenol)結構。由此，通式I之受質可經組態以在諸如純甲醇或純乙醇之溶劑中至少部分親水。脂肪酸部分一般整體經定製以具有足夠親水性而向受質提供水溶性。因此，受質可溶解於水性緩衝系統中；但應瞭解，如此項技術中已知，可在試劑混合物中包括清潔劑或其他該等試劑以提高受質物質之水溶性。
相對於天然腦苷脂或先前受質之長鏈脂肪酸，B2向受質提供水溶性。出乎意料地，特定B2結構之短烷基鏈長度(C2-C7之長度)使得可由所要酶以足以可操作之親和性及轉換率識別。另外，根據一些具體實例，類似地預期烯基鏈中缺乏飽和性不會賦予作為受質之功能。此等要素單獨使用或分別使用均使受質獲得藉由先前方法尚未獲得之完全溶解特性。
在一些具體實例中，B2可包括一或多個親核基團以與固體載體或可偵測標籤(諸如螢光標籤)相互作用。該等親核基團視情況為氮、氧或硫親核基團。視情況，親核基團為胺。
組成物之特性為其無需載有欲用於特定偵測程序(諸如質 譜)中之四級銨基。由B2基團賦予之相對可溶性足以改良使用受質進行之對一或多種酶的偵測。相較於前述受質，受質一般更具親水性而無需永久帶電部分且需要較少或無需清潔劑。此產生簡化分析程序，因為，如使用氯仿，使用清潔劑可能需要繁瑣淨化步驟，包括勞動密集型液液及固相萃取。
質譜分析期間受質之特異性亦可由B2之烷基內的碳長度及飽和度變化給予。B2之例示性化學結構包括用於偵測高歇病之四碳脂肪醯基及對偵測克拉伯病具有特異性之六碳脂肪醯基。應瞭解，酶之絕對特異性並不由B2賦予，而是更適當地由A之一致性賦予。B2之不同鏈長或飽和度可用於為相關酶定製受質以及充當以多重分析形式進行偵測之區別點。舉例而言，組合B2包括四碳脂肪醯基之受質與B2具有六碳脂肪醯基之第二受質的多重分析使得可偵測及鑑別產生及不能產生之產物。舉例而言，在使用受質之一些具體實例時，若結果表明反應產物中存在四碳脂肪醯基，則此表明物質中存在β-葡糖腦苷脂酶。在使用受質之一些具體實例時，若結果表明存在六碳脂肪醯基，則此表明存在半乳糖腦苷脂β-半乳糖苷酶。因此，藉由組合具有不同A基團之受質與不同產物組成物，可容易地快速鑑別樣品中所存在之特定酶。
受質在結構上由B3基團封端。B3可在結構上定製以提供不同鏈長。該等不同鏈長適用於在酶分析中將不同受質以及其酶促產物彼此區分開。舉例而言，在質譜中，含有12個碳原子鏈之受質與含有14個碳原子鏈之受質具有不同質荷比，且因此，可區分含有12個碳原子或14個碳原子鏈之受質。類似地，在免疫分析形式中，具有不同鏈長之受質可使用對 於特定化學部分具有選擇性之抗體區分。應認識到，在受質之組合用於多重或單一分析形式中時，受質中B3之鏈長或其他結構的任何差異同樣如此。
在一些具體實例中，受質具有如下結構：
其中A為單醣或二醣且經由糖苷鍵連接於分子之其餘部分；R1為C1-C6烷基或C2-C20烯基，且其中R2為C13-C20烷基或C13-C20烯基。視情況，R1為C6烷基或C4烷基，且R2為C13烷基。視情況，A為醛己醣或酮己醣。視情況，A為D-葡萄糖或D-半乳糖。視情況，A為D-葡萄糖或D-半乳糖，R1為C4烷基、C5烷基或C6烷基，且R2為C13-C20烷基或C13-C20烯基。視情況，A為D-葡萄糖或D-半乳糖，R1為C4烷基、C5烷基或C6烷基，且R2為C13烷基。
在一些具體實例中，受質具有如下結構：
其中A為單醣或二醣；B1為：C1-C20烷基；含有雜原子之C1-C20烷基、C2-C20烯基；含有雜原子之C2-C20烯基；及經取代或未經取代之C6-C20芳基；R1'為經取代或未經取代之C或N；R2'為經取代或未經取代之C、經取代或未經取代之N、O或S；R3'為經取代或未經取代之C、N或O；R4'為不存在、 經取代或未經取代之C1-C2、O或S；R1為：C1-C6烷基；含有雜原子之C1-C7烷基：具有取代基N、O或S之C1-C7烷基；C2-C7烯基；含有雜原子之C2-C7烯基；具有取代基N、O或S之C2-C7烯基；R5'為不存在、經取代或未經取代之C1-C2；O或S；且R6'為C1-C20烷基、含有雜原子之C1-C20烷基；具有取代基N、O或S之C1-C20烷基；C4-C20醚；C1-C20酯；C1-C20烯基；含有雜原子之C1-C20烯基；具有取代基N、O或S之C2-C20烯基；C6-C20芳基；及含有雜原子N、O或S之C6-C20雜環。
亦提供偵測酶活性之方法。特定酶之活性可藉由其作用於同源受質而產生酶促產物之能力或速率評定。在式I-III之受質的情況下，目標酶之作用可產生兩種產物：A(及/或A-H，因為，如圖5中所示，糖基典型地在第一碳上保留-OH基團)及HO-脂肪酸部分(B)，因為如圖5中所示，B部分亦典型地保留羥基化形式。藉由測定樣品中酶促產物之量，可測定目標酶之活性。對於需要定量評定酶促產物之應用，樣品中可包括已知量之對應於式I-III之非A部分的內標，該內標將在下文進行更詳細描述且視情況經標記。
可使用個體血液中某些溶酶體酶之活性測試個體是否患有溶酶體儲積症。因此，提供受質以用於偵測醫學病狀，尤其溶酶體儲積症，諸如高歇病及克拉伯病。為偵測高歇病，例示性糖部分為β-D-葡萄糖，且例示性脂肪酸部分(例如B1(-B2)(-B3))包括連接於C7醯胺基及含有長度為1-20個碳之烯基的取代基的亞甲基B1。為偵測克拉伯病，例示性糖部分為β-D-半乳糖，且例示性脂肪酸部分包括連接於C5醯胺基及含有長度為1-20個碳之烯基的取代基的亞甲基B1。
受質可經定製以用於分析各種酶，尤其與疾病病況或先天缺陷有關之酶或以其他方式用於醫學目的之酶。該定製為可能的，因為各種單醣及二醣基團可存在於通式I之A中。甚至對於新鑑別之目標酶，使用常規方法確定其對單醣及/或二醣基團之特異性後，即可使用本文中所提供之導引容易地製備受質。可使用本文所述之受質分析的酶的非限制性實例包括酸性β-葡糖腦苷脂酶、半乳糖腦苷脂α-半乳糖苷酶及酸性神經髓磷脂酶。
如所預期，可合成具有不同糖之受質，其各自特異於特定溶酶體酶且亞基B2或B3各自具有不同鏈長。此系統供給視情況可選之多重分析，其中在同一樣品或樣品容器中使用結構上類似但具有酶特異性之受質分析兩種或兩種以上溶酶體酶。
本發明提供充當適用於評定樣品或樣品容器中酶促產物之量的實驗對照或標準物之化合物。為用於質譜方法，對應於特定受質之內標在結構上與其酶促產物(亦即脂肪酸部分)一致，但內標具有不同質荷(m/z)比。由此，所提供之內標包括酶促產物之改變形式，例如酶促產物之經穩定同位素標記之類似物，其中一或多個原子經相應原子同位素置換以與相應酶促產物產生差異可偵測之質量差。當藉由質譜分析內標及酶促產物時，所得譜圖顯示內標與酶促產物空間分離，各自由其自身之峰表示。內標之已知量由其已知m/z比率下之峰值反映。酶促產物之量可藉由在其已知m/z下相對於內標之峰值比較峰值來評定。同位素標記產生內標之實例為用2H(亦即氘，D)置換B2或B3(或兩者)之醯基上的1H。因而，如質譜上所偵測，具有經取代之2H的「較重」內標分子與酶促產物具有不 同m/z。在一特定具體實例中，用氘標記內標以相對於相應裂解產物產生3至9道爾頓之質量變化。
在一些具體實例中，用可偵測標籤或重原子標記物標記受質。可偵測標籤可與B2基團、B3基團或兩者相互作用。此項技術中確認多種螢光探針適用於標記活性胺。因此，一些具體實例包括B2基團或B3基團，必要時其在適用於與標記物或受質表面相互作用之親核基團中封端。說明性親核基團包括氮或氧親核基團。用於特異性標記生物分子之尤其敏感目標為末端胺基。受質之一特定具體實例包括具有此活性末端胺基之B2或B3。適用於標記受質之可偵測標籤之說明性實例包括螢光團，諸如異硫氰酸酯、丹磺醯基及其他磺醯氯、7-硝基苯并-2--1,3-二唑衍生物、螢光胺及其類似基團。
受質可以各種實體形式使用，例如溶液形式以及連接或固定於固體載體之形式。固體載體可由天然或合成材料、有機或無機材料(諸如聚合物、樹脂、金屬或玻璃)及其組合構成。適合固體載體可具有各種實體形式，其可包括例如薄膜；柱狀物；空心、實心、半實心、含有孔或腔之粒子(諸如珠粒)；凝膠；纖維，包括光學纖維材料；基質及樣品容器。樣品容器之非限制性實例包括樣品孔、管、毛細管、小瓶及任何其他容器、能夠容納樣品之凹槽或凹口。樣品容器可包含在多樣品平台上，諸如微盤、載片、微流體裝置及其類似物。多種適合粒子為此項技術中已知且說明性包括Luminex®型經編碼粒子、經編碼光學纖維的粒子、磁性粒子及玻璃粒子。受質及/或其酶促裂解產物與固體載體之共價相互作用適用於在一些分析形式中所執行之洗滌程序期間保留受質及/或產物，由此產生酶活性之穩 定且精確信號。
當分析形式需要使用固體載體時，例示性胺封端之B2或B3基團的存在可用於例如共價鍵結於高結合性固體載體。高結合性固體載體為具有經曝光部分之表面，該等經曝光部分具有化學活性或者能夠共價或高親和性結合於受質或內標。舉例而言，Corning Life Sciences製造出高結合性微孔盤，其經照射以使苯環斷裂且產生經曝光之羧酸。此等羧酸易於諸如由一種具體實例受質之離胺酸衍生物組分上的末端胺基進行親核攻擊。此反應快速且在受質/產物與高結合性表面之間產生緊密相互作用。
本文所述之方法及所提供之組成物可在多重形式中執行以使得可同時分析複數個樣品。說明性多重形式包括使用物理及/或化學方式編碼之粒子。在多重形式中使用經編碼粒子已例如描述於US 6,649,414及US 6,939,720中。因為代碼使得粒子可彼此區分，故複數個不同粒子可存在於單一反應混合物中，從而使得複數種不同樣品或不同酶可同時分析。視使用者之實驗目標而定，粒子上之代碼可例如對應於樣品來源、欲分析之特定酶、所存在之特定受質及其類似資訊。
適用於所提供之方法的樣品含有或懷疑含有一或多種目標酶。目標酶可包含在如下樣品中，該等樣品獲自個體以及實驗室物質(諸如細胞系及合成蛋白來源)。例示性樣品來源說明性包括：組織勻漿；細胞培養溶解物；及生物流體，包括尿、液體或乾燥形式之血液、眼淚、唾液及腦脊髓液。樣品可進一步分級分離，必要時，直至獲得含有特定細胞類型之部分。舉例而言，血液樣品可分級分離成血清或含有特定類型血細胞(諸如紅血球或白血球(白細胞))之部分。必要時，樣品可為來自個體之 樣品的組合，諸如組織與流體樣品之組合及其類似組合。在一特定具體實例中，樣品為血液，其可為例如全血或其血液部分，或自乾血液樣品復原。
獲得保持樣品中分子之活性或完整性的樣品的方法為熟習此項技術者所熟知。該等方法包括使用適當緩衝劑及/或抑制劑(包括核酸酶、蛋白酶及磷酸酶抑制劑)，其使樣品中之分子保持不變或使樣品中分子之變化達最小。該等抑制劑包括例如螯合劑，諸如乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid；EDTA)、乙二醇雙(P-胺基乙基醚)N,N,N1,N1-四乙酸(EGTA)；蛋白酶抑制劑，諸如苯基甲基磺醯氟(phenylmethylsulfonyl fluoride；PMSF)、抑肽酶、抗纖維蛋白溶酶肽、抗蛋白酶及其類似物；及磷酸酶抑制劑，諸如磷酸鹽、氟化鈉、釩酸鹽及其類似物。適當緩衝劑及分離分子之條件為熟習此項技術者所熟知且可視例如欲特性化之樣品中分子之類型而變化(參見例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(增刊47),John Wiley & Sons,New York(1999)；Harlow及Lane,Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)；Harlow及Lane,Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1999)；Tietz Textbook of Clinical Chemistry，第3版，Burtis及Ashwood編，W.B.Saunders,Philadelphia,(1999))。樣品亦可經加工而去除干擾物質之存在或使其達最小。
在篩檢來自新生兒及兒童患者之血液時通常使用乾血點形式之樣品。為製備此等樣品，收集血液且保留在濾紙上。為進行分析，將乾血自濾紙洗提至水溶液中，該水溶液一般含有緩衝劑(諸如磷酸鹽緩衝鹽水)及蛋白酶抑制劑。蛋白酶抑制劑條件之特定實例包括例如以下中之一或多者：最終濃度為50至400μg/ml之AEBSF鹽酸鹽、最終濃度為0.2 至25mg/ml之去水EDTA二鈉、最終濃度為0.5至1μg/ml之抗纖維蛋白溶酶肽半硫酸鹽及最終濃度為0.5至1μg/ml之胃酶抑素A。可使用已知常用於此項技術之蛋白酶抑制劑混合物。通用分析溶液提取用於隨後分配於多重分析反應中之單一乾血樣品或其他類型樣品的用途可用於自動及高通量篩檢。單一乾樣品提取可無需自同一樣品獲得數個樣品打孔片或收集其他樣品來源之等分試樣，因此降低因血液在濾紙上不均勻分佈所致之變化及樣品轉移中之誤差。當使用乾樣品時，提取效率可隨所分析之不同酶而變化。在此等及其他類型樣品中，當包含在不同分析溶液中時目標酶可具有不同活性水準。通用分析溶液之組成視情況經選擇以使得欲測試之各酶具有活性。
在一些具體實例中，將乾血點或源自其之打孔片直接置於包括一或多種受質及視情況存在之內標的分析緩衝劑中，且使其培育足以使樣品中所存在之酶將受質轉化為產物的時間，隨後藉由一或多種偵測方法偵測。
所提供之受質及產物可用於各種分析形式中。當在酶促分析期間需要觀察受質消耗情況時，可在分析中偵測受質，而當需要觀察酶促分析期間之產物形成時，可在分析中偵測產物。當出於兩種觀點需要觀察酶促反應以確定所產生產物之量與所消耗受質之量相互關聯時，可偵測受質與產物。
舉例而言，受質或產物之量可使用常規串聯質譜程序偵測。採用質譜之例示性酶分析可如下執行。將樣品與受質一起培育可形成酶促產物之時間。在培育期期間，受質由血液樣品中所存在之目標酶裂解而形 成各別產物。隨後藉由添加使蛋白質組分沈澱之試劑使反應淬滅。例示性試劑包括乙醇、乙腈及稀三氟乙酸。隨後將培育混合物之一部分轉移至新分析容器中。視情況，可添加稀釋試劑(諸如甲醇、乙腈、水-甲醇混合物或水-乙腈)以稀釋所轉移部分。如此稀釋之樣品降低內源競爭物質之量以便可相對提高串聯質譜分析之靈敏度。其他類型試劑可經熟習此項技術者選擇以與藉由質譜進行之多種分析相容。
在一些具體實例中，將經稀釋樣品直接手動或藉助於自動進樣器及液體處理器自動注射於串聯質譜儀中。必要時，樣品可在分析前進行衍生。試劑經選擇以與MS/MS系統非敵對。舉例而言，適合溶劑不含清潔劑及腐蝕劑，諸如氯仿。常簡單地使用純乙醇及純甲醇，因為其在機械乾燥方法後可容易地汽化。
串聯質譜儀可經設定以同時偵測所添加之受質、相應所得酶促產物及相應內標。該偵測藉助於母離子掃描、前驅離子掃描或多反應監測掃描來完成。
酶促分析期間所消耗受質或所形成產物之量亦可使用抗體及其他目標特異性結合分子偵測。對於免疫分析，可使用抗體偵測受質、產物或兩者。適用於該等方法之抗體可具有特異性以使得其可識別個別受質，或可具有非特異性以使得其可識別多種或所有受質。受質或產物視情況包括標記物(諸如生物素或抗生物素蛋白)以使得可進行特異性偵測。
抗體說明性產生於動物中，包括小鼠、大鼠、兔、馬、驢或用於製造抗體之其他適合動物。在一些應用中，用可偵測標籤(諸如螢光標籤)標記抗體有用。當使用未標記抗體時，可藉由使用對一次抗體之物 種IgG具有特異性的二次抗體執行偵測，該一次抗體說明性地用螢光標籤(諸如若丹明)標記。在此項技術中應瞭解，在本發明中，其他抗體偵測系統可類似地操作，諸如經辣根過氧化酶標記之抗體或經鹼性磷酸酶標記之抗體。
當藉由提供多種酶特異性受質測試單一樣品中之多種酶時，使用可在受質或其產物之間識別且區分之抗體。抗體結合於酶特異性受質或其產物之複合物可使用諸多方法彼此區分。在一種情形下，使含有目標酶之樣品與連接於粒子之受質在分析溶液中接觸。在此實施例中，各粒子連接於特定受質且存在代表各受質之多個粒子。目標酶作用於受質而產生產物(A)及分子之含脂肪酸部分(B)。該產物保持結合於粒子，而A產物釋放至溶液中。隨後使識別特定產物之抗體與分析溶液接觸。若在酶促分析期間產生產物，則抗體將結合於產物而產生具有結合之抗體的粒子。為區分粒子上所含之不同產物，具有不同產物特異性之抗體可具有不同可偵測部分，諸如不同螢光標籤。作為偵測酶促產物之替代方案，可使用識別受質之抗體偵測在與酶一起培育後保留在珠粒上之受質。在此情形下，若發生酶促反應，則任一產物應保持連接於珠粒。在任一情況下，所選受質特異性抗體不與連接於珠粒之產物進行顯著交叉反應。
在另一情形下，使含有目標酶之樣品與連接於經編碼粒子之受質在分析溶液中接觸。經編碼粒子具有特徵，諸如條碼或光學特徵，其使得該等粒子可彼此區分。舉例而言，經編碼粒子可具有對應於不同目標酶受質之不同條碼。在該分析中，目標酶作用於受質而產生產物。脂肪酸產物保持結合於粒子，而A產物釋放至溶液中，或反之亦然。隨後使識別 特定產物之抗體與分析溶液接觸。因為粒子之編碼表明何種受質連接於粒子，故抗體無需對於特定產物具有特異性，由此可使用一種類型抗體來偵測衍生自多種不同受質之產物。若在酶促分析期間產生產物，則該等非特異性抗體將結合於產物而產生具有結合之抗體的粒子。隨後例如藉由偵測抗體上之標籤或粒子之物理性能區分具有結合之抗體的粒子與無抗體之粒子。結合抗體之粒子上所含之不同產物可基於各粒子之編碼確定。
作為免疫分析形式之另一實例，產生針對特定受質之抗體。淬滅酶促反應後，將反應溶液轉移至高結合性微量滴定盤中，由此活性B2部分(例如)經由末端胺基共價連接於盤。藉由洗滌移除酶及分析溶液組分。隨後在各分析孔中培育特異性一次抗體，繼而隨後進行洗滌以移除未結合之抗體。視情況使用二次抗體進行偵測且定量。每單位時間初始反應所形成之產物愈多，所量測酶之活性愈大。
在替代性免疫分析形式中，視情況使用對於脂肪酸亞基具有特異性之抗體作為標準夾心ELISA分析中微量滴定盤表面上之捕捉抗體。使用針對產物上之獨特抗原決定基的一次抗體(諸如針對脂肪酸部分(或用特異性結合對成員(諸如生物素)修飾該脂肪酸部分)之一次抗體)進行偵測。如此項技術中所公認，視情況使用經標記二次抗體進行上述偵測。
在另一免疫分析形式中，例示性抗體與結合於B1部分之α-D-葡萄糖A基團反應。受質可使用胺基封端之脂肪酸部分連接於固體載體。或者，以溶液形式提供受質，將反應物轉移至樣品容器中，其中淬滅例示性酶促反應後，將反應溶液轉移至高結合性微量滴定盤中，由此活性脂肪酸部分經由末端胺基共價連接於容器。作為另一替代性方案，採用對 於產物/受質上之另一抗原決定基具有特異性的捕捉抗體。藉由洗滌移除未反應之酶及緩衝劑組分。隨後在各分析孔中培育對A-B1部分具有特異性之抗體以偵測且定量保留之受質。初始酶促反應後剩餘之受質愈多，酶之活性愈低。
抗體說明性地未標記且產生於動物中，包括小鼠、大鼠、兔、馬、驢或用於製造抗體之其他適合動物。說明性地用螢光標記(諸如若丹明)標記對於一次抗體之物種IgG具有特異性的二次抗體且隨後用於偵測保留之受質。在此項技術中應瞭解，在本發明中，其他抗體偵測系統可類似地操作，諸如經辣根過氧化酶標記之抗體或經鹼性磷酸酶標記之抗體。
在適合免疫分析形式之另一實例中，對於結合於B1部分及/或脂肪酸部分之一部分的例示性α-D-葡萄糖A基團具有特異性的單株小鼠抗體自身由螢光標記說明性標記。在此系統中，視情況同時分析多種溶酶體酶對各種特異性受質之活性。一說明性實例包括兩種酶系統，其中採用兩種受質，一種對GALC具有特異性且另一種對ABG具有特異性。將各受質與生物樣品同時添加至反應物中。因為各受質視情況含有胺封端之脂肪酸基團，故兩者均類似地結合於高結合性微量滴定盤。如上洗滌之後，將兩種各自對各別受質具有特異性之抗體添加於微量滴定盤中。用不同螢光團(諸如若丹明或花青)說明性標記各抗體。因此，可偵測且定量各抗體之結合而不會彼此干擾，且可在來自同一樣品之微量滴定盤之同一孔中偵測各酶活性之量。
在一些具體實例中，藉由首先獲得樣品(說明性包括血清、血漿、全血、尿、唾液、其他生物流體或組織溶解物)、溶液形式之重組或 天然經純化酶或生物流體或液體介質中之經化學或功能修飾之酶來執行目標酶分析。隨後切割濾紙樣品之一部分且沈積於添加分析溶液之非結合性分析管或微量滴定盤孔中。分析溶液包含水性緩衝劑、受質、標準物以及蛋白酶抑制劑。隨後在30至41℃範圍內之特定溫度下培育樣品混合物30分鐘至20小時範圍內之確定時間。完成培育後，藉由添加中止溶液終止酶促反應。中止溶液說明性地為以6倍反應物體積添加之0.4M甘胺酸/NaOH(pH 10.4)。Leonard R等人，J.Biol.Chem.,2006；281：4867-75；Boot,RG等人，J.Biol.Chem.,2006；282：1305-12。產物形成之量藉由將已知體積之樣品轉移至高結合性分析管或微量滴定盤且培育5分鐘至2小時來測定。未結合物質藉由洗滌移除。說明性地使用偶合過氧化酶法偵測完整受質或產物。
在另一情形下，藉由偶合酶法即時量測所釋放之葡萄糖或半乳糖產物之水準。非限制性實例包括在診斷高歇病時自對於β-葡糖腦苷脂酶具有特異性之受質釋放葡萄糖。在此分析方法中，葡萄糖與葡萄糖氧化酶反應產生葡萄糖酸內酯且釋放過氧化氫。所釋放之過氧化氫藉由與過氧化酶反應產生在標準螢光計上量測之螢光分子來偵測。適合過氧化酶之實例為辣根過氧化酶或此項技術中已知之任何其他過氧化酶。由葡萄糖氧化酶釋放之過氧化氫與偵測物受質分子相互作用。過氧化酶催化此受質向螢光產物之轉化。適合於與受質一起使用之偵測物分子包括Amplex Red，其經氧化而產生螢光產物試鹵靈(resorufin)。Amplex Red及偵測自由葡萄糖之套組可購自Invitrogen公司。在螢光計上偵測紅色螢光產物之增加，該螢光計經設定激發波長為571nm且發射波長為585nm，帶通設定為5nm。醣苷酶活性量愈大，產生紅色螢光產物愈快速。
在一些具體實例中，產生不同溶酶體酶之多種受質，該等受質具有獨特脂肪酸結構。此可阻止對一種酶之產物抑制，如果該酶對一種受質之催化活性比另一酶對其相應受質之催化活性大得多那麼其尤其重要。在一組6種或6種以上溶酶體酶之受質中篩檢單一突變糖苷酶的條件下，此格外重要。由其他溶酶體酶形成之產物可能抑制較低活性酶之功能以使得其活性不能精確量測。由此，應瞭解，受質及產物對各酶之特異性視情況不同。
當藉由組合針對各別酶之多種受質同時偵測超過一種酶時，受質不僅在給予酶特異性之糖部分之類型方面可能不同，而且在脂肪酸部分之任何組分的長度方面可能不同。使用MS/MS作為偵測工具時此尤其重要，因為具有相應有區別之質量指數的有區別之受質分子對應於所檢查之各種酶。.
對於使用所述受質及標準化合物分析酶描述之方法可擴展為同時分析單一反應物中之複數種酶，而無需多個分析來輔助確認對於醫學病症之診斷。該等方法亦可用於在評估通過特定生物化學路徑之化學通量率或監視生物化學信號傳導路徑時同時量測數種酶。由於使用本文所述之化合物可採用之質譜偵測的高靈敏度(其可能每個分析僅需要亞微克數量之受質試劑)，以低公克規模(low-gram scale)合成數百種受質試劑變得實際且經濟。
在各種具體實例中，藉由使用所提供之受質可同時量測兩種、三種、四種、五種、六種或六種以上溶酶體酶之活性。
作為與所提供之受質一起使用的另一例示性形式，受質可用 相同螢光團標記，但具有使一者與其他者區別之顯著質量或電荷特性。酶促裂解反應後所產生之產物之量藉由逆相高效液相層析(high performance liquid chromatography；HPLC)偵測。藉由添加乙醇、乙腈或稀三氟乙酸使反應淬滅。將培育混合物之一部分轉移至新分析容器中，向其中添加純溶液(諸如甲醇、乙腈、水-甲醇混合物或水-乙腈)。在5μm粒徑C18 HPLC管柱上分離反應產物及未反應之受質且藉由螢光偵測器或偵測器組偵測。產物之量基於使用增加量之相關產物產生之標準曲線計算。
應瞭解，在此項技術中，多種酶之多種受質視情況同時藉由層析法偵測。若使用具有足夠不同之質量或滯留特性之受質，則各產物可例如在HPLC管柱上解析且可在單一分析中定量。或者，用具有不同或相同激發或發射特性之不同螢光團標記各受質。偵測可藉由一類螢光偵測器進行，該等螢光偵測器可同時定量個別產物彼此及其相應經標記受質。其他偵測方法類似地適合且為此項技術中已知。
圖2描繪用於偵測溶酶體儲積症之例示性受質結構。該結構由葡萄糖或半乳糖形式(其中說明半乳糖)之糖(A)及脂族基B構成。基團B包括亞甲基形式之連接子臂(B1)、具有C5醯胺基之B2亞基及碳長度在10至30範圍內且具有取代基O之烯基形式的B3亞基。應瞭解，圖2之結構亦可關於式III描述為其一個例示性具體實例。
圖3描繪用於偵測溶酶體儲積症之例示性受質結構。該結構由葡萄糖或半乳糖形式(其中說明半乳糖)之糖(A)及脂族基B構成。基團B包括亞甲基形式之連接子臂(B1)、具有C7醯胺基之B2亞基及碳長度在10至30範圍內且具有取代基O之烯基形式的B3亞基。應瞭解，圖3之 結構亦可關於式III描述為其一個例示性具體實例。
圖5展示使用例示性受質進行之通用酶促反應。特定親和性結合及酶促反應後，受質裂解為兩個基團，糖部分A及脂族基B。基團B視情況由醯胺及長鏈烷基或烯基部分構成。兩個基團視情況隨後藉由MS/MS分析。內標亦同時進行MS/MS分析。內標視情況為B之同位素標記類似物，其用氘置換甲基或分子其他部分上之氫原子。
亦提供用作用於偵測酶活性之內標或對照的化合物，其具有下式：
其中B1為：C1-C20烷基；含有雜原子之C1-C20烷基、C2-C20烯基；含有雜原子之C2-C20烯基、經取代或未經取代之C6-C20芳基；B2為：C2-C7胺甲酸乙酯；C2-C7醯胺基、C2-C7酯、C2-C7脲基；C2-C7胺甲醯基；C2-C7羰基；C1-C7烷基；含有雜原子之C1-C7烷基；具有取代基N、O或S之C1-C7烷基；C2-C7烯基；含有雜原子之C2-C7烯基；具有取代基N、O或S之C2-C7烯基；且B3為：C1-C20烷基、含有雜原子之C1-C20烷基；具有取代基N、O或S之C1-C20烷基；C4-C20醚；C1-C20酯；C1-C20烯基；含有雜原子之C1-C20烯基；具有取代基N、O或S之C2-C20烯基；C1-C20炔基；含有雜原子之C1-C20炔基；具有取代基N、O或S之C2-C20炔基；C6-C20芳基；及含有雜原子N、O或S之C6-C20雜環。取代基N、O或S視情況獨立地為羥基、胺基、硫醇、醚、硫醚或二級胺。
在一些具體實例中，結構B1-B2-B3具有如下結構：
其中R1為C1-C6烷基或C2-C20烯基，且其中R2為C1-C20烷基；C1-C20烯基；具有取代基N、O或S之C1-C20烷基、C1-C20烯基或具有取代基N、O或S之C1-C20烯基；且R2如對於式II所定義。視情況，R1為C6烷基或C4烷基，且R2為C13烷基。視情況，R1為C4烷基、C5烷基或C6烷基，且R2為C13-C20烷基或C13-C20烯基。視情況，R1為C4烷基或C6烷基，且R2為C13烷基。式V之組成物視情況包括一或多種穩定次級分佈同位素，其視情況為2H、13C、15N、17O、18O、31P、34S或其組合。
本發明內標之特定說明性具體實例包括(但不限於)：
其中x為2至4之值，且其中R2為C1-C20烷基、C1-C20烯基或C1-C20炔基，其中任一者可經N、O或S取代或包括N、O或S之取代基。視情況，x為2或4且R2為C13烷基。應進一步瞭解，在一些具體實例中，重同位素視情況存在於醯胺基之α碳上，含有羥基之脂族基的任何位置上或其任何組合。
應進一步瞭解，式V或式VI之化合物亦用作拮抗劑、分析對照或用於臨床治療諸如甲狀腺機能減退、糖尿病及HIV之疾病。
在另一具體實例中，式I-III之受質視情況經合成而在A與B1之間具有不可水解連接。此產生對目標溶酶體酶維持高特異性之自殺受質(suicide substrate)。此等分子充當更具特異性且有效之酶功能抑制劑。
包括受質、酶促產物及內標之所有試劑均可視情況藉由收集適當部分藉由逆相HPLC純化且藉由ESI-MS特性化，其可為線上HPLC-MS分析或離線分析。
本發明之各種態樣藉由以下非限制性實施例說明。該等實施例出於說明目的且並不限制本發明之任何實踐。應瞭解，在不背離本發明之精神及範疇的情況下可進行變化及修改。本文所說明之試劑可購得或藉由熟知方法自容易購得之前驅物容易地合成，且一般技術之人士易於瞭解何處可獲得該等試劑。
實施例
實施例1：製備受質：
實質上如流程I所描繪製備化合物1：
簡言之，將經α-D-葡萄糖修飾之神經鞘胺醇(A)(D-葡糖基-β1-1'-D-赤-神經鞘胺醇，Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL)溶解於1mL無水DMF(Aldrich)中。添加1.5當量戊醯基-NHS酯(B)(來自50mg/mL於DMF中 之儲備溶液，儲存在-20℃下)。如由TLC所量測，反應在2分鐘內完成。在Speed-Vac中在不加熱之情況下對反應產物進行離心隔夜。將殘餘物溶解於1-1.4mL DMF中且以6-7部分注射於HPLC管柱(Vydac C18管柱(218TP1022，22×250mm)，在6mL/min下操作)上。使用溶劑A 25%甲醇水溶液及溶劑B 20%甲醇之乙腈溶液以35-100% B 30分鐘、隨後在100% B下保持30分鐘的梯度操作管柱。產物藉由UV在213nm下偵測。自所有HPLC操作彙集產物洗提份，且在離心濃縮機(Speed-Vac，油泵真空，室溫)中移除溶劑，得到近似定量產率之所要產物化合物1。
藉由NMR分析所得化合物1以確定身分。結果展現於圖1A中。觀察到之所得化合物之分子量為545.3948。類似地使用上述方法藉由將戊醯基-NHS酯用不同烷基鏈長度之基團取代來合成其他化合物。
表1中呈現所合成之其他式II化合物：
藉由自14至20個碳改變R2烷基鏈長度重複上述方法來合 成以包含10種化合物之組形式列出之化合物11-80，其中各R2烷基鏈長度分別如表1。經由NMR分析確定由此製備之化合物的身分及結構。
作為另一個實例，實質上如流程II中所述合成化合物7：
簡言之，將100mg半乳糖苷基-神經鞘胺醇(Avanti Polar Lipids公司，Alabaster,AL)溶解於3.3mL THF+0.56mL水中。向此溶液中添加1.5當量庚醯基-NHS酯。用二異丙基乙胺將混合物之pH值調節為8.5-9.0(在用水濕潤之pH紙上點樣)。如由TLC所量測，反應幾乎在2小時內完成。為促使反應完成，再添加0.75當量庚醯基-NHS酯，如上調節pH值且在室溫下攪拌混合物總共3-4小時。在Speed-Vac中在不加熱之情況下對反應產物進行離心隔夜。將經乾燥之殘餘物溶解於1.4mL DMF中且如上在HPLC管柱上注射0.2mL部分。自所有HPLC操作彙集產物洗提份且在離心濃縮機(Speed-Vac，油泵真空，室溫)中移除溶劑，得到81%產率之所要產物。化合物合成藉由如圖1B中所說明之NMR確定。
實施例2：製備內標
實質上如流程III中所說明，藉由類似於實施例1之方法製備內標，但以未結合於糖部分之神經鞘胺醇開始。
簡言之，使市售神經鞘胺醇(Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL)及脂肪酸之適當NHS酯如實施例1中反應。所用例示性NHS酯為：戊醯基-NHS酯、庚醯基-NHS酯、戊醯基-NHS酯(各自之H經或不經D取代)。如上藉由HPLC純化內標且以20-90%之產率獲得。
藉由NMR分析所得例示性化合物81以確定合成，所得分子量為424。類似地使用流程II之方法合成其他經標記內標，其包括神經鞘胺醇或NHS酯前驅物中之H經D取代。表2中呈現所合成之其他例示性式V化合物。
實施例3：偵測樣品中之酶活性。
分別使用化合物1及7之受質偵測酸性-β-葡糖腦苷脂酶(ABG)及半乳糖腦苷脂-β-半乳糖苷酶(GALC)之存在。藉由自同意之成人靜脈穿刺獲得血液且點抹在濾紙上。對於各樣品，自乾血區打出3mm直徑之圓片置於96孔微量滴定盤之孔中。隨後將血液圓片直接與分析溶液一起培育，該分析溶液含有最終濃度為5μmol/L之受質及最終濃度為0.1μmol/L之相應內標。亦向分析溶液中添加0.5mol/L最終濃度之乙酸鈉緩衝液。在攝氏37度下在恆溫空氣振盪器中在迴轉式振盪(150rpm)下培育含有血液圓片之分析混合物15至24小時。培育期後，向各管或孔中添加純甲醇之等分試樣以終止酶促反應。進入質譜儀之前，用純甲醇稀釋經培育之反應混合物。為進行質譜分析，以正離子模式操作電噴霧源且以母離子掃描模式偵測離子。酶促產物之量由產物與內標之離子豐度比減去空白樣計算。
圖6說明使用化合物1作為ABG受質相對於先前使用之受質的意外改良結果，其說明產物偵測值相較於用C5醯胺基取代C12醯胺基之類似化合物改良2倍。GALC陽性樣品展現分子量為264.27之正離子。相應 內標產生分子量為271.31之正離子。
實施例4：同時偵測樣品中之多種酶活性。
同時分別使用化合物1及7之受質偵測酸性-β-葡糖腦苷脂酶(ABG)及半乳糖腦苷脂-β-半乳糖苷酶(GALC)之存在。藉由自同意之成人靜脈穿刺獲得血液且點抹在濾紙上。對於各樣品，自乾血區打出3mm直徑之圓片置於96孔微量滴定盤之孔中。隨後將血液圓片直接與分析溶液一起培育，該分析溶液含有最終濃度為5μmol/L之受質及最終濃度為0.1μmol/L之相應內標。亦向分析溶液中添加0.5mol/L最終濃度之乙酸鈉緩衝液(最終分析體積為30μl)。在攝氏37度下在恆溫空氣振盪器中在迴轉式振盪(150rpm)下培育含有血液圓片之分析混合物15至24小時。培育期後，向各管或孔中添加100μl 50：50甲醇/乙酸乙酯之等分試樣以終止酶促反應。隨後向反應物補充400μl HPLC級乙酸乙酯及200μl水。離心反應物且將所得液體上層轉移至新分析盤中且在氮氣下蒸發。向分析盤中添加83%乙腈/17%水及0.1%甲酸之分析緩衝液且藉由MS/MS對樣品進行分析以偵測酶促產物及內標。為進行質譜分析，以正離子模式操作電噴霧源且以母離子掃描模式偵測離子。酶促產物之量由產物與內標之離子豐度比減去空白樣計算。可偵測ABG與GALC。
實施例5：在一替代性具體實例中，藉由免疫分析定量與式I受質之反應產物。將點樣於濾紙上之血液在緩衝液中復原以釋放活性組分。向反應室中添加一種或一系列受質且使反應進行隔夜(約14小時)。藉由添加6倍體積甘胺酸/NaOH(pH 10.4)淬滅反應。向高結合性經照射微量滴定盤之孔中添加各反應物之樣品且培育隔夜以使反應產物與盤之各孔 充分結合。亦將產生標準曲線的於類似緩衝液/樣品中之產物添加至盤中作為定量基礎。完成與盤表面結合後，藉由使用噴瓶、盤洗滌器或任何其他自動或非自動盤洗滌系統用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌孔兩次。隨後藉由添加阻斷劑阻斷蛋白質結合之任何其他位點，該阻斷劑說明性地包括含3%牛血清白蛋白之PBS或此項技術中已知之任何其他合成或天然阻斷劑。在室溫下培育阻斷劑兩小時。用PBS洗滌孔三次。隨後將一次抗體添加至孔中以識別且結合保留之受質或產物。在孔中培育抗體至少2小時。洗滌盤四次以移除未結合之抗體。若一次抗體經標記，則將盤用於偵測。視情況，將經標記二次抗體置於盤之各孔中且使得再培育2小時，繼而洗滌4次且藉由適當方法(諸如藉由螢光或光學盤讀取器)偵測。
實施例6：在一替代性具體實例中，藉由免疫分析定量與式III受質之反應產物。將點樣於濾紙上之血液在緩衝液中復原以釋放活性組分。向反應室、較佳微盤孔中添加一種或一系列固定於經編碼粒子之受質且使反應進行隔夜(約14小時)。亦將產生標準曲線的於類似緩衝液/樣品中之酶添加至經編碼粒子之各別組中作為定量基礎。藉由添加6倍體積甘胺酸/NaOH(pH 10.4)淬滅反應。隨後將一次抗體添加至孔中以識別且結合保留之受質或產物。培育抗體至少30分鐘。若一次抗體經標記，則該分析準備進行偵測。視情況，將經標記二次抗體置於盤之各孔中且再培育30分鐘。藉由流式細胞儀完成偵測。
實施例7：式I之一例示性具體實例的B2上的活性末端胺基或式II或III之R1或R2基團易於進行諸多標記程序。在一代表性實施例中，末端胺尤其用氟異硫氰酸酯(fluoroisothiocyanate；FITC)標記。藉由向B2 基團之末端胺添加FITC分子衍生受質。可對不在末端碳上之胺基(若存在)執行類似修飾。將經純化/凍乾之受質再懸浮於0.1M 5mg/mL濃度之碳酸氫鈉緩衝液(pH 9.0)中。在與受質反應前不久，在黑暗中將5mg FITC染料溶解於0.5ml DMSO中。在溫和渦旋下添加0.1ml受質溶液之染料溶液且在室溫下在黑暗中培育1小時。藉由在10×300mm在磷酸鹽緩衝鹽水中預平衡之Sephadex G管柱上凝膠過濾而移除自由未反應染料。藉由質譜或此項技術中已知之其他方法測定最終產物之濃度。視情況濃縮經標記受質且分成數份以儲存在-20℃下直至進一步使用。
將經標記受質用於偵測葡糖腦苷脂酶活性及偵測高歇氏病(Gaucher's disease)之反應中。對於各患者或對照樣品，自濾紙上之乾血區打出3mm直徑之圓片置於微離心管或96孔微量滴定盤之孔中。隨後將血液圓片直接與分析溶液一起培育，該分析溶液含有最終濃度為5μmol/L之經標記受質及最終濃度為0.1μmol/L之內標。在37℃下在恆溫空氣振盪器中在迴轉式振盪(150rpm)下培育含有血液圓片之分析混合物15至24小時。培育期後，向各管或孔中添加純甲醇之等分試樣以終止酶促反應。向含有HPLC移動相(甲醇：水：乙酸82：18：0.1 vol/vol/vol)之第二管中添加反應物樣品。在4.6×250-mm Symmetry C18逆相HPLC管柱(Waters,Milford,MA)上以1.3mL/min之速率使用82：18：0.1 vol/vol/vol之甲醇：水：乙酸作為移動相等度分離20-μl經淬滅反應溶液之等分試樣。使用螢光偵測器(L-7480型；Hitachi,Naperville,IL)在中等增益靈敏度下連續監測螢光強度。藉由比較峰面積與包含已知濃度經標記產物之外標的峰面積測定樣品中經標記產物之量。反應物中產物之濃度可容易地測定，且葡糖腦苷脂酶之活性藉由除以 每單位反應時間之產物莫耳數求出。
本說明書中所提及之任何專利或公開案表明熟習本發明所屬之技術者的水準。此等專利及公開案以引用的方式併入本文中，引用程度如同各個別公開案經特別且個別指示以引用的方式完全併入本文中一般。
熟習此項技術者應易於瞭解，本發明可經充分修改以執行目標且獲得所提及之目的及優點以及其中所固有之目的及優點。本發明之實施例以及本文所述之方法、程序、處理、分子及特定化合物目前代表特定具體實例，為例示性的，且不欲限制本發明之範疇。顯而易見，存在其他具體實例且其涵蓋在由申請專利範圍之範疇所界定之本發明精神內。

Claims (54)

  1. 一種用於分析酶之受質，其具有下式： 其中A為由糖苷鍵連接於O之單醣或二醣；B1選自由以下組成之群：C1-C20烷基；含有雜原子之C1-C20烷基、C2-C20烯基；含有雜原子之C2-C20烯基、經取代或未經取代之C6-C20芳基；B2選自由以下組成之群：C2-C7醯胺基；C2-C7胺甲酸乙酯；C2-C7酯、C2-C7脲基；C2-C7胺甲醯基；C2-C7羰基；C1-C7烷基；含有雜原子之C1-C7烷基；具有取代基N、O或S之C1-C7烷基；C2-C7烯基；含有雜原子之C2-C7烯基；具有取代基N、O或S之C2-C7烯基；且B3選自由以下組成之群：具有取代基N、O或S之C1-C20烷基；C1-C20烷基、含有雜原子之C1-C20烷基；C4-C20醚；C1-C20酯；C1-C20烯基；含有雜原子之C1-C20烯基；具有取代基N、O或S之C2-C20烯基；C1-C20炔基；含有雜原子之C1-C20炔基；具有取代基N、O或S之C2-C20炔基、C6-C20芳基；及含有雜原子N、O或S之C6-C20雜環。
  2. 如申請專利範圍第1項之受質，其中A為醛己糖或酮己糖。
  3. 如申請專利範圍第1項之受質，其中A為D-葡萄糖或D-半乳糖。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之受質，其中B1為亞甲基。
  5. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之受質，其中B2為C2-C7醯胺基。
  6. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之受質，其中B3為具有取代 基N、O或S之C2-C20烯基。
  7. 如申請專利範圍第1項之受質，其中A為D-葡萄糖或D-半乳糖；B1為C1-C2烷基或C6芳基；且B2為C2-C7醯胺基。
  8. 如申請專利範圍第7項之受質，其中B3為具有取代基N、O或S之C2-C20烯基。
  9. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之受質，其包含： 其中：A為醛己糖或酮己糖；R1為C1-C6烷基或C2-C20烯基；且R2為C1-C20烷基、具有取代基N、O或S之C1-C20烷基、C1-C20烯基或具有取代基N、O或S之C1-C20烯基。
  10. 如申請專利範圍第9項之化合物，其中A為D-葡萄糖或D-半乳糖，R1為C4-C6烷基，且R2為C13-C20烷基、具有取代基N、O或S之C13-C20烷基、C13-C20烯基或具有取代基N、O或S之C13-C20烯基。
  11. 如申請專利範圍第10項之化合物，其中R2為C13烷基。
  12. 一種用於分析酶之受質，其包含： 其中A為由糖苷鍵連接於O之單醣或二醣； B1選自由以下組成之群：C1-C20烷基；含有雜原子之C1-C20烷基、C2-C20烯基；含有雜原子之C2-C20烯基；及經取代或未經取代之C6-C20芳基；R1'為經取代或未經取代之C或N；R2'為經取代或未經取代之C、經取代或未經取代之N、O或S；R3'為經取代或未經取代之C、N或O；R4'為不存在、經取代或未經取代之C1-C2、O或S；R1為：C1-C6烷基；含有雜原子之C1-C7烷基：具有取代基N、O或S之C1-C7烷基；C2-C7烯基；含有雜原子之C2-C7烯基；具有取代基N、O或S之C2-C7烯基；R5'為不存在、經取代或未經取代之C1-C2；O或S；且R6'為C1-C20烷基、含有雜原子之C1-C20烷基；具有取代基N、O或S之C1-C20烷基；C4-C20醚；C1-C20酯；C1-C20烯基；含有雜原子之C1-C20烯基；具有取代基N、O或S之C2-C20烯基；C6-C20芳基；及含有雜原子N、O或S之C6-C20雜環。
  13. 如申請專利範圍第13項之受質，其中A為醛己糖或酮己糖。
  14. 如申請專利範圍第14項之受質，其中A為D-葡萄糖或D-半乳糖。
  15. 如申請專利範圍第12項至第14項中任一項之受質，其選自由以下組成之群：，其中R2'為經取代或未經取代之C或經取代或未經 取代之N； ，其中R2"為H或甲基且R2'''為H或甲基；及，其中R3'為經取代或未經取代之C；且R4'為不存在、經取代或未經取代之C1-C2、O或S。
  16. 如申請專利範圍第12項至第14項中任一項之受質，其包含： 其中：A為醛己糖或酮己糖；R1為C1-C6烷基或C2-C20烯基；且R2為C1-C20烷基、具有取代基N、O或S之C1-C20烷基、C1-C20烯基或具有取代基N、O或S之C1-C20烯基。
  17. 如申請專利範圍第16項之受質，其中A為D-葡萄糖或D-半乳糖，R1為C4-C6烷基；且R2為C13-C20烷基。
  18. 如申請專利範圍第12項至第14項中任一項之受質，其選自由以下組成之群：，其中R2'為經取代或未經取代之C或經取代或未經取代之N；且R6'為C1-C20烷基、含有雜原子之C1-C20烷基；具有取代基N、O或S之C1-C20烷基；C4-C20醚；C1-C20酯；C1-C20烯基；含有雜原子之C1-C20烯基；具有取代基N、O或S之C2-C20烯基；C6-C20芳基；及含有雜原子N、O或S之C6-C20雜環；，其中R2'為經取代或未經取代之C或經取代或未經取代之N；R2為C13-C20烷基、含有雜原子之C13-C20烷基、具有取代基N、O或S之C13-C20烷基；C13-C20烯基、含有雜原子之C13-C20烯基；或具有取代基N、O或S之C13-C20烯基；及，其中R2為C13-C20烷基、含有雜原子之C13-C20烷基、具有取代基N、O或S之C13-C20烷基；C13-C20烯基、含有雜原子之C13-C20烯基；或具有取代基N、O或S之C13-C20烯基。
  19. 一種用於分析酶之受質，其由以下物質組成：
  20. 一種用於分析酶之受質，其由以下物質組成：
  21. 一種用於分析酶之受質，其包含：，其中n為0、1、2、3、4或5。
  22. 如申請專利範圍第21項之受質，其中A為醛己糖或酮己糖。
  23. 如申請專利範圍第21項之受質，其中A為D-葡萄糖或D-半乳糖。
  24. 一種分子，其包含下式： 其中B1選自由以下組成之群：C1-C20烷基；含有雜原子之C1-C20烷基、C2-C20烯基；含有雜原子之C2-C20烯基、經取代或未經取代之C6-C20芳基；B2選自由以下組成之群：C2-C7胺甲酸乙酯；C2-C7醯胺基、C2-C7酯、C2-C7脲基；C2-C7胺甲醯基；C2-C7羰基；C1-C7烷基；含有雜原子之C1-C7烷基；具有取代基N、O或S之C1-C7烷基；C2-C7烯基；含有雜原子之 C2-C7烯基；具有取代基N、O或S之C2-C7烯基；且B3選自由以下組成之群：C1-C20烷基、含有雜原子之C1-C20烷基；具有取代基N、O或S之C1-C20烷基、C4-C20醚；C1-C20酯；C1-C20烯基；含有雜原子之C1-C20烯基；具有取代基N、O或S之C2-C20烯基；C1-C20炔基；含有雜原子之C1-C20炔基；具有取代基N、O或S之C2-C20炔基；C6-C20芳基；及含有雜原子N、O或S之C6-C20雜環。
  25. 如申請專利範圍第24項之分子，其包括元素之穩定次級分佈同位素。
  26. 如申請專利範圍第25項之分子，其中該穩定次級分佈同位素在每次出現時選自由2H、13C、15N、17O、18O、31P及34S組成之群。
  27. 如申請專利範圍第24項之分子，其包含該B2上元素之穩定次級分佈同位素。
  28. 如申請專利範圍第24項之分子，其包含該B3上元素之穩定次級分佈同位素。
  29. 如申請專利範圍第24項至第28項中任一項之分子，其中B1為亞甲基。
  30. 如申請專利範圍第24項至第28項中任一項之分子，其中B2為C2-C7醯胺基。
  31. 如申請專利範圍第24項至第28項中任一項之分子，其中B3為具有取代基N、O或S之C2-C20烯基。
  32. 如申請專利範圍第24項至第28項中任一項之分子，其中B1為C1-C2烷基；B2為C2-C7醯胺基，且B3為包含以羥基形式存在之取代基O的C13-C20烯基。
  33. 如申請專利範圍第24項至第28項中任一項之分子，其包含： ；或
  34. 一種偵測試管內酶活性之方法，其包含：使含有目標酶之樣品與如申請專利範圍第1項至第3項、第12項至第14項或第19項至第23項中任一項之受質在如下條件下接觸，其中該目標酶能夠作用於該受質而產生酶促產物；及偵測該酶促產物。
  35. 如申請專利範圍第34項之方法，其中該目標酶為酸性β-葡糖腦苷脂酶且該受質為如申請專利範圍第1項之受質，其中該B2為C2-C7醯胺基，且B3為具有取代基N、O或S之C13-C20烯基。
  36. 如申請專利範圍第34項之方法，其中該目標酶為酸性半乳糖腦苷脂β-半乳糖苷酶且其中該B2為C2-C7醯胺基，且B3為具有以羥基形式存在之取代基O的C13-C20。
  37. 如申請專利範圍第34項之方法，其中該偵測步驟藉由質譜進行。
  38. 如申請專利範圍第34項之方法，其進一步包含使該樣品與內標接觸，該內標具有如申請專利範圍第24項至第28項中任一項之結構。
  39. 如申請專利範圍第38項之方法，其中該內標包含2H。
  40. 如申請專利範圍第38項之方法，其進一步包含診斷患有溶酶體儲積症 之個體。
  41. 一種用於藉由如下方法偵測酶活性之受質，其包含：使含有目標酶之樣品與該受質在如下條件下接觸，其中該目標酶能夠作用於該受質而產生酶促產物；及偵測該酶促產物；該受質包含： 其中A為由糖苷鍵連接於O之單醣或二醣；B1選自由以下組成之群：C1-C20烷基；含有雜原子之C1-C20烷基、C2-C20烯基；含有雜原子之C2-C20烯基；及經取代或未經取代之C6-C20芳基；R1'為經取代或未經取代之C或N；R2'為經取代或未經取代之C、經取代或未經取代之N、O或S；R3'為經取代或未經取代之C、N或O；R4'為不存在、經取代或未經取代之C1-C2、O或S；R1為：C1-C6烷基；含有雜原子之C1-C7烷基：具有取代基N、O或S之C1-C7烷基；C2-C7烯基；含有雜原子之C2-C7烯基；具有取代基N、O或S之C2-C7烯基；R5'為不存在、經取代或未經取代之C1-C2；O或S；且R6'為C1-C20烷基、含有雜原子之C1-C20烷基；具有取代基N、O或S之 C1-C20烷基；C4-C20醚；C1-C20酯；C1-C20烯基；含有雜原子之C1-C20烯基；具有取代基N、O或S之C2-C20烯基；C6-C20芳基；及含有雜原子N、O或S之C6-C20雜環。
  42. 如申請專利範圍第41項之受質，其中A為醛己糖或酮己糖。
  43. 如申請專利範圍第41項之受質，其中A為D-葡萄糖或D-半乳糖。
  44. 如申請專利範圍第41項至第43項中任一項之受質，其選自由以下組成之群： ，其中R2'為經取代或未經取代之C或經取代或未經取代之N； ，其中R2"為H或甲基且R2'''為H或甲基；及，其中R3'為經取代或未經取代之C；且 R4'為不存在、經取代或未經取代之C1-C2、O或S。
  45. 如申請專利範圍第41項至第43項中任一項之受質，其包含： 其中：A為醛己糖或酮己糖；R1為C1-C6烷基或C2-C20烯基；且R2為C1-C20烷基、具有取代基N、O或S之C1-C20烷基、C1-C20烯基或具有取代基N、O或S之C1-C20烯基。
  46. 如申請專利範圍第45項之受質，其中A為D-葡萄糖或D-半乳糖，R1為C4-C6烷基；且R2為C13-C20烷基。
  47. 如申請專利範圍第41項至第43項中任一項之受質，其選自由以下組成之群：，其中R2'為經取代或未經取代之C或經取代或未經取代之N；且R6'為C1-C20烷基、含有雜原子之C1-C20烷基；具有取代基N、O或S之C1-C20烷基；C4-C20醚；C1-C20酯；C1-C20烯基；含有雜原子之C1-C20烯基；具有取代基N、O或S之C2-C20烯基；C6-C20芳基；及含有雜原子N、O或S之C6-C20雜環； ，其中R2'為經取代或未經取代之C或經取代或未經取代之N；R2為C13-C20烷基、含有雜原子之C13-C20烷基、具有取代基N、O或S之C13-C20烷基；C13-C20烯基、含有雜原子之C13-C20烯基；或具有取代基N、O或S之C13-C20烯基；及，其中R2為C13-C20烷基、含有雜原子之C13-C20烷基、具有取代基N、O或S之C13-C20烷基；C13-C20烯基、含有雜原子之C13-C20烯基；或具有取代基N、O或S之C13-C20烯基。
  48. 如申請專利範圍第41項至第43項中任一項之受質，其由以下物質組成：
  49. 如申請專利範圍第41項至第43項中任一項之受質，其由以下物質組成：
  50. 如申請專利範圍第41項至第43項中任一項之受質，其由以下物質組 成：，其中n為0、1、2、3、4或5。
  51. 如申請專利範圍第50項之受質，其中A為醛己糖或酮己糖。
  52. 如申請專利範圍第50項之受質，其中A為D-葡萄糖或D-半乳糖。
  53. 一種受質，其實質上如說明書中所述。
  54. 一種內標，其實質上如說明書中所述。
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