WO2022019336A1 - 重水素化標識化合物およびその製造方法 - Google Patents

重水素化標識化合物およびその製造方法 Download PDF

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WO2022019336A1
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fatty acid
mmol
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acid
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良 滝田
順子 渡辺
康平 渡邉
弘太郎 濱
和明 横山
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国立大学法人 東京大学
学校法人帝京大学
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    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode

Definitions

  • the present invention relates to a deuterated labeled compound and a method for producing the same.
  • the present invention also relates to a method for quantifying a lipid or a metabolite thereof and a method for analyzing lipid metabolism.
  • Lipids are one of the three major nutrients along with carbohydrates and proteins, and have various physiological functions such as signal transmitters as well as energy sources and components of biological membranes.
  • fatty acids which are the basic building blocks of lipids, have a simple structure with a carboxy group at the end of a long-chain hydrocarbon skeleton, but there are various types due to differences in carbon number, double bonds, etc. It is known to exhibit various physiological functions. For example, in relation to diseases, an increase in extremely long-chain fatty acids is observed in tissues of the whole body in adrenoleukodystrophy, and trans fatty acids have health effects. We are calling on governments to reduce the number by 2023.
  • GC-MS Gas chromatography-mass spectrometry
  • LC-MS liquid chromatography-mass spectrometry
  • Non-Patent Document 1 the method of deuterating and labeling a fatty acid with a ruthenium catalyst has a problem that the reaction result depends on the position and number of unsaturated bonds and cannot be applied to a trans form. Therefore, it is expected to establish a quantitative method for fatty acids, which is important for metabolic analysis of lipids and fatty acids.
  • An object of the present invention is to provide a novel deuterated labeled compound and a method for producing the same. It is also an object of the present invention to provide a novel method for quantifying lipids or fatty acid-binding proteins or their metabolites, and a novel method for analyzing in vivo metabolism.
  • the present inventors have found that a deuterated labeled compound can be synthesized by deuterating at least the ⁇ -position of a fatty acid, and that this deuteration technique can be applied to various fatty acids.
  • the present inventors have also confirmed that lipid metabolism analysis is possible using the deuterated labeled compound.
  • the present invention is based on these findings.
  • a deuterated labeled compound characterized in that at least the ⁇ -position of the fatty acid is deuterated.
  • the deuterated labeled compound of the present invention is advantageous in that it can be widely used for quantitative analysis and metabolic analysis of lipids and fatty acids.
  • Deuterated labeled compounds of the present invention also can advantageously be synthesized using inexpensive heavy water or methanol -d 1 as heavy hydrogen source. Since the deuterated labeled compound of the present invention is further distinguished from fatty acids and lipids existing in the living body, it is also advantageous in that it can be used as a metabolite marker for in vivo metabolism analysis and the like.
  • FIG. 1 shows the results of LC-MS / MS analysis of phosphatidylcholine (constituent fatty acid: palmitic acid / linoelaidic acid-D 4 ) (PC 16: 0 / D 4-trans-18: 2).
  • FIG. 2 shows the results (volcano plot) of a comprehensive analysis of metabolites (derivatives) of phosphatidylcholine (PC) produced in activated human platelets.
  • E is a trans type
  • Z is a cis type
  • a p-value indicates a significance probability.
  • FIG. 3 shows the stereospecificity of the acyl transfer activity of deuterated labeled fatty acids in human platelets.
  • FIG. 4A shows the HODE transfer activity of AGPAT7 (p indicates a significant probability).
  • FIG. 4B shows the results of dynamic analysis of the HODE transfer activity of AGPAT7.
  • alkyl as all or part of a group means a straight-chain or branched hydrocarbon chain, and in the case of an alkyl having 1 to 4 carbon atoms, for example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl. , N-Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl.
  • alkenyl as all or part of a group means a straight or branched hydrocarbon chain having one or more double bonds.
  • halogen atom examples include chlorine (Cl), bromine (Br), fluorine (F) and iodine (I), with chlorine, bromine and iodine being preferred.
  • aromatic hydrocarbon group and “aromatic heterocyclic group” refer to a ring compound having aromatic characteristics or a portion thereof, and are stable, for example, including a cyclic conjugated system having 4n + 2 ⁇ electrons.
  • the aromatic hydrocarbon group is a 6 to 14-membered unsaturated carbocycle, and may be a monocyclic group or a two- or three-ring aromatic fused ring group, for example, benzene, naphthalene, and the like. Anthracene and phenanthrene can be mentioned.
  • the aromatic heterocyclic group is a 5- to 14-membered unsaturated heterocycle containing one or more heterocyclic atoms selected from the group consisting of oxygen atom, nitrogen atom and sulfur atom as ring member atoms. It may be a monocyclic group or a 2 or 3 ring type aromatic fused heterocyclic group.
  • the number of heteroatoms can be one or more, for example, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2 or 1.
  • Examples of the aromatic heterocyclic group include pyridine, quinoline, purine, isoquinoline and oxazoline.
  • the deuterated labeled compound of the present invention at least the ⁇ -position of the ⁇ -position and the ⁇ -position of the fatty acid is deuterated.
  • the deuterated labeled compound of the present invention may also have the ⁇ -position of the fatty acid further deuterated.
  • the ⁇ -position and ⁇ -position of the fatty acid refer to the carbon atom ( ⁇ carbon) closest to the carboxy group at the terminal of the fatty acid and the carbon atom ( ⁇ carbon) closest to the second.
  • deuteration means that hydrogen on the carbon atom at the ⁇ -position or ⁇ -position is replaced with deuterium.
  • deuterium at the ⁇ -position of a fatty acid means on the carbon atom at the ⁇ -position. It means that the hydrogen in the above is replaced with deuterium, which is synonymous with the existence of deuterium on the carbon atom at the ⁇ -position (deuterium is bonded to the carbon atom).
  • the number of deuteriums present in the deuterium-labeled compound of the present invention is 1 to 4, and it is preferable when the deuterium-labeled compound of the present invention is provided as a labeled compound that is not affected by an endogenous substance. Is 3 or 4, more preferably 4.
  • the number of deuteriums present on the carbon atom at the ⁇ -position of the fatty acid is 1 or 2
  • the number of deuteriums present on the carbon atom at the ⁇ -position is 1 or 2.
  • the number of deuterium present on the ⁇ -position carbon atom of the fatty acid in the deuterium-labeled compound of the present invention is two, and the deuterium present on the ⁇ -position carbon atom is heavy.
  • the number of hydrogens is 1 or 2 (more preferably 2).
  • the deuterated labeled compound of the present invention may be a fatty acid or a derivative thereof itself, or may be a compound having a fatty acid as a part of its structure.
  • the deuterated labeled compound of the present invention is a fatty acid or a derivative thereof itself, the ⁇ -position of the fatty acid is deuterated as described above.
  • the deuterated labeled compound of the present invention has a fatty acid as a part of the structure, one or more fatty acids can be a part of the structure.
  • the deuterated labeled compound of the present invention is a compound having one fatty acid as a part of the structure, the ⁇ -position of the fatty acid is deuterated.
  • the deuterated labeled compound of the present invention is a compound having two or more fatty acids as a part of the structure, the ⁇ -position of at least one fatty acid is deuterated.
  • the two or more fatty acids may be partially or wholly the same type of fatty acid, or may be different types of fatty acid.
  • the "fatty acid” includes either a saturated fatty acid or an unsaturated fatty acid from the viewpoint of the degree of unsaturation.
  • Fatty acids are also short-chain fatty acids (2-4 carbon atoms), medium-chain fatty acids (5-11 carbon atoms), and long-chain fatty acids (12-22 carbon atoms) from the viewpoint of carbon number (including carbon of carboxy group). , Which contains any of very long-chain fatty acids (23 or more carbon atoms).
  • the lower limit of the carbon number of the fatty acid can be, for example, 2, 3, 5, 8, 12 or 16, and the upper limit of the carbon number of the fatty acid is, for example, 36, 30 or 25. The upper and lower limits of these carbon numbers can be combined arbitrarily.
  • the number of carbon atoms of the fatty acid can be, for example, 2 to 36, 2 to 30, 2 to 25, 3 to 36, 3 to 30, 3 to 25, 8 to 25 or 16 to 25. ..
  • Unsaturated fatty acids may also be cis or trans.
  • the "fatty acid” has one or more (for example, 1 to 3 or 1 to 2) hydrogen atoms on a hydrocarbon group as a hydroxyl group, an alkoxy group, an epoxy group, an amino group, a halogen group, or a cyano group. It also includes those substituted with a functional group such as a group, an alkylthio, a (tert-butyldimethylsilyl) oxy group (the functional groups may be the same or different).
  • fatty acids examples include palmitic acid, stearic acid, oleic acid, elaidic acid, linolenic acid, linolenic acid, linolenic acid, 13-hydroxy-9Z, 11E-octadecadienoic acid (13-HODE), (S).
  • the "fatty acid derivative” refers to a compound obtained by derivatizing the above-mentioned fatty acid, and examples thereof include fatty acid esters, fatty acid dimethyl disulfide derivatives, fatty acid dimethyl oxazoline derivatives, and fatty acid silyl derivatives.
  • Fatty acid derivatives are advantageous in that they can be used in fatty acid analysis using GS-MS or LC-MS.
  • the "fatty acid ester” refers to a compound (ester) obtained by esterifying the above-mentioned fatty acid, and specifically means a compound obtained by esterifying the carboxy group of the fatty acid.
  • the fatty acid ester include alkyl esters (for example, alkyl esters having 1 to 6 carbon atoms (preferably 1 to 4 carbon atoms) such as methyl esters, ethyl esters, propyl esters, butyl esters, pentyl esters, and hexyl esters).
  • alkyl esters for example, alkyl esters having 1 to 6 carbon atoms (preferably 1 to 4 carbon atoms) such as methyl esters, ethyl esters, propyl esters, butyl esters, pentyl esters, and hexyl esters.
  • aryl esters eg, aromatic hydrocarbon esters such as phenyl esters.
  • the "fatty acid dimethyl disulfide derivative” refers to a compound obtained by derivatizing the above-mentioned fatty acid with dimethyl disulfide, and specifically, a methyl sulfide group is introduced into the unsaturated position (two carbon atoms) of the fatty acid.
  • the methyl sulfide group can be introduced by reacting dimethyl disulfide with the unsaturated position of an unsaturated fatty acid or an ester thereof (for example, a methyl ester).
  • the "fatty acid dimethyloxazoline derivative” refers to a compound obtained by converting the above-mentioned fatty acid into dimethyloxazoline, and specifically, refers to a compound in which a dimethyloxazoline group is introduced into the carboxy moiety of the fatty acid.
  • the dimethyloxazoline derivative can be obtained by reacting a fatty acid ester (for example, methyl ester) with 2-amino-2-methylpropanol.
  • the "fatty acid silyl derivative” refers to the above-mentioned compound obtained by silylating a fatty acid (silyl body), and specifically refers to a compound obtained by silylating a carboxy group of a fatty acid.
  • the fatty acid silyl derivative can be obtained by reacting a fatty acid with a silylating agent.
  • the silylating agent include a trimethylsilylating agent, a dimethylsilylating agent, a dimethylalkylsilylating agent, a halomethylsilylating agent, and a cyclic silylene agent.
  • lipids examples include cholesterol esters, acylglycerols (eg, monoacylglycerols, diacylglycerols, triacylglycerols), phospholipids (eg, phosphatidylcholine (sometimes referred to as "PC” herein)), phosphatidylinositol, phosphatidyl.
  • acylglycerols eg, monoacylglycerols, diacylglycerols, triacylglycerols
  • phospholipids eg, phosphatidylcholine (sometimes referred to as "PC” herein)
  • PC phosphatidylinositol
  • fatty acid-binding proteins are type II platelet activator acetylhydrolase, which is a covalent bond of myristic acid to the amino end, a synaptic posterior membrane thickening protein 95, which is a covalent bond of palmitic acid to a cysteine residue, and a serine residue. Examples thereof include grelin covalently bonded to octanoic acid and Rab protein covalently bonded to a cysteine residue with isoprenoid.
  • the compound of the formula (II) or the compound of the formula (III) described later is provided.
  • the deuterated labeled compound of the present invention can be produced by a deuteration reaction with a substrate compound.
  • the dehydrogenation reaction step includes at least a dehydrogenation reaction step for the ⁇ -position of the fatty acid, and may further include a dehydrogenation reaction step for the ⁇ -position of the fatty acid.
  • the order of both steps may be first.
  • the dehydrogenation reaction for the ⁇ -position of fatty acid in the production method of the present invention can be carried out by dehydrogenating the fatty acid amide in the presence of a platinum group metal catalyst.
  • the platinum group metal catalyst include palladium catalysts (for example, palladium acetate, palladium trifluoroacetate, palladium pivalate, palladium chloride, allylpalladium chloride dimer, palladium acetylacetonate, tris (dibenzilidenacetone) dipalladium, and bis.
  • a deuterium-containing compound may be present as a source of deuterium.
  • the source of deuterium include heavy water, methanol-d 1 , methanol-d 4 , ethanol-d 1 , ethanol-d 6 , isopropanol-d 1 , isopropanol- 8, etc., which are reactive, costly, and safe. Heavy water is preferable from the viewpoint of sex.
  • the dehydrogenation reaction using a platinum group metal catalyst in the present invention can be carried out in a solvent in the presence of a base.
  • a base include, for example, cesium pivalate, cesium acetate, potassium pivalate, potassium acetate, sodium pivalate, sodium acetate, lithium pivalate, lithium acetate, zinc pivalate, zinc acetate, calcium pivalate, calcium acetate.
  • cesium pivalate, magnesium acetate, cesium carbonate, cesium hydrogencarbonate and the like, and cesium pivalate is preferable from the viewpoint of reactivity.
  • solvent examples include organic solvents, for example, toluene, benzene, trifluoromethylbenzene, hexane, cyclohexane, pentane, heptane, methylene chloride, chloroform and the like, and toluene is preferable from the viewpoint of reactivity. ..
  • the dehydrogenation reaction using a platinum group metal catalyst in the present invention is also carried out at room temperature to 130 ° C. (preferably 70 to 90 ° C.) in the presence of 0.02 to 4 equivalents (preferably 0.2 to 2 equivalents) of the base. ), It can be carried out by stirring under the conditions of 1 to 24 hours (preferably 17 to 19 hours).
  • the deuteration reaction for the ⁇ -position of fatty acid in the production method of the present invention can be carried out by deuterating the fatty acid amide in the presence of a base.
  • a carbonate for example, potassium carbonate, sodium carbonate, cesium carbonate, lithium carbonate
  • a carboxylate for example, an acetate
  • a hydrogen carbonate for example, a hydroxide salt, a phosphate
  • an alkali metal Salts eg, lithium salt, sodium salt, potassium salt, cesium salt
  • alkaline earth metal salts eg, magnesium salt, calcium salt, barium salt
  • the deuteration reaction for the ⁇ -position of the fatty acid can be carried out in a solvent, and the solvent can also be a source of deuterium.
  • the solvent can also be a source of deuterium. Examples include methanol -d 1, methanol -d 4, ethanol -d 1, ethanol -d 6, isopropanol -d 1, isopropanol -d 8, heavy water (D 2 O), acetone -d 6, chloroform -d 1 , acetonitrile-d 3 , dimethyl sulfoxide-d 6, and the like can be mentioned.
  • the dehydrogenation reaction for the ⁇ -position of the above fatty acid is carried out at a temperature of room temperature to 120 ° C. (preferably 70 to 90 ° C.) in the presence of 0.1 to 3 equivalents (preferably 0.5 to 2 equivalents) of the base. It can be carried out by stirring under the conditions of 1 to 24 hours (preferably 16 to 20 hours).
  • fatty acid amide and its preparation Any fatty acid amide can be used as long as it is a substrate for the dehydrogenation reaction of the present invention, and for example, a compound of the following formula (I) can be used.
  • R a- C ( O) -N (-R b ) -R c ... (I)
  • R a represents a hydrocarbon chain bonded to the carboxyl group of the fatty acid
  • R b represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • R c is the following group (i), group (ii) or group (iii) :.
  • a two-ringed 9 to 10-membered aromatic heterocyclic group (this heterocycle may preferably contain 1 to 4 heterogeneous atoms as ring-membered atoms, and may be the same or different. Often, one selected from an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, a halogen atom, a carboxy group, a benzyl group, an amino group, an aromatic hydrocarbon group and an aromatic heterocyclic group.
  • Ra represents, for example, an alkyl group or an alkenyl group, and the alkyl group or the alkenyl group has one or more (for example, 1 to 3 or 1 to 2) functional groups (the functional groups are the same). It may be different, for example, a hydroxyl group, an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, an epoxy group, an amino group, a halogen group, a cyano group, an alkylthio group having 1 to 4 carbon atoms and (tert-butyldimethylsilyl) oxy. It may be substituted with (which can be selected from the groups).
  • the lower limit of the carbon number of the alkyl group and the alkenyl group represented by Ra can be, for example, 1, 2, 4, 7, 11 or 15, and the upper limit of the carbon number is, for example, 36 or 35. , 30, 29 or 24, and the upper and lower limits of these carbon atoms can be arbitrarily combined.
  • the number of carbon atoms of the alkyl group and the alkenyl group represented by Ra is, for example, 1 to 36, 1 to 30, 2 to 35, 2 to 29, 2 to 24, 7 to 24 or 15 to 24. be able to.
  • R b preferably represents a hydrogen atom.
  • R c is preferably a bicyclic 10-membered aromatic heterocyclic group, which may contain one or two nitrogen atoms as ring-membered atoms. ), More preferably quinoline and purine, and further preferably quinoline-8-yl group and purin-6-yl.
  • R c is preferably a ⁇ monocyclic 6-membered aromatic heterocyclic group, preferably 1 or 2 nitrogen atoms as ring-membered atoms. More preferably, a phenyl group substituted with (may contain one nitrogen atom as a ring member atom); or-group-N (-R 11 ) ( -R 12 ) (R 11 and R 12 are the same). Or different, they represent a hydrogen atom or methyl, preferably R 11 and R 12 represent methyl), group-OR 13 (R 13 represents methyl), group-SR 14 (R 14 represents methyl).
  • R 15 and R 16 each independently represent an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and R 15 and R 16 are the carbons to which they are bonded. It may be combined with an atom to form a 5-membered heterocycle, which may be substituted with one or two methyl groups) to represent a phenyl group substituted.
  • R c is, more preferably below (Ia), represents a group represented by any of (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (If) and (Ig).
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 may be the same or different, and may be the same or different, and have a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and an alkoxy having 1 to 4 carbon atoms.
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 may be the same or different, with an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, and a halogen.
  • R 7 may be the same or different, and may be the same or different, a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, a halogen atom, a carboxy group, a benzyl group, an amino group, and an aroma.
  • fatty acid amides of the formula (I) those in which R c represents a group of the formula (Ia) (8-quinoline amide and its derivative) are preferable from the viewpoint of reactivity.
  • the fatty acid amide used as a substrate for the dehydrogenation reaction of the present invention can be prepared by the fatty acid amidation reaction.
  • the amidation of a fatty acid can be carried out, for example, by reacting a fatty acid with a compound having an amino group by a condensation reaction of a carboxylic acid and an amine.
  • the fatty acid amide may be synthesized by carrying out the fatty acid amidation reaction prior to the dehydrogenation reaction to synthesize the fatty acid amide which is the substrate of the dehydrogenation reaction.
  • the amidation reaction of fatty acids is, for example, carboxylic acid: Ra- COOH ( Ra is synonymous with the contents defined above) and amine: HN (-R b ) ( -R c ) (R b and R).
  • c is synonymous with the content defined above) and can be carried out by reacting with a condensation reaction of a carboxylic acid and an amine.
  • Condensation reactions of carboxylic acids and amines are known, for example, Yang, Q. et al., ACS Catal. 2017, 7, 5220-5224. And Peng, J.-B. Et al., ACS Catal. 2019, It can be carried out by referring to 9, 2977-2893. Etc.
  • the production method of the present invention may further include a step of deprotecting the dehydrogenated fatty acid amide to convert it into a fatty acid ester, followed by hydrolyzing the ester.
  • the step of deprotecting the fatty acid amide (step of conversion to fatty acid ester) can be carried out according to a known method (for example, Deguchi, T. et al., ACS Catal. 2017, 7, 3157-3161.).
  • the step of hydrolyzing the ester can be carried out according to a known method (for example, Meyer, MP et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 430-439.). Specifically, it can be carried out according to the description of the examples described later.
  • the deuterated labeled compound of the present invention can be obtained by deprotecting the amide and hydrolyzing the ester.
  • At least the ⁇ -position of the ⁇ -position and ⁇ -position of the above may be deuterated, and the ⁇ -position of the fatty acid may be further deuterated, preferably the number of deuterium present on the carbon atom of the ⁇ -position of the fatty acid.
  • the ester of the deuterated labeled fatty acid of the present invention may be obtained without hydrolyzing the ester.
  • R d represents an alkyl group (for example, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms) or an aryl group (for example, an aromatic hydrocarbon group such as a phenyl group), which is a fatty acid.
  • At least the ⁇ -position of the ⁇ -position and the ⁇ -position may be dehydrogenated, and the ⁇ -position of the fatty acid may be further dehydrogenated. Examples thereof include dehydrogenated labeled fatty acid esters represented by two hydrogen atoms and one or two (more preferably two) dehydrogens present on the carbon atom at the ⁇ -position.
  • the deuterated labeled compound of the present invention When the deuterated labeled compound of the present invention is composed of a lipid, the deuterated labeled compound can be synthesized using a fatty acid or a derivative thereof, which is the deuterated labeled compound of the present invention.
  • a method for synthesizing a lipid is known, and the deuterated labeled lipid of the present invention can be synthesized according to a known method except that the deuterated labeled fatty acid of the present invention or a derivative thereof is used as the fatty acid.
  • the deuterated labeled lipid of the present invention can be synthesized by a known method using the deuterated labeled fatty acid of the present invention or a derivative thereof as a starting material.
  • cholesterol esters are described in Komura, K. et al., Synthesis. 2008, 3407-3410.
  • acylglycerols are described in Manhas, S. et al., Green Chem. 2019, 21, 5363-5367.
  • Phospholipids can be synthesized according to the description of Acharya, H. P. et al., Synlett. 2005, 2015-2018.
  • the deuterated labeled compound of the present invention is a stable isotope labeled compound, it can be used as an internal standard substance for mass spectrometry. That is, according to the present invention, there is provided a method for quantifying a lipid or fatty acid binding protein or a metabolite thereof, which comprises using the deuterated labeled compound of the present invention as an internal standard substance for mass spectrometry. The invention also provides the use of the deuterated labeled compounds of the invention as internal standards for mass spectrometry in methods of quantifying lipid or fatty acid binding proteins or their metabolites.
  • the quantification is performed using a standard substance as an index, but impurities and the like contained in the target sample may affect ionization and cannot be quantified accurately. Therefore, by using a substance having similar chemical properties and structure as the target substance as an internal standard substance, it is possible to correct the influence of ionization and accurately quantify the target substance.
  • the types of internal standard substances for lipids and their metabolites were limited to a small number, but according to the quantification method of the present invention and the use of the present invention, it has been difficult to accurately quantify lipids and their substances. It is also advantageous in that metabolites can be accurately quantified.
  • the method for quantifying a lipid or fatty acid-binding protein of the present invention or a metabolite thereof is a step of preparing a sample for mass spectrometry containing (A) a target sample, a standard substance and a dehydrogenation-labeled compound of the present invention, and (B). It may include a step of analyzing (analyzing) the sample for mass spectrometry by mass spectrometry.
  • the target sample include body fluids such as blood and urine, skin, oral mucosa, tissues obtained by surgery, foods, cosmetics, and pharmaceuticals.
  • the deuterated labeled compound of the present invention is a stable isotope labeled compound, it can also be used as a metabolite marker. That is, according to the present invention, there is provided a method (analytical method) for analyzing in vivo metabolism, which comprises using the deuterated labeled compound of the present invention as a metabolite marker. The present invention also provides the use of the deuterated labeled compound of the present invention as a metabolite marker in an analysis method (analytical method) of in vivo metabolism.
  • Examples of the metabolism in the body to be analyzed include metabolism of substances in the body such as lipid metabolism and glucose metabolism. According to the analysis method of the present invention and the use of the present invention, it is advantageous in that it is possible to analyze the metabolic mechanism of lipid, which has been difficult to accurately quantify.
  • the method for analyzing lipid metabolism of the present invention comprises (C) a step of administering the labeled compound of the present invention to a subject or using the labeled compound of the present invention in an in vitro evaluation system, and (D) a subject or an evaluation system. It may include a step of detecting or analyzing (analyzing) the presence of the labeled compound in the above. Detection or analysis of the presence of a labeling substance in a subject may be performed on body fluids or tissues collected from the subject or may be performed directly on the subject. Examples of the target include an animal model.
  • Examples of the evaluation system include cells, tissues, organs and organs isolated from living organisms; tissues, organs and organs prepared by regenerative medicine engineering techniques; cultured cells; microorganisms; enzymes and the like.
  • the detection and analysis of the presence of the labeling substance can be carried out, for example, by mass spectrometry or NMR.
  • Preparation of a sample suitable for the analytical method can be carried out according to a known method.
  • the method for analyzing lipid metabolism of the present invention and the use of the present invention can be carried out at least in step (D) in vitro.
  • the IR spectrum was measured with a spectrophotometer (Cary 630 FTIR, Agilent), the ESI mass spectrometry spectrum was measured with a mass spectrometer (micrOTOF-II, Bruker), and the melting point was measured with a melting point measuring instrument (MP-21 type, Yamato Science). All chemicals were reagent grade and were used as received. All reactions were performed in 10 mL screw cap tubes, Schlenk tubes, or eggplant flasks. Purification of the product in each reaction can be performed using a medium pressure preparative liquid chromatograph system (EPCLC-W-Prep 2XY, Yamazen) and a cartridge column (Purif-Pack®-EX, Illuminated Science), or silica gel (DIOL). Silica gel, Fuji Silysia) was used for normal phase column chromatography.
  • EPCLC-W-Prep 2XY Yamazen
  • a cartridge column Purif-Pack®-EX, Illuminated Science
  • silica gel DIOL
  • Examples 1 to 16 various fatty acids were deuterated. Moreover, in this Example (Example 17), deuterated lipid was synthesized using deuterated labeled fatty acid. Furthermore, in this example (Examples 18 to 21), lipid metabolism analysis was performed using deuterated labeled fatty acids. Hereinafter, they will be described in order.
  • Example 1 Production of deuterated labeled fatty acid (linoleic acid) (1) Preparation of (9Z, 12Z) -N- (quinoline-8-yl) octadeca-9,12-dienamide
  • Linoleic acid (1.40 g, 5.0 mmol), DMF (0.1 mL) and CH 2 Cl 2 (15 mL) were placed in a 50 mL dichloromethane tube under an argon atmosphere. After cooling to 0 ° C., oxalyl chloride (0.85 mL, 10 mmol) was added dropwise, and the mixture was stirred and reacted overnight at room temperature. All volatiles were then removed under reduced pressure.
  • the compound obtained in (1) above was first deuterated at the ⁇ -position and then deuterated at the ⁇ -position to obtain the title compound. Specifically, the procedure was performed according to the following procedures a and b.
  • a Deuterium at the ⁇ -position was performed.
  • the compound (205.9 mg, 0.506 mmol), palladium acetate (11.4 mg, 0.051 mmol, 10 mol%) and cesium pivalate (23.6 mg, 0.10 mmol, 20 mol%) obtained in (1) above were added. Placed in a 10 mL screw cap tube under air. After toluene (5.0 mL, 0.1 M) was added to dissolve the amide, heavy water (D 2 O) (0.50mL) was added to the mixture. The reaction was stirred at 80 ° C. for 18 hours and the progress was monitored by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS).
  • ESI-MS electrospray ionization mass spectrometry
  • the reaction mixture was cooled to room temperature, transferred to a separation funnel, diluted with ethyl acetate (AcOEt) and washed with brine.
  • the organic layer was dried over Na 2 SO 4 , filtered and evaporated under reduced pressure.
  • the crude ⁇ -position-deuterium labeled compound was crudely purified by silica gel flash column chromatography.
  • 1 HNMR analysis confirmed that the deuteration rate was 96% at the ⁇ -position and 97% at the ⁇ -position.
  • 1 HNMR analysis confirmed that the deuteration rate was 96% at the ⁇ -position and 94% at the ⁇ -position.
  • Example 2 Production of deuterated labeled fatty acid (stearic acid) (1) Preparation of N- (quinoline-8-yl) stearamide The 8-quinoline amidation of the carboxy group of stearic acid was carried out in the same procedure as described in Example 1 (1).
  • IR ATR-IR, neat 3300-2500 (br), 2956, 2915, 2848, 1696, 1481, 1409, 1320, 1197, 951, 891, 719, 664 cm -1 . mp 68-69 °C.
  • IR (ATR-IR, neat) 3291, 2915, 2848, 1662, 1521, 1484, 1423, 1379, 1320, 1260, 1167, 958, 824, 787, 757, 719, 678 cm -1 . mp 37-38 °C.
  • IR (ATR-IR, neat) 3291, 2956, 2915, 2848, 1659, 1521, 1379, 1320, 1271, 962, 823, 790, 757, 723 cm -1 . mp 35-36 °C.
  • IR ATR-IR, neat 3400-2400 (br), 3034, 2960, 2919, 2848, 1711, 1468, 1420, 1375, 1312, 1059, 962, 872, 731, 667 cm -1 . mp 41 °C.
  • Example 5 Production of deuterated labeled fatty acid (linoelaidic acid) (1) Preparation of (9E, 12E) -N- (quinoline-8-yl) octadeca-9,12-dienamide
  • IR ATR-IR, neat 3300-2500 (br), 3023, 2922, 2855, 1707, 1461, 1409, 1293, 1088, 985, 839, 727 cm -1 . mp 28-29 °C.
  • Example 6 Preparation of deuterated labeled fatty acid ((S, 9Z, 11E) -13-((tert-butyldimethylsilyl) oxy) Octodeca-9,11-dienonic acid (TBS-13-HODE)) (1) Preparation of (S, 9Z, 11E) -13-((tert-butyldimethylsilyl) oxy) -N- (quinoline-8-yl) octadeca-9,11-dienamide
  • TBS-13-HODE The 8-quinoline amidation of the carboxy group of TBS-13-HODE was carried out in the same procedure as described in Example 8 (1).
  • IR ATR-IR, neat 3400-2400 (br), 3008, 2926, 2855, 1707, 1461, 1409, 1361, 1297, 1252, 1074, 984, 947, 872, 835, 775, 731, 671 cm - 1 .
  • Example 7 Production of deuterated labeled fatty acid (erucic acid) (1) Preparation of (Z) -N- (quinoline-8-yl) dokosu-13-enamide
  • IR ATR-IR, neat 3300-2500 (br), 3001, 2915, 2848, 1692, 1469, 1405, 1293, 1234, 1185,1059, 947, 723 cm -1 . mp 30-31 °C.
  • 8-quinoline amidation of the carboxy group of palmitic acid was performed based on the reaction of Scheme 4. Specifically, the procedure was as follows. Palmitic acid (129 mg, 0.5 mmol), 8-aminoquinoline (79 mg, 0.55 mmol), WSCD / HCl (125 mg, 0.65 mmol), DMAP (6.1 mg, 0.05 mmol), and CH 2 Cl 2 ( 5 mL) was placed in a 50 mL shenk tube at room temperature under an argon atmosphere. After stirring overnight, the reaction was quenched with aqueous NH 4 Cl, washed with brine. The organic layer was dried over Na 2 SO 4 , filtered and evaporated under reduced pressure.
  • IR (ATR-IR, neat) 3291, 2915, 2848, 1659, 1521, 1484, 1424, 1379, 1320, 1252, 1170, 824, 787, 753, 719 cm -1 . mp 57-58 °C.
  • IR (ATR-IR, neat) 3291, 2956, 2915, 2848, 1655, 1520, 1423, 1379, 1319, 1267, 1162, 823, 787, 753, 719 cm -1 . mp 55-56 °C.
  • IR ATR-IR, neat 3300-2400 (br), 2956, 2915, 2848, 1692, 1469, 1413, 1312, 1200, 951, 891, 719, 664 cm -1 . mp 62-63 °C.
  • Example 10 Preparation of deuterated labeled fatty acid (13-HODE) (1) Preparation of (S, 9Z, 11E) -13-hydroxy-N- (quinoline-8-yl) octadeca-9,11-dienamide
  • IR ATR-IR, neat 3448 (br), 3008, 2926, 2855, 1737, 1461, 1435, 1267, 1193, 1126, 1081, 1048, 984, 951, 913, 854, 854, 731 cm -1 .
  • IR ATR-IR, neat 3500-2300 (br), 3012, 2926, 2855, 1707, 1461, 1409, 1290, 1267, 1126, 1051, 1018, 984, 947, 910, 835, 731 cm -1 .
  • Example 11 Production of deuterated labeled fatty acid (linolenic acid) (1) Preparation of (9Z, 12Z, 15Z) -N- (quinoline-8-yl) octadeca-9,12,15-trienamide
  • the 8-quinoline amidation of the carboxy group of linolenic acid was carried out in the same procedure as described in Example 1 (1).
  • Example 12 Production of deuterated labeled fatty acid (arachidonic acid) (1) Preparation of (5Z, 8Z, 11Z, 14Z) -N- (quinoline-8-yl) ikosa-5,8,11,14-tetraenamide
  • the 8-quinoline amidation of the carboxy group of arachidonic acid was carried out in the same procedure as described in Example 8 (1).
  • the compound obtained in (1) above was first deuterated at the ⁇ -position and then deuterated at the ⁇ -position to obtain the title compound. Specifically, the procedure was performed according to the following procedures a and b.
  • a Deuterium at the ⁇ -position was performed.
  • the compound (33.9 mg, 0.079 mmol), palladium acetate (17.7 mg, 0.079 mmol, 1 eq) and cesium pivalate (36.8 mg, 0.16 mmol, 2 eq) obtained in (1) above were added under air. Placed in a 10 mL screw cap tube. Toluene (0.8 mL, 0.1 M) was added to dissolve the amide was added to the mixture D 2 O (0.08mL). The reaction was stirred at 80 ° C. for 1 hour and the progress was monitored by ESI-MS.
  • the reaction mixture was cooled to room temperature, pyrrolidine ammonium dithiocarbamate (33.7mg, 0.21mmol, 2.6eq) and D 2 O a (0.8 mL) was added to the reaction. After stirring for 30 minutes, the mixture was transferred to a separatory funnel, diluted with ethyl acetate and washed with brine. The organic layer was dried over Na 2 SO 4 , filtered and evaporated under reduced pressure. The crude ⁇ -position-deuterium labeled compound was crudely purified by silica gel flash column chromatography.
  • IR ATR-IR, neat
  • IR ATR-IR, neat 3300-2500 (br), 3012, 2960, 2926, 2855, 1707, 1461, 1409, 1297, 1178, 1107, 1047, 928, 839, 705 cm -1 .
  • Example 13 Production of deuterated labeled fatty acid (eicosapentaenoic acid (EPA)) (1) (5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z) -N- (quinoline-8-yl) ikosa-5,8,11, Preparation of 14,17-pentamide
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • IR ATR-IR, neat 3400-2500 (br), 3012, 2967, 2926, 2870, 1707, 1409, 1297, 1174, 1110, 1070, 928, 835, 794, 701 cm -1 .
  • Example 14 Production of deuterated labeled fatty acid (pentacosa-10,12-diic acid) (1) Preparation of N- (quinoline-8-yl) pentacosa-10,12-diinamide
  • IR ATR-IR, neat 3347, 3045, 2919, 2851, 1677, 1528, 1484, 1424, 1387, 1327, 1264, 824, 749, 719, 678 cm -1 . mp 46-47 °C.
  • IR ATR-IR, neat 3200-2500 (br), 3022 (br), 2919, 2848, 2684, 1689, 1461, 1420, 1331, 1189, 1115, 1051, 999, 932, 895, 842, 723, 678 cm -1 . mp 28-29 °C.
  • IR ATR-IR, neat 3289 (br), 2915, 2851, 1662, 1521, 1485, 1461, 1428, 1379, 1323, 1271, 1163, 1133, 1096, 1025, 980, 913, 869, 824, 790 , 749, 708 cm -1 . mp 73-74 °C.
  • IR ATR-IR, neat 3370 (br), 2922, 2855, 1741, 1461, 1430, 1338, 1290, 1174, 1133, 1074, 1040, 947, 906, 876, 850, 723, 671 cm -1 . mp 48-49 °C.
  • IR ATR-IR, neat 3500-2500 (br), 3042, 2915, 2848, 2583, 1692, 1465, 1409, 1320, 1193, 1133, 1103, 1025, 951, 906, 842, 723, 664 cm - 1 . mp 73-74 °C.
  • Example 16 Production of deuterated labeled fatty acid ((9Z, 11E) -N- (quinoline-8-yl) octadeca-9,11-dienoic acid) (1) (9Z, 11E) -N- (quinoline-8) -Il) Preparation of octadeca-9,11-dienamide The 8-quinoline amidation of the carboxy group of (9Z, 11E) -N- (quinoline-8-yl) octadeca-9,11-dienoic acid was carried out in the same procedure as described in Example 8 (1).
  • IR ATR-IR, neat 3358, 3019, 2922, 2855, 1689, 1521, 1484, 1457, 1428, 1383, 1327, 1260, 1163, 984, 947, 828, 790, 757, 723, 675 cm -1 ..
  • IR ATR-IR, neat 3355, 3015, 2922, 2855, 1689, 1521, 1484, 1461, 1428, 1383, 1327, 1264, 1163, 984, 947, 828, 790, 753, 723, 678 cm -1 ..
  • Example 17 Deuterated labeled lipids ((R) -2-(((S, 9Z, 11E) -13-((tert-butyldimethylsilyl) oxy) octadeca-9,11-dienoyl-2,2,3) , 3-d 4 ) Oxy) -3- (palmitoyloxy) propyl (2- (trimethylammonio) ethyl) phosphate) synthesis example 17 uses deuterated labeled fatty acids as shown in the scheme below. Compound was synthesized.
  • Example 18 Lipid metabolism analysis using deuterated labeled fatty acid (1)
  • phosphatidylcholine ((R) -2-(((9E, 12E) -octadeca-9,12-dienoyl-2,2,3,3) using deuterated labeled fatty acids is used as shown in the scheme below.
  • -D 4 Oxy) -3- (palmitoyloxy) propyl (2- (trimethylammonio) ethyl) phosphatidylate) (constitutive fatty acid: palmitic acid / linoelaidic acid-D 4 ) was synthesized and analyzed by LC-MS / MS. It was examined whether it is possible to distinguish it from fatty acids (lipids) derived from the living body.
  • Lysophosphatidylcholine (Lyso-PC) (1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) (Tokyo Chemical Industry, 11.4 mg, 0.023 mmol), linoelysinic acid-2,2,3,3-d 4 (12) .7 mg, 0.045 mmol) and DMAPO (18.7 mg, 0.135 mmol) were placed in a 10 mL Schlenck tube and dried by toluene azeotropic boiling. Under an argon atmosphere, CH 2 Cl 2 (0.5 mL) was added and dissolved, then MNBA (46.5 mg, 0.135 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours.
  • IR ATR-IR, neat 3377 (br), 3027, 2960, 2922, 2855, 1733, 1495, 1469, 1349, 1252, 1174, 1092, 1059, 965, 924, 876, 816, 734 cm -1 .
  • LC-MS / MS analysis was performed using an LC-MS apparatus in which a mass spectrometer (MS) was connected to high performance liquid chromatography (LC). Ultimate 3000 ultra high performance LC system (Thermo) was used as LC, and Q-Exactive Orbitrap (Thermo) was used as MS. InertSustain C18 Metal-free column (GL Sciences) was used as an HPLC column, and gradient elution was performed using a mobile phase composed of acetonitrile, methanol, water and isopropanol. The analysis conditions were as shown in Table 1.
  • Example 19 Lipid metabolism analysis using deuterated labeled fatty acid (2)
  • lipid metabolism analysis of human platelets was performed using deuterated labeled fatty acids.
  • Activated platelets are known to produce a large number of lipid metabolites, and the types of fatty acids taken up by PCs were investigated.
  • LC-MS / MS analysis For LC-MS / MS analysis, Nexera XR HPLC system (Shimadzu Corporation) was used as LC, and QTRAP4500 (Sciex) was used as MS. A capsule pack C18 ACR column (Osaka Soda) was used as an HPLC column, and gradient elution was performed using a mobile phase composed of acetonitrile, methanol, water and isopropanol. The analysis conditions were as shown in Table 2.
  • the molecular species produced a 185 m / z one deuterated phosphocholine as product ions, by comprehensively measured using multiple reaction monitoring (Multiple Reaction Monitoring) method, the added linoleic acid -D 4 or Rinoeraijin acid It was detected PC molecular species containing -D 4.
  • multiple reaction monitoring Multiple Reaction Monitoring
  • the added linoleic acid-D 4 or linoleic acid-D 4 is not contained.
  • a PC molecular species endogenously present in platelets was detected.
  • the PC molecular species containing linoleic acid -D 4 or Rinoeraijin acid -D 4 comprehensively detect, for each PC molecular species is detected, and linoleic acid -D 4 during addition It was compared Rinoeraijin acid -D 4 during addition.
  • the volcano plot can be created by converting the fluctuation ratio (ratio) and significance probability (p-value) obtained by comparison into log 2 and -log 10 , respectively, and creating charts with the values on the X-axis and Y-axis, respectively. Obtained.
  • FIG. 2 is a volcano plot of the analysis results by LC-MS, and is a dehydrogenation-labeled fatty acid (linoleic acid-D 4 or linoleic acid-D 4 ) and an in vivo-derived fatty acid (linoleic acid or linoleic acid).
  • PC phosphatidylcholine
  • PC Constituent fatty palmitic acid / Rinoeraijin acid -D 4 (trans)
  • PC compared to (constituent fatty palmitic acid / linoleic acid -D 4 (cis))
  • PC compared to (constituent fatty palmitic acid / linoleic acid -D 4 (cis))
  • linoleic acid-D 4 (cis type) was oxidized and incorporated and existed as PC (constituent fatty acid: palmitic acid / HODE-D 4).
  • Example 20 Lipid metabolism analysis using deuterated labeled fatty acid (3)
  • Rinoeraijin acid -D 4 was studied mechanisms efficiently taken up the PC.
  • the lipid fraction derived from platelets obtained by the method described in Example 19 (1) a was suspended in an acetic acid buffer, and PLA 1 ( derived from Aspergillus oryzae , Sigma) and diethyl ether were added. Was added and stirred overnight under 4 degree conditions. Methanol containing 1% formic acid was added, and the supernatant was recovered after centrifugation. The recovered supernatant was applied to a solid-phase extraction column (Waters), washed with water and chloroform, and eluted with 1% formic acid-containing methanol.
  • PLA 1 derived from Aspergillus oryzae , Sigma
  • lipid fraction derived from platelets obtained by the method described in Example 19 (1) a was suspended in a Tris buffer containing 0.1% Triton-X100, and PLA 2 (Apis melipera ( Apis melipera)) was suspended. Derived from mellifera ), Sigma) was added, and the mixture was stirred overnight under 4 degree conditions. The reaction solution was applied to a solid-phase extraction column (Waters), washed with water and chloroform, and then eluted with methanol. 2-Acyl-LPC and 1-acyl-LPC in the reaction solution obtained by elution were carried out using an LC-MS apparatus.
  • the Ultimate 3000 ultra high performance LC system (Thermo) was used as the LC, and the Q-Exactive Orbitrap (Thermo) was used as the MS.
  • a capsule pack C18 ACR column (Osaka Soda) was used as an HPLC column, and gradient elution was performed using a mobile phase composed of water and isopropanol.
  • the analysis conditions were as shown in Table 4.
  • Example 21 Lipid metabolism analysis using deuterated labeled fatty acid (4)
  • Example 21 the enzymatic activity of the acyltransferase that transfers HODE to LPC was investigated.
  • a cell membrane fraction corresponding to an amount of 3 ⁇ g of protein, 1-acyl-palmitic acid-LPC (final concentration 26 ⁇ M) as an acyltransferase acceptor molecule and D4-HODE-CoA (final concentration 10 ⁇ M) as an acyltransferase donor molecule were mixed. .. After incubation at 37 ° C. for 10 minutes, the total lipid fraction was extracted by the method described in Bligh EG, et al., Can. J. BIochem. Physiol, 1959 and reaction products were measured using LC-MS. .. HODE-CoA-D 4 was obtained by subjecting HODE-D 4 and CoA to a condensation reaction using oxalyl chloride.
  • the cell membrane fraction obtained by the above method has a cell membrane fraction corresponding to a protein amount of 0.05 ⁇ g, and 1-acyl-palmitic acid-LPC (final concentration 10 ⁇ M) as an acyltransferase acceptor molecule.
  • 1-acyl-palmitic acid-LPC final concentration 10 ⁇ M
  • mixed HODE-CoA-D 4 as acyltransferase donor molecule final concentration 0 [mu] M, 0.01 [mu] M, 0.02 uM, 0.1 [mu] M, 0.2 [mu] M or 1 [mu] M
  • the total lipid fraction was extracted by the method described in Bligh EG, et al., Can. J. BIochem.

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Abstract

本発明は、新規な重水素化標識化合物およびその製造方法の提供を目的とする。本発明によれば、脂肪酸の少なくともβ位が重水素化された重水素化標識化合物およびその製造方法が提供される。本発明の重水素化標識化合物は、脂質や脂肪酸、脂肪酸結合タンパク質の代謝解析等に広く用いることができる点で有利である。本発明の重水素化標識化合物は、脂質若しくは脂肪酸結合タンパク質またはそれらの代謝物の定量において質量分析の内部標準物質として使用することができる。本発明の重水素化標識化合物はまた、生体内代謝の解析において代謝物マーカーとして使用することができる。

Description

重水素化標識化合物およびその製造方法 関連出願の参照
　本願は、先行する日本国出願である特願２０２０－１２４６７４（出願日：２０２０年７月２１日）の優先権の利益を享受するものであり、その開示内容全体は引用することにより本明細書の一部とされる。
　本発明は、重水素化標識化合物およびその製造方法に関する。本発明はまた、脂質またはその代謝物の定量方法および脂質代謝の解析方法に関する。
　脂質は、炭水化物やタンパク質と並ぶ三大栄養素の一つであり、エネルギー源や生体膜の構成要素としてだけでなく、情報伝達物質等の多様な生理機能を有する。また、脂質の基本構成単位である脂肪酸は、長鎖の炭化水素骨格の末端にカルボキシ基を有するシンプルな構造でありながらも、炭素数や二重結合等の違いから様々な種類が存在し多彩な生理機能を発現することが知られている。例えば、疾患との関係では副腎白質ジストロフィーにおいて全身の組織で極長鎖脂肪酸の増加が認められ、トランス脂肪酸は健康への影響から世界保健機関（ＷＨＯ）は加工食品を製造する時に生じるトランス脂肪酸を２０２３年までに低減するよう各国政府に対し呼び掛けている。
　このように社会的にも注目度の高い脂肪酸の解析にはガスクロマトグラフィー－質量分析（ＧＣ－ＭＳ）や液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）が主に用いられている。しかしながら、ＧＣ－ＭＳやＬＣ－ＭＳにおいて内部標準物質となる安定同位体標識脂肪酸の種類は極めて限られているのが現状である。また、１３炭素（１３Ｃ）や重水素（２Ｈ）等を用いた従来の脂肪酸の同位体標識化合物の製造方法は、工程数が多いことや酸化脂肪酸への適用が難しいといった問題があった（特許文献１）。また、ルテニウム触媒により脂肪酸を重水素化標識する方法では不飽和結合の位置や数により反応結果が左右され、またトランス体には適用できないという問題があった（非特許文献１）。このため、脂質や脂肪酸の代謝解析に重要な脂肪酸の定量的な手法の確立が期待されている。
特開２０１６－２２２５９０号公報
Vidovic et al., J. Org. Chem. 2017, 82, 13115-13120.
　本発明は、新規な重水素化標識化合物およびその製造方法を提供することを目的とする。本発明はまた、脂質若しくは脂肪酸結合タンパク質またはそれらの代謝物の新規な定量方法と、生体内代謝の新規な解析方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、脂肪酸の少なくともβ位を重水素化することで重水素化標識化合物を合成できること、そしてこの重水素化技術は多様な脂肪酸に適用可能であることを見出した。本発明者らはまた、前記重水素化標識化合物を使用して脂質代謝解析が可能であることを確認した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
　本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］脂肪酸の少なくともβ位が重水素化されたことを特徴とする、重水素化標識化合物。
［２］脂肪酸のα位がさらに重水素化された、上記［１］に記載の重水素化標識化合物。
［３］重水素の数が３個または４個である、上記［１］または［２］に記載の重水素化標識化合物。
［４］標識化合物が脂肪酸若しくはその誘導体または脂肪酸をその構造の一部とする化合物である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の重水素化標識化合物。
［５］脂肪酸の誘導体が、脂肪酸エステル、脂肪酸ジメチルジスルフィド誘導体または脂肪酸ジメチルオキサゾリン誘導体である、上記［４］に記載の重水素化標識化合物。
［６］脂肪酸エステルが、アルキルエステルまたはアリールエステルである、上記［５］に記載の重水素化標識化合物。
［７］脂肪酸をその構造の一部とする化合物が、脂質または脂肪酸結合タンパク質である、上記［４］に記載の重水素化標識化合物。
［８］脂質がコレステロールエステル、アシルグリセロール、リン脂質、糖脂質またはスフィンゴ脂質である、上記［７］に記載の重水素化標識化合物。
［９］上記［１］～［８］のいずれかに記載の重水素化標識化合物の製造方法であって、脂肪酸アミドを白金族金属触媒の存在下で重水素化する工程を含んでなる、方法。
［１０］白金族金属触媒が、パラジウム触媒である、上記［９］に記載の製造方法。
［１１］脂肪酸アミドを塩基の存在下で重水素化する工程をさらに含んでなる、上記［９］または［１０］に記載の製造方法。
［１２］重水素化された化合物を脱保護する工程をさらに含んでなる、上記［９］～［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］上記［１］～［８］のいずれかに記載の重水素化標識化合物を質量分析の内部標準物質として使用することを特徴とする、脂質若しくは脂肪酸結合タンパク質またはそれらの代謝物の定量方法。
［１４］上記［１］～［８］のいずれかに記載の重水素化標識化合物を代謝物マーカーとして使用することを特徴とする、生体内代謝の解析方法。
［１５］脂質若しくは脂肪酸結合タンパク質またはそれらの代謝物の定量方法における質量分析の内部標準物質としての、上記［１］～［８］のいずれかに記載の重水素化標識化合物の使用、または生体内代謝の解析方法における代謝物マーカーとしての、上記［１］～［８］のいずれかに記載の重水素化標識化合物の使用。
　本発明の重水素化標識化合物は、脂質や脂肪酸の定量分析や代謝解析等に広く用いることができる点で有利である。本発明の重水素化標識化合物はまた、重水素源として安価な重水やメタノール－ｄ１を使用して合成できる点でも有利である。本発明の重水素化標識化合物はさらに、生体内に存在する脂肪酸や脂質と区別されるため、代謝物マーカーとして生体内代謝解析等に使用することができる点でも有利である。
図１は、ホスファチジルコリン（構成脂肪酸：パルミチン酸／リノエライジン酸－Ｄ４）（ＰＣ　１６：０／Ｄ４－ｔｒａｎｓ－１８：２）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析の結果を示す。 図２は、活性化されたヒト血小板において生成されたホスファチジルコリン（ＰＣ）の代謝産物（派生物）の網羅的解析の結果（ボルケーノプロット）を示す。Ｅはトランス型、Ｚはシス型、ｐ値は有意確率を示す。 図３は、ヒト血小板における重水素化標識脂肪酸のアシル転移活性の立体特異性を示す。 図４Ａは、ＡＧＰＡＴ７のＨＯＤＥ転移活性を示す（ｐは有意確率を示す）。図４Ｂは、ＡＧＰＡＴ７のＨＯＤＥ転移活性の動的解析結果を示す。
発明の具体的説明
＜＜定義＞＞
　本発明において基の全部または一部としての「アルキル」は、直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を意味し、炭素数１～４のアルキルの場合、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチルが挙げられる。
　本発明において基の全部または一部としての「アルケニル」は、１個または複数個の二重結合を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を意味する。
　本発明において「ハロゲン原子」としては、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、フッ素（Ｆ）、ヨウ素（Ｉ）が挙げられ、塩素、臭素、ヨウ素が好ましい。
　本発明において「置換されていてもよい」とは、置換される基または原子上の１または複数個の水素原子が別の基に置換されることを意味する。
　本発明において「芳香族炭化水素基」および「芳香族複素環基」は、芳香族の特性を有する環系化合物またはその部分をいい、例えば、π電子が４ｎ＋２個ある環状共役系を含む安定な構造を有する。芳香族炭化水素基は、６～１４員の不飽和炭素環であり、単環式であっても、２または３環式の芳香族縮合環基であってもよく、例えば、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレンが挙げられる。芳香族複素環基は、酸素原子、窒素原子および硫黄原子からなる群から選択される１種または２種以上の異種原子を環員原子として含む、５～１４員の不飽和複素環であり、単環式であっても、２または３環式の芳香族縮合複素環基であってもよい。異種原子の個数は、１個または複数個とすることができ、例えば、１～４個、１～３個、１～２個または１個である。芳香族複素環基としては、例えば、ピリジン、キノリン、プリン、イソキノリン、オキサゾリンが挙げられる。
＜＜重水素化標識化合物＞＞
　本発明の重水素化標識化合物は、脂肪酸のα位とβ位のうち少なくともβ位が重水素化されたものである。本発明の重水素化標識化合物はまた、脂肪酸のα位がさらに重水素化されていてもよい。ここで、脂肪酸のα位、β位とは、脂肪酸の末端のカルボキシ基に最も近い炭素原子（α炭素）と、２番目に近い炭素原子（β炭素）をそれぞれいう。また、重水素化とは、α位またはβ位の炭素原子上の水素が重水素に置換されていることをいい、例えば、脂肪酸のβ位の重水素化とは、β位の炭素原子上の水素が重水素に置換されていることをいい、β位の炭素原子上に重水素が存在すること（炭素原子に重水素が結合していること）と同義である。
　本発明の重水素化標識化合物に存在する重水素の数は１～４個であり、本発明の重水素化標識化合物を内在性物質の影響を受けない標識化合物として提供する場合には、好ましくは３個または４個であり、より好ましくは４個である。本発明の重水素化標識化合物における脂肪酸のβ位の炭素原子上に存在する重水素の数は１または２個であり、α位の炭素原子上に存在する重水素の数は１または２個である。本発明の好ましい態様においては、本発明の重水素化標識化合物における脂肪酸のβ位の炭素原子上に存在する重水素の数は２個であり、かつ、α位の炭素原子上に存在する重水素の数は１または２個（より好ましくは２個）である。
　本発明の重水素化標識化合物は、脂肪酸またはその誘導体そのものであっても、脂肪酸をその構造の一部とする化合物であってもよい。本発明の重水素化標識化合物が、脂肪酸またはその誘導体そのものである場合には、該脂肪酸のβ位が重水素化されていることは前記の通りである。また、本発明の重水素化標識化合物が、脂肪酸をその構造の一部とするものである場合、１個または２個以上の脂肪酸を構造の一部とすることができる。本発明の重水素化標識化合物が１個の脂肪酸を構造の一部とする化合物である場合には、該脂肪酸のβ位が重水素化されている。また、本発明の重水素化標識化合物が２個以上の脂肪酸を構造の一部とする化合物である場合には、少なくとも１個の脂肪酸のβ位が重水素化されている。なお、２個以上の脂肪酸は一部または全部が同じ種類の脂肪酸であっても、異なる種類の脂肪酸であってもよい。
　本発明において「脂肪酸」は、不飽和度の観点からは飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸のいずれをも含むものである。脂肪酸はまた、炭素数（カルボキシ基の炭素を含む）の観点からは短鎖脂肪酸（炭素数２～４）、中鎖脂肪酸（炭素数５～１１）、長鎖脂肪酸（炭素数１２～２２）、極長鎖脂肪酸（炭素数２３以上）のいずれをも含むものである。脂肪酸の炭素数の下限は例えば２個、３個、５個、８個、１２個または１６個とすることができ、脂肪酸の炭素数の上限は例えば３６個、３０個または２５個とすることができ、これら炭素数の上限および下限は任意に組み合わせることができる。脂肪酸の炭素数は例えば２～３６個、２～３０個、２～２５個、３～３６個、３～３０個、３～２５個、８～２５個または１６～２５個とすることができる。不飽和脂肪酸はまた、シス型であってもトランス型であってもよい。本発明において「脂肪酸」は、炭化水素基上の１個または複数個（例えば１～３個または１～２個）の水素原子が、水酸基、アルコキシ基、エポキシ基、アミノ基、ハロゲン基、シアノ基、アルキルチオ、（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ基等の官能基（該官能基は同一であっても異なっていてもよい）により置換されたものも含む。脂肪酸の例としては、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノエライジン酸、リシノール酸、１３－ヒドロキシ－９Ｚ，１１Ｅ－オクタデカジエノイック酸（１３－ＨＯＤＥ）、（Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）－１３－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）オクトデカ－９，１１－ジエノン酸（ＴＢＳ－１３－ＨＯＤＥ）、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、エルカ酸、イソプレノイド、９－ヒドロキシオクタデカン酸、（９Ｚ，１１Ｅ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１１－ジエン酸等が挙げられる。
　本発明において「脂肪酸の誘導体」は上述の脂肪酸を誘導体化してなる化合物をいい、例えば、脂肪酸エステル、脂肪酸ジメチルジスルフィド誘導体、脂肪酸ジメチルオキサゾリン誘導体、脂肪酸シリル誘導体が挙げられる。脂肪酸の誘導体はＧＳ－ＭＳやＬＣ－ＭＳを用いた脂肪酸解析等において使用することができる点で有利である。
　本発明において「脂肪酸エステル」は、上述の脂肪酸をエステル化してなる化合物（エステル体）をいい、具体的には脂肪酸のカルボキシ基をエステル化してなる化合物をいう。脂肪酸エステルとしては、アルキルエステル（例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル、ペンチルエステル、ヘキシルエステルのような炭素数１～６（好ましくは炭素数１～４）のアルキルエステル）や、アリールエステル（例えば、フェニルエステルのような芳香族炭化水素エステル）が挙げられる。
　本発明において「脂肪酸ジメチルジスルフィド誘導体」は、上述の脂肪酸をジメチルジスルフィドを用いて誘導体化してなる化合物をいい、具体的には、脂肪酸の不飽和位（２つの炭素原子）にメチルスルフィド基が導入されてなる化合物をいう。メチルスルフィド基は、不飽和脂肪酸またはそのエステル体（例えば、メチルエステル）の不飽和位にジメチルジスルフィドを反応させることにより導入できる。
　本発明において「脂肪酸ジメチルオキサゾリン誘導体」は、上述の脂肪酸をジメチルオキサゾリン化してなる化合物をいい、具体的には、脂肪酸のカルボキシ部分にジメチルオキサゾリン基が導入されてなる化合物をいう。ジメチルオキサゾリン誘導体は、脂肪酸のエステル体（例えば、メチルエステル）と２－アミノ－２－メチルプロパノールを反応させることにより得ることができる。
　本発明において「脂肪酸シリル誘導体」は、上述の脂肪酸をシリル化してなる化合物（シリル体）をいい、具体的には脂肪酸のカルボキシ基をシリル化してなる化合物をいう。脂肪酸シリル誘導体は、脂肪酸とシリル化剤とを反応させることにより得ることができる。シリル化剤としては、トリメチルシリル化剤、ジメチルシリル化剤、ジメチルアルキルシリル化剤、ハロメチルシリル化剤、環状シリレン化剤が挙げられる。
　本発明において「脂肪酸をその構造の一部とする化合物」としては脂質、脂肪酸結合タンパク質が挙げられる。なお、前記タンパク質にはペプチドも含まれる。脂質の例としては、コレステロールエステル、アシルグリセロール（例えば、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロール）、リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン（本明細書中「ＰＣ」ということがある）、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルセリン）、糖脂質（例えば、ヘキソシルセラミド、スルファチド、ガングリオシド、グロボシド）、スフィンゴ脂質（スフィンゴミエリン、セラミド、スフィンゴシン－１－リン酸）等が挙げられる。脂肪酸結合タンパク質の例としては、アミノ末端にミリスチン酸が共有結合してなるＩＩ型血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ、システイン残基にパルミチン酸が共有結合してなるシナプス後膜肥厚タンパク質９５、セリン残基にオクタン酸が共有結合してなるグレリン、システイン残基にイソプレノイドが共有結合してなるＲａｂタンパク質等が挙げられる。
　本発明の重水素化標識化合物の好ましい態様によれば、後述の式（ＩＩ）の化合物または式（ＩＩＩ）の化合物が提供される。
＜＜重水素化標識化合物の製造方法＞＞
　本発明の重水素化標識化合物は、基質化合物に対する重水素化反応により製造することができる。ここで、重水素化反応工程は、脂肪酸のβ位に対する重水素化反応工程を少なくとも含むものであり、脂肪酸のα位の重水素化反応工程をさらに含んでいてもよい。脂肪酸のα位の重水素化反応工程と、脂肪酸のβ位の重水素化反応工程との両方を実施する場合、両工程の順序はいずれが先でもよい。
＜脂肪酸のβ位に対する重水素化反応＞
　本発明の製造方法における脂肪酸のβ位に対する重水素化反応は、脂肪酸アミドを白金族金属触媒の存在下で重水素化することにより実施することができる。ここで、白金族金属触媒としては、パラジウム触媒（例えば、酢酸パラジウム、トリフルオロ酢酸パラジウム、ピバル酸パラジウム、塩化パラジウム、アリルパラジウムクロリドダイマー、パラジウムアセチルアセトナート、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム、ビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム、シクロペンタジエニルアリルパラジウムのようなパラジウム錯体、およびホスフィン配位子、Ｎ－ヘテロ環状カルベン配位子が配位したパラジウム錯体）、白金触媒（白金アセチルアセトナート、塩化白金のような白金錯体、およびホスフィン配位子、Ｎ－ヘテロ環状カルベン配位子が配位したパラジウム錯体）、ロジウム触媒、ルテニウム触媒等が挙げられ、反応性と価格の観点から好ましくは酢酸パラジウム、トリフルオロ酢酸パラジウム、ピバル酸パラジウムである。基質化合物に対する触媒量は０．０１～２当量（ｅｑ）（好ましくは０．１～１当量）の範囲とすることができる。
　上記重水素化反応においては重水素の供給源として重水素含有化合物を存在させてもよい。重水素の供給源としては、重水、メタノール－ｄ１、メタノール－ｄ４、エタノール－ｄ１、エタノール－ｄ６、イソプロパノール－ｄ１、イソプロパノール－ｄ８等が挙げられ、反応性、コスト、安全性の観点から重水が好ましい。
　本発明における白金族金属触媒を用いた重水素化反応は、塩基の存在下、溶媒中において実施することができる。使用可能な塩基としては、例えば、ピバル酸セシウム、酢酸セシウム、ピバル酸カリウム、酢酸カリウム、ピバル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ピバル酸リチウム、酢酸リチウム、ピバル酸亜鉛、酢酸亜鉛、ピバル酸カルシウム、酢酸カルシウム、ピバル酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、炭酸セシウム、炭酸水素セシウム等が挙げられ、反応性の観点から好ましくはピバル酸セシウムである。また使用可能な溶媒としては有機溶媒が挙げられ、例えば、トルエン、ベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン、ヘキサン、シクロヘキサン、ペンタン、ヘプタン、塩化メチレン、クロロホルム等が挙げられ、反応性の観点からはトルエンが好ましい。
　本発明における白金族金属触媒を用いた重水素化反応はまた、０．０２～４当量（好ましくは０．２～２当量）の塩基の存在下、室温～１３０℃（好ましくは７０～９０℃）の温度、１～２４時間（好ましくは１７～１９時間）の条件下で撹拌することにより実施することができる。
＜脂肪酸のα位に対する重水素化反応＞
　本発明の製造方法における脂肪酸のα位に対する重水素化反応は、脂肪酸アミドを塩基の存在下で重水素化することにより実施することができる。ここで、塩基としては、炭酸塩（例えば、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸セシウム、炭酸リチウム）、カルボン酸塩（例えば、酢酸塩）、炭酸水素塩、水酸化物塩、リン酸塩、アルカリ金属塩（例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、セシウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩）が挙げられる。
　脂肪酸のα位に対する重水素化反応は溶媒中で実施することができ、該溶媒は重水素の供給源ともなるものを使用することができる。その例としては、メタノール－ｄ１、メタノール－ｄ４、エタノール－ｄ１、エタノール－ｄ６、イソプロパノール－ｄ１、イソプロパノール－ｄ８、重水（Ｄ２Ｏ）、アセトン－ｄ６、クロロホルム－ｄ１、アセトニトリル－ｄ３、ジメチルスルホキシド－ｄ６等が挙げられる。
　上記の脂肪酸のα位に対する重水素化反応は、０．１～３当量（好ましくは０．５～２当量）の塩基の存在下、室温～１２０℃（好ましくは７０～９０℃）の温度、１～２４時間（好ましくは１６～２０時間）の条件下で撹拌することにより実施することができる。
＜脂肪酸アミドおよびその調製＞
　脂肪酸アミドは、本発明の重水素化反応の基質となるものであればいずれも使用できるが、例えば、下記式（Ｉ）の化合物を使用することができる。
　Ｒａ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（－Ｒｂ）－Ｒｃ・・・（Ｉ）
（上記式中、
　Ｒａは、脂肪酸のうちカルボキシ基に結合する炭化水素鎖を表し、
　Ｒｂは、水素原子または炭素数１～４のアルキル基を表し、
　Ｒｃは、下記基（ｉ）、基（ｉｉ）または基（ｉｉｉ）：
（ｉ）２環式の９～１０員の芳香族複素環基（この複素環は、好ましくは環員原子として１～４個の異種原子を含んでいてもよく、また、同一または異なってもよく、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、ハロゲン原子、カルボキシ基、ベンジル基、アミノ基、芳香族炭化水素基および芳香族複素環基から選択される１種または２種以上により置換されていてもよい）；
（ｉｉ）フェニル基（このフェニル基は、下記（ａ）または（ｂ）：
（ａ）単環式の６員の芳香族複素環基（この複素環は環員原子として１または２個の異種原子を含んでいてもよい）；または
（ｂ）－Ｎ（－Ｒ１１）（－Ｒ１２）、－ＯＲ１３、－ＳＲ１４または－Ｃ（＝ＮＲ１５）（－ＯＲ１６）（Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５およびＲ１６はそれぞれ独立して水素原子または炭素数１～４のアルキル基を表し、Ｒ１５およびＲ１６はそれらが結合している炭素原子と一緒になって５または６員の複素環を形成してもよく、この複素環は１個または２個の炭素数１～４のアルキル基により置換されていてもよい）により置換されていてもよい）；または
（ｉｉｉ）－Ｘ－Ｚ（Ｘは－ＣＨ－または－Ｃ（＝Ｏ）－を表し、Ｚは単環式の６員の芳香族複素環基（この複素環は環員原子として１または２個の異種原子を含んでいてもよい）を表す）を表す。）
　Ｒａは、例えば、アルキル基またはアルケニル基を表し、前記アルキル基または前記アルケニル基は１個または複数個（例えば１～３個または１～２個）の官能基（該官能基は同一であっても異なっていてもよく、例えば、水酸基、炭素数１～４のアルコキシ基、エポキシ基、アミノ基、ハロゲン基、シアノ基、炭素数１～４のアルキルチオ基および（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ基から選択することができる）で置換されていてもよい。Ｒａが表すアルキル基およびアルケニル基の炭素数の下限は例えば１個、２個、４個、７個、１１個または１５個とすることができ、炭素数の上限は例えば３６個、３５個、３０個、２９個または２４個とすることができ、これら炭素数の上限および下限は任意に組み合わせることができる。Ｒａが表すアルキル基およびアルケニル基の炭素数は例えば１～３６個、１～３０個、２～３５個、２～２９個、２～２４個、７～２４個または１５～２４個とすることができる。
　Ｒｂは、好ましくは水素原子を表す。
　Ｒｃが基（ｉ）を表す場合、Ｒｃは、好ましくは２環式の１０員芳香族複素環基（この複素環は環員原子として１または２個の窒素原子を含んでいてもよい）を表し、より好ましくはキノリン、プリンを表し、さらに好ましくはキノリン－８－イル基、プリン－６－イルである。
　Ｒｃが基（ｉｉ）を表す場合、Ｒｃは、好ましくは
－　単環式の６員の芳香族複素環基（この複素環は、好ましくは環員原子として１または２個の窒素原子、より好ましくは環員原子として１個の窒素原子を含んでいてもよい）により置換されたフェニル基；または
－　基－Ｎ（－Ｒ１１）（－Ｒ１２）（Ｒ１１およびＲ１２は、同一または異なってもよく、水素原子またはメチルを表し、好ましくはＲ１１およびＲ１２はメチルを表す）、基－ＯＲ１３（Ｒ１３はメチルを表す）、基－ＳＲ１４（Ｒ１４はメチルを表す）または基－Ｃ（＝ＮＲ１５）（－ＯＲ１６）（Ｒ１５およびＲ１６はそれぞれ独立して炭素数１～４のアルキル基を表し、Ｒ１５およびＲ１６はそれらが結合している炭素原子と一緒になって５員の複素環を形成してもよく、この複素環は１個または２個のメチル基により置換されていてもよい）により置換されたフェニル基
を表す。
　Ｒｃが基（ｉｉｉ）を表す場合、Ｒｃは、好ましくは基－Ｘ－Ｚ（Ｘは－ＣＨ－または－Ｃ（＝Ｏ）－を表し、Ｚは単環式の６員の芳香族複素環基（この複素環は、好ましくは環員原子として１または２個の窒素原子、より好ましくは環員原子として１個の窒素原子を含んでいてもよい）を表す）を表す。
　Ｒｃは、さらに好ましくは下記（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（Ｉｆ）および（Ｉｇ）のいずれかの基を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 （上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、同一または異なってもよく、水素原子、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、ハロゲン原子、カルボキシ基、ベンジル基、アミノ基、芳香族炭化水素基および芳香族複素環基を表し、好ましくは、水素原子、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、ハロゲン原子またはカルボキシ基を表し、より好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の１つまたは２つが、同一または異なってもよく、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、ハロゲン原子、カルボキシ基、ベンジル基、アミノ基、芳香族炭化水素基および芳香族複素環基を表し、残りが水素原子を表し、さらに好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の１つまたは２つが、同一または異なってもよく、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、ハロゲン原子またはカルボキシ基を表し、残りが水素原子を表す）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （上記式中、Ｒ７は、同一または異なってもよく、水素原子、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、ハロゲン原子、カルボキシ基、ベンジル基、アミノ基、芳香族炭化水素基および芳香族複素環基を表し、好ましくは、水素原子、炭素数１～４のアルキル基またはベンジル基を表す）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （上記基中、Ａは、基－Ｎ（－Ｒ１１）（－Ｒ１２）、基－ＯＲ１３、基－ＳＲ１４または基－Ｃ（＝ＮＲ１５）（－ＯＲ１６）を表し、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５およびＲ１６は前記で定義した内容と同義であり、好ましくは、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４はメチルであり、Ｒ１５およびＲ１６は、同一または異なってもよく炭素数１～４のアルキルを表す）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　式（Ｉ）の脂肪酸アミドのうち、反応性の観点からＲｃが式（Ｉａ）の基を表すもの（８－キノリンアミドおよびその誘導体）が好ましい。
　本発明の重水素化反応の基質となる脂肪酸アミドは脂肪酸のアミド化反応により調製することができる。脂肪酸のアミド化は、例えば、脂肪酸とアミノ基を有する化合物とをカルボン酸とアミンの縮合反応により反応させて実施することができる。本発明では重水素化反応に先立って脂肪酸のアミド化反応を実施して重水素化反応の基質となる脂肪酸アミドを合成してもよい。脂肪酸のアミド化反応は、例えば、カルボン酸：Ｒａ－ＣＯＯＨ（Ｒａは前記で定義した内容と同義である）と、アミン：ＨＮ（－Ｒｂ）（－Ｒｃ）（ＲｂおよびＲｃは前記で定義した内容と同義である）とをカルボン酸とアミンの縮合反応により反応させて実施することができる。カルボン酸とアミンの縮合反応は公知であり、例えば、Yang, Q. et al., ACS Catal. 2017, 7, 5220-5224.やPeng, J.-B. et al., ACS Catal. 2019, 9, 2977-2893.等を参照して実施することができる。
＜アミドの脱保護とエステルの加水分解＞
　本発明の製造方法は、重水素化された脂肪酸アミドを脱保護して脂肪酸エステルへ変換し、続いて該エステルを加水分解する工程をさらに含んでもよい。脂肪酸アミドを脱保護する工程（脂肪酸エステルへの変換工程）は、公知の方法（例えば、Deguchi, T. et al., ACS Catal. 2017, 7, 3157-3161.）に従って実施することができる。また、エステルを加水分解する工程は、公知の方法（例えば、Meyer, M. P. et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 430-439.）に従って実施することができる。具体的には後記の実施例の記載に従って実施することができる。
　アミドの脱保護とエステルの加水分解により本発明の重水素化標識化合物を得ることができる。製造された本発明の重水素化標識化合物としては、例えば、式（ＩＩ）：Ｒａ－Ｃ（＝Ｏ）－ＯＨ（Ｒａは前記式（Ｉ）で定義した内容と同義であり、脂肪酸のα位およびβ位のうち少なくともβ位が重水素化され、脂肪酸のα位がさらに重水素化されていてもよく、好ましくは、脂肪酸のβ位の炭素原子上に存在する重水素の数が２個であり、かつ、α位の炭素原子上に存在する重水素の数が１または２個（より好ましくは２個）である）で表される重水素化標識脂肪酸が挙げられる。また、本発明においてはエステルの加水分解を行わず、本発明の重水素化標識脂肪酸のエステル体を得てもよい。製造された本発明の重水素化標識化合物のエステル体としては、例えば、式（ＩＩＩ）：Ｒａ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｒｄ（Ｒａは前記式（Ｉ）で定義した内容と同義であり、Ｒｄはアルキル基（例えば、炭素数１～６または炭素数１～４のアルキル基）またはアリール基（例えば、フェニル基のような芳香族炭化水素基）を表し、脂肪酸のα位およびβ位のうち少なくともβ位が重水素化され、脂肪酸のα位がさらに重水素化されていてもよく、好ましくは、脂肪酸のβ位の炭素原子上に存在する重水素の数が２個であり、かつ、α位の炭素原子上に存在する重水素の数が１または２個（より好ましくは２個）である）で表される重水素化標識脂肪酸エステルが挙げられる。
＜重水素化標識脂質の合成例＞
　本発明の重水素化標識化合物が脂質から構成される場合、該重水素化標識化合物は本発明の重水素化標識化合物である脂肪酸またはその誘導体を使用して合成することができる。脂質の合成方法は公知であり、脂肪酸として本発明の重水素化標識脂肪酸またはその誘導体を用いる以外は公知の方法に従って本発明の重水素化標識脂質を合成することができる。
　本発明の重水素化標識脂質は、本発明の重水素化標識脂肪酸またはその誘導体を出発物質として公知の方法により合成することができる。例えば、コレステロールエステルはKomura, K. et al., Synthesis. 2008, 3407-3410.の記載に従って、アシルグリセロールはManhas, S. et al., Green Chem. 2019, 21, 5363-5367.の記載に従って、リン脂質はAcharya, H. P. et al., Synlett. 2005, 2015-2018.の記載に従って、それぞれ合成することができる。
＜＜重水素化標識化合物を用いた定量方法＞＞
　本発明の重水素化標識化合物は安定同位体標識化合物であるため、質量分析の内部標準物質として使用することができる。すなわち本発明によれば、本発明の重水素化標識化合物を質量分析の内部標準物質として使用することを特徴とする、脂質若しくは脂肪酸結合タンパク質またはそれらの代謝物の定量方法が提供される。本発明によればまた、脂質若しくは脂肪酸結合タンパク質またはそれらの代謝物の定量方法における質量分析の内部標準物質としての、本発明の重水素化標識化合物の使用が提供される。一般に、対象試料中の脂質等の目的物質の質量分析では標準物質を指標としてその定量を行うが、対象試料に含まれる夾雑物等がイオン化に影響を与え正確に定量できない場合がある。このため、目的物質と化学的性質や構造が類似した物質を内部標準物質として使用することで、イオン化の影響を補正し目的物質を正確に定量することが可能となる。従来は脂質やその代謝物の内部標準物質は種類が少なく限定されるものであったが、本発明の定量方法および本発明の使用によればこれまで正確な定量が困難であった脂質やその代謝物についても正確な定量ができる点で有利である。
　本発明の脂質若しくは脂肪酸結合タンパク質またはそれらの代謝物の定量方法は、（Ａ）対象試料、標準物質および本発明の重水素化標識化合物を含む質量分析用試料を調製する工程と、（Ｂ）前記質量分析用試料を質量分析により解析（分析）する工程とを含んでいてもよい。対象試料としては、例えば、血液、尿等の体液、皮膚、口腔粘膜、外科的手術によって得られる組織の他、食品、化粧品、医薬品が挙げられる。
＜＜重水素化標識化合物を用いた生体内代謝の解析方法＞＞
　本発明の重水素化標識化合物は安定同位体標識化合物であるため、代謝物マーカーとして使用することもできる。すなわち本発明によれば、本発明の重水素化標識化合物を代謝物マーカーとして使用することを特徴とする、生体内代謝の解析方法（分析方法）が提供される。本発明によればまた、生体内代謝の解析方法（分析方法）における代謝物マーカーとしての、本発明の重水素化標識化合物の使用が提供される。脂肪酸に存在する水素を重水素で置換しても化学的性質は基本的に同じであり、生体内や生体外の評価系における標識化合物を質量分析や核磁気共鳴（ＮＭＲ）等で容易に検出することが可能である。このため、例えば、本発明の重水素化標識化合物をモデル動物に投与することにより、あるいは、生体外の評価系（例えば、生体から単離した細胞、組織、器官および臓器；再生医工学技術により調製された組織、器官および臓器；培養細胞；微生物；酵素等）に使用することにより、生体内の代謝過程や代謝産物の動態をトレースすることができる。解析対象となる生体内代謝としては、脂質代謝、糖代謝等の生体内物質代謝が挙げられる。本発明の解析方法および本発明の使用によれば、これまで正確な定量が困難であった脂質の代謝メカニズムの解析をすることができる点で有利である。
　本発明の脂質代謝の解析方法は、（Ｃ）対象に本発明の標識化合物を投与するか、または生体外の評価系に本発明の標識化合物を使用する工程と、（Ｄ）対象または評価系における前記標識化合物の存在を検出または解析（分析）する工程とを含んでいてもよい。対象における標識物質の存在の検出または解析は、対象から採取した体液や組織について実施しても、対象に対して直接実施してもよい。前記対象としては、例えば、動物モデルが挙げられる。前記評価系としては、例えば、生体から単離した細胞、組織、器官および臓器；再生医工学技術により調製された組織、器官および臓器；培養細胞；微生物；酵素等が挙げられる。標識物質の存在の検出および解析は、例えば、質量分析やＮＭＲにより実施することができる。分析手法に適した試料の調製は公知の方法に従って実施することができる。本発明の脂質代謝の解析方法および本発明の使用は、少なくとも工程（Ｄ）をイン・ビトロで実施することができる。
　以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
測定機器等
　本実施例（例１～１８）では、以下の測定機器等を使用した。ＮＭＲスペクトルは、ＮＭＲ分光計（AVANCE HD 400、Bruker）で取得した。化学シフトはδ（ｐｐｍ）値で表され、結合定数はヘルツ（Ｈｚ）で表される。１Ｈおよび１３Ｃ　ＮＭＲスペクトルは、テトラメチルシランまたは溶媒残留シグナルを参照した。略語は次のものを使用した：ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｍ＝マルチプレット、ｂｒ－ｓ＝ブロードシングレット。ＩＲスペクトルは分光光度計（Cary 630 FTIR、Agilent）、ＥＳＩ質量分析スペクトルは質量分析計（micrOTOF-II、Bruker）、融点は融点測定器（ＭＰ－２１型、ヤマト科学）で測定した。すべての化学物質は試薬グレードのものであり、受領時の状態で使用した。すべての反応は、１０ｍＬスクリューキャップチューブ、シュレンクチューブ、若しくはナスフラスコで行った。各反応における生成物の精製は、中圧分取液体クロマトグラフシステム（EPCLC-W-Prep 2XY、山善）とカートリッジカラム（Purif-Pack（登録商標）-EX、照光サイエンス）を、若しくはシリカゲル（DIOLシリカ、富士シリシア）を使用して順相カラムクロマトグラフィーにより行った。
　本実施例（例１～１６）では、各種脂肪酸について重水素化を行った。また、本実施例（例１７）では、重水素化標識脂肪酸を使用して重水素化脂質の合成を行った。さらに、本実施例（例１８～２１）では、重水素化標識脂肪酸を使用して脂質代謝解析を行った。以下、順に説明する。
例１：重水素化標識脂肪酸（リノール酸）の製造
（１）（９Ｚ，１２Ｚ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１２－ジエナミドの調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　リノール酸（１．４０ｇ、５．０ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（０．１ｍＬ）およびＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）をアルゴン雰囲気下で５０ｍＬシェンクチューブに入れた。０℃に冷却後、塩化オキサリル（０．８５ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で一晩攪拌し反応させた。次に、すべての揮発性物質を減圧下で除去した。アルゴン雰囲気下の別のフレームドライしたフラスコで、８－アミノキノリン（７２１ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．８７ｍＬ、６．２５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液を０℃に冷却した。ＣＨ２Ｃｌ２（９．０ｍＬ）中の酸塩化物の溶液を、カニューレを介して溶液に滴下した。室温で一晩攪拌した後、反応を１Ｎ　ＨＣｌでクエンチし、ＮａＨＣＯ３水溶液と塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。そして、得られた化合物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題化合物を得た（収率４４％、８８４ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲデータは、公知文献（Perez-Gomez, M. et al., Organometallics. 2019, 38, 973-980.）に記載されているものと一致することが確認された。
無色油: Rf 0.74 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.56 (m, 3H), 5.31-5.39 (m, 4H), 2.77 (dd, J = 6.4, 6.0 Hz, 2H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.00-2.07 (m, 4H), 1.83 (tt, J = 7.6, 7.6 Hz, 2H), 1.27-1.41 (m, 14H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
（２）重水素化標識化合物（（９Ｚ，１２Ｚ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１２－ジエナミド－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（１）で得られた化合物に対してまずβ位の重水素化を行い、次いでα位の重水素化を行って表題の化合物を得た。具体的には下記アおよびイの手順に従って行った。
ア　β位の重水素化
　まず、β位の重水素化を行った。上記（１）で得られた化合物（２０５．９ｍｇ、０．５０６ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（１１．４ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ、１０ｍｏｌ％）およびピバル酸セシウム（２３．６ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、２０ｍｏｌ％）を空気下で１０ｍＬスクリューキャップチューブに入れた。トルエン（５．０ｍＬ、０．１Ｍ）を加えてアミドを溶解させた後、その混合物に重水（Ｄ２Ｏ）（０．５０ｍＬ）を加えた。８０℃で１８時間攪拌して反応させ、進行をエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）でモニターした。反応混合物を室温に冷却し、分離漏斗に移し、酢酸エチル（ＡｃＯＥｔ）で希釈し、塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。粗β位－重水素化標識化合物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより粗精製した。
イ　α位の重水素化
　続いて、上記アで得られたβ位－重水素化標識化合物（１８８．６ｍｇ、約０．４６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（６３．７ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、およびメタノール－ｄ１（ＣＨ３ＯＤ、２．３ｍＬ、０．２Ｍ）を空気下で１０ｍＬスクリューキャップチューブに入れた。８０℃で１８時間攪拌して反応させ、進行をＥＳＩ－ＭＳでモニターした。反応混合物を室温に冷却し分離漏斗に移し、ＡｃＯＥｔで希釈し、塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。得られた化合物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、重水素化された表題化合物を得た（収率７８％、１６２．２ｍｇ、０．３９５ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９７％と確認された。
無色油: Rf 0.74 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.12 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.40-7.55 (m, 3H), 5.32-5.38 (m, 4H), 2.77 (dd, J = 6.4, 6.0 Hz, 2H), 2.52 (br-s, 0.07H, 97%D), 2.00-2.07 (m, 4H), 1.77-1.80 (m, 0.08H, 96%D), 1.27-1.41 (m, 14H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.9, 148.1, 138.3, 136.3, 134.6, 130.2, 130.0, 128.0, 127.9 (overlapped), 127.4, 121.5, 121.3, 116.4, 37.0-37.4 (m, α-CD2), 31.5, 29.6, 29.3 (overlapped), 29.3, 29.2, 29.0, 27.2, 25.6, 24.4-25.2 (m, β-CD2), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C27H34D4N2ONa+ [M+Na]+ 433.3127, found 433.3139.
IR (ATR-IR, neat) 3555, 3008, 2922, 2851, 2848, 1685, 1520, 1383, 1327, 1264, 1163, 969, 913, 824, 790, 753, 678 cm-1.
（３）重水素化エステル化合物（リノール酸メチル－２，２，３，３－ｄ４（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエートメチル－２，２，３，３－ｄ４））の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　公知文献（Deguchi, T. et al. T., ACS Catal. 2017, 7, 3157-3161.）の記載に従って、上記（２）で得られた化合物の８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した。具体的には以下の手順に従って行った。
　上記（２）で得られた化合物（３８．４ｍｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）、ニッケルビス（２，２，６，６－テトラメチル－３，５－ヘプタンジオネート）（８．０ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ、２０ｍｏｌ％）およびＭｅＯＨ－ｄ１（ＣＨ３ＯＤ、０．９ｍＬ、０．１Ｍ）を粗いＮ２パージとともに１０ｍＬスクリューキャップチューブに入れた。１００℃で１６時間撹拌して反応させ、進行を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）およびＥＳＩ－ＭＳによりモニターした。反応混合物を分離漏斗に移し、ＡｃＯＥｔで希釈し、塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。そして、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率８５％、２３．８ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％と確認されたが、β位は残Ｈ２Ｏピークとのオーバーラップにより確認できなかった。
無色油: Rf 0.74 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.30-5.42 (m, 4H), 3.67 (s, 3H), 2.77 (dd, J = 6.4, 6.4 Hz, 2H), 2.27 (br-s, 0.07H, 97%D), 2.02-2.07 (m, 4H), 1.60 (overlapped with H2O), 1.30-1.36 (m, 20H), 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 174.4, 130.2, 130.1, 128.1, 127.9, 51.4, 33.0-33.8 (m, α-CD2), 31.5, 29.6, 29.4, 29.1, 28.9, 27.2, 27.2, 25.6, 23.7-24.5 (m, β-CD2), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C19H30D4NaO2 + [M+Na]+ 321.2702, found 321.2710.
IR (ATR-IR, neat) 3008, 2922, 2855, 1737, 1461, 1260, 1193, 1085, 719 cm-1.
（４）重水素化標識脂肪酸（リノール酸－２，２，３，３－ｄ４（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノイック酸－２，２，３，３－ｄ４））の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　公知文献（Meyer, M. P. et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 430-439.）を参考に、上記（３）で得られた化合物を加水分解によりカルボン酸に変換し、表題の重水素化リノール酸－ｄ４を得た。具体的には以下の手順に従って行った。
　上記（３）で得られたエステル化合物（２３．８ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（０．８０ｍＬ）およびメタノール－ｄ１（ＣＨ３ＯＤ、０．２７ｍＬ）を粗いＮ２パージとともに１０ｍＬスクリューキャップチューブに入れた。０℃に冷却した後、ＮａＯＤ／Ｄ２Ｏ溶液（Sigma-Aldrich、４０ｗｔ％、３０μＬ）を反応混合物に加えた。混合物を０℃で５分間および室温で２時間撹拌した。進行はＴＬＣによりモニターした。反応を１Ｎ　ＨＣｌでクエンチし、ジエチルエーテルで希釈し、分離した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。得られた化合物をシリカゲフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（ＤＩＯＬシリカゲル（富士シリシア化学）、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題の重水素化リノール酸－ｄ４を得た（収率９０％、２０．４ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９４％と確認された。
無色油: Rf 0.13 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.30-5.42 (m, 4H), 2.77 (dd, J = 6.4, 6.8 Hz, 2H), 2.32 (br-s, 0.08H, 96%D), 2.02-2.08 (m, 4H), 1.59-1.63 (m, 0.11H, 94%D), 1.24-1.39 (m, 14H), 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.1, 130.2, 130.0, 128.1, 127.9, 32.9-33.8 (m, α-CD2), 31.5, 29.6, 29.4, 29.1 (overlapped), 28.8, 27.2, 27.2, 25.6, 23.6-24.4 (m, β-CD2), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C18H27D4O2 - [M-H]- 283.2581, found 283.2579.
IR (ATR-IR, neat) 3400-2400 (br), 3009, 2922, 2855, 1707, 1481, 1409, 1293, 947, 839, 719 cm-1.
例２：重水素化標識脂肪酸（ステアリン酸）の製造
（１）Ｎ－（キノリン－８－イル）ステアラミドの調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 　ステアリン酸のカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例１（１）に記載した手順と同様の手順で行った。ステアリン酸（１．４１ｇ、５．０ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題化合物を得た（収率７７％、１．５７ｇ、３．８３ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲデータは、公知文献（Qian, P. et al., Chem. Lett. 1999, 28, 1229-1230.、Gou, Q. et al., J. Org. Chem. 2015, 80, 3176-3186.）に記載されているものと一致していることが確認された。
白色固体: Rf 0.48 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.79-8.82 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.56 (m, 3H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.82 (tt, J =7.6, 7.6 Hz, 2H), 1.25-1.42 (m, 28H), 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
（２）重水素化標識化合物（Ｎ－（キノリン－８－イル）ステアラミド－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（１）で得られた化合物（１２３．２ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）の重水素化を例１（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、重水素化された表題の化合物を得た（収率６５％、８０．６ｍｇ、０．１９５ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９３％と確認された。
白色固体: Rf 0.48 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.82 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.56 (m, 3H), 2.53 (br-s, 0.08H, 96%D), 1.75-1.82 (m, 0.14H, 93%D), 1.25-1.42 (m, 28H), 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.0, 148.1, 138.3, 136.3, 134.6, 127.9, 127.5, 121.5, 121.3, 116.4, 37.1-38.0 (m, α-CD2), 31.9, 29.7 (overlapped), 29.7, 29.6, 29.5, 29.4, 29.2, 29.1, 24.5-25.4 (m, β-CD2), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C27H38D4N2ONa+ [M+Na]+ 437.3440, found 437.3430
IR (ATR-IR, neat) 3339, 2956,2914, 2848, 1662, 1524, 1487, 1379, 1323, 1267, 1167, 837, 790, 760, 723 cm-1. 
mp 62-63 ℃.
（３）重水素化エステル化合物（ステアリン酸メチル－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（２）で得られた重水素化標識化合物（２９．４ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）について、例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率７５％、１６．２ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９６％と確認された。
白色固体: Rf 0.81 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.59 (s, 3H), 2.26 (br-s, 0.08H, 96%D), 1.57-1.59 (m, 0.07H, 97%D), 1.18-1.21 (m, 28H), 0.81 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 173.4, 50.4, 32.1-32.8 (m, α-CD2), 30.9, 28.7 (overlapped), 28.7, 28.6, 28.6, 28.6, 28.4, 28.3, 28.2, 28.0, 27.9, 22.7-23.6 (m, β-CD2), 21.7, 13.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C19H34D4NaO2 + [M+Na]+ 303.3196, found 303.3198.
IR (ATR-IR, neat) 2952, 2915, 2844, 1737, 1461, 1275, 1193, 1096, 850, 719, 671 cm-1.
mp 38-39 ℃.
（４）重水素化標識脂肪酸（ステアリン酸－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（３）で得られた化合物（１５．４ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題の重水素化ステアリン酸－ｄ４を得た（収率８８％、１３．１ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９４％と確認された。
白色固体: Rf 0.81 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ2.32 (br-s, 0.08H, 96%D), 1.59-1.62 (m, 0.12H, 94%D), 1.26-1.30 (m, 28H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.0, 130.0, 129.7, 32.9-33.6 (m, α-CD2), 31.9, 29.7(overlapped), 29.7, 29.7, 29.6, 29.5, 29.4, 29.2, 28.9, 28.8, 23.5-242 (m, β-CD2), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C18H31D4O2 + [M+Na]+ 287.2894, found 287.2893.
IR (ATR-IR, neat) 3300-2500 (br), 2956, 2915, 2848, 1696, 1481, 1409, 1320, 1197, 951, 891, 719, 664 cm-1.
mp 68-69 ℃.
例３：重水素化標識脂肪酸（オレイン酸）の製造
（１）Ｎ－（キノリン－８－イル）オレアミドの調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　オレイン酸のカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例１（１）に記載した手順と同様の手順で行った。オレイン酸（１．４１ｇ、５．０ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～８０／２０）、表題化合物を得た（収率８７％、１．７７ｇ、４．４３ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲデータは、公知文献（Ano, Y. et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12984-12986.）に記載されているものと一致していることが確認された。
無色油: Rf 0.57 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.82 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.54 (m, 3H), 5.33-5.35 (m, 2H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.00-2.05 (m, 4H), 1.82 (tt, J = 7.6, 7.6 Hz, 2H), 1.26-1.44 (m, 20H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
（２）重水素化標識化合物（Ｎ－（キノリン－８－イル）オレアミド－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（１）で得られた化合物（１２２．６ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）の重水素化を例１（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～８０／２０）、重水素化された表題の化合物を得た（収率７８％、９８．６ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９７％と確認された。
無色油: Rf 0.57 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.79-8.81 (m, 2H), 8.14 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 2H), 7.42-7.54 (m, 3H), 5.30-5.38 (m, 2H), 2.53 (br-s, 0.06H, 97%D), 1.98-2.01 (m, 4H), 1.77-1.79 (m, 0.07H, 97%D), 1.26-1.42 (m, 20H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 171.9, 148.1, 138.3, 136.3, 134.6, 130.0, 129.8, 127.9, 127.4, 121.5, 121.3, 116.4, 37.1-37.6 (m, α-CD2), 31.9, 29.8 (overlapped), 29.7, 29.5, 29.3, 29.3, 29.2, 29.0, 27.2, 27.2, 24.4-25.4 (m, β-CD2), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C27H36D4N2ONa+ [M+Na]+ 435.3284, found 435.3276.
IR (ATR-IR, neat) 3355, 3004, 2922, 2851, 1685, 1521, 1382, 1327, 1264, 824, 790, 753 cm-1. 
（３）重水素化エステル化合物（オレイン酸メチル－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（２）で得られた重水素化標識化合物（５８．２ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）について、例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率８７％、３７．０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９６％と確認された。
無色油: Rf 0.70 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.30-5.39 (m, 2H), 3.37 (s, 3H), 2.27 (br-s, 0.07H, 97%D), 1.99-2.03 (m, 2H), 1.59-1.65 (m, 0.09H, 96%D), 1.27-1.30 (m, 20H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 174.4, 130.0, 129.8, 51.4, 33.0-33.8 (m, α-CD2), 31.3, 29.8, 29.7, 29.5, 29.3, 29.1, 28.9, 27.2, 27.2, 23.2-24.7 (m, β-CD2), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C19H32D4NaO2 + [M+Na]+ 323.2859, found 323.2852.
IR (ATR-IR, neat) 3004, 2922, 2851, 1741, 1461, 1260, 1193, 1085, 850, 813, 723 cm-1.
（４）重水素化標識脂肪酸（オレイン酸－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（３）で得られた化合物（１８．４ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題の重水素化オレイン酸－ｄ４を得た（収率７１％、１２．４ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９６％と確認された。
無色油: Rf 0.28 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.30-5.39 (m, 2H), 2.32-2.33 (m, 0.07H, 97%D), 1.99-2.04 (m, 4H), 1.57-1.63 (m, 0.08H, 96%D), 1.27-1.31 (m, 20H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.0, 130.0, 129.7, 33.1-33.7 (m, α-CD2), 31.9, 29.8, 29.7, 29.5, 29.3, 29.1, 29.1, 28.8 (overlapped), 27.2, 27.2, 23.5-24.2 (m, β-CD2), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C18H29D4O2 - [M-H]- 285.2737, found 285.2730.
IR (ATR-IR, neat) 3300-2500 (br), 3004, 2922, 2851, 1707, 1461, 1409, 1297, 947, 723 cm-1.
例４：重水素化標識脂肪酸（エライジン酸）の製造
（１）（Ｅ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデク－９－エナミドの調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　エライジン酸のカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例１（１）に記載した手順と同様の手順で行った。エライジン酸（１．４１ｇ、５．０ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～８０／２０）、表題化合物を得た（収率８６％、１．７６ｇ、４．３０ｍｍｏｌ）。本化合物はCAS No. [1453491-93-4]（Pan, F. et al., Org. Lett. 2013, 15, 4758-4761.）として知られているが、スペクトルデータは報告されていない。
白色固体: Rf 0.55 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.82 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.56 (m, 3H), 5.33-5.38 (m, 2H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.96 (m, 4H), 1.80 (tt, J = 7.6, 7.6 Hz, 2H), 1.26-1.46 (m, 20H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.9, 148.1, 138.4, 136.4, 134.6, 130.5, 130.2, 127.9, 127.5, 121.6, 121.3, 116.4, 38.3, 32.6, 32.6, 31.9, 29.7 (overlapped), 29.6, 29.5, 29.3, 29.3, 29.2, 29.0, 25.7, 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C27H41N2O+ [M+H]+ 409.3213, found 409.3198.
IR (ATR-IR, neat) 3291, 2915, 2848, 1662, 1521, 1484, 1423, 1379, 1320, 1260, 1167, 958, 824, 787, 757, 719, 678 cm-1. 
mp 37-38 ℃.
（２）重水素化標識化合物（（Ｅ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデク－９－エナミド－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（１）で得られた化合物（１２２．６ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）の重水素化を例１（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～８０／２０）、重水素化された生成物を得た（収率７６％、９４．１ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９６％と確認された。
白色固体: Rf 0.55 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.82 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 2H), 7.43-7.56 (m, 3H), 5.33-5.43 (m, 2H), 2.53 (br-s, 0.07H, 97%D), 1.96 (m, 4H), 1.77-1.81 (m, 0.08H, 96%D), 1.26-1.42 (m, 20H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.0, 148.1, 138.3, 136.4, 134.6, 130.4, 130.2, 127.9, 127.5, 121.5, 121.3, 116.4, 37.1-37.8 (m, α-CD2), 32.6, 32.6, 31.9, 29.7 (overlapped), 29.6, 29.5, 29.3, 29.2, 29.2, 29.0, 24.4-25.2 (m, β-CD2), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C27H36D4N2ONa+ [M+Na]+ 435.3284, found 435.3278.
IR (ATR-IR, neat) 3291, 2956, 2915, 2848, 1659, 1521, 1379, 1320, 1271, 962, 823, 790, 757, 723 cm-1. 
mp 35-36 ℃.
（３）重水素化エステル化合物（エライジン酸メチル－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（２）で得られた重水素化標識化合物（２５．６ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）について、例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率８５％、１５．９ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％と確認されたが、β位は残Ｈ２Ｏピークとのオーバーラップにより確認できなかった。
無色油: Rf 0.73 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.33-5.43 (m, 2H), 3.67 (s, 3H), 2.27 (br-s, 0.08H, 96%D), 1.95-1.97 (m, 2H), 1.60 (overlapped with H2O), 1.26-1.29 (m, 20H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 173.4, 129.5, 129.2, 50.4, 32.1-32.6 (m, α-CD2), 28.6, 28.5, 28.5, 28.3, 28.2, 28.0, 27.9, 27.8, 22.7-23.6 (m, β-CD2), 21.7, 13.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C19H32D4NaO2 + [M+Na]+ 323.2859, found 323.2849.
IR (ATR-IR, neat) 2922, 2851, 1741, 1461, 1435, 1260, 1193, 1085, 989, 805, 723 cm-1.
（４）重水素化標識脂肪酸（エライジン酸－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（３）で得られた化合物（１５．０ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）を加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題の重水素化エライジン酸－ｄ４を得た（収率９０％、１２．９ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９５％と確認された。
白色粘着固体: Rf 0.25 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.33-5.43 (m, 2H), 2.31 (br-s, 0.08H, 96%D), 1.94-1.
97 (m, 4H), 1.60-1.65 (m, 0.10H, 95%D), 1.26-1.30 (m, 20H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.0, 130.5, 130.2, 32.9-33.6 (m, α-CD2), 32.6, 32.6, 31.9, 29.7, 29.7, 29.6, 29.5, 29.3, 29.2, 28.9, 28.8, 23.4-24.2 (m, β-CD2), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C18H29D4O2 - [M-H]- 285.2737, found 285.2738.
IR (ATR-IR, neat) 3400-2400 (br), 3034, 2960, 2919, 2848, 1711, 1468, 1420, 1375, 1312, 1059, 962, 872, 731, 667 cm-1.
mp 41 ℃.
例５：重水素化標識脂肪酸（リノエライジン酸）の製造
（１）（９Ｅ，１２Ｅ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１２－ジエナミドの調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　リノエライジン酸のカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例１（１）に記載した手順と同様の手順で行った。ステアリン酸（２８０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題化合物を得た（収率９０％、１８１．２ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）。
無色油: Rf 0.55 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.54 (m, 3H), 5.35-5.45 (m, 4H), 2.65-2.66 (m, 2H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.95-2.00 (m, 4H), 1.82 (tt, J = 7.6, 7.6 Hz, 2H), 1.24-1.41 (m, 14H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.9, 148.1, 138.4, 136.4, 134.6, 131.1, 131.0, 128.7, 128.6, 127.9, 127.5, 121.6, 121.3, 116.4, 38.3, 35.7, 32.6, 31.4, 29.5, 29.2, 29.2, 29.0, 25.7, 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C27H38N2ONa+ [M+Na]+ 429.2876, found 429.2875.
IR (ATR-IR, neat) 3355, 2922, 2851, 1689, 1521, 1484, 1424, 1383, 1323, 1260, 1189, 969, 828, 790, 752 cm-1.
（２）重水素化標識化合物（（９Ｅ，１２Ｅ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１２－ジエナミド－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（１）で得られた化合物（１３１．４ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）の重水素化を例１（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、重水素化された生成物を得た（収率７５％、９８．５ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９５％、β位が９７％と確認された。
無色油: Rf 0.55 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 2H), 7.42-7.55 (m, 3H), 5.38-5.42 (m, 4H), 2.65-2.66 (m, 2H), 2.53 (br-s, 0.06H, 97%D), 1.95-2.00 (m, 4H), 1.77-1.83 (m, 0.10H, 95%D), 1.24-1.41 (m, 14H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.9, 148.1, 138.3, 136.3, 134.6, 131.1, 130.9, 128.7, 128.5, 127.9, 127.4, 121.5, 121.3, 116.4, 37.1-37.9 (m, α-CD2), 35.6, 32.5, 31.4, 29.5, 29.2, 29.0 (overlapped), 24.6-25.4 (m, β-CD2), 22.5, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C27H34D4N2ONa+ [M+Na]+ 433.3127, found 433.3139.
IR (ATR-IR, neat) 3355, 3023, 2922, 2851, 1685, 1521, 1424, 1383, 1327, 1264, 969, 917, 824, 790, 753, 678 cm-1.
（３）重水素化エステル化合物（リノエライジン酸メチル２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（２）で得られた重水素化標識化合物（２１．０ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）について、例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率８６％、１３．１ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％と確認されたが、β位は残Ｈ２Ｏピークとのオーバーラップにより確認できなかった。
無色油: Rf 0.62 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.35-5.46 (m, 4H), 3.67 (s, 3H), 2.66-2.67 (m, 2H), 2.27 (br-s, 0.07H, 97%D), 1.97-1.99 (m, 4H), 1.60 (overlapped with H2O), 1.26-1.35 (m, 14H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 174.4, 131.1, 130.9, 128.7, 128.6, 51.4, 35.6, 33.0-33.9 (m, α-CD2), 32.5, 32.5, 31.4, 29.5, 29.2, 29.1, 29.0, 28.9, 23.7-24.7 (m, β-CD2), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C19H30D4NaO2+ [M+Na]+ 321.2702, found 321.2700.
IR (ATR-IR, neat) 3023, 2922, 2855, 1737, 1461, 1435, 1260, 1193, 1085, 969, 805, 727 cm-1.
（４）重水素化標識脂肪酸（リノエライジン酸－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　リノエライジン酸メチル－ｄ４（３７．５ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題の重水素化リノエライジン酸－ｄ４を得た（収率７３％、２６．０ｍｇ、０．０９１ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９４％と確認された。
白色粘着固体: Rf 0.13 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.35-5.46 (m, 4H), 2.62-2.71 (m, 2H), 2.31 (br-s, 0.08H, 96%D), 1.96-2.00 (m, 4H), 1.58-1.61 (m, 0.11H, 94%D), 1.25-1.38 (m, 14H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.2, 131.1, 130.9, 128.7, 128.5, 35.7, 32.9-33.6 (m, α-CD2), 32.6, 32.5, 31.4, 29.4, 29.2, 29.1, 29.0, 28.8, 23.4-24.4 (m, β-CD2), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C18H27D4O2 - [M-H]- 283.2581, found 283.2582.
IR (ATR-IR, neat) 3300-2500 (br), 3023, 2922, 2855, 1707, 1461, 1409, 1293, 1088, 985, 839, 727 cm-1.
mp 28-29 ℃.
例６：重水素化標識脂肪酸（（Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）－１３－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）オクトデカ－９，１１－ジエノン酸（ＴＢＳ－１３－ＨＯＤＥ））の製造
（１）（Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）－１３－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１１－ジエナミドの調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　ＴＢＳ－１３－ＨＯＤＥのカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例８（１）に記載した手順と同様の手順で行った。ＴＢＳ－１３－ＨＯＤＥ（３８５ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６５／３５）、表題化合物を得た（収率７０％、３７７ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）。
無色油: Rf 0.55 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.54 (m, 3H), 6.41 (dd, J = 14.8, 10.8 Hz, 1H), 5.96 (dd, J = 10.8, 10.8 Hz, 1H), 5.61 (dd, J = 14.8, 6.0 Hz, 1H), 5.39 (dt, J = 10.8, 7.6 Hz, 1H), 4.14 (dt, J = 6.0, 6.0 Hz, 1H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.16 (dt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 1.82 (tt, J = 7.6, 7.6 Hz, 2H), 1.26-1.46 (m, 16H), 0.86-0.89 (m, 12H), 0.04 (s, 3H), 0.02 (s, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.9, 148.1, 138.3, 136.8, 136.3, 134.6, 131.7, 128.1, 128.0, 127.5, 124.4, 121.6, 121.3, 116.4, 73.2, 38.4, 38.3, 31.9, 29.7, 29.3, 29.3, 29.1, 27.7, 25.9, 25.7, 25.0, 22.6, 18.3, 14.1, -4.3, -4.7
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C33H52N2O2SiNa+ [M+Na]+ 559.3690, found 559.3695.
IR (ATR-IR, neat) 3355, 3004, 2926, 2855, 1689, 1521, 1484, 1383, 1323, 1252, 1074, 984, 828, 675 cm-1.
（２）重水素化標識化合物（（Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）－１３－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１１－ジエナミド－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（１）で得られた化合物（２０１．１ｍｇ、０．３７５ｍｍｏｌ）の重水素化を例１（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６５／３５）、重水素化された表題の化合物を得た（収率６９％、１３８．９ｍｇ、０．２５７ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９７％と確認された。
無色油: Rf 0.55 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.54 (m, 3H), 6.41 (dd, J = 14.8, 10.8 Hz, 1H), 5.96 (dd, J = 10.8, 10.8 Hz, 1H), 5.61 (dd, J = 14.8, 6.0 Hz, 1H), 5.39 (dt, J = 10.8, 7.6 Hz, 1H), 4.16 (dt, J = 6.0, 6.0 Hz, 1H), 2.53 (br-s, 0.05H, 97%D), 2.16 (dt, J = 7.6, 7.2 Hz, 2H), 1.77-1.81 (m, 0.05H, 97%D), 1.26-1.56 (m, 16H), 0.86-0.89 (m, 12H), 0.04 (s, 3H), 0.02 (s, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.9, 148.1, 138.3, 136.8, 136.3, 134.6, 131.7, 128.1, 127.9, 127.4, 124.4, 121.5, 121.3, 116.4, 73.2, 38.4, 37.0-37.9 (m, α-CD2), 31.8, 29.7, 29.3, 29.1, 29.0, 27.7, 25.9, 24.9, 24.4-25.1 (m, β-CD2), 22.6, 18.3, 14.1, -4.3, -4.8
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C33H48D4N2O2SiNa+ [M+Na]+ 563.3941, found 563.3944.
IR (ATR-IR, neat) 3355, 2922, 2855, 1685, 1521, 1383, 1327, 1252, 1074, 984, 835, 734 cm-1.
（３）重水素化エステル化合物（ＴＢＳ－１３－ＨＯＤＥメチル－２，２，３，３－ｄ４（（Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）－１３－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）オクタデカ－９，１１－ジエノエートメチル－２，２，３，３－ｄ４））の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（２）で得られた重水素化標識化合物（１５４．６ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）について、例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率６２％、７６．９ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％と確認されたが、β位は残Ｈ２Ｏピークとのオーバーラップにより確認できなかった。
無色油: Rf 0.68 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.41 (dd, J = 14.8, 10.8 Hz, 1H), 5.96 (dd, J = 10.8, 10.8 Hz, 1H), 5.61 (dd, J = 14.8, 6.0 Hz, 1H), 5.39 (dt, J = 10.8, 7.6 Hz, 1H), 4.15 (dt, J = 6.0, 6.0 Hz, 1H), 3.67 (s, 3H), 2.27 (br-s, 0.06H, 97%D), 2.13-2.18 (m, 2H), 1.58 (overlapped with H2O), 1.27-1.52 (m, 6H), 0.86-0.90 (m, 12H), 0.05 (m, 3H), 0.02 (m, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 174.4, 136.9, 131.7, 128.3, 124.5, 73.3, 51.5, 38.5, 33.0-33.8 (m, α-CD2), 32.0, 29.7, 29.2, 29.2, 29.0, 27.8, 27.5, 26.0, 25.1, 23.8-24.7 (m, β-CD2), 22.7, 18.3, 14.2, -4.2, -4.7
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C25H44D4NaO3Si+ [M+Na]+ 451.3516, found 451.3506.
IR (ATR-IR, neat) 3008, 2948, 2930, 2855, 1741, 1461, 1435, 1360, 1252, 1193, 1077, 984, 951, 835, 775, 734 cm-1.
（４）重水素化標識脂肪酸（ＴＢＳ－１３－ＨＯＤＥ－２，２，３，３－ｄ４（（Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）－１３－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）オクトデカ－９，１１－ジエノン酸－２，２，３，３－ｄ４））の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　ＴＢＳ－１３－ＨＯＤＥメチル－２，２，３，３－ｄ４（９１．４ｍｇ、０．２１３ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９０／１０～８０／２０）、表題の重水素化ＴＢＳ－１３－ＨＯＤＥを得た（収率９４％、８２．８ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９６％と確認された。
無色油: Rf 0.17 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.41 (dd, J = 14.8, 10.8 Hz, 1H), 5.96 (dd, J = 10.8, 10.8 Hz, 1H), 5.61 (dd, J = 14.8, 6.0 Hz, 1H), 5.39 (dt, J = 10.8, 7.6 Hz, 1H), 4.15 (dt, J = 6.0, 6.0 Hz, 1H), 2.31 (br-s, 0.07H, 97%D), 2.13-2.18 (m, 2H), 1.58-1.61 (m, 0.08H, 96%D), 1.26-1.49 (m, 16H), 0.86-0.90 (m, 12H), 0.05 (s, 3H), 0.03 (s, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.2, 136.8, 131.6, 128.2, 124.4, 73.2, 38.4, 32.9-33.7 (m, α-CD2), 31.8, 29.6, 29.1, 29.0, 28.8, 27.7, 25.9, 25.0, 23.4-24.4 (m, β-CD2), 22.6, 18.3, 14.1
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C24H42D4O3SiNa+ [M+Na]+ 437.3359, found 437.3349.
IR (ATR-IR, neat) 3400-2400 (br), 3008, 2926, 2855, 1707, 1461, 1409, 1361, 1297, 1252, 1074, 984, 947, 872, 835, 775, 731, 671 cm-1.
例７：重水素化標識脂肪酸（エルカ酸）の製造
（１）（Ｚ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）ドコス－１３－エナミドの調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　エルカ酸のカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例８（１）に記載した手順と同様の手順で行った。エルカ酸（８８０ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～８２／１８）、表題化合物を得た（収率７０％、８４０ｍｇ、１．８１ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲデータは、公知文献（Sun, W.-W. et al., Org. Lett. 2013, 16, 480-483.）に記載されているものと一致していることが確認された。
無色油: Rf 0.43 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.81 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.2 Hz, 2H), 7.43-7.56 (m, 3H), 5.31-5.38 (m, 2H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.99-2.06 (m, 4H), 1.91 (tt, J = 7.6, 7.2 Hz, 2H), 1.26-1.45 (m, 28H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
（２）重水素化標識化合物（（Ｚ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）ドコス－１３－エナミド－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（１）で得られた化合物（７１．５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の重水素化を例１（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～８２／１８）、重水素化された表題の化合物を得た（収率８３％、５９．９ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９７％と確認された。
無色油: Rf 0.43 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.79-8.81 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.2 Hz, 2H), 7.44-7.56 (m, 3H), 5.31-5.38 (m, 2H), 2.53 (br-s, 0.07H, 97%D), 1.93-2.01 (m, 4H), 1.77-1.80 (m, 0.07H, 97%D), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.0, 148.1, 138.3, 136.3, 134.6, 129.9 (overlapped), 127.9, 127.4, 121.5, 121.3, 116.4, 37.3-38.0 (m, α-CD2), 31.9, 29.8, 29.7, 29.7, 29.6 (overlapped), 29.6, 29.5 (overlapped), 29.4, 29.3 (overlapped), 29.1, 27.2, 24.5-25.2 (m, β-CD2), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C31H44D4N2NaO+ [M+Na]+ 491.3910, found 491.3914.
IR (ATR-IR, neat) 3355, 2922, 2815, 1685, 1521, 1383, 1327, 1263, 824, 790, 753, 723, 678 cm-1.
（３）重水素化エステル化合物（エルカ酸メチル－２，２，３，３－ｄ４（（１３Ｚ）－１３－ドコセン酸メチル－２，２，３，３－ｄ４））の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（２）で得られた重水素化標識化合物（２９．２ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）について、例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率８３％、１８．３ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％と確認されたが、β位は残Ｈ２Ｏピークとのオーバーラップにより確認できなかった。
無色油: Rf 0.71 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.31-5.39 (m, 2H), 3.67 (s, 3H), 2.27 (br-s, 0.08H, 96%D), 1.97-2.06 (m, 2H), 1.58 (overlapped with H2O), 1.26-1.29 (m, 28H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 174.4, 129.9, 129.9, 51.4, 33.0-33.9 (m, α-CD2), 31.9, 29.8, 29.7, 29.7, 29.6, 29.6, 29.6, 29.5, 29.5, 29.3 (overlapped), 29.2, 29.0, 28.9, 27.2, 23.7-24.6 (m, β-CD2), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C23H40D4NaO2 + [M+Na]+ 379.3485, found 379.3472.
IR (ATR-IR, neat) 3004, 2922, 2851, 1741, 1481, 1260, 1193, 1074, 805, 723 cm-1.
（４）重水素化標識脂肪酸（エルカ酸－２，２，３，３－ｄ４（（１３Ｚ）－１３－ドコセン酸－２，２，３，３－ｄ４））の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（３）で得られた化合物（１７．７ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題の重水素化エルカ酸－ｄ４を得た（収率９５％、１６．２ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９７％と確認された。
白色粘着固体: Rf 0.31 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.31-5.39 (m, 2H), 2.31 (br-s, 0.06H, 97%D), 1.97-2.06 (m, 4H), 1.55-1.65 (m, 0.07H, 97%D), 1.26-1.34 (m, 28H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.1, 129.9, 129.9, 32.9-33.7 (m, α-CD2), 31.9, 29.8, 29.7, 29.7 29.6, 29.6, 29.6, 29.5, 29.5, 29.5, 29.3 (overlapped), 29.2, 28.8, 27.2, 23.7-24.4 (m, β-CD2), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C22H37D4O2 - [M-H]- 341.3363, found 341.3359.
IR (ATR-IR, neat) 3300-2500 (br), 3001, 2915, 2848, 1692, 1469, 1405, 1293, 1234, 1185,1059, 947, 723 cm-1.
mp 30-31 ℃.
例８：重水素化標識脂肪酸（パルミチン酸）の製造
（１）Ｎ－（キノリン－８－イル）パルミタミドの調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　パルミチン酸のカルボキシ基の８－キノリンアミド化をスキーム４の反応に基づいて行った。具体的には下記の手順に従って行った。パルミチン酸（１２９ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、８－アミノキノリン（７９ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）、ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（１２５ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（６．１ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、およびＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）を室温でアルゴン雰囲気下の５０ｍＬシェンクチューブに入れた。一晩撹拌した後、反応をＮＨ４Ｃｌ水溶液でクエンチし、塩水で洗った。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。得られた化合物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題化合物を得た（収率８７％、１６６．３ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）。
白色固体: Rf 0.41 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.81 (br-s, 1H), 8.80-8.82 (m, 2H), 8.17 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.46-7.56 (m, 3H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.82 (tt, J =7.6, 7.6 Hz, 2H), 1.25-1.47 (m, 24H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.0, 148.1, 138.4, 136.4, 134.6, 127.9, 127.5, 121.5, 121.3, 116.4, 38.3, 31.9, 29.7, 29.7, 29.7, 29.7, 29.6, 29.5, 29.4, 29.4, 29.4 29.3, 25.7, 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C25H39N2O+ [M+H]+ 383.3057, found 383.3053.
IR (ATR-IR, neat) 3291, 2915, 2848, 1659, 1521, 1484, 1424, 1379, 1320, 1252, 1170, 824, 787, 753, 719 cm-1. 
mp 57-58 ℃.
（２）重水素化標識化合物（Ｎ－（キノリン－８－イル）パルミタミド－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（１）で得られた化合物（３８．３ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）の重水素化を例１（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、重水素化された表題の化合物を得た（収率８１％、３１．２ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９８％と確認された。
白色固体:Rf0.41(n-hexane/AcOEt=4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.15 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.43-7.55 (m, 3H), 2.53 (br-s, 0.08H, 96%D), 1.77-1.80 (m, 0.04H, 98%D), 1.25-1.42 (m, 24H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.0, 148.1, 138.4, 136.4, 134.6, 127.9, 127.5, 121.5, 121.3, 116.4, 37.3-38.0 (m, α-CD2), 31.9, 29.7 (overlapped), 29.7, 29.6, 29.5, 29.4, 29.2, 29.1, 24.4-25.4 (m, β-CD2), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C25H34D4N2ONa+ [M+Na]+ 409.3127, found 409.3124.
IR (ATR-IR, neat) 3291, 2956, 2915, 2848, 1655, 1520, 1423, 1379, 1319, 1267, 1162, 823, 787, 753, 719 cm-1. 
mp 55-56 ℃.
（３）重水素化エステル化合物（パルミチン酸メチル－２，２，３，３－ｄ４（ヘキサデカン酸メチル－２，２，３，３－ｄ４））の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（２）で得られた重水素化標識化合物（９．７ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）について、例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率６６％、４．５ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９５％と確認された。
白色ろう状個体: Rf 0.71 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.66 (s, 3H), 2.26 (br-s, 0.08H, 96%D), 1.58 (m, 0.10H, 95%D), 1.25-1.28 (m, 24H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 174.4, 51.4, 33.0-33.6 (m, α-CD2), 31.9, 29.7, 29.7, 29.7, 29.6, 29.6, 29.5, 29.4, 29.4, 29.2, 28.9, 23.8-24.7 (m, β-CD2), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C17H30D4NaO2 + [M+Na]+ 297.2702, found 297.2695.
IR (ATR-IR, neat) 2956, 2922, 2855, 1741, 1465, 1435, 1260, 1193, 1077, 1025, 801, 719 cm-1.
（４）重水素化標識脂肪酸（パルミチン酸－２，２，３，３－ｄ４（ヘキサデカン酸－２，２，３，３－ｄ４））の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（３）で得られた化合物（２５．２ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題の重水素化パルミチン酸－ｄ４を得た（収率８２％、１９．７ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９５％と確認された。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ2.31 (br-s, 0.08H, 96%D), 1.59-1.62 (m, 0.10H, 95%D), 1.26-1.30 (m, 24H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.3, 32.9-33.8 (m, α-CD2), 31.9, 29.7, 29.7, 29.7, 29.7, 29.7, 29.6, 29.4, 29.4, 29.2, 28.8, 23.5-24.2 (m, β-CD2), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C16H27D4O2 - [M-H]- 259.2581, found 259.2580.
IR (ATR-IR, neat) 3300-2400 (br), 2956, 2915, 2848, 1692, 1469, 1413, 1312, 1200, 951, 891, 719, 664 cm-1.
mp 62-63 ℃.
例９：重水素化標識脂肪酸（リシノール酸）の製造
（１）（Ｒ，Ｚ）－１２－ヒドロキシ－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデック－９－エナミドの調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　リシノール酸のカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例８（１）に記載した手順と同様の手順で行った。リシノール酸（３０３ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ、純度８０％、関東化学）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより２回精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６５／３５）、表題化合物を得た（収率１４％、６２．０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）。
無色油: Rf 0.35 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.80-8.82 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.54 (m, 3H), 5.53-5.59 (m, 1H), 5.37-5.43 (m, 1H), 3.58-3.64 (m, 1H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.21 (dd, J = 6.8, 6.4 Hz, 2H), 2.03-2.06 (m, 2H), 1.82 (tt, J = 7.6, 7.6 Hz, 2H), 1.28-1.48 (m, 18H), 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.9, 148.1, 138.3, 136.4, 134.6, 133.3, 127.9, 127.5, 125.3, 121.6, 121.3, 116.4, 71.5, 38.2, 36.9, 35.4, 31.8, 29.6, 29.4, 29.3, 29.2, 29.1, 27.4, 25.7, 25.6, 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C27H40N2O2Na+ [M+Na]+ 447.2982, found 447.2986.
IR (ATR-IR, neat) 3351, 3004, 2922, 2851, 1677, 1521, 1484, 1383, 1323, 1254, 1062, 828, 790, 757, 690 cm-1.
（２）重水素化標識化合物（（Ｒ，Ｚ）－１２－ヒドロキシ－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデック－９－エナミド－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（１）で得られた化合物（２７．５ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）の重水素化を例１（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６５／３５）、重水素化された表題の化合物を得た（収率５３％、１４．７ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９５％と確認された。
無色油: Rf 0.35 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.82 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.54 (m, 3H), 5.53-5.59 (m, 1H), 5.37-5.43 (m, 1H), 3.58-3.64 (m, 1H), 2.53 (br-s, 0.09H, 96%D), 2.20 (dd, J = 6.8, 6.4 Hz, 2H), 2.03-2.06 (m, 2H), 1.77-1.80 (m, 0.10H, 95%D), 1.25-1.48 (m, 18H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.0, 148.1, 138.3, 136.4, 134.6, 133.4, 127.9, 127.5, 125.5, 121.6, 121.3, 116.4, 71.5, 37.1-37.8 (m, α-CD2), 36.9, 35.4, 31.8, 29.6, 29.4, 29.2, 29.1, 29.0, 27.4, 25.7, 24.4-25.3 (m, β-CD2), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C27H36D4N2O2Na+ [M+Na]+ 451.3233, found 451.3229.
IR (ATR-IR, neat) 3350, 3004, 2922, 2851, 1677, 1520, 1484, 1383, 1327, 1263, 1047, 828, 790, 767 cm-1.
（３）重水素化エステル化合物（リシノール酸メチル－２，２，３，３－ｄ４（（（Ｒ，Ｚ）－１２－ヒドロキシオクタデカ－９－エノエート－２，２，３，３－ｄ４））の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（２）で得られた重水素化標識化合物（２１．７ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）について、例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９５／５～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率６１％、９．７ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９５％と確認されたが、β位は残Ｈ２Ｏピークとのオーバーラップにより確認できなかった。
無色油: Rf 0.54 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.53-5.60 (m, 1H), 5.37-5.44 (m, 1H), 3.67 (s, 3H), 3.61-3.65 (m, 1H), 2.27 (br-s, 0.10H, 95%D), 2.21 (dd, J = 6.8, 6.8 Hz, 2H), 2.05 (dt, J = 7.2, 6.8 Hz, 2H), 1.58 (overlapped with H2O), 1.25-1.48 (m, 18H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 174.4, 133.4, 125.2, 71.5, 51.4, 36.9, 35.4, 32.9-33.8 (m, α-CD2), 31.8, 29.6, 29.4, 29.1, 29.1, 28.8, 27.4, 25.7, 23.7-24.6 (m, β-CD2), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C19H32D4O3Na+ [M+Na]+ 339.2808, found 339.2806.
IR (ATR-IR, neat) 3437 (br), 3008, 2922, 2855, 1737, 1461, 1435, 1267, 1193, 1122, 1081, 1044, 857, 805, 723 cm-1.
（４）重水素化標識脂肪酸（リシノール酸－２，２，３，３－ｄ４（（Ｒ，Ｚ）－１２－ヒドロキシオクタデカ－９－エノン酸－２，２，３，３－ｄ４））の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（３）で得られた化合物（１４．０ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９０／１０～６０／４０）、表題の重水素化パルミチン酸－ｄ４を得た（収率８９％、１１．８ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９５％、β位が９３％と確認された。
無色油: Rf 0.54 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.52-5.59 (m, 1H), 5.36-5.43 (m, 1H), 3.59-3.65 (m, 1H), 2.30 (br-s, 0.10H, 95%D), 2.21 (dd, J = 6.8, 6.8 Hz, 2H), 2.05 (td, J = 7.2, 6.8 Hz, 2H), 1.58-1.61 (m, 0.15H (overlapped), ca. 93%D), 1.25-1.49 (m, 18H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 179.4, 133.4, 125.2, 71.6, 36.8, 35.3, 32.9-33.7 (m, α-CD2), 31.8, 29.5, 29.3, 29.0, 28.9, 28.7, 27.3, 25.7, 23.4-24.4 (m, β-CD2), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C18H30D4O3Na+ [M+Na]+ 325.2651, found 325.2655.
IR (ATR-IR, neat) 3500-2400 (br), 3011, 2922, 2855, 1707, 1461, 1405, 1290, 1123, 1077, 1033, 947, 857, 801, 723 cm-1.
例１０：重水素化標識脂肪酸（１３－ＨＯＤＥ）の製造
（１）（Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）－１３－ヒドロキシ－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１１－ジエナミドの調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　１３－ＨＯＤＥのカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例８（１）に記載した手順と同様の手順で行った。１３－ＨＯＤＥ（１０２．３ｍｇ、０．３４５ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより２回精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題化合物を得た（収率２７％、３８．８ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）。
無色油: Rf 0.32 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.43-7.53 (m, 3H), 6.49 (dd, J = 15.2, 11.2 Hz, 1H), 5.97 (dd, J = 11.2, 11.2 Hz, 1H), 5.66 (dd, J = 15.2, 6.8 Hz, 1H), 5.43 (dt, J = 11.2, 7.6 Hz, 1H), 4.16 (dt, J = 7.6, 6.4 Hz, 1H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.18 (dt, J = 6.8, 6.8 Hz, 2H), 1.80-1.83 (m, 2H), 1.23-1.61 (m, 16H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.0, 148.1, 138.3, 136.4, 136.0, 134.6, 132.8, 128.0, 127.9, 127.5, 125.7, 121.6, 121.4, 116.5, 72.9, 38.2, 37.4, 31.8, 29.5, 29.2, 29.1, 28.9, 27.6, 25.6, 25.1, 22.6, 14.0
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C27H38N2O2Na+ [M+Na]+ 445.2825, found 445.2823.
IR (ATR-IR, neat) 3347, 3004, 2922, 2851, 1677, 1525, 1484, 1383, 1323, 1260, 1066, 984, 947, 828, 790, 753 cm-1.
（２）重水素化標識化合物（（Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）－１３－ヒドロキシ－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１１－ジエナミド－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（１）で得られた化合物（３８．８ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）の重水素化を例１（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った（第２工程は２１時間）。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、重水素化された表題の化合物を得た（収率６４％、２５．０ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９３％、β位が９４％と確認された。
無色油: Rf 0.32 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.43-7.53 (m, 3H), 6.49 (dd, J = 15.2, 11.2 Hz, 1H), 5.97 (dd, J = 11.2, 11.2 Hz, 1H), 5.66 (dd, J = 15.2, 6.8 Hz, 1H), 5.43 (dt, J = 11.2, 7.6 Hz, 1H), 4.16 (dt, J = 7.6, 6.4 Hz, 1H), 2.53 (br-s, 0.14H, 93%D), 2.18 (dt, J = 6.8, 6.8 Hz, 2H), 1.77-1.81 (m, 0.13H, 94%D), 1.23-1.61 (m, 16H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.0, 148.1, 138.3, 136.4, 136.0, 134.5, 132.8, 127.9, 127.8, 127.5, 125.7, 121.6, 121.4, 116.5, 72.8, 37.2-37.7 (m, α-CD2), 37.3, 31.8, 29.4, 29.1, 28.9, 27.6, 25.1, 24.5-25.2 (m, β-CD2), 22.6, 14.0
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C27H34D4N2O2Na+ [M+Na]+ 449.3077, found 449.3073.
IR (ATR-IR, neat) 3347, 3004, 2922, 2851, 1677, 1521, 1484, 1383, 1327, 1263, 1047, 984, 947, 828, 790 cm-1.
（３）重水素化エステル化合物（（Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）－１３－ヒドロキシオクタデカ－９，１１－ジエン酸メチル－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（２）で得られた重水素化標識化合物（２４．０ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）について、例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９５／５～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率６０％、１０．６ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９４％と確認されたが、β位は残Ｈ２Ｏピークとのオーバーラップにより確認できなかった。
無色油: Rf 0.39 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.48 (dd, J = 15.2, 11.2 Hz, 1H), 5.97 (dd, J = 11.2, 11.2 Hz, 1H), 5.66 (dd, J = 15.2, 6.8 Hz, 1H), 5.43 (dt, J = 11.2, 7.6 Hz, 1H), 4.16 (dt, J = 6.8, 6.4 Hz, 1H), 3.13 (s, 3H), 2.27 (br-s, 0.13H, 94%D), 2.18 (dt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 1.25-1.64 (m, 16H), 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 174.4, 136.0, 132.8, 127.8, 125.7, 72.9, 51.5, 37.3, 33.1-33.8 (m, α-CD2), 31.8, 29.5, 29.0, 29.0, 28.8, 27.7, 25.1, 23.7-24.6 (m, β-CD2), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C19H30D4O3Na+ [M+Na]+ 337.2651, found 337.2650.
IR (ATR-IR, neat) 3448 (br), 3008, 2926, 2855, 1737, 1461, 1435, 1267, 1193, 1126, 1081, 1048, 984, 951, 913, 854, 854, 731 cm-1.
（４）重水素化標識脂肪酸（１３－ＨＯＤＥ－２，２，３，３－ｄ４（（Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）－１３－ヒドロキシオクタデカ－９，１１－ジエン酸－２，２，３，３－ｄ４））
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（３）で得られた化合物（１７．５ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題の重水素１３－ＨＯＤＥ－ｄ４を得た（収率８４％、１４．１ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９４％と確認されたが、β位は残Ｈ２Ｏピークとのオーバーラップにより確認できなかった。
無色油: Rf 0.13 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ 6.49 (dd, J = 15.1, 11.2 Hz, 1H), 5.97 (dd, J = 11.2, 11.2 Hz, 1H), 5.66 (dd, J = 15.1, 6.8 Hz, 1H), 5.43 (dt, J = 11.2, 7.6 Hz, 1H), 4.17 (dt, J = 6.8, 6.4 Hz, 1H), 2.31 (br-s, 0.12H, 94%D), 2.17-2.18 (m, 2H), 1.26-1.63 (m, 16H), 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 179.3, 135.7, 132.8, 127.8, 125.8, 73.0, 37.3, 32.6-33.8 (m, α-CD2), 31.8, 29.3, 28.8, 28.8, 28.6, 27.6, 25.1, 23.4-24.4 (m, β-CD2), 22.6, 14.0
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C18H28D4O3Na+ [M+Na]+ 323.2495, found 323.2494.
IR (ATR-IR, neat) 3500-2300 (br), 3012, 2926, 2855, 1707, 1461, 1409, 1290, 1267, 1126, 1051, 1018, 984, 947, 910, 835, 731 cm-1.
例１１：重水素化標識脂肪酸（リノレン酸）の製造
（１）（９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１２，１５－トリエナミドの調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
　リノレン酸のカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例１（１）に記載した手順と同様の手順で行った。リノレン酸（９７０ｍｇ、３．４８ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～８２／１８）、表題化合物を得た（収率７６％、１．０７ｇ、２．６５ｍｍｏｌ）。
無色油: Rf 0.39 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.82 (m, 2H), 8.15 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.42-7.53 (m, 3H), 5.28-5.42 (m, 6H), 2.79-2.82 (m, 4H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.03-2.09 (m, 4H), 1.78-1.84 (m, 2H), 1.35-1.46 (m, 8H), 0.97 (t, J = 7.6 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.9, 148.1, 138.3, 136.3, 134.6, 131.9, 130.3, 128.3, 127.9, 127.7, 127.7, 127.4, 127.1, 121.5, 121.3, 116.4, 38.2, 29.6, 29.3, 29.3, 29.2, 27.2, 25.7, 25.6, 25.5, 20.6, 14.3
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C27H37N2O+ [M+H]+ 405.2900, found 405.2903.
IR (ATR-IR, neat) 3355, 3008, 2922, 2851, 1689, 1521, 1484, 1383, 1323, 1260, 828, 790, 682 cm-1.
（２）重水素化標識化合物（（９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１２，１５－トリエナミド－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（１）で得られた化合物（３３．３ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）の重水素化を例１（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～８２／１８）、重水素化された表題の化合物を得た（収率６８％、２２．７ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９５％と確認された。
無色油: Rf 0.39 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.82 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.56 (m, 3H), 5.30-5.42 (m, 6H), 2.79-2.82 (m, 4H), 2.53 (br-s, 0.07H, 97%D), 2.03-2.09 (m, 4H), 1.77-1.81 (m, 0.10H, 95%D), 1.35-1.44 (m, 8H), 0.89 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.9, 148.1, 138.3, 136.3, 134.6, 131.9, 130.3, 128.3 (overlapped), 127.9, 127.7, 127.4, 127.1, 121.5, 121.3, 116.4, 37.1-37.9 (m, α-CD2), 29.6, 29.3, 29.2, 29.0, 27.2, 25.6, 25.5, 24.4-25.2 (m, β-CD2), 20.5, 14.3
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C27H32D4N2ONa+ [M+Na]+ 431.2971, found 431.2961.
IR (ATR-IR, neat) 3354, 3008, 2960, 2922, 2851, 1684, 1521, 1383, 1327, 1264, 913, 828, 790 cm-1.
（３）重水素化エステル化合物（リノレン酸メチル－２，２，３，３－ｄ４（（９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）－オクタデカ－９，１２，１５－トリエネートメチル－２，２，３，３－ｄ４））の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（２）で得られた重水素化標識化合物（３２．１ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）について、ニッケルビス（２，２，６，６－テトラメチル－３，５－ヘプタンジオネート）を５０ｍｏｌ％とし、反応後にピロリジンジチオカルバミン酸アンモニウム（３３．６ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を加えて後処理をしたこと以外は例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率７２％、１６．８ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％と確認されたが、β位は残Ｈ２Ｏピークとのオーバーラップにより確認できなかった。
無色油: Rf 0.77 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.28-5.43 (m, 6H), 3.67 (s, 3H), 2.79-2.82 (m, 4H), 2.27 (br-s, 0.08H, 96%D), 2.03-2.12 (m, 4H), 1.58 (overlapped with H2O), 1.25-1.35 (m, 8H), 0.98 (t, J = 7.6 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 174.4, 132.0, 130.3, 128.3, 128.3, 127.7, 127.1, 51.4, 33.0-33.8 (m, α-CD2), 29.6, 29.1, 28.9, 28.9, 27.2, 25.6, 25.5, 23.7-24.5 (m, β-CD2), 20.6, 14.3
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C19H28D4NaO2 + [M+Na]+ 319.2546, found 319.2539.
IR (ATR-IR, neat) 3012, 2960, 2926, 2855, 1741, 1461, 1435, 1260, 1193, 1085, 1021, 984, 798, 705 cm-1.
（４）重水素化標識脂肪酸（リノレン酸－２，２，３，３－ｄ４（（９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）－オクタデカ－９，１２，１５－トリエン酸－２，２，３，３－ｄ４））
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（３）で得られた化合物（１６．３ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題の重水素化リノレン酸－ｄ４を得た（収率８９％、１３．９ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９５％と確認された。
無色油: Rf 0.17 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.28-5.43 (m, 6H), 2.79-2.82 (m, 4H), 2.31 (br-s, 0.08H, 96%D), 2.03-2.12 (m, 4H), 1.60 (br-s, 0.10H, 95%D), 1.32-1.35 (m, 8H), 0.98 (m, J = 7.6 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 179.9, 132.0, 130.3, 128.3, 128.3, 127.8, 127.1, 32.9-33.6 (m, α-CD2), 29.6, 29.1, 28.8, 28.2, 27.2, 25.6, 25.5, 23.4-24.4 (m, β-CD2), 20.6, 14.3
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C18H25D4O2 - [M-H]- 281.2424, found 281.2416.
IR (ATR-IR, neat) 3500-2500 (br), 3012, 2926, 2855, 1707, 1461, 1405, 1260, 1174, 1074, 973, 723 cm-1.
例１２：重水素化標識脂肪酸（アラキドン酸）の製造
（１）（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）イコサ－５，８，１１，１４－テトラエナミドの調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
　アラキドン酸のカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例８（１）に記載した手順と同様の手順で行った。アラキドン酸（５００ｍｇ、１．６４ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６５／３５）、表題化合物を得た（収率９２％、６４９ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ）。
無色油: Rf 0.44 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.80 (m, 2H), 8.15 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.45-7.53 (m, 3H), 5.31-5.46 (m, 8H), 2.78-2.83 (m, 6H), 2.58 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.23 (dt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 2.04 (dt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 1.82 (tt, J = 7.6, 7.2 Hz, 2H), 1.26-1.36 (m, 6H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.5, 148.1, 138.3, 136.4, 134.5, 130.5, 129.1, 128.9, 128.5, 128.2, 128.2, 127.9, 127.9, 127.6, 127.4, 121.6, 121.3, 116.4, 37.5, 31.5, 29.3, 27.2, 26.7, 25.7, 25.6, 25.6, 25.4, 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C29H39N2O+ [M+H]+ 431.3057, found 431.3057.IR (ATR-IR, neat) 3355, 3008, 2952, 2922, 2855, 1689, 1521, 1484, 1481, 1383, 1323, 1148, 828, 790, 686 cm-1.
（２）重水素化標識化合物（（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）イコサ－５，８，１１，１４－テトラエナミド－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（１）で得られた化合物に対してまずβ位の重水素化を行い、次いでα位の重水素化を行って表題の化合物を得た。具体的には下記アおよびイの手順に従って行った。
ア　β位の重水素化
　まず、β位の重水素化を行った。上記（１）で得た化合物（３３．９ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（１７．７ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ、１ｅｑ）およびピバル酸セシウム（３６．８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ、２ｅｑ）を空気下で１０ｍＬのスクリューキャップチューブに入れた。トルエン（０．８ｍＬ、０．１Ｍ）を加えてアミドを溶解し、Ｄ２Ｏ（０．０８ｍＬ）を混合物に加えた。反応は８０℃で１時間撹拌して行い、進行をＥＳＩ－ＭＳでモニターした。反応混合物を室温に冷却し、ピロリジンジチオカルバミン酸アンモニウム（３３．７ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、２．６ｅｑ）およびＤ２Ｏ（０．８ｍＬ）を反応に加えた。３０分間撹拌した後、混合物を分液漏斗に移し、酢酸エチルで希釈し、塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。粗β位－重水素化標識化合物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより粗精製した。
イ　α位の重水素化
　続いて、上記アで得られたβ位－重水素化標識化合物（２９．５ｍｇ、約０．０６８ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（９．４ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、およびメタノールｄ１（ＣＨ３ＯＤ、０．３４ｍＬ、０．２Ｍ）を空気下で１０ｍＬスクリューキャップチューブに入れた。反応は８０℃で１８時間攪拌して行い、進行をＥＳＩ－ＭＳでモニターした。反応混合物を室温に冷却し、分離漏斗に移し、酢酸エチルで希釈し、塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。得られた化合物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６５／３５）、重水素化された生成物を得た（収率６７％、２２．６ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９５％、β位が８８％と確認された。
無色油: Rf 0.44 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.79-8.81 (m, 2H), 8.15 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.43-7.53 (m, 3H), 5.34-5.45 (m, 8H), 2.79-2.83 (m, 6H), 2.55 (br-s, 0.10H, 95%D), 2.22 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 2.04 (dt, J = 6.8, 6.8 Hz, 2H), 1.86-1.92 (m, 0.24H, 88%D), 1.26-1.38 (m, 6H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.6, 148.1, 138.3, 136.4, 134.5, 130.5, 129.1, 128.9, 128.5, 128.2, 128.2, 127.9, 127.9, 127.6, 127.4, 121.6, 121.3, 116.4, 36.3-37.2 (m, α-CD2), 31.5, 29.3, 27.2, 26.5, 25.7, 25.6, 25.6, 24.4-25.3 (m, β-CD2), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C29H35D4N2O+ [M+H]+ 435.3308, found 435.3303.
IR (ATR-IR, neat) 3355, 3008, 2952, 2922, 2851, 1684, 1521, 1383, 1327, 1264, 917, 824, 790 cm-1.
（３）重水素化エステル化合物（アラキドン酸メチル－２，２，３，３－ｄ４（（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－５，８，１１，１４－テトラエン酸メチル－２，２，３，３－ｄ４））の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（２）で得られた重水素化標識化合物（５２．４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）について、ニッケルビス（２，２，６，６－テトラメチル－３，５－ヘプタンジオネート）を５０ｍｏｌ％とし、反応後にピロリジンジチオカルバミン酸アンモニウム（５１．３ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を加えて後処理をしたこと以外は例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率７５％、２８．９ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が残Ｈ２Ｏピークとの部分的なオーバーラップがあり約９１％と確認された。
無色油: Rf 0.76 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.31-5.43 (m, 8H), 3.67 (s, 3H), 2.80-2.84 (m, 6H), 2.29 (br-s, 0.09H, 96%D), 2.09 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 2.04 (dt, J = 6.8, 6.8 Hz, 2H), 1.66-1.71 (m, ca. 0.17H, 91%D), 1.24-1.40 (m, 6H), 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 174.1, 130.5, 128.9, 128.9, 128.6, 128.2, 128.2, 127.9, 127.5, 51.5, 32.3-33.2 (m, α-CD2), 31.5, 29.3, 27.2, 26.3, 25.6, 25.6, 25.6, 23.6-24.7 (m, β-CD2), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C21H30D4NaO2 + [M+Na]+ 345.2702, found 345.2705.
IR (ATR-IR, neat) 3012, 2960, 2926, 2855, 1737, 1655, 1435, 1394, 1260, 1193, 1167, 1111, 1077, 1044, 1006, 969, 917, 846, 816, 708 cm-1.
（４）重水素化標識脂肪酸（アラキドン酸－２，２，３，３－ｄ４（（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－５，８，１１，１４－テトラエン酸－２，２，３，３－ｄ４））
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（３）で得られた化合物（２３．８ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～８０／２０）、表題の重水素化アラキドン酸－ｄ４を得た（収率９３％、２１．２ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９５％、β位が９０％と確認された。
無色油: Rf 0.18 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.31-5.44 (m, 8H), 2.80-2.87 (m, 6H), 2.34 (br-s, 0.11H, 95%D), 2.12 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 2.05 (dt, J = 6.8, 6.8 Hz, 2H), 1.66-1.71 (m, ca. 0.20H, 90%D), 1.26-1.39 (m, 6H), 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.0, 130.5, 129.1, 128.7, 128.6, 128.3, 128.1, 127.9, 127.6, 32.4-33.1 (m, α-CD2), 31.5, 29.3, 27.2, 26.2, 25.6, 25.6, 23.3-24.2 (m, β-CD2), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C20H27D4O2 - [M-H]- 307.2581, found 307.2582.
IR (ATR-IR, neat) 3300-2500 (br), 3012, 2960, 2926, 2855, 1707, 1461, 1409, 1297, 1178, 1107, 1047, 928, 839, 705 cm-1.
例１３：重水素化標識脂肪酸（エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ））の製造
（１）（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）イコサ－５，８，１１，１４，１７－ペンタミドの調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
　ＥＰＡのカルボキシ基の８－キノリンアミド化を反応時間を２時間としたこと以外は例１（１）に記載した手順と同様の手順で行った。ＥＰＡ（１．１６ｇ、３．８２ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６５／３５）、表題化合物を得た（収率７２％、１．１８ｇ、２．７６ｍｍｏｌ）。
淡黄色油: Rf 0.61 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.80-8.81 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 2H), 7.45-7.54 (m, 3H), 5.27-5.49 (m, 10H), 2.79-2.84 (m, 8H), 2.58 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.22 (td, J = 7.6, 6.4 Hz, 2H), 2.07 (dq, J = 7.6, 7.6 Hz, 2H), 1.91 (tt, J = 7.6, 7.2 Hz, 2H), 0.96 (t, J = 7.6 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.5, 148.0, 138.3, 136.3, 134.5, 132.0, 129.1, 128.9, 128.5, 128.2, 128.2, 128.1, 128.1, 127.9, 127.9, 127.4, 127.0, 121.5, 121.3, 116.4, 37.5, 26.7, 25.7, 25.6, 25.5, 25.5, 25.4, 20.5, 14.3
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C29H37N2O+ [M+H]+ 429.2900, found 429.2898.
IR (ATR-IR, neat) 3355, 3008, 2960, 2922, 1689, 1521, 1484, 1461, 1387, 1323, 1260, 1148, 828, 790, 686 cm-1.
（２）重水素化標識化合物（（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）イコサ－５，８，１１，１４，１７－ペンタミド－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（１）で得られた化合物（１７．５ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）の重水素化を例１２（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６５／３５）、重水素化された表題の化合物を得た（収率９１％、１６．１ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９２％、β位が８５％と確認された。
淡黄色油: Rf 0.61 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.15 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.43-7.54 (m, 3H), 5.27-5.49 (m, 10H), 2.79-2.84 (m, 8H), 2.55 (br-s, 0.16H, 92%D), 2.22 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 2.07 (dq, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 1.86-1.92 (m, 0.31H, 88%D), 0.96 (t, J = 8.0 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.6, 148.1, 138.3, 136.4, 134.5, 132.0, 129.1, 128.9, 128.5, 128.3, 128.2, 128.1, 128.1, 127.9, 127.9, 127.5, 127.0, 121.6, 121.4, 116.4, 36.5-37.2 (m, α-CD2), 26.6, 26.5, 25.7, 25.6, 25.5, 24.4-25.3 (m, β-CD2), 20.6, 14.3
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C29H32D4N2NaO+ [M+Na]+ 455.2971, found 455.2963.
IR (ATR-IR, neat) 3355, 3008, 2960, 2922, 1685, 1521, 1383, 1327, 1263, 917, 824, 790, 753, 686 cm-1.
（３）重水素化エステル化合物（エイコサペンタエン酸メチル－２，２，３，３－ｄ４（（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ）－イコサ－５，８，１１，１４，１７－ペンタエン酸メチル－２，２，３，３－ｄ４））の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（２）で得られた重水素化標識化合物（４６．８ｍｇ、０．１０８ｍｍｏｌ）について、ニッケルビス（２，２，６，６－テトラメチル－３，５－ヘプタンジオネート）を５０ｍｏｌ％とし、反応後にピロリジンジチオカルバミン酸アンモニウム（４６．２ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を加えて後処理をしたこと以外は例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率４７％、１６．４ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９１％と確認された。
無色油: Rf 0.67 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.28-5.43 (m, 10H), 3.67 (s, 3H), 2.79-2.86 (m, 8H), 2.29 (br-s, 0.09H, 96%D), 2.04-2.10 (m, 4H), 1.66-1.72 (m, 0.19H, 91%D), 0.98 (t, J = 8.0 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 174.1, 132.0, 128.9, 128.8, 128.6, 128.3, 128.2, 128.1, 128.1, 127.9, 127.0, 51.4, 32.3-33.2 (m, α-CD2), 26.3, 25.6 (overlap), 25.6, 25.5, 23.6-24.5 (m, β-CD2), 20.6, 14.3
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C21H28D4NaO2 + [M+Na]+ 343.2546, found 343.2544.
IR (ATR-IR, neat) 3015, 2963, 2933, 2874, 1741, 1454, 1435, 1390, 1267, 1193, 1167, 1111, 1077, 921, 805, 708 cm-1.
（４）重水素化標識脂肪酸（エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）－２，２，３，３－ｄ４（（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ）－イコサ－５，８，１１，１４，１７－ペンタエン酸－２，２，３，３－ｄ４））
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（３）で得られた化合物（１５．３ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～８０／２０）、表題の重水素化エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）－ｄ４を得た（収率９６％、１４．１ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９４％、β位が９１％と確認された。
無色油: Rf 0.16 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.28-5.44 (m, 10H), 2.80-2.88 (m, 8H), 2.33-2.34 (m, 0.13H, 94%D), 2.04-2.13 (m, 4H), 1.67-1.70 (m, 0.18H, 91%D), 0.97 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 179.6, 132.1, 129.0, 128.8, 128.6, 128.3, 128.2, 128.2, 128.1, 127.9, 127.0, 32.2-33.2 (m, α-CD2), 26.2, 25.6 (overlap), 25.5, 25.5, 23.3-24.1 (m, β-CD2), 20.6, 14.3
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C20H25D4O2 - [M-H]- 305.2424, found 305.2424.
IR (ATR-IR, neat) 3400-2500 (br), 3012, 2967, 2926, 2870, 1707, 1409, 1297, 1174, 1110, 1070, 928, 835, 794, 701 cm-1.
例１４：重水素化標識脂肪酸（ペンタコサ－１０，１２－ジイン酸）の製造
（１）Ｎ－（キノリン－８－イル）ペンタコサ－１０，１２－ジイナミドの調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
　ペンタコサ－１０，１２－ジイン酸のカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例８（１）に記載した手順と同様の手順で行った。ペンタコサ－１０，１２－ジイン酸（７４９ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥ
ｔ＝１００／０～７０／３０）、表題化合物を得た（収率８９％、８９０ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ）。
薄桃色固体: Rf 0.50 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.79 (br-s, 1H), 8.77-8.79 (m, 2H), 8.14 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.42-7.54 (m, 3H), 2.54 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.21 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 1.80 (tt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 1.24-1.53 (m, 30H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.9, 148.1, 138.4, 136.4, 134.6, 127.9, 127.5, 121.6, 121.3, 116.4, 77.6, 77.5, 65.3, 65.3, 38.2, 31.9, 29.7, 29.6, 29.6, 29.6, 29.5, 29.4, 29.2, 29.1, 29.0, 28.9, 28.8, 28.4, 28.3, 25.6, 22.7, 19.2, 19.2, 14.1.
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C34H49N2O+ [M+H]+ 501.3839, found 501.3839.
IR (ATR-IR, neat) 3347, 3042, 2915, 2851, 1681, 1528, 1484, 1424, 1387, 1331, 1260, 1100, 824, 790, 749, 682 cm-1.
mp 46-47 ℃.
（２）重水素化標識化合物（Ｎ－（キノリン－８－イル）ペンタコサ－１０，１２－ジイナミド－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（１）で得られた化合物（１８３．８ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）のβ位の重水素化は例１（２）アに記載した手順と同様の手順で行い、α位の重水素化は高い重水素化含有量を得るために例１（２）イに記載した手順と同様の手順を２回繰り返して行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、重水素化された表題の化合物を得た（収率６０％、１１１．０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９６％と確認された。
白色固体: Rf 0.50 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.80 (m, 2H), 8.15 (dd, J = 8.4, 1.2 Hz, 2H), 7.43-7.55 (m, 3H), 2.53 (br-s, 0.06H, 97%D), 2.23 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 1.76-1.80 (m, 0.09H, 96%D), 1.25-1.54 (m, 26H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.9, 148.1, 138.3, 136.4, 134.6, 127.9, 127.5, 121.6, 121.3, 116.4, 77.6, 77.5, 65.3, 65.3, 37.0-37.8 (m, α-CD2), 31.9, 29.6, 29.6, 29.6, 29.5, 29.4, 29.2, 29.1, 29.0, 28.9, 28.9, 28.8, 28.4, 28.3, 24.4-25.3 (m, β-CD2), 22.7, 19.2, 19.2, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C34H45D4N2O+ [M+H]+ 505.4090, found 505.4091.
IR (ATR-IR, neat) 3347, 3045, 2919, 2851, 1677, 1528, 1484, 1424, 1387, 1327, 1264, 824, 749, 719, 678 cm-1.
mp 46-47 ℃.
（３）重水素化エステル化合物（ペンタコサ－１０，１２－ジイン酸メチル－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（２）で得られた重水素化標識化合物（７６．３ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）について、例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率８０％、４７．７ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９５％と確認された。
白色固体: Rf 0.80 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.67 (s, 3H), 2.24 (t, J = 7.0 Hz, 4.09H, overlapped with a-CD2), 1.58 (br-s, 0.08H, 96%D), 1.51 (tt, J = 7.2, 7.0 Hz, 4H),1.26-1.41 (m, 26H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 174.3, 77.6, 77.4, 65.3, 65.2, 51.4, 32.9-33.7 (m, α-CD2), 31.9, 29.7, 29.6, 29.6, 29.5, 29.4, 29.1, 29.0, 28.9, 28.9, 28.8, 28.8, 28.4, 28.3, 23.7-24.6 (m, β-CD2), 22.7, 19.2, 19.2, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C26H40D4NaO2 + [M+H]+ 415.3485, found 415.3486.
IR (ATR-IR, neat) 2922, 2855, 1741, 1461, 1435, 1260, 1193, 1088, 1051, 1006, 850, 813, 723 cm-1.
mp 28-29 ℃.
（４）重水素化標識脂肪酸（ペンタコサ－１０，１２－ジイン酸－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（３）で得られた化合物（４７．７ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題の重水素化ペンタコサ－１０，１２－ジイン酸－ｄ４を得た（収率＞９９％、４６．０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９６％と確認された。
白色固体: Rf 0.18 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 2.31 (br-s, 0.06H, 97%D), 2.24 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 1.58 (br-s, 0.09H, 96%D), 1.51 (tt, J = 7.2, 7.0 Hz, 4H), 1.26-1.41 (m, 26H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.2, 77.6, 77.4, 65.3, 65.2, 32.9-33.7 (m, α-CD2), 31.9, 29.7, 29.6, 29.6, 29.5, 29.4, 29.1, 29.0, 28.9, 28.9, 28.7, 28.8, 28.4, 28.3, 23.4-24.3 (m, β-CD2), 22.7, 19.2, 19.2, 14.1
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C25H37D4O2 - [M-H]- 377.3363, found 377.3352.
IR (ATR-IR, neat) 3200-2500 (br), 3022 (br), 2919, 2848, 2684, 1689, 1461, 1420, 1331, 1189, 1115, 1051, 999, 932, 895, 842, 723, 678 cm-1.
mp 28-29 ℃.
例１５：重水素化標識脂肪酸（９－ヒドロキシオクタデカン酸）の製造
（１）９－ヒドロキシ－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカンアミドの調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
 　９－ヒドロキシオクタデカン酸のカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例８（１）に記載した手順と同様の手順で行った。９－ヒドロキシオクタデカン酸（１８０．３ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９５／５～５０／５０）、表題化合物を得た（収率６５％、１６６．８ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）。
白色固体: Rf 0.16 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.81 (br-s, 1H), 8.78-8.82 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.56 (m, 3H), 3.54-3.60 (m, 1H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.82 (tt, J = 7.6, 7.6 Hz, 2H), 1.26-1.47 (m, 26H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.9, 148.1, 138.4, 136.4, 134.6, 127.9, 127.4, 121.5, 121.3, 116.4, 71.9, 38.2, 37.5, 37.5, 31.9, 29.7, 29.6, 29.6, 29.5, 29.3, 29.3, 29.2, 25.7, 25.6, 25.6, 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C27H42N2O2Na+ [M+Na]+ 449.3138, found 449.3135.
IR (ATR-IR, neat) 3289 (br), 2922, 2851, 1666, 1521, 1487, 1465, 1424, 1379, 1320, 1260, 1193, 1107, 1074, 824, 790, 753, 723 cm-1.
mp 73 ℃.
（２）重水素化標識化合物（９－ヒドロキシ－（Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカンアミド－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（１）で得られた化合物（８５．３ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）の重水素化を例１（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９５／５～５０／５０）、重水素化された表題の化合物を得た（収率７１％、６０．７ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９８％、β位が９６％と確認された。
無色油: Rf 0.14 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.82 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.56 (m, 3H), 3.55-3.60 (m, 1H), 2.53 (br-s, 0.04H, 98%D), 1.77-1.81 (m, 0.08H, 96%D), 1.26-1.47 (m, 26H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.0, 148.1, 138.4, 136.4, 134.6, 128.0, 127.5, 121.5, 121.3, 116.5, 71.9, 37.0-38.0 (m, α-CD2), 37.5, 37.5, 31.9, 29.7, 29.6, 29.6, 29.5, 29.3, 29.3, 29.0, 25.7, 25.6, 24.4-25.3 (m, β-CD2), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C27H39D4N2O2 + [M+H]+ 431.3570, found 431.3570.
IR (ATR-IR, neat) 3289 (br), 2915, 2851, 1662, 1521, 1485, 1461, 1428, 1379, 1323, 1271, 1163, 1133, 1096, 1025, 980, 913, 869, 824, 790, 749, 708 cm-1.
mp 73-74 ℃.
（３）重水素化エステル化合物（９－ヒドロキシオクタデカン酸メチル－２，２，３，３－ｄ４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（２）で得られた重水素化標識化合物（４１．６ｍｇ、０．０９７ｍｍｏｌ）について、例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９５／５～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率５８％、１７．７ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％と確認され、β位は残Ｈ２Ｏピークとの部分的なオーバーラップにより＞９３％と確認された。
白色固体: Rf 0.45 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.66 (s, 3H), 3.55-3.60 (m, 1H), 2.27 (br-s, 0.05H, 97%D), 1.57-1.60 (m, <0.14H (overlapped), >93%D), 1.26-1.46 (m, 26H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 174.4, 72.0, 51.4, 37.5, 37.5, 32.9-33.8 (m, α-CD2), 31.9, 29.7, 29.7, 29.6, 29.5, 29.3, 29.2, 28.8, 25.7, 25.6, 23.9-24.6 (m, β-CD2), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C19H34D4NaO3 + [M+Na]+ 341.2964, found 341.2964.
IR (ATR-IR, neat) 3370 (br), 2922, 2855, 1741, 1461, 1430, 1338, 1290, 1174, 1133, 1074, 1040, 947, 906, 876, 850, 723, 671 cm-1.
mp 48-49 ℃.
（４）重水素化標識脂肪酸（９－ヒドロキシオクタデカン酸－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（３）で得られた化合物（１７．１ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９０／１０～６０／４０）、表題の重水素化９－ヒドロキシオクタデカン酸－ｄ４を得た（収率９５％、１４．５ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９３％と確認された。
白色固体: Rf 0.08 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.56-3.62 (m, 1H), 2.31 (br-s, 0.06H, 97%D), 1.57-1.62 (m, 0.14H, 93%D), 1.26-1.30 (m, 26H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 179.3, 72.1, 37.5, 37.4, 32.9-33.6 (m, α-CD2), 31.9, 29.7, 29.6, 29.6, 29.4, 29.3, 29.1, 28.7, 25.6, 25.5, 23.5-24.5 (m, β-CD2), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C18H31D4O3 - [M-H]- 303.2843, found 303.2843.
IR (ATR-IR, neat) 3500-2500 (br), 3042, 2915, 2848, 2583, 1692, 1465, 1409, 1320, 1193, 1133, 1103, 1025, 951, 906, 842, 723, 664 cm-1.
mp 73-74 ℃.
例１６：重水素化標識脂肪酸（（９Ｚ，１１Ｅ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１１－ジエン酸）の製造
（１）（９Ｚ，１１Ｅ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１１－ジエナミドの調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
 　（９Ｚ，１１Ｅ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１１－ジエン酸のカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例８（１）に記載した手順と同様の手順で行った。（９Ｚ，１１Ｅ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１１－ジエン酸（９７．６ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６５／３５）、表題化合物を得た（収率８４％、１１８．２ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）。
無色油: Rf 0.60 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.56 (m, 3H), 6.29 (ddd, J = 15.2, 10.8, 1.0 Hz, 1H), 5.94 (dd, J = 10.8, 10.8 Hz, 1H), 5.65 (dt, J = 15.2, 7.2 Hz, 1H), 5.29 (dt, J = 10.8, 7.2 Hz, 1H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.15 (dt, J = 7.2, 6.8 Hz, 2H), 2.09 (dt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 1.82 (dt, J = 7.6, 7.2 Hz, 2H), 1.24-1.48 (m, 16H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.9, 148.1, 138.3, 136.3, 134.7, 134.6, 129.9, 128.7, 127.9, 127.4, 125.6, 121.5, 121.3, 116.4, 38.2, 32.9, 31.7, 29.7, 29.4, 29.3, 29.3, 29.1, 28.9, 27.7, 25.7, 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C27H39N2O+ [M+H]+ 407.3057, found 407.3057.
IR (ATR-IR, neat) 3358, 3019, 2922, 2855, 1689, 1521, 1484, 1457, 1428, 1383, 1327, 1260, 1163, 984, 947, 828, 790, 757, 723, 675 cm-1.
（２）重水素化標識化合物（（９Ｚ，１１Ｅ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１１－ジエナミド－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（１）で得られた化合物（６３．８ｍｇ、０．１５７ｍｍｏｌ）の重水素化を例１（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、重水素化された表題の化合物を得た（収率７１％、４６．０ｍｇ、０．１１２ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９８％と確認された。
無色油: Rf 0.48 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.0, 1.2 Hz, 2H), 7.44-7.56 (m, 3H), 6.29 (dd, J = 15.0, 10.8, 1.0 Hz, 1H), 5.94 (dd, J = 10.8, 10.8 Hz, 1H), 5.65 (dt, J = 15.0, 7.2 Hz, 1H), 5.29 (dt, J = 10.8, 7.2 Hz, 1H), 2.53 (br-s, 0.08H, 96%D), 2.15 (dt, J = 7.2, 6.8 Hz, 2H), 2.09 (dt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 1.77-1.80 (m, 0.05H, 98%D), 1.24-1.48 (m, 16H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.0, 148.1, 138.3, 136.4, 134.7, 134.6, 129.9, 128.7, 127.9, 127.4, 125.6, 121.5, 121.3, 116.4, 37.1-37.7 (m, α-CD2), 32.9, 31.7, 29.7, 29.4, 29.2, 29.1, 29.0, 28.9, 27.7, 24.4-25.2 (m, β-CD2), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C27H35D4N2O+ [M+H]+ 411.3308, found 411.3311.
IR (ATR-IR, neat) 3355, 3015, 2922, 2855, 1689, 1521, 1484, 1461, 1428, 1383, 1327, 1264, 1163, 984, 947, 828, 790, 753, 723, 678 cm-1.
（３）重水素化エステル化合物（（９Ｚ，１１Ｅ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１１－ジエン酸メチル－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（２）で得られた重水素化標識化合物（３２．３ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）について、例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率７０％、１６．４ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％と確認されたが、β位は残Ｈ２Ｏピークとのオーバーラップにより確認できなかった。
無色油: Rf 0.72 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.29 (ddd, J = 15.2, 10.8, 1.2 Hz, 1H), 5.94 (dd, J = 10.8, 10.8 Hz, 1H), 5.65 (dt, J = 15.2, 7.2 Hz, 1H), 5.29 (dt, J = 10.8, 7.2 Hz, 1H), 3.66 (s, 3H), 2.26 (br-s, 0.09H, 96%D), 2.15 (dt, J = 7.2, 6.8 Hz, 2H), 2.09 (dt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 1.60 (overlapped with H2O), 1.24-1.48 (m, 16H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 174.4, 134.8, 129.9, 128.7, 125.6, 51.4, 32.8-33.8 (m, α-CD2), 32.9, 31.7, 29.7, 29.4, 29.1, 29.1, 28.9, 28.9, 27.6, 23.7-24.5 (m, β-CD2), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C19H30D4NaO2 + [M+Na]+ 321.2702, found 321.2702.
IR (ATR-IR, neat) 3019, 2952, 2922, 2855, 1741, 1461, 1435, 1260, 1193, 1174, 1081, 984, 947, 805, 727 cm-1.
（４）重水素化標識脂肪酸（（９Ｚ，１１Ｅ）－オクタデカ－９，１１－ジエン酸－２，２，３，３－ｄ４）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
 （上記式中、Ｄは重水素である。）
　上記（３）で得られた化合物（１４．１ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～８０／２０）、表題の（９Ｚ，１１Ｅ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１１－ジエン酸－ｄ４を得た（収率９７％、１３．０ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）。１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９８％と確認された。
無色油: Rf 0.36 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.29 (ddd, J = 15.2, 10.8, 1.2 Hz, 1H), 5.94 (dd, J = 10.8, 10.8 Hz, 1H), 5.66 (dt, J = 15.2, 7.2 Hz, 1H), 5.29 (dt, J = 10.8, 7.2 Hz, 1H), 2.31 (br-s, 0.08H, 96%D), 2.15 (dt, J = 7.2, 6.8 Hz, 2H), 2.09 (dt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 1.58-1.65 (m, 0.04H, 98%D), 1.25-1.42 (m, 16H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 179.7, 134.8, 129.9, 128.7, 125.6, 32.8-33.5 (m, α-CD2), 32.9, 31.8, 29.7, 29.4, 29.1, 29.0, 28.9, 28.8, 27.6, 23.5-24.2 (m, β-CD2), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C18H27D4O2 - [M-H]- 283.2581, found 283.2579.
IR (ATR-IR, neat) 3300-2500 (br), 3019, 2922, 2855, 1701, 1461, 1409, 1297, 1088, 11025, 984, 947, 835, 805, 727 cm-1.
例１７：重水素化標識脂質（（Ｒ）－２－（（（Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）－１３－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）オクタデカ－９，１１－ジエノイル－２，２，３，３－ｄ ４ ）オキシ）－３－（パルミトイルオキシ）プロピル（２－（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート）の合成
　例１７では、下記スキームに示すように重水素化標識脂肪酸を使用して表題の化合物を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
　１－ヘキサデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホリルコリン（東京化成工業、１１．４ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）およびＴＢＳ－１３－ＨＯＤＥ－２，２，３，３－ｄ４（１９．１ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）を１０ｍＬシュレンクチューブに入れて、トルエン共沸により乾燥させた。室温でアルゴン雰囲気下、２、４、６－トリクロロベンゾイルクロリド（２１．６μＬ、０．１３８ｍｍｏｌ）、１－メチルイミダゾール（１１μＬ、０．１３８ｍｍｏｌ）、およびＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）を加え、３６時間撹拌した。進行はＴＬＣによりモニターした。反応後、揮発成分を全て減圧留去した。得られた化合物をシリカゲフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２／メタノール＝１００／０～７０／３０）、（Ｒ）－２－（（（Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）－１３－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）オクタデカ－９，１１－ジエノイル－２，２，３，３－ｄ４）オキシ）－３－（パルミトイルオキシ）プロピル（２－（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェートを得た（収率５５％、１１．３ｍｇ、０．０１２７ｍｍｏｌ）。
白色ろう様固体: Rf 0.17 (CH2Cl2/methanol = 1/1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.41 (dd, J = 15.2, 11.2 Hz, 1H), 5.96 (dd, J = 11.2, 10.8 Hz, 1H), 5.61 (dd, J = 15.2, 6.0 Hz, 1H), 5.38 (dt, J = 10.8, 7.6 Hz, 1H), 5.21 (br-s, 1H), 4.37-4.40 (m, 3H), 4.10-4.16 (m, 2H), 3.93-4.03 (m, 4H), 3.41 (s, 9H), 2.28 (t, J = 7.6 Hz, 2H, α-CH2 of palmitate moiety and α-CD2 of TBS-13-HODE moiety), 2.15 (dt, J = 7.6, 6.8 Hz, 2H), 1.56-1.59 (m, 2H, β-CH2 of palmitate moiety and β-CD2 of TBS-13-HODE moiety), 1.44-1.50 (m,2H), 1.25-1.36 (m, 38H), 0.86-0.90 (m, 15H), 0.05 (s, 3H), 0.03 (s, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 173.6, 173.2, 136.9, 131.5, 128.2, 124.3, 73.2, 70.1 (d, J = 6.4 Hz), 66.2 (br-s), 63.9 (br-s), 62.7, 59.7 (br-s), 54.5, 38.4, 34.1, 33.5-34.0 (m, α-CD2), 31.9, 31.8, 29.7, 29.7, 29.7, 29.7, 29.6, 29.4, 29.4, 29.2, 29.2, 28.9, 27.7, 27.7 , 25.9, 25.0, 25.0, 24.9, 23.6-24.5 (m, β-CD2), 22.7, 22.6, 18.3, 14.1, 14.1, -4.3, -4.7
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C48H90D4NO9PSiNa+ [M+Na]+ 914.6579, found 914.6593.
IR (ATR-IR, neat) 2952, 2922, 2855, 1737, 1651, 1461, 1364, 1252, 1170, 1059, 969, 872, 835, 775, 671 cm-1.
例１８：重水素化標識脂肪酸を使用した脂質代謝解析（１）
　例１８では、下記スキームに示すように重水素化標識脂肪酸を使用してホスファチジルコリン（（Ｒ）－２－（（（９Ｅ，１２Ｅ）－オクタデカ－９，１２－ジエノイル－２，２，３，３－ｄ４）オキシ）－３－（パルミトイルオキシ）プロピル（２－（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート）（構成脂肪酸：パルミチン酸／リノエライジン酸－Ｄ４）を合成し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析により生体内由来の脂肪酸（脂質）との区別が可能か検討した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
　リゾホスファチジルコリン（Ｌｙｓｏ－ＰＣ）（１－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）（東京化成工業、１１．４ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）、リノエライジン酸－２，２，３，３－ｄ４（１２．７ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰＯ（１８．７ｍｇ、０．１３５ｍｍｏｌ）を１０ｍＬシュレンクチューブに入れて、トルエン共沸により乾燥させた。アルゴン雰囲気下、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）を加え溶解させた後、ＭＮＢＡ（４６.５ｍｇ、０.１３５ｍｍｏｌ）を加えて室温で３時間撹拌した。進行はＴＬＣによりモニターした。反応後、揮発成分を全て減圧留去した。得られた化合物をシリカゲフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２／メタノール＝１００／０～８０／２０）、を得た（収率５０％、９．４ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）。
白色ろう状固体: Rf 0.11 (n-hexane/AcOEt = 2/3)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.35-5.46 (m, 4H), 5.17-5.22 (m, 1H), 4.40 (dd, J = 12.0, 2.4 Hz, 1H) 4.32 (br-s, 2H), 4.12 (dd, J = 12.0, 7.6 Hz, 1H), 3.89-3.99 (m, 2H), 3.81 (br-s, 2H), 3.37 (s, 9H), 2.65-2.68(m, 2H), 2.27 (t, J = 7.6 Hz, 2H, a-position (CH2) of palmitate moiety and a-position (CD2) of linoelaidate moiety), 1.95-2.00 (m, 4H), 1.53-1.60 (m, 2H, b-position (CH2) of palmitate moiety and b-position (CD2) of linoelaidate moiety), 1.25-1.44 (m, 38H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 173.6, 173.3, 131.1, 130.9, 128.7, 128.5, 70.5 (d, JP-C = 7.8 Hz), 66.5 (d, JP-C = 5.1 Hz), 63.4 (d, JP-C = 7.7 Hz), 63.0, 59.3 (d, JP-C = 4.6 Hz), 54.5, 35.7, 34.1, 33.0-33.9 (m, α-CD2 of linoelaidate moiety), 32.6, 32.6, 31.9, 31.4, 30.9, 29.7 (overlapped), 29.7 (overlapped), 29.6 (overlapped), 29.4, 29.4, 29.2, 29.2 (overlapped), 29.2, 29.1, 28.9, 24.9, 23.7-24.7 (m, β-CD2 of linoelaidate moiety), 22.7, 22.6, 14.1, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C42H76D4NNaO8P+ [M+Na]+ 784.5765, found 784.5765.
IR (ATR-IR, neat) 3377 (br), 3027, 2960, 2922, 2855, 1733, 1495, 1469, 1349, 1252, 1174, 1092, 1059, 965, 924, 876, 816, 734 cm-1.
　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析は、高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ）に質量分析装置（ＭＳ）をつなげたＬＣ－ＭＳ装置を用いて行った。ＬＣとして、Ultimate 3000 ultra high performance LC system（Thermo）を用い、ＭＳとして、Q-Exactive Orbitrap（Thermo）を用いた。InertSustain C18 Metal-free column（ジーエルサイエンス）をＨＰＬＣカラムとして用い、アセトニトリル、メタノール、水およびイソプロパノールから構成される移動相を用いてグラジエント溶出した。分析条件は表１に示す通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000071
　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析を行った結果は、図１に示す通りであった。主要ピークＡ（ｍ／ｚ　１８５）はホスホコリン（ｍ／ｚ　１８４）とは対応せず、一重水素化ホスホコリンが割り当てられることが確認された。ピークは、ホスファチジルコリン（（Ｒ）－２－（（（９Ｅ，１２Ｅ）－オクタデカ－９，１２－ジエノイル－２，２，３，３－ｄ４）オキシ）－３－（パルミトイルオキシ）プロピル（２－（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート）がマススペクトロメトリー中で断片化され、ケテン種を生じる際に形成される（Hsu FF and Turk J., J Am Soc Mass Spectrom, 2003）。重要なことに、一重水素化ホスホコリンの１８５ｍ／ｚのピークは四重水素化脂肪酸を有するホスファチジルコリンに限定的に検出され、設計通りα位に重水素元素を有することが確認された。この結果から、１８５ｍ／ｚのピークは、生体内における代謝物マーカーとして利用することが可能であり、重水素化リン脂質を生体内由来リン脂質から区別することができることが確認された。
例１９：重水素化標識脂肪酸を使用した脂質代謝解析（２）
　例１９では、重水素化標識脂肪酸を使用してヒト血小板の脂質代謝解析を行った。活性化された血小板は多数の脂質代謝物を産生することが知られており、ＰＣに取り込まれる脂肪酸の種類について検討した。
（１）方法
ア　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析
　ヒト静脈血より単離した血小板をタイロード液にサスペンドし、メチルベータシクロデキストリン（Sigma）中に溶解したにリノール酸－Ｄ４またはメチルベータシクロデキストリン中に溶解したリノエライジン酸－Ｄ４を終濃度３０μＭとなるように添加し、さらに、トロンビン（０．００１ユニット）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。そして、Bligh EG, et al., Can. J. Biochem. Physiol, 1959に記載の方法に従って活性化されたヒト血小板から脂質を抽出し、ＬＣ－ＭＳを用いて解析した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析は、ＬＣとして、Nexera XR HPLCシステム（島津製作所）を用い、ＭＳとして、QTRAP4500（Sciex）を用いた。カプセルパックＣ１８　ＡＣＲカラム（大阪ソーダ）をＨＰＬＣカラムとして用い、アセトニトリル、メタノール、水およびイソプロパノールから構成される移動相を用いてグラジエント溶出した。分析条件は表２に示す通りであった。一重水素化ホスホコリンの１８５　ｍ／ｚをプロダクトイオンとして生成する分子種を、多重反応モニタリング（Multiple Reaction Monitoring）法を用いて網羅的に測定することで、添加したリノール酸－Ｄ４もしくはリノエライジン酸－Ｄ４を含むＰＣ分子種を検出した。また、ホスホコリンの１８４　ｍ／ｚをプロダクトイオンとして生成する分子種を、多重反応モニタリング法を用いて網羅的に測定することで、添加したリノール酸－Ｄ４もしくはリノエライジン酸－Ｄ４を含まない、血小板に内在的に存在するＰＣ分子種を検出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000072
イ　脂質代謝解析
　ＬＣ－ＭＳによって、リノール酸－Ｄ４もしくはリノエライジン酸－Ｄ４を含むＰＣ分子種を網羅的に検出し、検出された各ＰＣ分子種について、リノール酸－Ｄ４添加時とリノエライジン酸－Ｄ４添加時で比較した。比較して得た変動比（ｒａｔｉｏ）と有意確率（ｐ値）を、それぞれｌｏｇ２と－ｌｏｇ１０に換算し、それぞれをＸ軸、Ｙ軸の値として図表を作成することで、ボルケーノプロットを得た。
ウ　ホスファチジルコリン（ＰＣ）形成のスキーム
　血小板内における重水素化標識脂肪酸（脂肪酸－Ｄ４）を含むＰＣ形成のスキームを下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
（２）結果
　結果は、図２および表３に示す通りであった。図２は、ＬＣ－ＭＳによる解析結果をボルケーノプロットしたものであり、重水素化標識脂肪酸（リノール酸－Ｄ４またはリノエライジン酸－Ｄ４）と生体内由来脂肪酸（リノール酸またはリノエライジン酸）のそれぞれの代謝プロファイルを解析するために、ｍ／ｚ　１８５およびｍ／ｚ　１８４のプロダクトイオンをスキャニングすることによりホスファチジルコリン（ＰＣ）の種類について網羅的に解析した結果を示す。リノール酸－Ｄ４およびリノエライジン酸－Ｄ４の派生物を比較した結果、生体外由来脂肪酸（重水素化標識脂肪酸）と生体内由来脂肪酸のそれぞれについてＰＣ種として１７種と３種の成分を検出した（図２の太線で囲んだ箇所）。そして、ＭＳ／ＭＳ解析を進めた結果、２０種のＰＣのうち１１種を同定した（表３、図２のナンバリングしたプロット）。プロット＃１のＰＣは、ＰＣ（構成脂肪酸：パルミチン酸／リノエライジン酸－Ｄ４（トランス型））が、ＰＣ（構成脂肪酸：パルミチン酸／リノール酸－Ｄ４（シス型））と比較して、多いことが確認された。一方で、プロット＃５では、リノール酸－Ｄ４（シス型）が酸化されて取り込まれＰＣ（構成脂肪酸：パルミチン酸／ＨＯＤＥ－Ｄ４）として存在することが確認された。これらの結果から、活性化された血小板ではリノエライジン酸－Ｄ４（トランス型）とリノール酸－Ｄ４（シス型）の代謝プロファイルは異なることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000074
例２０：重水素化標識脂肪酸を使用した脂質代謝解析（３）
　例２０では、ＰＣにリノエライジン酸－Ｄ４が効率的に取り込まれるメカニズムについて検討した。
（１）方法
　血小板におけるシス型脂肪酸とトランス型脂肪酸の立体特異性について検討した。重水素化標識脂肪酸がＰＣにおけるグリセロール骨格のｓｎ－１位またはｓｎ－２位に結合するかを解析するために、血小板から抽出した脂質分画をホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）またはホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）でインキュベートした。ＰＣはＰＬＡ１およびＰＬＡ２によりそれぞれ２－アシル－ＬＰＣおよび１－アシル－ＬＰＣに分解される（次のスキーム参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
　ＰＬＡ１反応として、例１９（１）アに記載の方法により得た血小板由来の脂質分画を酢酸バッファー中に懸濁し、ＰＬＡ１（アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）由来、Sigma）と、ジエチルエーテルを添加して、４度条件下で一晩撹拌した。１％のギ酸入りメタノールを添加し、遠心後、上清を回収した。回収した上清を固相抽出カラム（Waters）にアプライし、水とクロロホルムを用いて洗浄後、１％のギ酸入りメタノールで溶出した。ＰＬＡ2反応として、例１９（１）アに記載の方法により得た血小板由来の脂質分画を０．１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を含むトリスバッファー中に懸濁し、ＰＬＡ2（アピス・メリフェラ（Apis mellifera）由来、Sigma）を添加して、４度条件下で一晩撹拌した。反応液を固相抽出カラム（Waters）にアプライし、水とクロロホルムを用いて洗浄後、メタノールで溶出した。溶出して得た反応液中の２－アシル－ＬＰＣおよび１－アシル－ＬＰＣは、ＬＣ－ＭＳ装置を用いて行った。なお、ＬＣとして、Ultimate 3000 ultra high performance LC system（Thermo）を、ＭＳとして、Q-Exactive Orbitrap（Thermo）を用いた。カプセルパックＣ１８　ＡＣＲカラム（大阪ソーダ）をＨＰＬＣカラムとして用い、水およびイソプロパノールから構成される移動相を用いてグラジエント溶出した。分析条件は表４に示す通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000076
　結果は、図３に示す通りであった。リノエライジン酸－Ｄ４（トランス型）は、リノール酸－Ｄ４（シス型）と比較してＰＣのｓｎ－１位とｓｎ－２位の両方で有意に多くＰＣに取り込まれることが確認された（図３Ａ）。一方、エライジン酸－Ｄ４（トランス型）は、オレイン酸－Ｄ４（シス型）と比較して、やや多めにＰＣに取り込まれる傾向があった（図３Ｂ）。これらの結果から、リノエライジン酸－Ｄ４（トランス型）とエライジン酸－Ｄ４（トランス型）の代謝プロファイルは異なり、それぞれのトランス脂肪酸の代謝プロセスはそれらの構造特性によって異なることが示唆された。
例２１：重水素化標識脂肪酸を使用した脂質代謝解析（４）
　例２１では、ＬＰＣにＨＯＤＥを転移させるアシルトランスフェラーゼの酵素活性ついて検討した。
（１）方法
　１０％の牛胎児血清を添加したＤ－ＭＥＭ（富士フィルム和光純薬）中で培養したＨＥＫ２９３細胞に対して、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Thermo）内にＡＧＰＡＴ２およびＡＧＰＡＴ７をクローニングして得た発現プラスミドを、リポフェクション法により導入した。リポフェクション用試薬としては、リポフェクトアミン２０００（Thermo）を用いた。４８時間後、細胞を回収し、トリスバッファー中に懸濁させ、チップ式ソニケーターで細胞を破砕することで細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を１００，０００ｇの回転速度で１時間遠心分離し、細胞膜画分を得た。３μｇのタンパク量に相当する細胞膜画分、アシルトランスフェラーゼアクセプター分子として１－アシル－パルミチン酸－ＬＰＣ（終濃度２６μＭ）と、アシルトランスフェラーゼドナー分子としてＤ４―ＨＯＤＥ―ＣｏＡ（終濃度１０μＭ）を混合した。３７℃で１０分間のインキュベーション後、総脂質分画はBligh EG, et al., Can. J. BIochem. Physiol, 1959に記載の方法により抽出し、ＬＣ－ＭＳを用いて、反応産物を測定した。なお、ＨＯＤＥ－ＣｏＡ－Ｄ４は、オキサリルクロリドを用いてＨＯＤＥ－Ｄ４とＣｏＡを縮合反応させることにより得た。
　動態解析（kinetic analysis）は、上記方法によって得た細胞膜画分について、０．０５μｇのタンパク量に相当する細胞膜画分、アシルトランスフェラーゼアクセプター分子として１－アシル－パルミチン酸－ＬＰＣ（終濃度１０μＭ）と、アシルトランスフェラーゼドナー分子としてＨＯＤＥ－ＣｏＡ－Ｄ４（終濃度０μＭ、０．０１μＭ、０．０２μＭ、０．１μＭ、０．２μＭまたは１μＭ）を混合した。３７℃で１０分間のインキュベーション後、総脂質分画はBligh EG, et al., Can. J. BIochem. Physiol, 1959に記載の方法により抽出し、ＬＣ－ＭＳを用いて、反応産物を測定した。ＬＣ－ＭＳ条件は、ＬＣとして、Ultimate 3000 ultra high performance LC system（Thermo）を、ＭＳとして、Q-Exactive Orbitrap（Thermo）を用いた。InertSustainC18メタルフリーカラム（ジーエルサイエンス）をＨＰＬＣカラムとして用い、アセトニトリル、メタノール、水およびイソプロパノールから構成される移動相を用いてグラジエント溶出した。分析条件は表１と同様とした。測定結果について、Ｘ軸をＨＯＤＥ－ＣｏＡ－Ｄ４量、Ｙ軸をｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質とするグラフ上に表記し、ミカエリス・メンテン式を用いて回帰曲線を作成することで、ＫｍおよびＶｍａｘを得た。
（２）結果
　結果は、図４に示す通りであった。ＡＧＰＡＴ７は、ＡＧＰＡＴ２または対照と比較して有意に高いＨＯＤＥ－Ｄ４転移活性を有することが確認された（図４Ａ）。また、ＡＧＰＡＴ７のＨＯＤＥ転移活性の動態解析の結果、ＫｍとＶｍａｘは７１．２ｎＭと１．２５ｎｍｏｌ／分／ｍｇと算出された（図４Ｂ）。
　以上の例１８～２１の結果から、本発明の重水素化標識脂肪酸を使用して生体サンプルの脂質代謝解析が可能であることが確認された。

 

Claims (15)

  1. 　脂肪酸の少なくともβ位が重水素化されたことを特徴とする、重水素化標識化合物。
  2. 　脂肪酸のα位がさらに重水素化された、請求項１に記載の重水素化標識化合物。
  3. 　重水素の数が３個または４個である、請求項１または２に記載の重水素化標識化合物。
  4. 　標識化合物が脂肪酸若しくはその誘導体または脂肪酸をその構造の一部とする化合物である、請求項１～３のいずれか一項に記載の重水素化標識化合物。
  5. 　脂肪酸の誘導体が、脂肪酸エステル、脂肪酸ジメチルジスルフィド誘導体または脂肪酸ジメチルオキサゾリン誘導体である、請求項４に記載の重水素化標識化合物。
  6. 　脂肪酸エステルが、アルキルエステルまたはアリールエステルである、請求項５に記載の重水素化標識化合物。
  7. 　脂肪酸をその構造の一部とする化合物が、脂質または脂肪酸結合タンパク質である、請求項４に記載の重水素化標識化合物。
  8. 　脂質がコレステロールエステル、アシルグリセロール、リン脂質、糖脂質またはスフィンゴ脂質である、請求項７に記載の重水素化標識化合物。
  9. 　請求項１～８のいずれか一項に記載の重水素化標識化合物の製造方法であって、脂肪酸アミドを白金族金属触媒の存在下で重水素化する工程を含んでなる、方法。
  10. 　白金族金属触媒が、パラジウム触媒である、請求項９に記載の製造方法。
  11. 　脂肪酸アミドを塩基の存在下で重水素化する工程をさらに含んでなる、請求項９または１０に記載の製造方法。
  12. 　重水素化された化合物を脱保護する工程をさらに含んでなる、請求項９～１１のいずれか一項に記載の製造方法。
  13. 　請求項１～８のいずれか一項に記載の重水素化標識化合物を質量分析の内部標準物質として使用することを特徴とする、脂質若しくは脂肪酸結合タンパク質またはそれらの代謝物の定量方法。
  14. 　請求項１～８のいずれか一項に記載の重水素化標識化合物を代謝物マーカーとして使用することを特徴とする、生体内代謝の解析方法。
  15. 　脂質若しくは脂肪酸結合タンパク質またはそれらの代謝物の定量方法における質量分析の内部標準物質としての、請求項１～８のいずれか一項に記載の重水素化標識化合物の使用、または生体内代謝の解析方法における代謝物マーカーとしての、請求項１～８のいずれか一項に記載の重水素化標識化合物の使用。

     
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