JPWO2007013601A1 - 生体分子用標識色素及び標識キット並びに生体分子の検出方法 - Google Patents
生体分子用標識色素及び標識キット並びに生体分子の検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2007013601A1 JPWO2007013601A1 JP2007526917A JP2007526917A JPWO2007013601A1 JP WO2007013601 A1 JPWO2007013601 A1 JP WO2007013601A1 JP 2007526917 A JP2007526917 A JP 2007526917A JP 2007526917 A JP2007526917 A JP 2007526917A JP WO2007013601 A1 JPWO2007013601 A1 JP WO2007013601A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- dye
- biomolecule
- labeling
- binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 0 C*1N2C1=C[C@]2*C(C1)C1(CCN)C#SC Chemical compound C*1N2C1=C[C@]2*C(C1)C1(CCN)C#SC 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
- C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D471/04—Ortho-condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
- C07D498/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D498/04—Ortho-condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0821—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B57/00—Other synthetic dyes of known constitution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
- C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
- C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
- C09K11/07—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials having chemically interreactive components, e.g. reactive chemiluminescent compositions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/66—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light electrically excited, e.g. electroluminescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
- C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
- C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
- C09K2211/1007—Non-condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
- C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
- C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
- C09K2211/1011—Condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
- C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
- C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
- C09K2211/1014—Carbocyclic compounds bridged by heteroatoms, e.g. N, P, Si or B
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
- C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
- C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
- C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
- C09K2211/1044—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing two nitrogen atoms as heteroatoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
- C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
- C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
- C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
- C09K2211/1044—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing two nitrogen atoms as heteroatoms
- C09K2211/1048—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing two nitrogen atoms as heteroatoms with oxygen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
- C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
- C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
- C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
- C09K2211/1059—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing three nitrogen atoms as heteroatoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
- C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
- C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
- C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
- C09K2211/1092—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing sulfur as the only heteroatom
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
- G01N21/6458—Fluorescence microscopy
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
- Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
- Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Zoology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
Description
Science 283,1,January,1999,83-87
-(CHR')p-X-(CHR")q- (I)
式中、Xは直接結合又は、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択され少なくとも1種の官能基を表し、R'とR"はそれぞれ独立に、水素原子、あるいは芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基、あるいは芳香族炭化水素基であって、必要によりスルホニル基、ヒドロキシル基、4級アミン基及びカルボキシル基からなる群から選択されたいずれか1種の荷電基により置換されたものを表し、Arはアリール基を表し、pとqはそれぞれ独立に0から20の整数を表し、p+q≧1である。
ここで、上記の被検体又は修飾物質と上記結合物質との組み合わせには、抗原−抗体、ハプテン−抗ハプテン抗体、ビオチン−アビジン、Tag−抗Tag抗体、レクチン−糖タンパク質又はホルモン−受容体を用いることができる。
すなわち、スペーサー部を設けることにより、発色部と標識対象である生体分子との間の立体障害が抑制され、結合部と生体分子の標識部位との結合が容易になる結果、高い標識率が得られたと考えられる。これにより、本発明の標識色素によれば、スペーサー部の長さを制御することにより、生体分子の標識部位の深度に影響されることなく、高い標識率を得ることが可能となる。これにより使用する標識色素の量を大幅に低減できることから、標的分子の検出費用を大幅にコストダウンすることも可能となる
さらに、有機EL色素は固体状態(固体及び半固体を含む)で高い量子収率を有しているので、マイクロアレイなどの基盤上、もしくはビーズ上の乾燥状態でも高い蛍光強度を与える。また、有機EL色素はCy3やCy5に比べ安価であるので、より低コストで生体分子の検出を行うことができる。また、有機EL色素の置換基を変えることにより励起波長及び発光波長を変化させることができるので、蛍光波長の選択の自由度が増加し、オレンジ、イエロー、グリーン、ブルーなど多くの蛍光波長を用いることができる。これにより、ストークスシフトの大きい(励起波長と蛍光波長の差が大きい)2種以上の蛍光色素を用いることが可能となり、一つの試料中に含まれる複数の標的核酸を同時に検出することも可能となる。また、Cy3やCy5は冷凍保存する必要があるのに対し、有機EL色素は化学的に安定であり、常温での長期保存に耐えることができるので、取り扱いが容易である。
本発明の生体分子用標識色素は、有機EL色素から成る発色部と、生体分子を結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有することを特徴とするものである。
すなわち、スペーサー部は、上記の群から選択された1種の官能基のみで構成しても良く、2種以上の官能基を含む構成とすることもできる。また、選択した一の官能基を2個以上含む構成とすることもできる。
(1)2種の官能基で構成する場合
-CONH-COO-、-CH2-O-、-CH2-NR- 等が好ましい。
(2)3種以上の官能基で構成する場合
(i)以下の一般式(I)で表されるものを用いることが好ましい。
-(CHR1)p-X-(CHR2)q- (I)
式中、Xは直接結合又は、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択された少なくとも1種の官能基を用いることができ、好ましくは-COO-、-CONH-、-O-、-CH=CH-、-C≡C-又は-Ar-、より好ましくは-COO-、-CONH-、-O-又は-Ar-を用いることができる。また、R1とR2はそれぞれ独立に、水素原子、あるいは芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基、あるいは芳香族炭化水素基であって、必要によりスルホニル基、ヒドロキシル基、4級アミン基及びカルボキシル基からなる群から選択されたいずれか1種の荷電基により置換されたものを用いることができる。また、Arはアリール基、好ましくは、フェニレン基又はナフチレンで基あり、必要に応じてスルホニル基で置換されたものを用いることができる。pとqはそれぞれ独立に0から20の整数、好ましくは0から10の整数、より好ましくは0から5の整数であり、p+q≧1である。
このスペーサー部の具体例を挙げると、-(CH2)p-CONH-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R1-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R1-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R1-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R1-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-(O-CH-)n-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R1-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R1-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R1-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R1-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R1-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R1(-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R1(-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R1(-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R1(-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-Ar-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-COO)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-C≡C-(CH2)q-、-(CH2)p-C=C-(CH2)q-、-(CH2)p-NR-(CH2)q-、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-(CH2)p-S-(CH2)q-、-(CH2)p-HN-C(=NH)-NH- (CH2)q-、-(CH2)p-CO-Ar-NR-(CH2)q-等を挙げることができる。より好ましくは、-(CH2)p-CONH-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-(CH2)q- である。
(ii)以下の一般式(II)で表されるものを用いることが好ましい。
-Y-(CHR3)r-Z- (II)
ここで、Y及びZは、それぞれ独立に、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-CH2NH-、-CH2NR-、-O-、-S-、-NR-、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択された1種の官能基であり、好ましくは、-CONH-と-COO-、-COO-と-COO-、-COO-と-NR- 等の組み合わせである。また、R3は、水素原子、あるいは芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基、あるいは芳香族炭化水素基であって、必要によりスルホニル基、ヒドロキシル基、4級アミン基及びカルボキシル基からなる群から選択されたいずれか1種の荷電基により置換されたものを用いることができる。また、Arはアリール基、好ましくは、フェニレン基又はナフチレンで基あり、必要に応じてスルホニル基で置換されたものを用いることができる。rは0から20の整数、好ましくは0から10の整数、より好ましくは0から5の整数である。このスペーサー部の具体例を挙げると、-CONH-(CH2)r-COO-、-CONH-CH(-R3-OH)-COO-、-CONH-CH(-R3-COOH)-COO-、-CONH-CH(R3-SO3H)-COO-、-COO-(CH2)r-COO- 等を挙げることができる。
修飾アミノ酸は、一般式:H-N(R1)-(R2-CO)-OHで表すことができる。ここで、R1とR2は、それぞれ独立に、エステル、エーテル、チオエステル、チオエーテル、アミド、カルバミド又はチオカルバミドを介して又は介さずに、スルホニル基、ヒドロキシル基、4級アミン基、及びカルボキシル基からなる群から選択されたいずれか1種の荷電基により置換された炭化水素基又は芳香族基又はヘテロ環基を表す。さらに炭化水素基又は芳香族基又はヘテロ環基は、それぞれ、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基又はアルコキシ基の少なくとも1種で置換されていても良い。
以下に、縮合多環化合物の具体例について説明する。
また、R'は芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基を示す。ここで、アルキル基、アルケニル基芳香族炭化水素基には、上記と同様のものを用いることができる。
また、An-は、Cl-、Br-、I-等のハロゲン化物イオン、CF3SO3 -、BF4 -、PF6 -を示す。なお、以下の一般式においても、特に断らない限り同様である。
なお、以下の一般式においても、特に断らない限り同様である。また、nは1以上の整数、好ましくは1〜5であり、以下の一般式中でも同様である。
また、チオフェン誘導体の場合、非縮合系の化合物であり、以下の一般式で示される2,3,4,5-テトラフェニルチオフェン誘導体を用いることもできる。
また、以下の一般式で示される2,3,4,5-テトラフェニルチオフェン誘導体を用いることもできる。
ここで、上記のR2とR3に、置換基を有しても良い芳香族炭化水素基又は炭化水素基を用いることが好ましい。Cy3に対応する緑色蛍光色素を得ることができる。芳香族炭化水素基としてはフェニル基、トリル基、キシリル基又はナフチル基、より好ましくはフェニル基又はトリル基である。さらに、置換基としてはスルホニウム基が好ましい。水溶性を高めることができるからである。
(DNAマイクロアレイ法)
本検出方法は、検出すべき標的核酸に有機EL色素を反応させて有機EL色素で標識する一方、標的核酸に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖のプローブ核酸を用意し、一本鎖に変成させた標的核酸とプローブ核酸とを基盤上でハイブリダイズさせ、標的核酸の蛍光を測定する。本検出方法では、基盤に固定するプローブ核酸には、遺伝子の発現を調べる場合、cDNA等をcDNAのライブラリー、ゲノムのライブラリー又は全ゲノムをテンプレートとしてPCR法により増幅して調製したものを用いることができる。また、遺伝子の変異等を調べる場合、標準となる既知の配列をもとにして、変異等に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成したものを用いることができる。
(PCR法)
(PCR法)
本検出方法は、検出すべき標的核酸の塩基配列に相補的なプローブを有機EL色素で標識し、標的核酸の増幅に先立って、あるいは増幅させた後、標的核酸とプローブとを反応させ、標的核酸の蛍光を測定する。具体的には、標的核酸の伸長反応は酵素(DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ)によって行われ、このとき標的核酸とオリゴヌクレオチドからなるプライマーとが形成した2本鎖核酸配列を酵素が認識し、その認識した位置から伸長反応が行われ、目的とする遺伝子領域だけを増幅させる。酵素が合成を行う際ヌクレオチド(dNTP、NTP)を原料として合成反応が行われる。このとき通常のヌクレオチド(dNTP、NTP)に、例えば、図27に示すような、色素を有するヌクレオチドを任意の割合で混合すると、その割合の色素が導入された核酸を合成することができる。または、PCRにより、任意の割合でアミノ基を有するヌクレオチドを導入した後に有機EL色素を結合させ、有機EL色素が導入された核酸を合成することも可能である。
ここで、上記の被検体又は修飾物質と上記結合物質との組み合わせには、抗原−抗体、ハプテン−抗ハプテン抗体、ビオチン−アビジン、Tag−抗Tag抗体、レクチン−糖タンパク質又はホルモン−受容体を用いることができる。
具体例として、以下の方法を用いることができる。
(1)基盤や溶液中に存在する生体分子(抗原:タンパク質、多糖類、核酸、ペプチド)に蛍光標識した抗体を結合させ検出を行う方法。
(2)基盤や溶液中にハプテンを修飾した生体分子(タンパク質、多糖類、核酸、ペプチド)に、蛍光標識した抗ハプテン抗体を結合させ検出を行う方法。
(3)基盤や溶液中にビオチンを修飾した生体分子(タンパク質、多糖類、核酸、ペプチド)に、蛍光標識したアビジンを結合させ検出を行う方法。
(4)基盤や溶液中に存在する生体分子(タンパク質、多糖類、核酸、ペプチド)に抗体を結合させ、さらにその抗体と特異的に結合する蛍光色素を標識した抗体を結合させ検出を行う方法。
(5)基盤や溶液中に存在する生体分子(タンパク質、多糖類、核酸)にハプテンを修飾した抗体を結合させ、さらにそのハプテンと特異的に結合する蛍光色素を標識した抗体を結合させ検出を行う方法。
(6)基盤や溶液中に存在する生体分子(タンパク質、多糖類、核酸)にビオチンを修飾した抗体を結合させ、さらにそのビオチンと特異的に結合する蛍光色素を標識したアビジンを結合させ検出を行う方法。
(7)基盤や溶液中に存在する生体分子(タンパク質、多糖類、核酸)にTag(ヒスチジンなど)を導入し、蛍光色素で標識した抗Tag抗体で検出を行う方法。
これらの標識物は、免疫染色、ELISA、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー等の各種の測定手法に使用することができる。
さらに、具体例を説明すると、例えば、図2に示すように、IgG抗体をペプシンで処理するとF(ab')2と呼ばれるフラグメントが得られる。このフラグメントをジチオスレイトール等で還元するとFab'と呼ばれるフラグメントが得られる。Fab'フラグメントは1つもしくは2つのチオール基(-SH)を有している。このチオール基に対してマレイミド基を作用させて特異的な反応を行うことができる。すなわち、図3に示すように、マレイミド基を導入した有機EL色素をフラグメントのチオール基と反応させることにより、有機EL色素で抗体を標識することができる。この場合、抗体の生理活性(抗原捕捉能)を失うことがない。
合成例1.
有機EL色素として、1, 2, 5,-オキサジアゾロ-[3, 4-c]ピリジン誘導体を用いた。
以下に、スペーサー部として-COO-を導入したオキサジアゾロ-[3, 4-c]ピリジンの活性エステル体の反応例(スキーム2と3)を示す。なお、スペーサー部を有しない活性エステル体をEL-OSu、スペーサー部を導入した活性エステル体をEL-OSu-Spと略す。
(合成手順)
(1)ジケトン誘導体(2)の合成
500mL三口フラスコに4-メトキシアセトフェノン(1)37.5 g (0.25 mol)、亜硝酸ナトリウム0.15 gを酢酸100 mLに溶解した。水浴中、HNO3 100 mLを酢酸100 mLに溶解したものを2時間かけて滴下した。その後、室温で2日間撹拌した。反応混合物を500mLの水にゆっくりと入れ、沈殿を生成させた。沈殿物は濾過し、クロロホルムに溶解した。クロロホルム相を飽和重曹水で洗浄し、10% NaCl 水溶液で2回洗浄した。MgSO4で脱水した後、減圧下、クロロホルムを留去し、オキサジアゾール-N-オキサイド(2)を34.5 g (収率78%)で得た。
500mL三口フラスコにオキサジアゾール-N-オキサイド(2)17.7 g (0.05 mol)をアセトニトリル400 mLに溶解した。それにZn 12.0 g、AcOH 7 mL、Ac2O 20mLを添加した。水浴中で反応温度が30℃を超えないように冷却した。12時間撹拌して反応終点とした。反応混合物を濾過し、不溶分を除去した。アセトニトリルを減圧下留去して残渣を得た。残渣をクロロホルムで再結晶し、オキサジアゾール-N-オキサイド(3)を10.2 g (収率60%)で得た。
500mL三口フラスコでオキサジアゾール-N-オキサイド(3)15.6 g (0.046 mol)をブタノール300 mLに溶解した。そこへグリシンエチルエステル塩酸塩 32.0 g (0.23 mol)を添加した。24時間加熱還流を行った。ブタノールを減圧下留去し、残渣を得た。残渣を200mLのクロロホルムに溶解し、10% HCl、飽和NaHCO3、10%NaClで洗浄した。MgSO4で乾燥し、溶媒を留去した。得られた残渣をクロロホルムで再結晶し、オキサジアゾロピリジンエチルエステル(4)を13.0 g (収率 70%)で得た。
500mL三口フラスコでオキサジアゾロピリジンエチルエステル(4)3.0 g (0.007 mol)を200 mLのエタノールに溶解した。そこへKOH 0.62 g (0.01 mol)を添加した。5時間加熱環流を行った後、反応混合物を200 mLの水へ添加した。この水溶液に濃塩酸を滴下してpH 1に調整したところ沈殿が生じた。沈殿物を濾過し、クロロホルムに溶解した。クロロホルム相を10% NaHCO3水溶液、水で洗浄した。クロロホルムを留去して残渣を得た。残渣を水-エタノール (1:1)で再結晶し、2.1 g (収率 81%)のオキサジアゾロピリジンカルボン酸(5)を得た。
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸(5)1.0 g (0.0026 mol)とN-ヒドロキシスクシンイミド0.30 g (0.0026 mol)をDMF 20mLに溶解した。これにN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 0.54 g (0.0026 mol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム)で単離精製し、オキサジアゾロピリジン活性エステル体(6)を0.76 g (収率62%)得た。
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジン活性エステル体(6) 100 mg (0.21 mmol)とアラニン18.8 mg (0.21 mmol)をDMF 20mLに溶解した。その後、室温で12時間撹拌した。反応終了後、減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール=7:3)で単離精製し、カルボン酸体(7)を83 mg (収率88%)得た。
次いで、50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸体(7)70 mg (0.16 mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド18.0 mg (0.16 mmol)をDMF 20mLに溶解した。これにDMF 5 mLに溶解したN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 32.2 mg (0.16 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム)で単離精製し、活性エステル体(8)を75.8 mg (収率89%)得た。
有機EL色素としてイミダゾロピリジンエチルエステル誘導体を用いた。以下に、スペーサー部として-COO-を導入したイミダゾロピリジンエチルエステルの活性エステル体の反応例(スキーム4と5)を示す。
500mL三口フラスコでエステル体(1)0.5 g (1.5 mmol)を50 mLのエタノールに溶解した。そこへKOH 0.12 g (2.1 mol)を添加した。5時間加熱環流を行った後、反応混合物を50 mLの水へ添加した。この水溶液に濃塩酸を滴下してpH 1に調整したところ沈殿が生じた。沈殿物を濾過し、クロロホルムに溶解した。クロロホルム相を10% NaHCO3水溶液、水で洗浄した。クロロホルムを留去して残渣を得た。残渣を水で再結晶し、0.3 g (収率 63%)のカルボン酸体(2) を得た。
50 mL 三口フラスコでカルボン酸誘導体(2)0.2 g (0.6 mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド0.07 g (0.6 mmol)をDMF 10mLに溶解した。これにN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 0.12 g (0.6 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム)で単離精製し、活性エステル体(3)を0.14 g (収率55%)得た。
50 mL 三口フラスコでイミダゾロピリジン活性エステル体(3) 80 mg (0.19 mmol)とアラニン17.3 mg (0.19 mmol)をDMF 20mLに溶解した。その後、室温で10時間撹拌した。反応終了後、減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール=7:3)で単離精製し、カルボン酸体(4)を 58 mg (収率 78%)得た。
次いで、50 mL 三口フラスコでイミダゾロピリジンカルボン酸体(4)54 mg (0.14 mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド16.1 mg (0.14 mmol)をDMF 20mLに溶解した。これにDMF 5 mLに溶解したN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 28.8 mg (0.14 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム)で単離精製し、活性エステル体(5)を62.2 mg (収率 92%)得た。
有機EL色素として合成例1で用いたオキサジアゾロピリジン誘導体を用い、スペーサー部にシステイン酸を用い、反応性基には活性エステル化したカルボニル基とアニオン性基であるスルホニウム基の両方を導入した。オキサジアゾロピリジン活性エステル体(6)をシステイン酸と反応させ、スペーサー部を導入したカルボン酸体(9)を合成した。その後、カルボン酸体(9)をジオキサン中、N-ヒドロキシスクシンイミドと反応させ、スペーサー部を導入したオキサジアゾロピリジン活性エステル体(10)を合成した。以下に反応例を示す。
(1)カルボン酸体(9)の合成
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジン活性エステル体(6) 100 mg (0.21 mmol)とシステイン酸 39 mg (0.23 mmol)をDMF 20mLに溶解した。その後、室温で12時間撹拌した。反応終了後、減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール=7:3)で単離精製し、カルボン酸体(9)を98 mg (収率88%)得た。
次いで、50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸体(9) 80 mg (0.15 mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド 19 mg (0.17 mmol)をDMF 20mLに溶解した。これにDMF 5 mLに溶解したN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 35 mg (0.17 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=10:1)で単離精製し、活性エステル体(10)を73 mg (収率 78%)得た。
有機EL色素として合成例1で用いたオキサジアゾロピリジン誘導体を用い、スペーサー部にセリンを用いた。オキサジアゾロピリジン活性エステル体(6)をセリンと反応させ、スペーサー部を導入したカルボン酸体(11)を合成した。その後、カルボン酸体(11)をジオキサン中、N-ヒドロキシスクシンイミドと反応させ、スペーサー部を導入したオキサジアゾロピリジン活性エステル体(12)を合成した。以下に反応例を示す。
(1)カルボン酸体(11)の合成
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジン活性エステル体(6) 100 mg (0.21 mmol)とセリン26 mg (0.25 mmol)をDMF 20mLに溶解した。その後、室温で12時間撹拌した。反応終了後、減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール=7:3)で単離精製し、カルボン酸体(12)を 79 mg (収率 81%)得た。
次いで、50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸体(11) 70 mg (0.15mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド 19 mg (0.17 mmol)をDMF 20mLに溶解した。これにDMF 5 mLに溶解したN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 35 mg (0.17 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=10:1)で単離精製し、活性エステル体(12)を 61 mg (収率 72%)得た。
有機EL色素として合成例1で用いたオキサジアゾロピリジン誘導体を用い、スペーサー部にペプチドリンカーとしてアラニルセリン(Ala-Ser)を用いた。オキサジアゾロピリジン活性エステル体(6)をアラニルセリンと反応させ、スペーサー部を導入したカルボン酸体(13)を合成した。その後、カルボン酸体(13)をジオキサン中、N-ヒドロキシスクシンイミドと反応させ、スペーサー部を導入したオキサジアゾロピリジン活性エステル体(14)を合成した。以下に反応例を示す。
(1)カルボン酸体(13)の合成
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジン活性エステル体(6) 100 mg (0.21 mmol)とアラニルセリン 45 mg (0.25 mmol)をDMF 20mLに溶解した。その後、室温で10時間撹拌した。反応終了後、減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール=6:4)で単離精製し、カルボン酸体(13)を72 mg (収率64%)得た。
次いで、50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸体(13) 60 mg (0.11 mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド 14 mg (0.12 mmol)をDMF 15mLに溶解した。これにDMF 5 mLに溶解したN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 25 mg (0.12 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で15時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=8:2)で単離精製し、活性エステル体(14)を60 mg (収率 86%)得た。
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸体(5) 100 mg (0.27 mmol)をSOCl2 20mLに混合し、2時間加熱環流を行った。室温まで冷却しSOCl2を留去し、酸クロライド体15を94 mg (Y. 90%)で得た。
100 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジン酸クロライド体(15) 90 mg (0.22 mmol)をTHF 40mLに混合した。そこへ5mLのTHFに溶解したエチレングリコール酸 20 mg (0.22 mmol)を投入し、1時間攪拌した。その後、THFを留去した。残渣をメタノールで再結晶し、カルボン酸体16を61 mg (Y. 62%)で得た。
次いで、50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸体(16) 100 mg (0.22 mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド 29 mg (0.24 mmol)をDMF 25mLに溶解した。これにDMF 10 mLに溶解したN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 50 mg (0.24 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で15時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=7:3)で単離精製し、活性エステル体(17)を107 mg (収率 89%)得た。
有機EL色素として合成例1で用いたオキサジアゾロピリジン誘導体を用い、スペーサー部にタウリンを用いて、合成例3のオキサジアゾロピリジン活性エステル体(10)を合成した。
DMFを減圧留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー (CHCl3:MeOH=3:1)で精製し目的物を分取したところ、分取した溶液に結晶が生じたのでそれを濾過した。得られた結晶をHPLC(Figure 3)、TLCにて確認したところ目的物であった。収量は283 mg(収率 58%)であった。
〈オリゴDNAの色素標識及び検出(1)〉
(オリゴDNA)
用いたオリゴDNAは以下の通りである。
17mer DNA H2N-(C6) - 5'-ACT CCA GTG GTA ATC TA -3'
20mer DNA H2N-(C6) - 5'-ACT CCA GTG GTA ATC TAC TG-3'
40mer DNA H2N-(C6) - 5'-ACT CCA GTG GTA ATC TAC TGG GAC GGA ACA GCT TTG AGG T-3'
標識色素には、合成例1で合成したオキサジアゾロピリジンの活性エステル体8(EL-OSu-Sp)を用いた。オリゴDNAに20mer DNAを用いた例について説明する。
H2N-(C6) - 5'-ACT CCA GTG GTA ATC TAC TG-3' (10 nmol)を含むホウ酸buffer (pH 8.5) 20 μlに、活性エステル体(EL-OSu-Sp)12 nmol (5.7 μg)(1.2当量)を含むDMSO溶液80 μlを加えて室温で6時間振とうした。振とう後、全量が1 mlになるように0.1 M TEAA (triethylamine acetate) buffer (pH7.0)を加え、NAP-10カラム(GE healthcare Sephadex G-25)を用いてオリゴヌクレオチドに由来する成分を分取した。その際、NAP-10カラムはあらかじめ0.1M TEAA buffer 15 mlで平衡化させた後使用した。全量が1 mlになるようにメスアップした試料をカラムに充填し、1 mlの溶液が溶出した後、0.1 M TEAA bufferを1.5 mlチャージした。この直後からの溶出液1.5 mlを分取した。得られた溶液100 μlを逆相HPLCにより分析した。
なお、比較のため、スペーサー部を含まないオキサジアゾロピリジンの活性エステル体(EL-OSu)を用いてオリゴDNAの標識を行った。また、Molecular Probe社製のAlexa594の活性エステル体も一部比較に用いた。
なお、標識率は、HPLCスペクトルのピーク面積を対比することによって算出した。
HPLC装置には、日本分光(株)製の LC-2000plus シリーズを用いた。
カラム:GL Science Inertsil ODS-3 Column 5μm、4.6 mm×250 mm
DNAグラジエント条件
Eluting solvent A: 0.1M TEAA水溶液(pH7.0)
Eluting solvent B: 90% CH3CN/0.1M TEAA水溶液 (pH7.0)
Gradient (B%) 0 min(10%)→30 min(45%)→40 min(100%)→50 min(100%)→60 min(10%)
流速 1ml/min
温度 40℃
EL-OSu又はEL-OSu-Spを用いて標識したオリゴDNAのHPLCの結果を、17mer DNA、20mer DNA、40mer DNAについて、図4A〜4B、図5A〜5C、図6A〜6Bに示す。また、標識率の値を表1から3に示す。
〈オリゴDNAの色素標識及び検出(2)〉
有機EL色素にスペーサー部を有するイミダゾロピリジンの活性エステル体5(im-EL-OSu-Sp)を用いた以外は、実施例1と同様の方法により20mer DNAへの色素標識を行った。
オキサジアゾロピリジンの活性エステル体(EL-OSu-Sp)を用いた場合と同様、モル比1.2程度でも概ね100%の標識率が得られた。
〈オリゴDNAの色素標識及び検出(3)〉
有機EL色素に合成例3で合成したスペーサー部を有するオキサジアゾロピリジンの活性エステル体10を用い、DMSOを10μlとして試料液全体の10vol%とした以外は、実施例1と同様の方法により20mer DNAへの色素標識を行った。
オキサジアゾロピリジンの活性エステル体8を用いた場合と同様、モル比1.2程度でも概ね100%の標識率が得られた。なお、実施例1では、有機EL色素を溶解させるためDMSOを試料液全体の80vol%としたが、本実施例では10vol%でも有機EL色素が溶解し、優れた水溶性を示した。
〈オリゴDNAの色素標識及び検出(4)〉
有機EL色素に合成例4で合成したスペーサー部を有するオキサジアゾロピリジンの活性エステル体12を用い、DMSOを10μlとして試料液全体の10vol%とした以外は、実施例1と同様の方法により20mer DNAへの色素標識を行った。
オキサジアゾロピリジンの活性エステル体8を用いた場合と同様、モル比1.2程度でも概ね100%の標識率が得られた。また、実施例3の場合と同様、優れた水溶性を示した。
〈オリゴDNAの色素標識及び検出(5)〉
有機EL色素に合成例5で合成したスペーサー部を有するオキサジアゾロピリジンの活性エステル体14を用い、DMSOを10μlとして試料液全体の10vol%とした以外は、実施例1と同様の方法により20mer DNAへの色素標識を行った。
オキサジアゾロピリジンの活性エステル体8を用いた場合と同様、モル比1.2程度でも概ね100%の標識率が得られた。なお、実施例1では、有機EL色素を溶解させるためDMSOを試料液全体の80vol%としたが、本実施例では10vol%でも有機EL色素が溶解し、優れた水溶性を示した。
〈タンパク質の色素標識及び検出(1)〉
(標識手順)
BSA(Bovine Serium Albumin)のリシン残基のアミノ基とスペーサー部を含むオキサジアゾロピリジンの活性エステル体8(EL-OSu-Sp))を反応させてアミド結合を形成させて、BSAへの色素標識を行った。具体的には、BSA 1.0 mg (15.05 nmol)を含む炭酸buffer(pH9.0) 100 μlに、活性エステル体35.82 μg(75.25 nmol)を含むDMSO溶液400μl加えて室温で24時間振盪した。その後全量が1 mlになるように0.1 M TEAA buffer(pH7.0)を加え、NAP-10カラム(GE healthcare Sephadex G-25)を用いてBSAに由来する成分を1.5 ml分取した。得られた溶液100μlを逆相HPLCにより分析した。
HPLC装置には、日本分光(株)製の LC-2000plus シリーズを用いた。
カラム:GL Science Inertsil ODS-3 Column 5μm、4.6 mm×250 mm
DNAグラジエント条件
Eluting solvent A: 0.1M TFA水溶液(pH7.0)
Eluting solvent B: 90% CH3CN/0.1M TFA水溶液 (pH7.0)
Gradient (B%) 0 min(5%)→20 min(50%)→60 min(70%)→70 min(100%)→80 min(100%)→90 min(5%)
流速 0 min→20 min, 60 min→90 min :1 mL/min、20 min→60 min :0.5 mL/min
温度 40℃
スペーサー部を有しないEL-OSuとスペーサー部を有するEL-OSu-Spを用いて標識したBSAのHPLCの結果を、それぞれ図8Aと8Bに示す。標識率を表4に示す。
〈タンパク質の色素標識及び検出(2)〉
有機EL色素に合成例3で合成したスペーサー部を有するオキサジアゾロピリジンの活性エステル体10を用い、DMSOを10μlとして試料液全体の10vol%とした以外は、実施例5と同様の方法によりBSAへの色素標識を行った。
実施例5の場合と同様の標識率で得られた。なお、実施例5では、有機EL色素を溶解させるためDMSOを試料液全体の80vol%としたが、本実施例では10vol%でも有機EL色素が溶解し、優れた水溶性を示した。
〈タンパク質の色素標識及び検出(4)〉
有機EL色素に合成例4で合成したスペーサー部を有するオキサジアゾロピリジンの活性エステル体12を用い、DMSOを10μlとして試料液全体の10vol%とした以外は、実施例5と同様の方法によりBSAへの色素標識を行った。
実施例5の場合と同様の標識率が得られた。また、実施例5の場合と同様、優れた水溶性を示した。
〈タンパク質の色素標識及び検出(5)〉
有機EL色素に合成例5で合成したスペーサー部を有するオキサジアゾロピリジンの活性エステル体14を用い、DMSOを10μlとして試料液全体の10vol%とした以外は、実施例5と同様の方法によりBSAへの色素標識を行った。
実施例5の場合と同様の標識率が得られた。なお、実施例5では、有機EL色素を溶解させるためDMSOを試料液全体の80vol%としたが、本実施例では10vol%でも有機EL色素が溶解し、優れた水溶性を示した。
〈タンパク質の色素標識及び検出(6)〉
有機EL色素に合成例6で合成したスペーサー部を有するオキサジアゾロピリジンの活性エステル体17を用い、DMSOを10μlとして試料液全体の10vol%とした以外は、実施例5と同様の方法によりBSAへの色素標識を行った。
実施例5の場合と同様の標識率が得られた。なお、本実施例でも優れた水溶性を示した。
Claims (34)
- 蛍光測定による生体分子の検出に用いる標識色素であって、有機EL色素から成る発色部と、生体分子を結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有する生体分子用標識色素。
- 上記有機EL色素が、1種以上のヘテロ原子、セレン原子又はボロン原子を含む5員環化合物と共役系を有する6員環化合物とから成る縮合多環化合物である請求項1記載の生体分子用標識色素。
- 上記縮合多環化合物が、以下の一般式(1)、(2)又は(3)のいずれか1種で示されるアゾール誘導体である請求項2記載の生体分子用標識色素。
(式中、R1、R2、R3、R4は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基、複素環基などの置換基を有してもよい芳香族炭化水素基又は炭化水素基又は複素環基を示し、Xは置換基を有していてもよい窒素原子又は硫黄原子又は酸素原子又はセレン原子、ボロン原子を示し、R'は芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、An-は、Cl-、Br-、I-等のハロゲン化物イオン、CF3SO3 -、BF4 -、PF6 -を示す。) - 上記のR2とR3が、それぞれ独立に、チオフェン誘導体、フラン誘導体、ピロール誘導体、イミダゾール誘導体、オキサゾール誘導体、チアゾール誘導体、ピラゾール誘導体及びピリジン誘導体からなる群から選択された1種である請求項3記載の生体分子用標識色素。
- 上記のR2とR3が、スルホニル基を有するアリール基である請求項3記載の生体分子用標識色素。
- 上記縮合多環化合物が、以下の一般式(4)、(5)、(6)、(7)又は(8)で示されるイミダゾール誘導体である請求項2記載の生体分子用標識色素。
(式中、R1、R2、R3、R4、R5は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基、複素環基などの置換基を有しても良い芳香族炭化水素基又は炭化水素基又は複素環基を示し、R1、 R2、R3、R4、R5は同じでも異なっていても良く、R'、R''は芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、An-は、Cl-、Br-、I-等のハロゲン化物イオン、CF3SO3 -、BF4 -、PF6 -を示す。) - 上記のR2とR3が、それぞれ独立に、チオフェン誘導体、フラン誘導体、ピロール誘導体、イミダゾール誘導体、オキサゾール誘導体、チアゾール誘導体、ピラゾール誘導体及びピリジン誘導体からなる群から選択された1種である請求項6記載の生体分子用標識色素。
- 上記のR2とR3が、スルホニル基を有するアリール基である請求項6記載の生体分子用標識色素。
- 上記結合部が、カルボン酸基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基から選択されたいずれか1種の反応性基を有する請求項1から8のいずれか一つに記載の生体分子用標識色素。
- 上記スペーサー部が、-CH2-、-NHCOO-、-CONH-、-CH2NH-、-CH2NR-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-(Rはアルキル基)、-(CH2-CH2-O)n-(nは1から10の整数)、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択される官能基を少なくとも1種含む請求項1から9のいずれか一つに記載の生体分子用標識色素。
- 上記スペーサー部が、以下の一般式(I)で表される請求項10記載の生体分子用標識色素。
-(CHR')p-X-(CHR")q- (I)
(式中、Xは直接結合又は、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択された少なくとも1種の官能基を表し、R'とR"はそれぞれ独立に、水素原子、あるいは芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基、あるいは芳香族炭化水素基であって、必要によりスルホニル基、ヒドロキシル基、4級アミン基及びカルボキシル基からなる群から選択されたいずれか1種の荷電基により置換されたものを表し、Arはアリール基を表し、pとqはそれぞれ独立に0から20の整数を表し、p+q≧1である。) - 上記スペーサー部が、アミノ酸又は2〜20個のアミノ酸からなるペプチドリンカーである請求項10記載の生体分子用標識色素。
- 上記スペーサー部がアミノ酸であって、該アミノ酸が天然アミノ酸又は合成アミノ酸である請求項12記載の生体分子用標識色素。
- 上記アミノ酸が、システイン酸、2-アミノ-3-スルホサルファニルプロパン酸、2-アミノ-3-スルホキシプロパン酸、チロシン、スレオニン、4-アミノ-2-ヒドロキシブタン酸、ホモセリン及びセリンからなる群から選択された1種である請求項13記載の生体分子用標識色素。
- 上記スペーサー部がペプチドリンカーであって、該ペプチドリンカーが、スルホニル基、ヒドロキシル基、4級アミン基及びカルボキシル基からなる群から選択された少なくとも1種の荷電基を有する請求項12記載の生体分子用標識色素。
- 上記ペプチドリンカーが、システイン酸、2-アミノ-3-スルホサルファニルプロパン酸、2-アミノ-3-スルホキシプロパン酸、チロシン、スレオニン、4-アミノ-2-ヒドロキシブタン酸、ホモセリン及びセリンからなる群から選択された少なくとも1種のアミノ酸を含む請求項15記載の生体分子用標識色素。
- 蛍光測定による生体分子の検出に用いる生体分子用標識キットであって、有機EL色素から成る発色部と、生体分子を結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有する標識色素を含む生体分子用標識キット。
- 蛍光測定による生体分子の検出に用いる生体分子用標識キットであって、少なくとも、有機EL色素から成る発色部と、該発色部に結合するスペーサー部であって、-CH2-、-NHCOO-、-CONH-、-CH2NH-、-CH2NR-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-(Rはアルキル基)、-(CH2-CH2-O)n-(nは1から10の整数)、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択される官能基を少なくとも1種含むスペーサー部とを有する標識色素前駆体、を含む生体分子用標識キット。
- さらに、カルボン酸基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基から選択されたいずれか1種の反応性基を標識色素に導入するための反応性基導入試薬を含む請求項17又は18に記載の生体分子用標識キット。
- 有機EL色素から成る発色部と、生体分子を結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有する標識色素を、生体分子試料と反応させ、該標識色素により標識された生体分子試料の蛍光を測定する生体分子の検出方法。
- 上記生体分子試料に、核酸、タンパク質、ペプチド類、そして糖類からなる群から選択されたいずれか1種を用いる請求項20記載の検出方法。
- 有機EL色素から成る発色部と、生体分子を結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有する標識色素で標識されたプローブと、生体分子試料とを反応させ、該生体分子試料の蛍光を測定する検出方法。
- 上記生体分子試料が核酸であり、上記プローブには該核酸の塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチド又はPNAを用いる請求項22記載の検出方法。
- 上記オリゴヌクレオチドがプライマー又はターミネータであり、上記核酸を増幅させて蛍光を測定する請求項23記載の検出方法。
- 上記核酸の増幅に先立ってプライマーを有機EL色素で標識する請求項24記載の検出方法。
- 上記オリゴヌクレオチド又はPNAがモレキュラービーコンである請求項23記載の検出方法。
- 生体分子から成る被検体又は修飾物質により修飾された該被検体の検出方法であって、被検体に特異結合する結合物質又は修飾物質に特異結合する結合物質の一方を、有機EL色素から成る発色部と、生体分子を結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有する標識色素で標識し、標識された結合物質からの蛍光を測定する生体分子の検出方法。
- 上記の被検体又は修飾物質と上記結合物質との組み合わせが、抗原−抗体、ハプテン−抗ハプテン抗体、ビオチン−アビジン、Tag−抗Tag抗体、レクチン−糖タンパク質又はホルモン−受容体である請求項27記載の検出方法。
- 生体分子試料を電気泳動によりサイズ分離する工程を含み、該電気泳動に先立ってあるいは該電気泳動後に生体分子試料を、有機EL色素から成る発色部と、生体分子を結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有する標識色素で標識する生体分子の検出方法。
- 上記生体分子試料が核酸であり、電気泳動画像に基づいて該核酸の塩基配列を決定する請求項29記載の検出方法。
- 上記生体分子試料がタンパク質であり、電気泳動画像に基づいて取り出したタンパク質を質量分析する請求項29記載の検出方法。
- 組織又は細胞試料中の生体分子を、有機EL色素から成る発色部と、生体分子を結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有する標識色素で標識する組織又は細胞の染色方法。
- 上記生体分子が核酸又はタンパク質である請求項32記載の染色方法。
- 組織又は細胞試料の染色に用いる染色色素であって、有機EL色素から成る発色部と、組織又は細胞中の生体分子と結合する結合部と、発色部と結合部とを連結するスペーサー部とを有する標識色素から成る染色色素。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007526917A JP5638734B2 (ja) | 2005-07-28 | 2006-07-28 | 生体分子用標識色素及び標識キット並びに生体分子の検出方法 |
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005219218 | 2005-07-28 | ||
JP2005219218 | 2005-07-28 | ||
JP2006025658 | 2006-02-02 | ||
JP2006025658 | 2006-02-02 | ||
PCT/JP2006/315008 WO2007013601A1 (ja) | 2005-07-28 | 2006-07-28 | 生体分子用標識色素及び標識キット並びに生体分子の検出方法 |
JP2007526917A JP5638734B2 (ja) | 2005-07-28 | 2006-07-28 | 生体分子用標識色素及び標識キット並びに生体分子の検出方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2007013601A1 true JPWO2007013601A1 (ja) | 2009-02-12 |
JP5638734B2 JP5638734B2 (ja) | 2014-12-10 |
Family
ID=37683488
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007526917A Active JP5638734B2 (ja) | 2005-07-28 | 2006-07-28 | 生体分子用標識色素及び標識キット並びに生体分子の検出方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8304259B2 (ja) |
EP (1) | EP1932888A4 (ja) |
JP (1) | JP5638734B2 (ja) |
KR (1) | KR101427354B1 (ja) |
CN (1) | CN101273096B (ja) |
WO (1) | WO2007013601A1 (ja) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009016718A1 (ja) * | 2007-07-30 | 2009-02-05 | Shinichiro Isobe | 診断薬及びそれを用いた診断方法 |
JP5145511B2 (ja) * | 2007-12-29 | 2013-02-20 | 株式会社シノテスト | 試料中の金属の測定方法 |
EP2265645A4 (en) * | 2008-03-13 | 2011-03-23 | Perkinelmer Health Sci Inc | ENZYMATIC SUBSTRATES FOR MULTIPLE DETECTION SYSTEMS |
EP2357469A1 (en) * | 2008-12-02 | 2011-08-17 | Japan Science and Technology Agency | Novel clear native electrophoresis method utilizing aromatic sulfonic acid compound |
CN102504572A (zh) * | 2011-10-18 | 2012-06-20 | 江苏南通维立科化工有限公司 | 一种日落黄色素半抗原与人工抗原的合成方法 |
JP5882834B2 (ja) * | 2012-06-06 | 2016-03-09 | 日本電信電話株式会社 | 生体分子検出素子および生体分子検出素子の製造方法 |
US20140274798A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Compounds and methods relating to lysosomal storage disorders |
US10241111B2 (en) | 2016-10-21 | 2019-03-26 | AhuraTech LLC | Electroluminescent binding assays |
US10159136B2 (en) | 2016-10-21 | 2018-12-18 | AhuraTech LLC | System and method for producing light in a liquid media |
WO2020172197A1 (en) * | 2019-02-19 | 2020-08-27 | Ultima Genomics, Inc. | Linkers and methods for optical detection and sequencing |
US11807851B1 (en) | 2020-02-18 | 2023-11-07 | Ultima Genomics, Inc. | Modified polynucleotides and uses thereof |
CN116419767A (zh) * | 2020-08-18 | 2023-07-11 | 阿尔缇玛基因组学公司 | 用于标记生物分子的试剂 |
WO2023164003A2 (en) * | 2022-02-23 | 2023-08-31 | Ultima Genomics, Inc. | Reagents for labeling biomolecules and uses thereof |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2172248C (en) * | 1993-09-22 | 2003-12-30 | John Kenten | Self-sustained sequence replication electrochemiluminescent nucleic acid assay |
JP2001288197A (ja) | 2000-04-10 | 2001-10-16 | Fuji Photo Film Co Ltd | 蛍光ヌクレオチド |
FR2839364B1 (fr) * | 2002-05-03 | 2004-12-24 | Commissariat Energie Atomique | Procede de detection d'une reconnaissance molecukaire par electrochimiluminescence |
JP2004187563A (ja) | 2002-12-10 | 2004-07-08 | Peptide Door Co Ltd | IgGに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示したファージを用いたIgGの検出方法 |
EP1712911B1 (en) | 2003-12-24 | 2011-08-17 | Shinichiro Isobe | Method for detecting biomolecule, labeling dye used therefor, and labeling kit |
CA2551723C (en) | 2003-12-24 | 2012-01-03 | Shinichiro Isobe | Single-layer organic electroluminescent device |
JP3881667B2 (ja) * | 2003-12-24 | 2007-02-14 | 信一郎 礒部 | 生体分子の検出方法及びそれに用いる標識色素並びに標識キット |
JPWO2006030788A1 (ja) | 2004-09-14 | 2008-05-15 | 信一郎 礒部 | インターカレータ及びそれを用いた遺伝子検出方法 |
JP2006180835A (ja) | 2004-12-28 | 2006-07-13 | Shinichiro Isobe | 遺伝子検出方法 |
JP2006234772A (ja) | 2005-02-28 | 2006-09-07 | Shinichiro Isobe | タンパク質の検出方法及びそれに用いる蛍光色素 |
-
2006
- 2006-07-28 WO PCT/JP2006/315008 patent/WO2007013601A1/ja active Application Filing
- 2006-07-28 JP JP2007526917A patent/JP5638734B2/ja active Active
- 2006-07-28 CN CN200680035218.4A patent/CN101273096B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2006-07-28 KR KR1020087004688A patent/KR101427354B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2006-07-28 EP EP06781918A patent/EP1932888A4/en not_active Withdrawn
- 2006-07-28 US US11/989,410 patent/US8304259B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1932888A1 (en) | 2008-06-18 |
CN101273096B (zh) | 2014-08-13 |
JP5638734B2 (ja) | 2014-12-10 |
KR101427354B1 (ko) | 2014-08-07 |
US8304259B2 (en) | 2012-11-06 |
CN101273096A (zh) | 2008-09-24 |
US20110195408A1 (en) | 2011-08-11 |
KR20080038183A (ko) | 2008-05-02 |
WO2007013601A1 (ja) | 2007-02-01 |
EP1932888A4 (en) | 2010-01-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5638734B2 (ja) | 生体分子用標識色素及び標識キット並びに生体分子の検出方法 | |
JP4801445B2 (ja) | 生体分子の検出方法及びそれに用いる標識色素並びに標識キット | |
Hüsken et al. | “Four-potential” ferrocene labeling of PNA oligomers via click chemistry | |
JP3881667B2 (ja) | 生体分子の検出方法及びそれに用いる標識色素並びに標識キット | |
JP5881624B2 (ja) | 蛍光色素 | |
JP5539635B2 (ja) | 蛍光色素 | |
JP5503836B2 (ja) | 蛍光色素及びその製造方法 | |
JP4860352B2 (ja) | 診断薬及びそれを用いた測定方法 | |
EP3137898A2 (en) | Fluorescent molecular sensor for targeting changes in protein surfaces, and methods of use thereof | |
Clavé et al. | A universal and ready-to-use heterotrifunctional cross-linking reagent for facile synthetic access to sophisticated bioconjugates | |
JP5189096B2 (ja) | 診断薬及びそれを用いた測定方法 | |
JP5244596B2 (ja) | タンパク質の検出方法及びそれに用いる蛍光色素 | |
JP5539920B2 (ja) | 診断薬及びそれを用いた測定方法 | |
JP2016196608A (ja) | 蛍光色素 | |
JP7045752B2 (ja) | 蛍光色素 | |
JP2019048908A (ja) | 蛍光色素 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090702 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120522 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120719 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130115 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130315 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130910 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140617 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140620 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140924 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20141023 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5638734 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |