CN106470980B - 靛红酸酐衍生物及其应用 - Google Patents

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Abstract

具有包含季铵基团的N‑取代基的靛红酸酐衍生物对于标记靶材料和/或使靶材料官能化和/或对于将材料偶联在一起是有用的。本公开内容的靛红酸酐衍生物可以有利地是水溶性的、容易地制备且纯化的。在本公开内容中有用的靛红酸酐衍生物优选地具有至少一种化学反应性基团或至少一种结合基团或至少一种可检测的标记物。还公开了由靛红酸酐衍生物制备或以其他方式制备的邻氨基苯甲酸酯衍生物和包含靛红酸酐衍生物的试剂盒。

Description

靛红酸酐衍生物及其应用
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年4月24日提交的美国临时申请第61/983,900号的权益，其全部公开内容据此通过引用并入本文。
技术领域
本公开内容涉及具有包含季铵基团的N-取代基的靛红酸酐衍生物和相关的邻氨基苯甲酸酯衍生物以及此类衍生物用于化学偶联和用于使材料的表面改性的用途。
背景
常常合意的是，使化合物偶联至另一种化合物或材料，用于包括标记靶化合物或材料和/或使靶化合物或材料官能化的多种应用。此类偶联工艺可以被用于使小分子和/或大分子偶联在一起。例如，碳二亚胺偶联方案例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(硫代-NHS)可以被用于使分别包含羧基或氨基的两个独特的大分子偶联。
靛红酸酐(还被称为2H-3,1-苯并噁嗪-2,4(1H)-二酮)及其衍生物通常被用作有机合成中的中间体。然而，它们还已经在偶联反应中被使用并且被用于使材料改性。例如，WO2012076794A1和美国专利申请公布20130253179公开了偶联的靛红酸酐或其衍生物以使核糖核酸(RNA)关于RNA的某些核糖部分官能化。WO2007145940公开了通过用N-甲基靛红酸酐标记分子来分析RNA分子的结构。美国专利第3,346,327号和第2,150,968号公开了使用靛红酸酐和其衍生物用于使羊毛和纤维素改性。
然而，某些偶联方案要求使用昂贵的试剂和/或导致形成必须从期望的反应产物中除去的不期望的副产物。此外，某些偶联反应可以是缓慢的和/或难以监测且实时定量。另外，包括靛红酸酐及其衍生物的许多偶联方案使用通常是较不合意的无水反应介质。
因此，对于可以被用于标记靶化合物或材料和/或使靶化合物或材料官能化和/或使化合物或材料偶联在一起的化合物存在持续的需求。
本公开内容的概述
本公开内容的优点包括具有包含季铵基团的N-取代基的靛红酸酐衍生物和相关的邻氨基苯甲酸酯衍生物。靛红酸酐衍生物和邻氨基苯甲酸酯衍生物可以被用于包括标记靶材料和/或使靶材料官能化和/或用于使材料偶联在一起的多种应用。
这些优点和其他优点通过具有包含季铵基团的N-取代基的靛红酸酐衍生物至少部分地被满足。此类靛红酸酐衍生物可以具有以下的式：
其中V、W、Y和Z独立地代表H、N3、NO2、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、支链的或直链的烷基、支链的或直链的烯基、支链的或直链的炔基、支链的或直链的烷氧基、甲酰基、乙酰基、或卤素；L1代表连接基；R3和R4独立地代表直链的或支链的烷基、烷基醚，或一起形成环杂烷基、或环杂芳基；Q-代表阴离子；p是从0至2的整数；当p是0时，L2代表有机侧基(pendantorgano group)；当p大于0时，L2代表第二独立的连接基；R1代表化学反应性基团、结合基团或可检测的标记物。
本公开内容的靛红酸酐衍生物的实施方案单独地或组合地包括以下的特征。例如，当p是1时，L2是连接基并且R1可以是化学反应性基团例如叠氮化物、炔、被保护的硫醇、包含二硫化物部分的基团、烯烃、芳基烯马来酰亚胺、缩醛、醛、酮、缩酮、腙、环氧化物、N-羟基琥珀酰亚胺酯、(硫代)N-羟基琥珀酰亚胺酯基、硫酯、硼酸、硼酸酯、或三烷氧基甲硅烷基；其中V和Z可以是H并且W和Y可以独立地代表H、N3、NO2、NH2、NHR5、NR5R5、C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、-CHO或缩醛；R3和R4可以独立地代表C1-6烷基或一起形成5-6元环杂环；R5可以代表C1-8脂肪族基团；Q-可以是卤素阴离子例如Cl-、Br-或I-；L1可以是二基(di-radical)C1-60有机基；当p大于零时，L2代表二基C1-60有机基并且当p是零时，L2代表C1-60有机侧基。可选择地，L1和L2可以独立地代表R5、Ar、R5-Ar、Ar-R5、R5-Ar-R5、-(CH2)n-、-(R5O)m-(CH2)n-、-(CH2)n–(R5O)m-R5、-(CH2)n–(OR5)m-R5，其沿着主链具有或不具有杂原子，和-(CH2)n–(OR5)m-XR5、以及-(CH2)n1–(OR5)m1-HA-(CH2)n2–(OR5)m2-R5，其中R5代表C1-8脂肪族基团；Ar代表二基芳基；n、n1和n2独立地代表1至30的整数；m、m1和m2独立地代表0至30的整数；HA代表杂原子的基团例如-CO-、-C(O)X-、-XC(O)-、-X-、-S-、-S(O)-、-XS(O)2-、-S(O)2X-；并且X代表O、S、NH、或NR5，条件是如果X是-NH-，那么仲胺大体上不与靛红酸酐衍生物的酸酐反应。
本公开内容的靛红酸酐衍生物可以由其片段容易地被制备并且提供用于制备该衍生物的方法。
本公开内容的另一方面包括一种使材料改性的方法，该方法通过使本公开内容的靛红酸酐衍生物与材料组合以形成(i)靛红酸酐衍生物，其包含通过R1偶联的材料，具有式(II)的结构，或(ii)邻氨基苯甲酸酯衍生物，其具有通过靛红酸酐衍生物的酸酐偶联的材料，具有式(III)的结构：
变量V、W、Y、Z、L1、L2、Q-、R3、R4、p和R1代表如用于上文式(I)的衍生物所描述的相同的取代基，包括各个变量中的每个的全部各种组合和子组合。M代表材料并且R'1代表由R1和材料(M)的反应或相互作用形成的基团。对于本公开内容有用的材料包括例如生物材料、聚合物、官能化的材料、玻璃、陶瓷、塑料、木材、纺织品、羊毛、纸、纤维素、金属、金属合金等等。材料可以呈微米颗粒或纳米颗粒的尺寸并且呈平板(flat sheet)、球体、棒等等的形状。
本公开内容的另一方面包括根据式(III)的邻氨基苯甲酸酯衍生物：
变量V、W、Y、Z、L1、L2、Q-、R3、R4、p、R1、M和Xa代表如上文所描述的相同的取代基，包括各个变量中的每个的全部各种组合和子组合。
在某些实施方案中，式(III)的邻氨基苯甲酸酯包括作为材料的生物材料，例如其中在式(III)中的M代表“Bio”。此类生物材料包括例如RNA、RNA适配体、及其官能化的衍生物(例如Olaptesed pegol(NOX-A12)和Emapticap pegol(NOX-E36),Noxxon Pharma)、DNA、DNA适配体、及其官能化的衍生物(例如抗核仁素适配体AS1411)、蛋白质(例如，链霉亲和素、中性抗生物素蛋白(Neutravidin)、抗生物素蛋白)、肽(例如，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)、环状-RGD等等)、肽模拟物(例如，αvβ3拮抗剂S247等等)、酶(例如，Elspar(门冬酰胺酶))、肽适配体、抗体(Ab)(例如，(曲妥单抗)、(贝伐单抗)、(西妥昔单抗)等等)、抗体片段(例如，抗原结合片段(Fab)例如(雷尼单抗)、单链可变片段(scFv)以及第三代3G分子)、糖(葡萄糖、葡萄糖胺等等)、淀粉等等。
本公开内容的另一方面包括具有多官能度的邻氨基苯甲酸酯，例如，其中在式(III)中的M代表L3-R”1。此类邻氨基苯甲酸酯可以具有以下的式：
变量V、W、Y、Z、L1、L2、Q-、R3、R4、p和R1代表如用于本文中的式(I)的衍生物所描述的相同的取代基，包括各个变量中的每个的全部各种组合和子组合。例如，HXa代表NH2基团、NHR5基团、SH基团、或OH基团，并且L3和R”1分别代表如用于本文中的式(I)的L1和R1所描述的相同的基团，包括各个变量中的每个的全部各种组合和子组合。
本公开内容的邻氨基苯甲酸酯衍生物可以由其片段容易地被制备并且提供用于制备该衍生物的方法。
本公开内容的另一方面包括一种试剂盒，包含至少第一靛红酸酐衍生物，所述第一靛红酸酐衍生物具有包含季铵基团的N-取代基。在某些实施方案中，靛红酸酐衍生物具有至少一种化学反应性基团或至少一种结合基团。在其他实施方案中，试剂盒包含第二靛红酸酐衍生物，所述第二靛红酸酐衍生物具有包含季铵基团的N-取代基，其中第一靛红酸酐衍生物包含第一化学反应性基团，并且第二靛红酸酐衍生物包含第二化学反应性基团，所述第二化学反应性基团能够与第一靛红酸酐衍生物的第一化学反应性基团化学地反应以使第一靛红酸酐衍生物和第二靛红酸酐衍生物偶联。
本发明的另外的优点依据以下详述对于本领域技术人员将容易地变得是明显的，其中简易地通过说明实施本发明所预期的最优模式的方式，仅示出和描述本发明的优选实施方案。如将被认识到的，本发明能够具有其他和不同的实施方案，并且本发明的若干细节能够在各种明显的方面具有修改，而全部不背离本发明。因此，附图和描述被认为本质上是说明性的，并且不认为是限制性的。
附图简述
对附图作出参考，其中具有相同参考数字指定的要素自始至终代表类似的要素并且在附图中：
图1是用本公开内容的靛红酸酐衍生物使基底的表面例如玻璃表面改性的图示。
图2图示了通过本公开内容的靛红酸酐衍生物将生物材料偶联至放射性标记物。
图3图示了两步偶联反应，其中本公开内容的靛红酸酐衍生物被用于使两种材料彼此偶联。
图4是示出用本公开内容的靛红酸酐衍生物标记的牛血清白蛋白的相对荧光随时间的图表。
图5是示出缓冲液、未标记的DNA适配体以及用本公开内容的靛红酸酐衍生物通过DNA上的氨基引物标记的DNA适配体的相对荧光的图表。
图6图示了用于用本公开内容的靛红酸酐衍生物标记牛血清白蛋白和胰岛素且使牛血清白蛋白和胰岛素轭合的方案。
图7是示出未标记的试剂和用本公开内容的靛红酸酐衍生物标记的牛血清白蛋白和胰岛素的相对荧光的图表。
图8是示出在1,3-双极性环加成之后的轭合的牛血清白蛋白的相对荧光的图表。
图9是示出用本公开内容的靛红酸酐衍生物轭合的氨基官能化的纳米颗粒的相对荧光的图表。
本公开内容的详述
本公开内容涉及具有包含季铵基团的N-取代基的靛红酸酐衍生物和相关的邻氨基苯甲酸酯衍生物。这些衍生物对于标记靶材料和/或使靶材料官能化和/或对于使材料偶联在一起是有用的。本公开内容的靛红酸酐衍生物可以有利地是水溶性的。靛红酸酐衍生物的水溶性通过化合物上的季铵基团来促进。当靛红酸酐衍生物在含水介质中偶联时，水溶性可以是有利的，所述含水介质对于最生物化学是优选的介质。另外，本公开内容的靛红酸酐衍生物的某些从常用商业起始试剂被容易地制备或衍生并且由于在常用有机溶剂中的高极性和低溶解度可以从非含水反应介质中容易地被分离。此外，提供了与靛红酸酐衍生物相关的邻氨基苯甲酸酯以及其用途。
目前有用的靛红酸酐衍生物可以具有以下的式：
变量V、W、Y和Z独立地代表H；N3(叠氮基)；NO2(硝基)；氨基；烷基氨基；二烷基氨基；支链的或直链的烷基，例如C1-8烷基例如甲基、乙基、丙基、异丙基；支链的或直链的烯基，例如C1-8烯基例如乙烯基；支链的或直链的炔基，例如C1-8炔基例如乙炔基(-C≡CH)；支链的或直链的烷氧基例如甲氧基、乙氧基；甲酰基(–CHO)、乙酰基(-COR5)、卤素例如氟、氯、溴、碘。R5代表可以是直链的、支链的、无环的、环状的、饱和的或不饱和的C1-8脂肪族基团。本文脂肪族基团包括直链的、支链的、无环的、环状的、饱和的或不饱和的。L1代表连接基，例如两个氮原子之间的二基有机基团(di-radical organo group)。R3和R4独立地代表直链的或支链的烷基，例如C1-8烷基例如甲基、乙基、正丙基、正丁基等等；烷基醚；或一起形成环杂烷基例如吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基；或环杂芳基例如吡啶基、咪唑基等等。Q-代表阴离子例如卤离子例如氟阴离子、氯阴离子、溴阴离子、或碘阴离子、磺酸盐阴离子、硫酸盐阴离子、或羧酸盐阴离子。变量p是从0至2的整数，例如，p可以是0、1、或2。当p是0时，靛红酸酐衍生物不包括R1基团并且L2代表在季氨氮上的有机侧基。当p大于0时，R1是存在的并且L2代表第二独立的连接基例如在季氮和一个或更多个R1基团之间的二基有机基团。当p是2时，在靛红酸酐衍生物上存在两个R1基团，所述R1基团可以是相同的或不同的。
作为连接基，L1和L2独立地代表二基有机基团，例如二基C1-60有机基，所述二基有机基团可以是脂肪族的或芳香族的或包括两者的元素。二基有机基团可以包括沿着主链的和/或取代基的杂原子。作为侧基，L2代表有机侧基例如C1-60有机侧基，所述有机侧基可以是脂肪族的或芳香族的或包括两者的元素。侧基可以包括沿着主链的和/或取代基的杂原子。沿着连接基二基有机基团或有机侧基的主链的杂原子(HA)可以包括以下中的一种或更多种：-CO-、-C(O)X-、-XC(O)-、-X-、-S-、-S(O)-、-XS(O)2-、-S(O)2X-，其中X是O、S、NH或NR5，条件是如果X是-NH-，那么仲胺大体上不与靛红酸酐衍生物的酸酐反应。即，仲胺不是碱性的，是由于其具有吸电子取代基例如芳基或被二硝基苯基取代的仲胺。具有沿着主链的杂原子的二基有机基团或有机侧基包括聚醚类，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚四亚甲基氧化物(poly(tetramethylene oxide))(还被称为聚四氢呋喃)、聚酯类、聚酰胺类、乙基噁唑啉类，等等。此外，L1和L2的二基有机基团或有机侧基可以独立地包括主链上或主链外的取代基，例如烷基、芳基、烷氧基、硫醚、酰胺、卤素，等等。
如果存在，那么R1代表化学反应性基团、结合剂、或可检测的标记物。例如，R1可以是化学反应性基团例如叠氮化物、炔、被保护的硫醇、包含二硫化物部分的基团例如二硫吡啶基、烯烃、芳基烯例如苯乙烯基团、马来酰亚胺、缩醛、醛、酮、缩酮、腙、环氧化物、N-羟基琥珀酰亚胺酯、(硫代)N-羟基琥珀酰亚胺酯基、硫酯、硼酸(B(OH)2)基、硼酸酯(例如，B(OR6)2基)、三烷氧基甲硅烷基(例如，Si(OR7)3基团)，其中每个R6可以是相同的或不同的并且代表直链的或支链的烷基，例如C1-8烷基例如甲基、乙基、正丙基、正丁基等等，或芳基或杂芳基，或一起形成环烷基例如(-CH2CH2-)、或环杂烷基例如CH3N(CH2CH2-)2、O(CH2CH2-)2，环芳基或环杂芳基；并且其中每个R7可以是相同的或不同的并且代表直链的或支链的烷基，例如C1-8烷基例如甲基、乙基、正丙基、正丁基等等；或R1可以是结合基团例如生物素基团或半抗原例如2,4-二硝基苯基；或R1可以是可检测的标记物例如染料、荧光团或放射性标记物。在本公开内容中有用的靛红酸酐衍生物优选地具有至少一种化学反应性基团或至少一种结合基团或至少一种可检测的标记物。
在本公开内容的一方面中，V、W、Y和Z独立地代表氢、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硝基、叠氮基、C1-6烷基、烯基或炔基、甲酰基、或缩醛。在实施方案中，V和Z是H并且W和Y独立地代表H、N3、NO2、NH2、NHR5、NR5R5、C1-6烷基、C1-6烯基例如-CH＝CH2、C1-6炔基例如-C≡CH、-CHO或缩醛。在另一个实施方案中，V、Y和Z可以是H并且W可以是H、N3、NO2、NH2、NHR5、NR5R5、C1-6烷基、C1-6烯基例如-CH＝CH2、C1-6炔基例如-C≡CH、-CHO或缩醛。R3和R4独立地代表C1-6烷基或一起形成5-6元环杂环例如吡咯烷基。Q-代表卤离子。L1代表二基C1-30有机基例如二基C1-20有机基，L1可以是脂肪族的或芳香族的或包括两者的元素并且其可以包括沿着主链的和/或取代基的杂原子，如上文所描述的。L2代表C1-30有机基，例如C1-20有机基，L2可以是脂肪族的或芳香族的或包括两者的元素并且其可以包括沿着主链的和/或取代基的杂原子，如上文所描述的。当p是0时，L2是二基C1-30有机基例如二基C1-20有机基并且当p是1时，L2是C1-30有机侧基例如C1-20有机侧基。在实施方案中，L1和L2独立地代表C1-30烷基、芳基、C2-30醚、聚醚、或其某些组合并且还可以包括以下中的一种或更多种或不包括以下：酯类、酰胺类、季胺类、沿着主链或其上的侧基的芳基和杂芳基，例如，L1和L2独立地代表R5、Ar、R5-Ar、Ar-R5、R5-Ar-R5、-(CH2)n-、-(R5O)m-(CH2)n-、-(CH2)n-(R5O)m-R5、-(CH2)n-(OR5)m-R5，其沿着主链具有或不具有杂原子，以及-(CH2)n-(OR5)m-XR5、和-(CH2)n1-(OR5)m1-HA-(CH2)n2-(OR5)m2-R5，其中X、R5和杂原子(HA)是如上文所定义的；Ar代表二基芳基例如亚苯基；n、n1和n2独立地代表1至30、例如1至8并且优选地1至6的整数；m、m1和m2独立地代表0至30、例如0至8并且优选地0至6的整数。
具有包含季铵基团的N-取代基的靛红酸酐衍生物的另外的实例在下面表1中被提供。
表1
对于表1中的化合物和式的V、W、Y、Z、Q-和R5的变量是如较前面所定义的。变量n代表1至30、例如1至8并且优选地1至6的整数并且m代表0至30、例如0至8并且优选地0至6的整数。在实施方案中，表1中的式4、式5、式7或式8具有R3和R4，R3和R4独立地代表C1-6烷基或一起形成5-6元环杂环，例如吡咯烷基；并且L1和L2独立地代表-R5-、-(CH2)n-、-(R5O)m-(CH2)n-、-(CH2)n–(R5O)m-R5-、-(CH2)n-(OR5)m-R5-，其沿着主链具有或不具有杂原子，以及-(CH2)n-(OR5)m-XR5-、-(CH2)n1-(OR5)m1-HA-(CH2)n2-(OR5)m2-R5-，其中X、R5和杂原子(HA)是如上文所定义的；n、n1和n2独立地代表1至30、例如1至8并且优选地1至6的整数；m、m1和m2独立地代表0至30、例如0至8并且优选地0至6的整数。表1中的化合物和式的另外的实施方案独立地或以任何组合的方式包括，其中V和Z是H并且W和Y独立地代表H、N3或NO2，或其中V、Y、Z各自代表H并且W代表H、N3、或NO2；Q-代表卤离子，例如Cl-、Br-或I-。
本公开内容的靛红酸酐衍生物可以从常用起始材料被容易地制备。例如，本公开内容的靛红酸酐衍生物一般可以根据下文示出的方案1或方案2来制备。
方案1
方案2
如在方案1中所示出的，靛红酸酐衍生物可以通过使靛红酸酐胺与Q-L2-(R1)p化合物反应来制备。可选择地，并且如在方案2中所示出的，靛红酸酐衍生物可以通过使Q-取代的靛红酸酐与胺化合物反应来制备。在方案1和方案2中所示出的程序提供用于制备本公开内容的靛红酸酐衍生物的多样化工艺。
在本公开内容的一个实施方案中，V、W、Y、Z是H，L1是-(CH2)2-，R3和R4是甲基，p是1并且靛红酸酐衍生物可以根据以下程序来制备。
方法A
方法A可以通过使等摩尔量的A1和QL2R1在反应烧瓶中混合来进行。可以将充足的溶剂例如丙酮添加至反应烧瓶以刚好溶解两种反应物。烧瓶可以被加盖并且将混合物加温至约40-45℃以促进反应。通过此方法A制备的许多靛红酸酐衍生物产生结晶化合物，该结晶化合物可以被过滤以除去溶剂和未反应的起始材料。通过此方法A制备的靛红酸酐衍生物还可以被促进以通过添加非溶剂例如二乙醚形成结晶化合物。非结晶衍生物可以通过色谱法来纯化。迟缓的反应可以使用不同的溶剂，例如2-丁酮，并且反应混合物加温至约60℃。另外，可以添加催化量的NaI以使反应加速。在丙酮中可溶的产物可以通过柱色谱法来纯化。例如，以下靛红酸酐衍生物A2可以使用方法A由以下容易地可用的或容易地可衍生的起始材料来制备和化合物A1来制备。
表2
在本公开内容的另一个实施方案中，V、W、Y、Z是H，L1是-(CH2)3-，p是1并且靛红酸酐衍生物可以根据以下程序来制备。
方法B
方法B可以通过使等摩尔量的B1和(CH3)2NL2R1在反应烧瓶中混合来进行。可以将充足的溶剂例如丙酮添加至反应烧瓶以刚好溶解两种反应物。烧瓶可以被加盖并且将混合物加温至约40-45℃以促进反应。通过此方法B制备的许多靛红酸酐衍生物产生结晶化合物，该结晶化合物可以被过滤以除去溶剂和未反应的起始材料。通过此方法B制备的靛红酸酐衍生物还可以被促进以通过添加非溶剂例如二乙醚形成结晶化合物。非结晶衍生物可以通过色谱法来纯化。迟缓的反应可以使用不同的溶剂例如2-丁酮，并且反应混合物加温至约60℃。在丙酮中可溶的产物可以通过柱色谱法来纯化。例如，以下靛红酸酐衍生物B2可以使用方法B由以下容易地可用的或容易地可衍生的起始材料和化合物B1来制备。
表3
包括各个表格中的那些的、本公开内容的靛红酸酐衍生物可以以与通过方法A或方法B制备的衍生物类似的方式来制备。另外，A1和B1的起始化合物可以从以下容易地可用的或容易地可衍生的起始材料分别根据如以下示出的方法C或方法D容易地被制备。
方法C
方法C可以在惰性气氛例如氮气气氛中进行。在此程序中，可以将化合物C1溶解在干燥的二甲基甲酰胺(DMF)中并且可以添加2当量的氢化钠。氢化钠的添加可以是这样的：其避免起泡。可选择地，碳酸钾可以替代氢化钠而使用。然后，可以添加胺盐酸盐(ClCH2CH2N+HR3R4Cl-)。产物可以通过将反应混合物添加至冰水并且滤去产物或通过萃取而获得。类似地，聚乙二醇化的胺盐酸盐(例如，ClCH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2N+HR3R4Cl-)可以替代胺盐酸盐(ClCH2CH2N+HR3R4Cl-)而使用。例如，以下起始靛红酸酐C2可以使用方法C由以下容易地可用的或容易地可衍生的起始材料和化合物C1来制备。
表4
方法D可以在惰性气氛例如氮气气氛中进行。在此程序中，可以将化合物D1溶解在干燥的DMF中并且可以添加氢化钠。氢化钠的添加可以是这样的：其避免起泡。然后，可以添加氯碘化合物(CL-L1-I)。当反应是完全的时，DMF可以在加热和真空下从反应混合物被除去，在DMF的加热和除去期间，碘化物交换氯化物。可以将残余物悬浮/溶解在THF中。产物可以通过将浆料添加至冰水并且滤去固体产物或通过将液体产物萃取到有机相中而获得。
方法D
例如，以下起始靛红酸酐D2可以使用方法D由以下容易地可用的或容易地可衍生的起始材料和化合物D1来制备。
表5
本公开内容的靛红酸酐衍生物可以被用于多种应用。在本公开内容的一方面中，具有包含季铵基团的N-取代基并且还具有至少一种反应性基团或至少一种结合基团的靛红酸酐衍生物可以被用于使材料改性。即，本公开内容的靛红酸酐衍生物可以被用于标记靶材料和/或使靶材料官能化和/或使材料偶联在一起。
在一方面中，本公开内容的靛红酸酐衍生物可以与材料组合以形成(i)靛红酸酐衍生物，其包含通过R1偶联的材料，具有式(II)的结构，或(ii)邻氨基苯甲酸酯衍生物，其具有通过有靛红酸酐衍生物的酸酐偶联的材料，具有如以下示出的式(III)的结构：
变量V、W、Y、Z、L1、L2、Q-、R3、R4、p和R1代表如用于上文式(I)的衍生物所描述的相同的取代基，包括各个变量中的每个的全部各种组合和子组合。M代表材料并且R'1代表由R1和材料(M)的反应或相互作用形成的基团。例如，当R1是化学反应性基团时，M可以具有互补的化学反应性基团并且R'1代表从如例如下文表8中那里示出的偶联的产物。可选择地，R'1可以代表R1的结合基团与材料的相互作用。在某些情况下，酸酐官能团和R1两者均可以与胺反应。为了区分两个可能的反应位点，芳基环上的反应性取代基(V、W、Y、Z)可以变化以增大或降低酸酐的反应性。
靛红衍生物的酸酐和R1朝向给定材料的相对反应性可以主要地通过选择合适的R1基团来调整。此外，芳基环上的基团(V、W、Y、Z)和用于R3、R4和连接基L2的基团可以被选择以影响靛红衍生物的酸酐和R1的相对反应性。例如，相对于R1，使V为体积大的烷基将减缓在酸酐部分处的反应速率。可选择地，相对于R1，使W、Y和Z为吸电子的将增大在酸酐处的反应速率。
除了能够调节分子的酸酐部分的反应速率，芳香族取代基(V、W、Y、Z)还可以包括化学反应性基团例如叠氮基，所述化学反应性基团将本公开内容的靛红酸酐衍生物从双官能的试剂(酸酐和化学反应性R1)改变成多官能的试剂(酸酐、化学反应性R1以及一种或更多种反应性V、W、Y和/或Z)。例如，下文的靛红酸酐衍生物57可以与生物材料中的氨基通过酸酐反应以形成具有进入到生物分子中的马来酰亚胺和叠氮化物的双官能度的邻氨基苯甲酸酯。
此类多官能试剂从而允许选择将生物材料连接至两种另外的材料。在上文实例的情况下，邻氨基苯甲酸可以使包含硫醇的材料偶联以与马来酰亚胺反应并且使包含炔的另一种材料偶联以通过1,3-双极性叠氮化合物/炔环加成与叠氮化物反应。此多化合价对于至材料表面例如生物分子的添加是有价值的贡献。
本公开内容的方面包括通过使靛红酸酐衍生物与具有可以与靛红酸酐衍生物的R1化学反应的基团组合而使材料改性。靛红衍生物的酸酐和R1朝向给定材料的相对反应性可以主要地通过选择合适的R1基团来调整。芳基环上的基团(V、W、Y、Z)和用于R3、R4和连接基L2的基团可以被选择以影响靛红衍生物的酸酐和R1的相对反应性。在本公开内容的一个实施方案中，该方法包括使具有作为化学反应性R1基团的NHS酯或硫酯的靛红酸酐衍生物和具有与R1反应的伯胺的材料组合以得到式(II)的衍生物。
本公开内容的另一方面包括通过使本公开内容的靛红酸酐衍生物与可以与靛红酸酐衍生物的酸酐化学反应的材料组合而使材料改性。方案3图示使本公开内容的靛红酸酐衍生物与材料组合的实施方案。
方案3
如在此方案3中所示出的，式(I)的靛红酸酐衍生物可以与具有亲核基团HXa的材料(M)组合，其中HXa代表例如NH2基团、NHR5基团、SH基团、或OH基团，以随着二氧化碳的释放而形成具有式(III)的邻氨基苯甲酸酯。即，式(I)的靛红酸酐衍生物可以与表示为HXaM的材料轭合以形成式(III)，其中M是该材料并且Xa代表例如NH基、NR5基团、S基团、或O基团。有利地，式(III)的邻氨基苯甲酸酯是荧光剂。因此，当反应完成时，在方案3中图示的偶联反应可以提供实时荧光信号指示。
另外，由于衍生物上的季铵基团，本公开内容的靛红酸酐衍生物可以有利地是水溶性的，这允许使材料在含水介质例如水中改性，所述含水介质对于最生物化学是优选的介质。虽然水可以与如在方案3中所示出的靛红衍生物的酸酐官能团反应，但是发现本公开内容的靛红酸酐可以与材料(M)进行比与水的水解明显地更迅速的反应。因此，可以使用过量的靛红酸酐衍生物以形成高收率的式(III)的邻氨基苯甲酸酯并且任何未反应的靛红酸酐衍生物都可以在其后被水解并且容易地除去。
此外，当R1是化学反应性基团时，可以制备本公开内容的靛红酸酐衍生物以与具有亲核基团的材料(M)在比与R1的任何反应明显地更高的程度上反应。这可以通过选择R1和用于如上文解释的V、W、Y、Z的基团来进行。
例如，当V、W、Y、Z全部是H并且R1是环氧基团时，具有伯胺的材料将与靛红酸酐衍生物的酸酐几乎排他地反应。这通过用衍生物1aa(在下文实施例部分中描述的)的迅速注射NMR实验来示出。当衍生物1aa(在下文实施例部分中描述的)与在缓冲至8.4的pH的D2O中的1当量的正丁胺反应(用于在蛋白质的赖氨酸残基中的碱性胺的模型)时，示出该胺与酸酐官能团反应，而没有观察到与环氧基团的反应。但是，当R1是如在衍生物1x(在下文实施例部分中描述的)中的NHS酯时，分析示出，对于朝向正丁胺的酸酐和NHS酯两者，反应速率是类似的。因此，芳基环上的取代基(V、W、Y、Z)应当被调节以调整相对反应速率。例如，相对于NHS酯，使V为体积大的烷基将减缓在酸酐部分处的反应速率。可选择地，相对于NHS酯，使W或Y为吸电子的将增大在酸酐处的反应速率。
对于本公开内容是有用的材料包括例如生物材料(Bio)例如RNA及其官能化的衍生物、DNA及其官能化的衍生物、蛋白质、肽、肽模拟物、酶、适配体、抗体、抗体片段、药物、糖、淀粉等等。如本文所使用的，材料不限于大分子并且可以包括小分子例如药物。另外有用的材料包括聚合物例如可水解和和可生物降解的聚合物，例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己内酯(PCL)-聚乙二醇共聚物，以及可以被用于药用物质的递送和被用作诊断物。对于本公开内容是有用的材料还包括玻璃、陶瓷、塑料、木材、纺织品、羊毛、纸、纤维素、金属、金属合金等等。材料可以呈微米颗粒或纳米颗粒的尺寸并且呈平板、球体、棒的形状。纳米颗粒包括有机的、无机的或无机/有机的聚合物杂化物。例如，可以在本公开内容中使用的其他材料包括形状因素(form factor)例如16孔板或96孔板。在本公开内容中是有用的另外的材料包括具有例如其中材料可以表示为HXaL3-R”1的官能度的那些。
本公开内容的另一方面包括式(III)的邻氨基苯甲酸酯，其中材料是生物材料。此类邻氨基苯甲酸酯衍生物可以根据式(IIIA)来表示：
变量V、W、Y、Z、L1、L2、Q-、R3、R4、p、R1和Xa代表如上文所描述的相同的取代基，包括各个变量中的每个的全部各种组合和子组合并且基团“Bio”代表生物材料。
在本公开内容的一个实施方案中，式(IIIA)的邻氨基苯甲酸酯包括生物材料例如RNA、RNA适配体、及其官能化的衍生物(例如Olaptesed pegol(NOX-A12)和Emapticappegol(NOX-E36),Noxxon Pharma)、DNA、DNA适配体、及其官能化的衍生物(例如抗核仁素适配体AS1411)、蛋白质(例如，链霉亲和素、中性抗生物素蛋白(Neutravidin)、抗生物素蛋白)、肽(例如，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)、环状-RGD等等)、肽模拟物(例如，αvβ3拮抗剂S247等等)、酶(例如，Elspar(门冬酰胺酶))、肽适配体、抗体(Ab)(例如，(曲妥单抗)、(贝伐单抗)、(西妥昔单抗)等等)、抗体片段(例如抗原结合片段(Fab)例如(雷尼单抗)、单链可变片段(scFv)以及第三代3G分子)、糖(葡萄糖、葡萄糖胺等等)、淀粉等等。
例如，靛红酸酐衍生物可以被用于通过将生物素基团偶联至材料使生物材料例如RNA及其官能化的衍生物、DNA及其官能化的衍生物、蛋白质、肽、肽模拟物、酶、适配体、抗体、抗体片段、药物、糖、淀粉等等改性。即，当本公开内容的靛红酸酐衍生物包含生物素基团(例如，式(I)的R1是生物素基团)时，此类衍生物可以被用于生物材料的生物素化中。生物材料的生物素化可以例如通过使包含生物素基团的本公开内容的靛红酸酐衍生物与生物材料组合来进行。这样的组合形成诸如在式(IIIA)中示出的邻氨基苯甲酸酯衍生物，其中Bio是生物材料并且R1是生物素基团。下文提供了邻氨基苯甲酸酯的另外的实例。
用生物素标记并且轭合抗体(Ab)
包含生物素基团的本公开内容的靛红酸酐衍生物在生物素化反应中是特别地有利的，因为生物素化的程度可以合理地被定量。多种生物材料的生物素化包括将至少一种生物素分子共价附接至材料。生物素形成可以被开发以分离、纯化、并且确定产生的生物素化的分子的具有链霉亲和素(和其他链霉亲和素类似物例如抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白)的高度特异性非共价络合物。已知生物素化度即被添加至材料的生物素的量是高度合意的(以便不干扰被衍生化的分子的生物活性)。同样地高度合意的是，产生的生物素化的程度是可定量的。因为生物素不具有固有地有用的发色团，所以此定量通常通过使用荧光标记的链霉亲和素(或抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白)，或使用抗生素蛋白/链霉亲和素连接的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶通过二级测定例如抗生物素抗体或酶活性测定被实现。
然而，包含生物素基团的本公开内容的靛红酸酐衍生物可以改善这些检测问题并且被用于生物素化的生物分子的构建。在一个这样的实施例中并且如在下文方案4中所图示的，抗体(即，抗MUC1抗体BC2(abcam，ab89492))可以用包含生物素基团的靛红酸酐衍生物例如衍生物1s来标记以提供BC2-1s生物轭合物(bioconjugate)。
方案4
邻氨基苯甲酸酯中固有的独特的吸光度(340nm-360nm)(即，靛红酸酐衍生物和生物材料的轭合物)可以被用于直接定量生物素化的程度而不需要二级测定检测。另外，标记的BC2-1s生物轭合物将具有独特的荧光光谱(激发/发射340nm/420nm)，是由于可以被用于在其中荧光检测是便利的(例如，凝胶内荧光(in-gel fluorescence)等等)多种条件下容易地确定生物素化的BC2-1s生物轭合物的邻氨基苯甲酸部分。
用荧光团标记并且轭合抗体(Ab)
本公开内容的靛红酸酐衍生物的另一应用包括通过将荧光化合物偶联至此使生物材料改性。抗体的荧光标记是以同样的方式用于生物领域和生物医学领域中的多种应用的广泛实践。本公开内容的实施例包括荧光标记的抗体用于检测高度特异性抗原的用途，其中其存在是特别的生理状态的诊断。
包含化学反应性基团(例如，式(I)的R1是化学反应性基团)的本公开内容的靛红酸酐衍生物可以被用于使生物材料例如抗体与荧光团偶联。在一个这样的实施例中并且如在下文方案5中所图示的，抗-EGFR抗体ICR10(abcam，ab231)可以用包含化学反应性基团的靛红酸酐衍生物例如衍生物1w来标记以提供ICR10-1w生物轭合物。
方案5
用1w使ICR10衍生化将赋予独特的吸收特性(340nm-360nm)并且将还致使ICR10荧光剂分别具有340nm/420nm的激发/发射最大值。这些性质将使最终使用者能够容易地确定在用1w衍生化之后的ICR10Ab的官能化的程度。另外，用1w处理之后的固定在抗体上的炔化学反应性基团允许将另一种材料即荧光团偶联到ICR10-1w轭合物上。使ICR10-1w轭合物通过化学反应性炔基与FITC-PEG-N3(NANOCS,PG2-AZFC-2k)偶联产生被荧光素标记的ICR10抗体。此轭合物现在将展现出约495nm/515nm的激发发射波长(指示荧光素)，使得此轭合物适于其中荧光检测是合意的应用(例如，共聚焦显微镜学、流式辅助细胞分选(flowassisted cell sorting)(FACS)等等)。
用药物标记并且轭合抗体(Ab)
本公开内容的靛红酸酐衍生物的另一应用包括通过将药物偶联至此使生物材料改性。在主要地癌症化疗中的应用下，抗体-药物轭合物(ADC)是相对地新的一类靶治疗剂。用于ADC的构建的一种常用策略是通过产自于抗体(或抗体片段)的硫醇和马来酰亚胺改性的药物之间的迈克尔加成反应使药物固定。
包含化学反应性基团(例如，式(I)的R1是化学反应性基团)的本公开内容的靛红酸酐衍生物可以被用于使生物材料例如抗体与药物偶联。在一个这样的实例中并且如在下文方案6A和方案6B中所图示的，抗体可以与药物轭合。
方案6A
例如，EGFR抗体(528)(Santa Cruz,sc-120)的抗体片段可以用多柔比星-2r轭合物来化学选择性地标记(方案6A)。此策略可以被用于具有能够经历用2r改性的亲核中心的多种药物。可选择地并且如在方案6B中所示出的，EGFR抗体(528)的ADC可以使用2r通过经由产自于Ab的赖氨酸残基的改性将马来酰亚胺结合至Ab上来产生。使用Ab-2r轭合物的独特的吸光度(吸光度340nm-360nm)，可以确定结合至Ab上的马来酰亚胺残基的数目。另外，包含合适地反应性硫醇的感兴趣的药物可以通过硫醇药物和马来酰亚胺官能团之间的迈克尔加成化学选择性地被结合至Ab-2r。
基于硫代-NHS和NHS的化学
本公开内容的靛红酸酐衍生物的另一应用包括使用此类衍生物作为用于使材料改性的基于硫代-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)化学的替代物。本公开内容的靛红酸酐衍生物上的季铵基团促进衍生物的水溶性，这在使用含水反应介质的生物化学中是有利的。本公开内容的靛红酸酐衍生物还提供的优势是反应的程度可以合理地被定量，因为靛红酸酐具有有区别的荧光和紫外信号。包含硫代-NHS基团或NHS基团(例如，式(I)的R1是(硫代)N-羟基琥珀酰亚胺酯基团或N-羟基琥珀酰亚胺酯)的本公开内容的靛红酸酐衍生物可以被用作用于使材料改性的基于硫代-NHS或NHS的化学的替代物。
材料的官能化和固定
本公开内容的靛红酸酐衍生物的另一应用包括使材料例如玻璃改性。玻璃表面的官能化广泛地被实践以用于生物技术工业内的应用。例如，具有环氧官能度的玻璃表面广泛地被用于多种生物材料例如蛋白质、肽、以及改性的和未改性的寡核苷酸的固定。
包含化学反应性基团(例如，式(I)的R1是环氧化物反应性基团)的本公开内容的靛红酸酐衍生物可以被用于使材料例如玻璃官能化。然后，官能化的材料可以被用于使生物材料固定化。例如并且如在图1中所示出的，包含环氧化物的本公开内容的靛红酸酐衍生物例如衍生物1aa可以在环氧化物涂覆的玻璃表面的制备中被使用。用1aa制造环氧化物涂覆的玻璃表面可以容易地通过简单的两步工艺容易地实现。首先，玻璃表面可以用(3-氨基丙基)三乙氧基甲硅烷(APTES)(Sigma-Aldrich,A3648)来处理以提供亲核表面。其次，1aa的溶液可以适用于表面，其中1aa将与APTES的氨基几乎排他地在1aa的酸酐处反应，留下环氧化物表面用于在前面提及的应用中的衍生化。
通过靛红酸酐衍生物将生物材料偶联至放射性标记物
包含硼或硅官能团的本公开内容的靛红酸酐衍生物在构建其中期望氟-18(18F)放射性核素的结合的材料中是有用的。18F放射性核素常用于正电子发射断层扫描成象(PET)中。作为核医学成像技术的PET的应用在医学界内是普遍的。PET利用正电子发射的放射性核素以用于γ射线的检测。典型地，这通过包含选择的放射性核素的代谢活性小分子的引入来实现。当前，用于PET的工业标准放射性药物是2-脱氧-2-(18F)氟-D-葡萄糖(FDG)。在操作上，此工艺要求FDG的全身性施用，FDG然后被代谢活性细胞不加选择地代谢。因此，摄取是代谢活性的函数。由于癌细胞的增加的代谢活性，PET常常被用作阐明癌症和癌症转移的手段。虽然，相对于健康细胞，存在通过癌细胞的增加的摄取，但是高度合意的是，将可能的有害的放射性暴露特定地限于疾病的部位。装饰有细胞靶向剂(例如，适配体、抗体、抗体片段、肽、肽模拟物、糖等等)的纳米颗粒用作作为18F标记的成像剂的选择性递送剂的分子骨架的用途可以有效地改善与结合18F的小分子的全身性递送相关的问题。
在一个这样的实施例中并且如在图2中所图示的，具有氨基官能团的纳米颗粒，例如具有氨基官能化的表面的50nm金(Au)纳米颗粒(AP)(可商购自Sigma Aldrich)可以用包含硼酸酯基团的靛红酸酐衍生物例如衍生物34来标记以提供AuNP-34轭合物。然后，此衍生物可以用18F-源直接处理以制备适于体内成像和诊断的AuNP-34-B(18F)- 3衍生物。
在另一个实施例中，氨基官能化的纳米颗粒可以用包含硅氧烷基团的靛红酸酐衍生物例如衍生物43来标记以提供纳米颗粒-43轭合物。然后，此衍生物可以用18F-源直接处理以制备适于体内成像和诊断的NP-43-Si(18F)- 3衍生物。
具有多官能度的邻氨基苯甲酸酯
本公开内容的另一方面包括具有多官能度的邻氨基苯甲酸酯。此类邻氨基苯甲酸酯具有在下文多个方案中示出的式(IIIB)的结构。
例如，方案7A图示使本公开内容的靛红酸酐衍生物与材料组合以产生具有多官能度的邻氨基苯甲酸酯的实施方案，其中材料可以被表示为HXaL3-R”1。
方案7A
变量V、W、Y、Z、L1、L2、Q-、R3、R4、p和R1代表如用于上文式(I)的衍生物所描述的相同的取代基，包括各个变量中的每个的全部各种组合和子组合。例如，HXa代表NH2基团、NHR5基团、SH基团、或OH基团，并且L3和R”1分别代表如用于上文式(I)的L1和R1所描述的相同的基团，包括各个变量中的每个的全部各种组合和子组合。
式IIIB的邻氨基苯甲酸酯可以通过简单地将表示为HXa-L3R”1的材料添加至式(I)的靛红酸酐衍生物来制备。当HXa-L3R”1是胺时，反应可以在水或水和混溶的有机溶剂例如乙腈中常规地进行，以在必要时帮助溶解HXa-L3R”1。当HXa-L3R”1是醇时，无水极性质子惰性溶剂例如DMSO和DMF可以被用于使用于反应的I溶解。
可选择地，式(IIIB)的邻氨基苯甲酸酯可以通过在下文方案7B和方案7C中示出的路线来制备。
方案7B
方案7C
在这些可选择的路线中，最后步骤将在丙酮中进行，具有最后的自清洁季铵化步骤的优点。
在本公开内容的实施方案中，式(IIIB)的邻氨基苯甲酸酯可以包含如在下文表6中提供的基团。
表6.式(IIIB)的邻氨基苯甲酸酯的实例
在本公开内容的另一个实施方案中，式(IIIA)的邻氨基苯甲酸酯可以包含如在下文表7中提供的基团。
表7.式(IIIA)的邻氨基苯甲酸酯的实例
通过互补的靛红酸酐衍生物偶联材料
本公开内容的靛红酸酐衍生物的另外的应用包括通过互补的靛红酸酐衍生物偶联不同的材料。例如，图3图示通用两步偶联反应，其中本公开内容的靛红酸酐衍生物被用于使用互补的R1化学反应性基团例如两个不同的衍生物上的R1a和R1b将两种材料(HXaMa和HXbMb)彼此偶联。互补的反应性基团R1a和R1b各自独立地代表可以与彼此反应的化学反应性基团。R1a和R1b基团分别作为半环和环在图3中被图示。R1a和R1b基团可以在容易地形成共价化学键的基团之中选择，例如在点击化学反应中已知的。
如在该图中所示出的，具有包含季铵基团的N-取代基和基团(R1a)的第一靛红酸酐衍生物与材料HXaMa组合，而具有包含季铵基团的N-取代基和第二基团(R1b)的第二靛红酸酐衍生物与材料HXbMb组合。如在图3中进一步图示的，第一基团(R1a)可以与第二基团(R1b)化学地反应或结合以使两种材料偶联。
在本公开内容的实施方案中，不同的材料通过第一靛红酸酐衍生物和第二靛红酸酐衍生物的使用来偶联。第一靛红酸酐衍生物可以具有式(IVA)的结构，且第二靛红酸酐衍生物具有式(IVB)的结构，如下：
其中Va、Vb、Wa、Wb、Ya、Yb、Za、Zb、L1a、L2a、L1b、L2b、Q-a、Q-b、R3a、R3b、R4a、R4b分别独立地代表来自以下的基团：V、W、Y、Z、L1、L2、Q-、R3、R4，包括各个变量中的每个的全部各种组合和子组合。基团R1a和R1b代表如选自R1的互补的化学反应性基团。
例如，R1a和R1b基团可以在容易地形成共价化学键的基团之中选择，例如在点击化学反应中已知的，例如，R1a和R1b可以在叠氮化物、炔、马来酰亚胺、被保护的硫醇、烯烃、腙、醛、酮、缩醛以及缩酮中来选择。下文表8图示用于R1a和R1b的互补反应性基团。
表8
本公开内容的靛红酸酐衍生物的偶联反应可以包括例如当R1a是烯烃并且R1b是硫醇时。R1a和R1b基团可以使用光通过形成碳-硫键来偶联。在其他情况下，本文描述的化合物的含叠氮化物或含炔的部分可以被用于使该化合物通过从叠氮化物官能团或炔官能团和其他化学物质的炔官能团或叠氮化物官能团通过碳-氮杂环的点击化学的形成偶联至另一类化学物质。
试剂盒
在本公开内容的另一方面中，具有包含季铵基团的N-取代基的靛红酸酐衍生物可以被包含在试剂盒中。此类试剂盒可以被制备并且被销售以使生物分子连接在一起或使生物分子与用于递送药物的其他材料连接或使生物材料连接至可检测的标记物例如放射性标记物或荧光团或两者。
试剂盒包含至少第一靛红酸酐衍生物，所述第一靛红酸酐衍生物具有包含季铵基团的N-取代基。试剂盒还可以包含第二靛红酸酐衍生物，所述第二靛红酸酐衍生物具有包含季铵基团的N-取代基，其中第一靛红酸酐衍生物包含第一化学反应性基团，并且第二靛红酸酐衍生物包含第二化学反应性基团，该第二化学反应性基团能够与第一靛红酸酐衍生物的第一化学反应性基团化学地反应以使第一靛红酸酐衍生物和第二靛红酸酐衍生物偶联。在本公开内容的实施方案中，第一靛红酸酐衍生物可以具有式(IVA)的结构，且第二靛红酸酐衍生物具有式(IVB)的结构。在本公开内容的实施方案中，试剂盒包含表1中的式4、式5、式7、或式8中的一种或更多种化合物，例如来自式5的叠氮化物和炔或来自式7的酰肼和醛。
试剂盒还可以包括关于如何使用第一靛红酸酐衍生物和/或第二靛红酸酐衍生物的说明书。说明书可以作为插入物被包括、被并入到容器中和/或试剂盒的包装中。
实施例
以下实施例意图进一步说明本公开内容的某些优选的实施方案并且本质上不是限制性的。本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规的实验确定本文描述的特定的物质和程序的许多等效物。
化合物1a至1d根据一般方案8和下文描述的一般程序来制备。
方案8
1)
2)
表9
用于合成靛红酸酐衍生物1a-d的一般程序：向舒伦克烧瓶(Schlenk flask)在干燥的氮气(N2)下添加(1.5g，36mmol)60wt％矿物油中的氢化钠(NaH)(在上文表中示出的1a和1a'需要2当量的NaH)。向此添加15ml的干燥的己烷，然后允许悬浮液短暂地搅拌以沉降，并且己烷通过套管除去。使此工艺重复三次。向新冲洗的NaH在室温下添加无水二甲基甲酰胺(DMF)(30ml)，产生混浊的悬浮液。向此悬浮液一次地添加靛红酸酐(5.1g，30mmol)。在此添加之后，添加另外的20ml的无水DMF并且将产生的悬浮液搅拌持续60分钟，在此时间之后一次添加被取代的烷基卤(在上表中示出的L1-Q1)(36mmol)。将产生的悬浮液搅拌持续约18小时，产生包含期望的产物的澄清的且有颜色的溶液。将产生的溶液在真空下在约100℃下浓缩，产生深颜色粘稠的残余物。然后，将此残余物溶解在二氯甲烷(150ml)中并且用100ml的饱和的碳酸氢钠(NaHCO3)(含水的)萃取三次。最后，将有机层用100ml的盐水溶液洗涤一次。然后，收集有机层并且用活性炭(0.5g)搅拌持续30分钟。然后，将产生的有机溶液通过一层硫酸镁(MgSO4)过滤以除去活性炭并且干燥残余的水的溶液两者。然后，将产生的溶液在真空下浓缩以除去二氯甲烷，产生浅颜色的固体，然后使该浅颜色的固体从异丙醇中重结晶。
衍生物1n至1s根据方案9和下文描述的一般程序来制备。
方案9
表10
用于从1b合成靛红酸酐衍生物的一般程序。向包含1b(约99mg，0.3mmol)的3ml螺旋加盖的小瓶添加1ml的试剂级干燥丙酮。将混合物加热以溶解试剂，随后通过0.4μm注射器过滤器过滤以除去任何不溶性氨基酸(来自1b的水解)。向此溶液添加对应的亲核体(CH3)2N-L2R1(在上文表中示出的)(0.3mmol)并且允许溶液在40℃下静置持续18小时。最终产物是固体并且通常通过抽吸过滤来分离。产物通过NMR和ESI质谱法来确证。结晶产物通过NMR分析是纯的，除痕量的丙酮之外。当没有观察到固体沉淀物时，反应混合物的NMR和ESI质谱法被用于确证产物形成。在1HNMR中，氨基的氮上的甲基氢的是诊断物。在起始胺(CH3)2N-L2R1中的这些氢共振是在约2ppm处，而产物的对应的氢(季铵化的胺上的甲基)是在3.1ppm和3.3ppm之间。化合物1s在使用的溶剂中不结晶并且在用旋转蒸发除去溶剂之后，作为粘稠的油获得。NMR分析通过此程序示出1s大于95％纯度。
衍生物1t至1aa根据一般方案10和下文描述的一般程序来制备。
方案10
1a R3＝R4＝CH3
1a' R3＝R4＝CH2CH2CH2CH2CH2
表11
用于从1a合成靛红酸酐衍生物的一般程序：向包含1a(70mg，0.3mmol)的3ml螺旋加盖的小瓶添加1ml的试剂级干燥丙酮。将混合物加热以溶解试剂，然后通过0.4μm注射器过滤器过滤以除去任何不溶性氨基酸(来自1a的水解)。向此溶液添加对应的亲核体QL2R1(在上文表中示出的)(0.3mmol)并且允许溶液在40℃下静置持续18小时。这些反应通过1HNMR来监测；氨基的氮上的甲基氢的是诊断物。在起始材料(1a)中的这些氢共振是在约2.3ppm处，而产物的对应的氢是在3.1ppm和3.3ppm之间。最终产物典型地是固体并且通过抽吸过滤来分离。产物通过NMR和ESI质谱法来确证。产物通常是纯的，除痕量的丙酮之外。当没有观察到固体时，反应混合物的ESI质谱法和NMR光谱学被用于确证产物形成。如果产物可以不被诱导结晶，那么将溶剂通过旋转蒸发除去以留下粘稠的油。收率通过粗重量来确定并且纯度通过NMR来确定。
酸酐和化学反应性R1基团的相对反应性
靛红酸酐衍生物1aa是双亲电试剂，其中两种反应性末端(酸酐和环氧化物)朝向胺是反应性的。用此试剂迅速注射NMR实验示出在两个末端处存在反应速率的显著差异。与用碳酸氢钠缓冲至8.4的pH的D2O中的1当量的正丁胺的反应(用于蛋白质的赖氨酸残基中的碱性氨基的模型)示出胺与酸酐官能团反应，而没有观察到与环氧基团的反应。
靛红酸酐衍生物1x也是双亲电试剂，其中两种反应性末端(酸酐和NHS酯)朝向胺是反应性的。用此试剂以1当量的正丁胺的NMR动力学研究示出对于两个末端，反应速率是类似的。但是，芳基环上的取代基(V、W、X、Y)允许调节相对反应速率。例如，相对于NHS酯，使V为体积大的烷基预计减缓在酸酐部分处的反应速率。可选择地，相对于NHS酯，使W或X为吸电子的预计增大在酸酐处的反应速率。
牛血清白蛋白的标记
靛红酸酐衍生物1w被用于根据方案11和下文描述的程序标记牛血清白蛋白。
方案11
向牛血清白蛋白(BSA)在5mM碳酸氢钠(pH 8.4和25℃)中的40mg/ml溶液(50μl)添加50μl的1w(在DI H2O中的1mg/ml)。立即将此溶液在20分钟内分别使用350ex/420em的峰值激发发射波长监测荧光。图4是示出对应于炔至BSA中的结合的、标记的BSA随时间的相对荧光的图表。此产物将准备用于附接至另一个分子上的互补的叠氮化物官能团以使它们使用叠氮化物-偶联点击反应偶联在一起。
DNA适配体的标记
靛红酸酐衍生物1p被用于根据方案12和下文描述的程序用5’NH2引物标记DNA适配体。
方案12
向DNA适配体(DNA Apt)在5mM碳酸氢钠(pH 8.4和25℃)中的1mg/ml溶液(50μl)添加50μl的1p(在DI H2O中的1mg/ml)。将产生的溶液留在25℃下温育持续约5分钟，在此时间之后，将DNA Apt-1p通过凝胶渗透色谱法(GPC)(Princeton Separations CS-10)清除掉水解的和未反应的1p。然后，分别使用350nm/420nm的峰值激发/发射波长，测量纯化的DNAApt-1p生物轭合物的荧光。DNA Apt-1p生物轭合物的荧光直接与未标记的DNA Apt比较，如在图5中所示出的，图5证明叠氮化物已经被结合至DNA上。此叠氮化物轭合物准备与炔配偶体(alkyne partner)在叠氮化物-炔点击反应中偶联以使两种互补的配偶体偶联在一起。
标记和轭合牛血清白蛋白和人类胰岛素
靛红酸酐衍生物1w和1q被用于根据图6中示出的方案和下文描述的程序标记牛血清白蛋白(BSA)和人类胰岛素。
向牛血清白蛋白(BSA)在5mM碳酸氢钠(pH 8.4和25℃)中的20mg/ml溶液(50μl)添加50μl的1w(在DI H2O中的1mg/ml)，(步骤1；图6中的方案13)。将产生的溶液留在室温下温育持续约5分钟，在此时间之后，将BSA-1w轭合物通过凝胶渗透色谱法(GPC)(PrincetonSeparations CS-10)清除掉水解的和未反应的1w。然后，分别使用340ex/420em的峰值激发发射波长分析纯化的BSA-1w轭合物的荧光，图7。荧光测量使用相同的激发波长/发射波长与未标记的BSA(10mg/ml)比较。由于缓冲液，而观察到最小背景荧光。
向人胰岛素(制造商)在5mM碳酸氢钠(pH 8.4和25℃):二甲基亚砜(DMSO)的80:20溶液中的20mg/ml溶液(50μl)添加50μl的1w(在DI H2O中的1mg/ml)。将产生的溶液留在室温下温育持续约5分钟，在此时间之后，将胰岛素-1w轭合物通过凝胶渗透色谱法(GPC)(Princeton Separations CS-10)清除掉水解的和未反应的1w。然后，分别使用340ex/420em的峰值激发发射波长分析纯化的胰岛素-1w轭合物的荧光，图7。荧光测量使用相同的激发波长/发射波长与未标记的胰岛素(10mg/ml)比较。由于缓冲液，而观察到最小背景荧光。重复此程序，用于用1q标记胰岛素。参见图6，方案14。NMR DOSY实验能够示出具有CF3基团的片段具有与胰岛素相同的扩散速率，示出1q被轭合至胰岛素。这些实验示出炔基和氟基两者均可以被结合至胰岛素中。胰岛素-1w轭合物是用于叠氮化物-炔点击反应中的叠氮化物的偶联配偶体，同时胰岛素-1w轭合物证明用氟部分改性分子的能力。
将第二材料偶联至BSA-1w邻氨基苯甲酸酯
上文制备的BSA-1w邻氨基苯甲酸酯根据图6的方案13，步骤2和下文描述的程序通过BSA-1w与化合物A的铜催化的1,3-双极性环加成进一步地被衍生化。
向牛血清白蛋白(BSA)在5mM碳酸氢钠(pH 8.4和25℃)中的40mg/ml溶液(50μl)添加50μl的1w(在DI H2O中的1mg/ml)，并且使产生的溶液静置在室温下温育超过30分钟。在此之后，将50μl的溶液通过凝胶渗透色谱法(GPC)(Princeton Separations CS-10)清除掉水解的和未反应的1w。BSA的标记分别使用340nm/420nm的峰值激发/发射波长通过荧光来确证(参见图4)。在用1w标记BSA之后，根据Hong等人的方法“Analysis and Optimizationof Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation”AngewChem.Int.Ed.Engl.2009:48(52):9879-9883进行优化的荧光铜催化的叠氮化物-炔环加成。选择此方法，因为其与宽分类的生物分子是相容的，是迅速的并且反应的进展通过由BSA-1w-A的形成产生的荧光来监测。简言之；将25μl的BSA-1w(20mg/ml)添加至407.5μl的磷酸盐缓冲液(100mM，pH 7)、10μl的A、2.5μl CuSO4(在DI H2O中的20mM)、5.0μl的三(3-羟基丙基三唑基甲基)胺(THTPA)(在去离子H2O中50mM)、抗坏血酸钠(在去离子H2O中的100mM)、以及氨基胍盐酸盐(在去离子H2O中的100mM)。将产生的溶液留在室温下避光温育持续60分钟。点击反应分别使用340nm/420nm和404nm/470nm的峰值激发/发射波长通过荧光来监测，图8。该顺序使用荧光示出了在生物分子上的合适位置使用1w之后，炔可以被用于叠氮化物-炔点击反应。
纳米颗粒的标记和官能化
靛红酸酐衍生物1w被用于根据以下程序标记包含聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)的纳米颗粒并且使包含聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)的纳米颗粒官能化。
将用表面上的伯氨基(按wt％计，以0.00001％氨基官能度和0.0001％氨基官能度)官能化的10mg的纳米颗粒(NP)添加至单独的1.5ml微离心管，然后分散到250μl的去离子H2O中。向这些中的每个添加50μl的1w(在去离子H2O中的1mg/ml)。将产生的溶液留在室温下温育持续30分钟。在此之后，将NP-1w轭合物在离心机上以21,000rcf在4℃下成球以除去水解的和未反应的1w两者。然后，将NP-1w小球再分散到500μl的去离子H2O中并且如上文再次成球。将此重复3次。最后，将清洁的NP-1w轭合物分散到1ml的去离子H2O中并且分别使用340nm/420nm的峰值激发/发射波长记录荧光，图9。在纳米颗粒的情况下观察到的荧光(图9)是至纳米颗粒的表面的炔附接的证据。然后，可以使NP-1w与包含叠氮化物的分子配对以进行叠氮化物-炔点击化学，从而使分子附接至纳米颗粒。
虽然要求保护的本发明已经详细地并且参考其特定的实施方案被描述，但是对本领域技术人员将明显的是，可以对要求保护的本发明做出各种改变和修改，而不偏离要求保护的本发明的精神和范围。因此，例如，本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规的实验确定本文描述的特定的物质和程序的许多等效物。这样的等效物被认为是在本发明的范围内并且被以下权利要求覆盖。

Claims (16)

1.一种具有下式的靛红酸酐衍生物：
其中V、W、Y和Z独立地代表H、N3、NO2、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、支链的或直链的烷基、支链的或直链的烯基、支链的或直链的炔基、支链的或直链的烷氧基、甲酰基、乙酰基、缩醛、或卤素；L1代表连接基；R3和R4独立地代表直链的或支链的烷基，或一起形成环杂烷基、或环杂芳基；Q-代表阴离子；p是从0至2的整数；当p是0时，L2代表有机侧基；当p大于0时，L2代表第二独立的连接基；R1代表化学反应性基团、结合基团或可检测的标记物。
2.如权利要求1所述的靛红酸酐衍生物，其中p是1，L2是连接基并且R1是化学反应性基团。
3.如权利要求2所述的靛红酸酐衍生物，其中R1代表叠氮化物、炔、被保护的硫醇、包含二硫化物部分的基团、烯烃、芳基烯马来酰亚胺、缩醛、醛、酮、缩酮、腙、环氧化物、N-羟基琥珀酰亚胺酯、(硫代)N-羟基琥珀酰亚胺酯基、硫酯、硼酸、硼酸酯、或三烷氧基甲硅烷基。
4.如权利要求1所述的靛红酸酐衍生物，其中p是1，L2是连接基并且R1是结合基团。
5.如权利要求4所述的靛红酸酐衍生物，其中R1代表生物素基或半抗原。
6.如权利要求1所述的靛红酸酐衍生物，其中p是1，L2是连接基并且R1代表可检测的标记物。
7.如权利要求1至6中任一项所述的靛红酸酐衍生物，其中V和Z是H并且W和Y独立地代表H、N3、NO2、NH2、NHR5、NR5R5、C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、-CHO或缩醛；R3和R4独立地代表C1-6烷基或一起形成5-6元环杂环；R5代表C1-8脂肪族基团；Q-代表卤素阴离子；L1代表二价C1-60有机基；当p是1或2时，L2代表二价或三价C1-60有机基并且当p是0时，L2代表C1-60有机侧基。
8.如权利要求7所述的靛红酸酐衍生物，其中L1和L2独立地代表R5、Ar、R5-Ar、Ar-R5、R5-Ar-R5、-(CH2)n-、-(R5O)m-(CH2)n-、-(CH2)n-(R5O)m-R5、或-(CH2)n-(OR5)m-R5，沿着主链具有或不具有杂原子，或-(CH2)n–(OR5)m-XR5、或-(CH2)n1-(OR5)m1-HA-(CH2)n2-(OR5)m2-R5，其中R5代表C1-8脂肪族基团；Ar代表二价芳基；n、n1和n2独立地代表1至30的整数；m、m1和m2独立地代表0至30的整数；HA代表-CO-、-C(O)X-、-XC(O)-、-X-、-S-、-S(O)-、-XS(O)2-、或-S(O)2X-；并且X代表O、S、NH或NR5，条件是如果X是-NH-，那么仲胺大体上不与所述靛红酸酐衍生物的酸酐反应。
9.一种使材料改性的方法，所述方法包括使权利要求1至6中任一项所述的靛红酸酐衍生物与材料组合以形成(i)靛红酸酐衍生物，其包含通过R1偶联的所述材料，具有式(II)的结构，或(ii)邻氨基苯甲酸酯衍生物，其具有通过所述靛红酸酐衍生物的酸酐偶联的所述材料，具有式(III)的结构：
其中M代表所述材料，Xa代表NH、NR5、S或O并且R'1代表由R1和所述材料M的反应或相互作用形成的基团。
10.如权利要求9所述的方法，包括形成所述式(III)的邻氨基苯甲酸酯，其中M是生物材料，p是1并且R1是化学反应性基团或结合基团。
11.如权利要求9所述的方法，包括形成所述式(III)的邻氨基苯甲酸酯，其中M是生物材料，p是1并且R1是可检测的标记物。
12.如权利要求9所述的方法，包括形成所述式(III)的邻氨基苯甲酸酯，其中M是聚合纳米颗粒。
13.如权利要求9所述的方法，还包括通过将第二材料偶联或结合至R1而将所述第二材料偶联至所述式(III)的邻氨基苯甲酸酯。
14.如权利要求9所述的方法，其中V和Z是H并且W和Y独立地代表H、N3、NO2、NH2、NHR5、NR5R5、C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、-CHO或缩醛；R3和R4独立地代表C1-6烷基或一起形成5-6元环杂环；R5代表C1-8脂肪族基团；Q-代表卤素阴离子；L1代表二价C1-60有机基；当p是1时，L2代表二价C1-60有机基并且当p是0时，L2代表C1-60有机侧基。
15.一种试剂盒，包含根据权利要求1-8中任一项所述的靛红酸酐衍生物作为至少第一靛红酸酐衍生物。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，还包含根据权利要求1-8中任一项所述的靛红酸酐衍生物作为第二靛红酸酐衍生物，其中所述第一靛红酸酐衍生物包含第一化学反应性基团，并且所述第二靛红酸酐衍生物包含第二化学反应性基团，所述第二化学反应性基团能够与所述第一靛红酸酐衍生物的所述第一化学反应性基团化学地反应以使所述第一靛红酸酐衍生物和所述第二靛红酸酐衍生物偶联。
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