JPS6187A - 非放射性生物学的プロ−ブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は非放射性生物学的プローブ、それらの製法およ
びそのようなプローブを使用してポリヌクレオチドを検
出し、局在化し、単離する技術に関する。

バイオテクノロジーにおいては、標識された核酸プロー
ブは、特定の核酸配列の検出およびその場での局在化の
ための不可欠の手段である。これらのプローブは産業上
有意の効果金有しており、主たる用途は例えばヒト、動
物および植物の病気の診断である。

本質的に、核酸プローブは、重要な核酸の相補性配列と
ハイゾリツド化するように選択された核酸配列からなる
。このゾローメ配列はそれ自体便利で信頼性のある検出
方法および検定法を促進するように明確に標識できる基
に結合される。

しかしながら、先行技術においては、不利点が多い。従
来、核酸プローブは３Ｈ，３２ｐ、　１４Ｃまたは１２
５工のような放射性同位元素で標識されてきた。放射性
同位元素による標識は感度が非常に良いが、価格が高（
つき、安全性と安定性に問題があったので、もつと安く
もつと容易に行える標識方法の開発が急がれていた。そ
の結果、最近、ヌクレオチド配列がビオチン（ビタミン
Ｈ）に結合されたＤＮＡプローズが入手できるようにな
った（例えば、Ｊ、　Ｊ、　Ｌｅａｒｙ、　Ｄ、　Ｊ、
　Ｂｒｉｇａｔｉ　ａｎｄ　Ｄ、　Ｇ。

Ｗａｒｄ、　１９８３．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａａ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　８０１４０４５〜４０４
９参照）。ビオチンがプローブリガンドとして特に適し
ているのは、ビオチン化したプローブが研究しているポ
リヌクレオチドとハイブリダイゼーションをした後で、
酵素、螢光性分子または化学発光触媒のような指示薬が
アビジン全弁して容易に付加するからである。ここでア
ビジンとは、ビオチンと特異的且つ非常に強く結合する
ことが知られている卵白蛋白質である。別法として、ビ
オチン化した核酸は抗ビオチン抗体を使用して検出でき
る。分子生物学においてアビジンビオチン複合体を１道
具として使用する際の一般的知見は、Ｅ、　Ａ、　Ｂａ
ｙｅｒ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｗｉｌｃｈｅｋ　（１９８０）
Ｍｅｔｈｏｄ８ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｎａ
ｌｙＱｉｓ″２６，１−４５に記載されている。

そのようなプローブは特定゛の利点を有しているが、Ｐ
、　Ｒ，Ｌａｎｇｅｒ、　Ａ、　Ａ、　Ｗａｌｄｒｏｐ
およびり、　Ｃ。

Ｗａｒｃｌ　（１９８１；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　ＳＡ　７８゜６６３３−６
６３７　）、　Ｄ、　Ｊ、　Ｂｒｉｇａｔｉ、　Ｄ、　
Ｍｙｅｒｓｏｎ。

Ｊ、　Ｊ−Ｌｅａｒｙ、　Ｂ＋５ｐａｌｈｏ１ｚ、　Ｓ
、　Ｚ、　Ｔｒａｖｉｓ、　Ｃ。

Ｋ、　Ｙ、　Ｆｏｎｇ、　Ｇ、　Ｄ、　Ｈｓｉｕｎｇお
よびＤ−０，Ｗａｒｄ（１９８３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　
１２６．３２−５０　）および、ｆ、　Ｊ。

Ｌｅａｒｙ、　Ｄ、　Ｊ、　Ｂｒｉｇａｔｉ　Ｄ、　０
．　Ｗａｒｄ　（１９８３，Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０．４
０４５−４０４９）のような既知方法によるビオチン化
したＤＮＡプローズの製造方法は、確立されたニック翻
訳反応（Ｐ−Ｗ、　Ｊ、　Ｒｉｇｂｙ、　Ｍ、　Ｄｉｅ
ｃｋｍａｎｎ、　Ｃ，Ｒｈ０ｄｅｓ　ａｎｄＰ、　Ｂｅ
ｒｇ、　１９７７、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１
１３．２３７−２５１　）（基質として二本鎖ＤＮＡ　
ｔ−必要とする）または末端転移酵素を使用して３′−
エクステンションを一本鎖ＤＮＡに付加することによっ
て類似のビオチン化ｄＵＴＰをＤＮＡに酵素によって挿
入することを含む。

ビオチン化ヌクレオチトヲ核酸に酵素によって挿入する
のは不利な点が多い。この方法に使用される細菌のＤＮ
Ａポリメラーゼは相補性ＤＮＡ鎖および二本鎖ＤＮＡを
鋳型として必要とするので一本鎖ＤＮＡ６ニツク翻訳に
使用できない。いくつかの細菌、動物細胞および動物性
ウィルスのＲＮＡポリメラーゼはビオチン化ａＵＴＰ類
似体を基質として使用できるが、広く使用されているト
リウィルス（ａｖｉａｎ　ｖｉｒｕｓ　）逆転写酵素は
ビオチン化ａＵＴＰ類似体を基質として使用できない（
Ｌａｎｇｅｒｅｔ　ａｌ、　１９８１　）。さらに、ビ
オチン化ＵＴＰ類似体は細菌のＲＮＡポリメラーゼとは
低効率でしか作用せず、真核生物のＲＮＡポリメラーゼ
（Ｌａｎｇｅｒら１９８１）によっては僅かしか利用さ
れず、或いは全く利用されない（Ｌａｎｇｅｒら１９８
１　）。さらに、診断用キット用にビオチン化ＤＮＡプ
ローズを大量（η景）に生産するには酵素を大量に反応
させる必要があるが、酵素および基質が高価である。

ビオチンはホルムアルデヒド９を使用して蛋白質チトク
ローム９を介してＲＮＡに化学的に結合された（　Ｊ、
　Ｅ、　Ｍａｎｎｉｎｇ、　Ｎ、　Ｄ、　Ｈｅｒｓｈｅ
ｙ、　Ｔ、　Ｒ，Ｂｒｏｋｅｒ。

Ｍ、　Ｐｅｌｌｅｇｒｉｍ、　Ｈ，Ｋ、　Ｍｉｔｃｈｅ
ｌｌ　ａｎｄ　Ｎ、　Ｄａｒｉａ　Ｓｏｎ。

１９７５、　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ　５３．１’０７−
１１７　）。しかしこの方法には多くの不利益がある。

この方法は完了するのに２〜３日かかり、約５μ２未満
のＲＮＡには適用が容易ではなく；チトクロームＧ　−
ＲＮＡ結合はハイブリダイゼーション条件下に不安定で
あり（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ、　Ｄ、　Ｓ、　Ｈｏｌｍ
ｅｓ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｍａｎｎｉｎｇ。

１９７７、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　
４．２９６１−２９７３）　；ＲＮＡの特性は、１３０
個のヌクレオチド残基当り１個のがさぼるチトクローム
９が結合することによって有意に変化させて上記公開さ
れた方法に適合するようにできる。

従って、従来技術に関連した種々の困難の１つかそれ以
上全解消または少くとも軽減することが本発明の目的で
ある。

従って、本発明の第一の態様は式Ｉの化合物を提供する
ことである： 式に ４Ｒ３ （式中、Ｂは基Ｃとベンゼン環と全っな（”−ＮＨ−基
であって、アジド基に対してパラ位にあってもパラ位に
なくてもよく； Ｃは少なくとも５個の炭素原子を含むヒドロカルビルア
ミン部分であり； Ｄはリガンドまたはハプテンであり； Ｒ□〜Ｒ４は同一かまたは異なって、水素原子、炭素原
子数１〜５のアルキル基、ニトロ基、ハライド基、カル
ボン酸基またはアミン基から選択される） 式Ｉの新規化合物は核酸プローブの製造における中間体
として有用であることがわかった。

好ましくはＢはアジド基に対してパラ位の−ＮＨ−基で
ある。より好ましくは、ヒドロカルビルアミン部分Ｃは
下記より選択される： であり； Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ９，Ｒ１０は同一かまたは異なっ
て、水素原子、炭素原子数１〜５のアルキル基またはハ
ライド基から選択され； ｎはＯ〜５の整数であり； ｍは１〜１０の整数であり； ｐはＯまたは１である） 好適なＣは下記より選択されるニ ー　（ＣＨ２）３−　Ｎ　−（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＣＨ
３ −（Ｃ；Ｈ）３−　Ｎ　−（ＯＨ２）３−　（ＮＨ−Ｇ
ｏ−ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＨ３ −ＣＯＨ２）３−ＮＨ（ＣＨ２）、　−ＮＨ−−（ＯＨ
２）３−ＮＨ（ＣＨ２）４−ＮＨ−（ＯＨ２）３−ＮＨ
−。

好適具体例において、上記ハプテンまたは配位子りは、
核酸に結合したとぎ４ゾチド蛋白質または他の分子と検
出し得る複合体を形成することができる。或いは標識さ
れたポリヌクレオチド全未標識ポリヌクレオチドから選
択的に抽出できる部分である。部分りはビオチン、イミ
ノビオチンまたはジニトロツボノール（ＤＮＰ）基、ま
たはそれらの誘導体から選択される。

一般に、高度に反応性の官能基を使用して核酸の安定な
化学的修飾を行う必要がある。これは２つの問題点を有
する。まず、試薬の合成のための必要条件が反応性基は
配位子（ビオチニル部分）と反応してはならず、従って
、該当する多くの高度に反応性の基が使用できなかった
と考えられる。

次に、非常に極性である以外の溶媒すべてに難溶の核酸
のカチオン塩は通常、高度に反応性の基の殆んどとの反
応のために核酸と激しく競合するとは考えられない水性
溶媒に溶解される。

本発明はアリールアジドについての最初の問題を克服す
る。アリールアジドは暗所で安定でその場で光活性化さ
れて高度に反応性の了り−ルニトレンを生成する。特に
、４−フルオル−３−ニトロフェニルア：）トは容易に
アミン（下記を参照）に結合して可視光線で光活性化で
き核酸プローブに損傷を与える紫外線による照射を避け
る。

本発明は、中性のｐＨでは正の電荷を有する塩基性第三
級アミン基を有するリンカ−を選択することにより上記
二番目の問題全克服するものである。これは試薬に高い
水溶性および核酸に対して静電的引力を与え、核酸に近
接して高度に局在化した濃度の試薬を使用することが可
能になる。ビオチン標識核酸のビオチニル基を効率よく
アビジン内のビオチン結合部位に浸透させるには長いリ
ンカ−が必要であることがわかった。従って、合成反応
に適した長い対称的トリアミンが好ましい。

式１　（Ｒ１〜Ｒ４は水素）の化合物が好ましい。他に
はＲ１，Ｒ２およびＲ４は水素で、Ｒ３は−ＮＯ２でも
よい。

特に好ましい式ｌの化合物は次の通りである。

便宜上、これらの化合物は、フォトビオチン１４（ビオ
チン部分が核酸に１４個の炭素の長さの鎖を介して結合
している）、フォトビオチン１７、フォトビオチン２０
、デニトローフォトビオチン１４およびフォト−ＤＮＰ
と各々称されている。フォトビオチン１４、Ｎ−（４−
７９）ゝ−２−二トロフェニル）−Ｎ’−（Ｎ−Ｄ−ビ
オチニル−３−アミノプロピル）−Ｎ′−メチ／Ｉ／−
１，３−プロパンジアミンは酢酸塩として水溶性であり
、光の不在下に水溶液中で安定であり、可視光線によっ
て急速に光分解されてアジド基が高度に反応性のニトレ
ンに転化し、これは核酸残基に対する安定な結合を形成
する。ニトレンも蛋白質や炭水化物のような他の重合体
物質に結合でき、そのような用途も本発明の範囲内にあ
る。

上記構造式において、−Ｂ−Ｃ−は四級アミン基を含む
水溶性対称性アミンの残基である。これは上記化合物に
親水性を付与し、ボリアニオニック核酸に対するイオン
不活性反応を促進する作用をする。式■および■に記載
されているようなグリシン残基が１つあるいはそれ以上
あると核酸と配位子またはハプテンとの間のリンカ−ア
ームを長くするように働く。

他のアミン、例えばスペルミジン、ＮＦ２．（ＣＨ２）
３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ２，およびスペルミン、ＮＦ２
（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２
を式ｌの−Ｂ−Ｃに使用してビオチンと核酸の間のリン
カ−アームを各々炭素数１５個と１９個にする。これら
のアミンは、式■と■の長くなったアミンおよび同様の
他のアミンと共に本発明の範囲に入る。

本発明は更に上記式Ｉの°化合物の酸付加塩を包含する
。水素酢酸塩および水素ギ酸塩が好ましい。

酸付加塩は暗所保存すれば長い貯蔵寿命を与えるので有
用な中間体である。

本発明の更に他の態様は、式Ｉ ４Ｒ３ （式中、Ｂは基Ｃ′ｆ！−アジド基に関してパラ位にあ
ってもなくてもよいはンゼン環に結合スる一ＮＨ−基で
あり；Ｃは少（とも５個の炭素を有するヒドロカルビル
アミノ部分であり；Ｄは配位子またはハシテンであるが
Ｄはジニトロフェノール基ではなく；Ｒ１ないしＲ４は
同じまたは異なっており、Ｈ１炭素数１〜５のアルキル
、ＮＯ２ハラ−イト８基、カルボン酸基およびアミノ基
から選択される）の化合物およびその酸付加塩の製造方
法であって、式■ の化合物を式■ の化合物と反応させることからなる方法が提供される。

さらに他の態様において式 （式中Ｂは、基ｃｌアシド基に対してパラ位に存在して
も存在しなくてもよいベンゼン環に結合せしめる一ＮＨ
−基であり；Ｃは少なくとも５個の炭素原子金有するヒ
ト四カルビルアミン基であり；Ｒ□ないしＲ４は同じま
たは異なっており、Ｈｓ炭素数１〜５のアルキル、　Ｎ
Ｏ２．ハライド基、カルボン酸基またはアミン基である
）の化合物およびその酸の製造方法であって、 式■ （式中Ｂ、ＣおよびＲ１ないしＲ４は上記と同じ定義を
有する） の化合物を式 （式中Ｘはハライド基であり、Ｒ９はＨ２炭素数１〜５
のアルキルまたはノライド基であり、ｎは１ないし５の
整数である） の化合物と反応させることからなる方法を提供する。

好ましくは、式ｘ■の化合物は式 を有する。

好ましくは、式■の化合物は式■ を有し、式Ｘ ＩＲ２ ４Ｒ３ （式中りは脱離基である） の化合物金式Ｘ （式中Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，ｍ、　ｎおよびｐは上記定義
の通りである） の化合物と反応させることによって製造される。

更に好ましくは、式Ｘの化合物は４−フルオル−３−ニ
トロフェニルアジドおよびＮ−（（４−アジド９ベンジ
ル）オキシ）サクシンイミドが選択される。

さらに好適具体例において式■の化合物は下記から選択
される： フォトビオチン１４　（Ｉｔ）は第１図に示したようＨ
３ 全盲する関連化合物は段階Ｂで４−フルオル−３−二ト
ロフェニルアジドの代りにＮ−（’（４−アジドインジ
ル）オキシ）サクシンイミドを使用することによって同
様の方法で製造できる。以上概略を述べた製造方法は本
発明の範囲内にある。

上述の反応工程は、本発明の範囲内と考えられる種々の
７オトビオチンの製造に適応する。例えば、アミン■の
代りにスはルミジン、スペルミンまたは他のジアミノ化
合物（４級アミン基があってもなくてもよい）を使用す
ることができる。更ニ、ビオチニル−Ｎ−ヒドロ・キシ
サクシンイミドエステル（■）の代りにビオチニル−グ
リシル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルまたは
ビオチニル−グリシル−グリシル−Ｎ−ヒドロキシサク
シンイミドエステルを使用してフォトビオチン１７およ
び２０（ｖおよび■）を各々生成できる。

更に、この工程によってビオチン以外のリガント９また
は上記工程（ｄ）のハプテンの共有結合を行って核酸プ
ローブの製造に適した光活性化剤を生成することができ
る。

ハシテンまたは配位子が２．４−ジニトロフェノールで
ある別の態様においては、検出ステップ（３）には、 （ａ）ステップ（３）の生成物全２．４−ジニトロフエ
ノールに対して調製したモノクローン性またはポリクロ
ーン性抗体と反応させ、 （ｂ）その生成物を抽出する。

ことも含まれる。このような検出法はビオチンプローブ
に関連して記載した方法に類似しており、標準的酵素結
合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）条件により
実施できる。

本発明のこの観点の好ましい態様においては、工程のス
テップ（１）は、 （ａ）　　各化合物上のハシテンまたは配位子りの異な
る式店で表わされる少な（とも二種の化合物を準備する
ことを含み、 そしてステップ（３）は、 （ａ）　　ステップ（２）のハイブリッド化生成物を一
つのハプテンまたは配位子についての第一抽出工程に付
し、そして （ｂ）（ａ）の抽出生成物を次いで第二のハプテンまた
は配位子に特異的な検出工程に付すことを含む。

核酸プローブのうちの他方は、この工程の間、除去され
たプローブと同じ核酸配列にノ・イブリッド化していな
い限り、溶液中から除去されないことが理解されるであ
ろう。固体支持体に結合した他のクローンの存在は、次
いでその配位子またはハプテンに特異的な反応により検
出される。陽性反応は核酸テストサンプル中の標的核酸
の存在を示す。

本発８Ａをより十分に説明゛するため、但し説明のため
にのみ、本発明の態様を以下に更に実際的に概説する。

病的状態に特異的な標的核酸の組換えＤＮＡクローンは
、−重鎖ファージＭ１３ベクター中に作成される。プロ
ーブとして使用される二つのクローンは、それらが標的
核酸の同一分子の異なる非重複区域へハイブリッド化す
るように作成される。

これら二つの区域は連続的である必要はないが、標的核
酸がハイブリッド化のために調製中またはハイブリット
９化反応の間に部分片断化を起す場合には、二つの区域
は相互に近接して存在することが好ましい。

二種の選択されたプローブは、一方はフォトビオチン（
Ｉ）そして他方はフオ）　−ＤＮＰ　（ｎ）　’ｔ−使
用して、各ＤＮＡ分子にハシテンの配位子が好ましくは
約３０−５０分子の多数で付着するように光化学的に標
識される。他の配位子またはハシテンの対を適宜使用す
ることもできる。

次いで、二種の標識プローブ当モル量を、標的核酸を検
出すべき核酸抽出物と混合し、混合物全単−相液体条件
下にハイブリッド化する。ハイブリッド化は二つのプロ
ーブにより、存在する如何なる標的核酸とのハイブリッ
ド化が完了またはほぼ完了することが保証される適当な
条件で継続する。プローブが標的核酸より十分過剰量で
あるときは、反応は実質的に擬−次反応であり、ハイブ
リッド化の速度はプローブの濃度によりコントロールで
きる。このことは標的配列の濃度が低い場合に、検出系
に高感度を与えるであろうから、重要な点である。

ハイブリッド化したクローンは、第２図に模式的に示す
タイプのハイズリラド構造として存在するであろう。こ
のハイブリッド化混合物を次いで固体支持体、例えば２
．４−ジニトロフェノールに対して調製された抗体（ポ
リクローン性またはモノクローン性）で予めコートされ
たプラスチック−ｒ４クロタイタープレ＝鼾のウニ）Ｌ
／（標準ＥＬＩＳＡアッセイに使用される）中に添加す
る。規定された条件で経験的に定めた時間インキュベー
トすると、溶液から全部または殆んどのＤＮＰ−標識プ
ローブが吸着されるであろう。この吸着プローブには、
ハイメリット化しなかったプローブ及び標的核酸にハイ
ブリッド化したプローブが含まれる。

この条件下ではビオチニル化ＤＮＡプローブは、該プロ
ーブもまたＤＮＰ−標識プローブと同じ標的核酸片にハ
イブリッド化している場合を除き、溶液中から除去され
ることはないであろう。全ての未結合物質は、次いで十
分洗浄して除去する。

次のステップは、各ウェル中に存在するノ・・イブリッ
ド化されたビオチニル化ＤＮＡプローゾのいかなる存在
をも特異的に検出することである。

ＥＬＩＳＡアッセイで広く用いられている検出系から類
推して、一つのアプローチは酵素へ共有結合したアビジ
ンまたはストレプトアビジンまたは酵素に結合した抗−
ビオテン抗体の使用である。適当な酵素の例は、アルカ
リホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼで
ある。従って、アビジン−ストレプトアビジン−または
抗体−酵素複合体を各ウェルに添加し、各ウェル中の結
合ビオチンへの結合を可能ならしめる規定された条件下
にインキュベートする。過剰の酵素試薬を除去するため
十分に洗浄した後、適当な基質を加えてｉレー）’ｅイ
ンキュベートして発色させる。

結合標的配列が何れかのウェルに存在すれば、色の発生
により検出され、発色の強さが結合標的核酸の量に相関
する。発色強度はプリントレコーダーを具えた自動ＥＬ
’ＩＳＡプレート読取装置で測定できる。

本発明のこの態様での重要な要件は、異なるリガンドま
たはハプテンで標識され、同じ標的核酸片にハイブリダ
イズするが互いにはハイブリダイズしない。二種の非放
射標識生物学的プローブを使用する点にある。標的核酸
はヒト、動物または植物（植物とは全ての微生物も含む
ものとする）の特定の病的状態に特異的なものである。

本方法は上記の例におけるビオチンおよび２．４−′）
ニトロフェノールに限定されるものではない。何故なら
、これらは適当な検出システムを使用して検出可能な他
の配位子またはハプテンに置き換え可能だからである。

更に１上記の例において、マイクロタイタープレートを
抗−ＤＮＰ抗体の代りにアビジンまたはストレプトアビ
ジンでコード口、結合標的配列の検出を適当な酵素にカ
ップリングさせた抗−ＤＮＰ抗体を用いて行ってもよい
。

この好ましい態様で述べた一般的手法は、特定標的核酸
の検出および診断にハイブリダイゼーション法を使用す
る他の方法に比べて、多くの顕著な利点を有する。殆ん
どの先行技術の方法において、同相の使用は、ドットー
ノロシト法（ａｏｔ　−ｂｌｏｔｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　
）およびその変法におげろように標的核□　　酸全結合
させるためか、またはサンドイッチ・ハイブリダイゼー
ション法におけるようにＤＮＡプローブの固定化のため
である。本発明の利点は次の通りである： 単一液相でのハイブリダイゼーションは、液体−同体支
持体での二相系におけるより約１０倍速いことが認めら
れる。従って、単−液相系でのハイブリダイゼーション
時間は、二相システムで要する通常の「−夜ｊの時間を
数時間またはそれ以下に相当短縮されうる。理論上は、
二種のプローブの濃度を高めれば、ハイブリダイゼーシ
ョン時間は「分」の単位まで短縮できる筈である。この
点での実用上の限界は、コントロールサンプルのバック
グラウンド反応により定まると思われる。

ハイブリダイゼーション反応に、多量のテストサンプル
を使用可能である。例えば、ドツト−プロットアッセイ
では通常５μｔでスポットされるのに比べ、本発明の単
−相システムでは１００ないし２００μｔのテストサン
プルを用いることが可能である。このことは検出の感度
上昇をもたらすであろう。

最初のハイブリダイゼーション反応および固体支持体へ
の結合が完了すると、以後の手順は実質的にＥＬＩＳＡ
法の場合と同じであるから、種々の十分に確立された検
出法およびアプローチを用いることが可能である。

別の態様においては、一つのテストサンプル中の二種ま
たはそれ以上の標的核酸を検出できる。

ハイブリダイゼーション反応混合物は唯一種のみ調製す
るがしかし、引続く工程は二種またはそれ以上の標的核
酸の検出を可能ならしめる。このことは、各標的核酸に
対する適当なプローズ対を複数含む混合物でのハイブリ
ダイゼーションにより達成される。各対の一方のプロー
ブは、同じ配位子またはハプテン、例えばビオチンで標
識し、そして各対の他方のプローブは特異的検出系を有
する異なる配位子またはハプテン、例えば２，４−ジニ
トロフェノール（これに代るものはＢ、　Ｆ、　Ｅｒｌ
ａｎｇθｒ。

１９８０、　Ｍｅｔｈｏａｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　７０
．８５−１０４に記載されている）で標識する。次いで
、ハイゾリグイゼーション溶液を、アビジン（またはス
トレプトアビジン）でコートしたマイクロタイタープレ
ートの多数のウェルに加える。同じテストサンプルを含
有する異なるウェルについて、使用されたハプテン各々
に特異的な検出システム金剛いてスクリーニングする。

更に別の態様においては、逆のアプローチが好ましい場
合がありうる。即ち、各ウェルを上記例における同一物
質（アビジンまたはストレプトアビジン）の代りに各配
位子またはへブテンに対する異なる抗体でコートする。

従って、各ウェルは異なる標的核酸を選別するであろう
が、検出システムは結合ビオチニル化ＤＮＡプローブを
検出するので、各ウェルについて同一である。

更に別の本発明の観点においては、サンプル中の核酸、
蛋白または炭水化物配列の検出および／または同定のた
めの診断キットが提供され、このキットは次式刈： （式中、Ｐはポリヌクレオチド鎖、蛋白質または炭水化
物の残基であり、 ＢはＣ基を式中のベンゼン環に結合させる一ＮＨ基であ
り、アジド基に対してパラ位であっても）くう位でなく
てもよく、 Ｃは少なくとも５個の炭素原子を有するヒドロカルビル
アミン残基であり一 りは配位子またはハプテンであり、そしてＲ１ないしＲ
４は同一または異なって、Ｈ１炭素原子数１ないし５の
アルキル基、ＮＯ１、ノ・ライド基、カルボン酸基また
はアミン基である）の化合物またはその酸付加塩を含ん
でいる。

本診断キットは更に、アビジン−、ストレプトアビジン
−または抗体−酵素複合体も含みうる。

ストレプトアビジン、仔牛の腸アルカリホスファターゼ
のビオチニル化ポリマーまたはストレプトアビジン−ビ
オチニル化アシッドホスファターゼ複合体が使用できる
。

本診断キットは発色試薬も含みうる。この発色試薬には
、リン酸塩化合物および指示薬化合物を含みうる。□リ
ン酸塩化合物は、５−プロモー４−クロロ−３−インド
リルホスフェートおよびナフトールＡｓ−ＭＸホスフェ
ートから選択してよい。指示薬化合物は、ニトロブルー
テトラゾリウムおよびファーストバイオレットＢ塩から
選択してよい。

本発明の更に別の目的は、次式Ｍ： （式中、Ｐはポリヌクレオチド鎖、蛋白質または炭水化
物の残基である； Ｂは基Ｃ全ベンゼン環に結合する一ＮＨ−基であり、該
Ｂはア：）ド基に対してパラ位に位置することもできる
し、または、パラ位に位置していなくてもよい； Ｃは炭素原子を少なくとも５個有するヒドロカルビルア
ミノ基である； Ｄは配位子またはハシテンである； Ｒ１〜Ｒ４は同一であっても、或いは、異なってもよ＜
、　Ｈ，Ｃ−Ｃアルキル、ＮＯ□　ハロゲン化物基、カ
ルボン酸基またはアミノ基である）。

の化合物およびその酸付加塩を提供することである。

好ましくは、Ｐは一本鎖または二本鎖デオキシリポ核酸
（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の残基である。式
刈り化合物類は非放射性生物学的プローブとしての機能
を果すことができる。

残基Ｐ＝２選択することにより、被験サンプル中の相補
核配配列と検出可能な複合体を使用時に生成できる。残
基Ｐはクローニンブイフタ−であることもできる。この
クローニング（フタ−を修飾し、所望の核酸配列を含ま
せることもできる。この操作は公知の組み換えＤＮＡ技
法により実施できる。プラスおよびマイナス組み換えＤ
ＮＡクローンを使用することもできる。残基Ｐはクロー
ン化されたインサートを含有する一本鎖バクテリオファ
ージＭ１３ＤＮＡであることもできる。一本鎖の環状フ
ァージＭ１３ＤＮＡゾローゾが好ましい。

その理由は次の通りである。（１）複製型のＭ１３にク
ローン化すると挿入配列のどちらかの鎖の一本鎖化りロ
ーン金選別単離できる；（２）一本鎖化ゾロープは二本
鎖化プローブよりも一層効果的に相補配列にハイブリッ
ドする；　（３Ｊ　Ｍ　１３ベクターはビオチンを標識
し、そして、アビジンコンジュゲートに結合させるため
の挿入配列の他に７２００個のＤＮＡ残基残基金石ので
、プローブの検出感度が高まる；および（４１Ｍ１３ク
ローン類はジデオキシヌクレオチｒ鎖成長停止反応技法
によるＤＮＡの配列化に広範に使用されている。

前記のような試薬を使用し、配位子（または］１ブテン
）をポリマーに化学的手段により共有結合させる方法は
、Ｌａｎｇｅｒら（１９８１）　、　Ｂｒｉｇａｔｉら
（１９８３）およびＬｅａｒｙら（１９８３）が既に報
告した酵素法を陵駕する多くの効果を有する。例えば、
話を簡単にするため特にホトビオチンについて述べる（
しかし、下記の効果を享受できる配位子またはハプテン
はビオチンだけではな（、例えば、イミノビオチンおよ
びジニトロフェノールなども享受できる）。

ホトビオチン化合物のような試薬の合成および該試薬の
一本鎖または二本鎖化核酸への共有結合は迅速で、しか
も、容易である。ビオチンの化学的結合は酵素によるヌ
クレオチド類似体の加入効率によって制限されない。全
ての核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）’ｉ標識するのに本質
的に一種類の方法を使用できる。かくして、種゛々な種
類の酵素類およびプライマー類全使用する必要はない。

多量の核酸を容易に、しかも、安価に標識できる。この
ことは、多量のプローブを必要とするような、診断用キ
ット用または液状ハイブリダイゼーション反応に使用す
るための生物学的プローブの製造にとって重要である。

ビオチンを一本鎖ＤＮＡに結合させる能力は、著しく高
い（実際上は無限界の）感度を有するプローブをもたら
すことができる。例えば、２００個の核酸残基からなる
所望のＤＮＡストランド″ヲ、およそ７．０００個のヌ
クレオチド残基からなる一本鎖ファージＭ１３イクター
ＤＮＡ中に挿入することもできるであろう。ビオチンは
ベクター／インサート複合体に、例えば、２００個のヌ
クレオチド残基あたりビオチン１個の比率で、結合され
る。この程度のインサートの標識化は相補核配配列にハ
イブリッドする能力を殆んど妨げないばかりか、検出用
に利用できるビオチンの数が、目的のＤＮＡストランド
９しか使用しなかった場合に利用できるであろうビオチ
ンの数よりも３５倍も高められた。

ハイブリダイゼーション後もビオチニル化核酸プローブ
の検出感度金更に高めることもできる。

例えば、分子量１０　Ｘ　１０　　の二本鎖線状ＤＮＡ
分子をホトビオチンで光分解し、残基３００個あたりビ
オチン１個の割合で結合させた場合、ＤＮＡ１個当り全
部で１００個のビオチン残基が存在することになるであ
ろう（従って、核酸残基の数は全部で３０，０００にな
る）。ハイブリッド化されたビオチニル化核酸プローブ
の検出に使用される複合体は二本鎖ＤＮＡに結合された
ビオチン１個当りアビジン−アルカリ性ホスファターゼ
（またはイルオキシダーゼ）コンジュゲー）ＩＰ分子を
添加することによって調製される。アビジン１分子はビ
オチン４分子に結合することができるので、この大きな
線状ＤＮＡ−ビオチン−アビジン−酵素複合体は、ハイ
ブリッド化されたビオチニル化核酸プローズ上のビオチ
ン残基に結合させるのに利用できる有効なビオチン結合
部位を極めて多量に有する。

従って、理論的には、こめ方法はハイブリッド化核酸プ
ローブの検出感度を更に１００倍高めることができる。

この計算上の検出感度の向上について考えると、酵素的
方法により調製された単純な核酸プローブにより、また
、低分子量アビジン−酵素コンジュゲートの使用により
得られる検出感度を理論的に３５００５００倍高とがで
きる。実際上は、検出感度を相当なレベルＫまで高める
ことができるが、理論値のレベルにまで高めることはで
きない。なぜなら、 ハイブリッド化されたビオチニル化核酸プローブへの巨
大な酵素複合体の接合性が立体的因子により制限される
からである。

一本鎖ゾローブは二本鎖プローグよりも好ましい、なぜ
なら、相補配列は溶液状で存在し、このような配列は配
列相互間で、ニトロセルロース上にスポットされた試験
サンプル中の相補配列よりも極めて迅速にハイズリラド
化するからである。

このことは、一本鎖化プロープに比べて二本鎖化プロー
ブを使用すると効率が低下することを意味する。

本発明の核酸プローブは次のような場合の診断用Ｋ特に
好ましい。

（ｉ）　　疾病因子が免疫学的方法によって検出できな
い場合。例えば、蛋白質コー）１−もたないＲＮＡ分子
であり、従って、非免疫原性である植物パイロイト９゜ Ｌ）免疫学的方法では検出が困難な疾病因子の場合。こ
のような因子は臨床および農業分野では多数存在し、こ
の分野で本発明の核酸プローグはまず最初に使用される
であろう。

（ホ）核酸プローズ法が現に使用されている免疫学的方
法よりも優れた方法をもたらす場合。

前記のような疾病因子には次のようなものがある。

（１）肺炎マイコプラスマ （Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（２
）　　エプスタイン−パーウィルス（３）　　サイトメ
ガロ　ウィルス （４）Ｂ型肝炎　ウィルス （５）非培養性アデノウィルス（例えば、胃腸炎を起こ
す） （６）　　ヒトＴ細胞リンパ腫ウィルス（カ　クラミジ
ア 本発明の更に他の目的は、次式刈 （式中、Ｐ、　Ｂ、　Ｇ、　ＤおよびＲ１〜Ｒ４は前記
に定義した通りのものである） の化合物の製造方法を提供することであり、該方法は、 （１）　　＜ａ）次式Ｉ ４Ｒ３ （式中、Ｂ、　Ｃ，ＤおよびＲ１〜Ｒ４は前記に定義し
た通りのものである） の化合物、および （１））　　核酸、炭水化物または蛋白質配列から選択
されるゾローブ配列、を用意し； （２）　　（ａ）と（ｂ）を混合し：そして、（３）工
程（２）の混合物を、（ａ）と（ｂ）との間で反応を起
こさせるのに十分な時間にわたって電磁線源にさらす； ことからなる。

好ましくは、プローズ配列はデオキシリポ核酸（ＤＮＡ
）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の一本鎖または二本鎖配列
である。好ましくは、工程（２）は（ａｌおよび（ｂ）
ｔ−溶液状で混合することからなる。大体中性の溶液を
使用できる。溶液は任意の好適な溶剤で調製できる。エ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が好ましい。このよ
うにして調製された混合物は例えば毛細管のような適当
な容器中に密封しておくこともできる。

この混合物全低温で電磁線にさらすことができる。約５
℃未満の温度が好ましい。電磁線は可視光線の形であっ
てもよい。

本発明の方法の好ましい実施態様では、更に次の工程を
含む。

（４）未反応成分類を溶剤抽出により除去する。

アルコール溶剤抽出を実施できる。

溶剤としてブタン−２−オールを使用できる。

好ましくは、例えば、ＤＮＡおよびホトビオチンを希Ｅ
ＤＴＡ−Ｎａ塩にとかして作った中性溶液に５℃未満の
温度で可視光線を照射することによって式Ｉの化合物を
プ四−プーＤＮＡ配列に結合させ、式刈の化合物を生成
できる。光分解ホトビオチンの場合、例えば、ブタン−
２−オールで抽出することにより、未反応成分類を除去
した後、特定の核酸配列の検出と局在化が求められる用
途において、従来のビオチニル化プローブと同様な方法
で使用できる。このような使用形態は本発明の別の目的
を構成するものと考えられる。

従って、本発明の別の目的は、核酸、蛋白質、または炭
水化物配列の検出および／または同定方法を提供するこ
とであり、該方法は、 （１）　　（ａ）　　被験サンプル、および（ｂ）次式
　刈 （式中、Ｐ、　Ｂ、　Ｃ，ＤおよびＲ１〜Ｒ４は前記に
定義した通りのものである） の少なくとも１種類の化合物、 を用意し： （２）（ａ）と（ｂ）との間で複合体を形成するのに好
適な条件下で、（ａ）および（ｂ）’を接触させ；そし
て、（３）工程（２）の生成物にノーブテンまたは配位
子りの検出および／または抽出方法を適用する；ことか
らなる。好ましくは、検出および／または同定される配
列は核酸配列である。特定のＤＮＡまたはＲＮＡ分子、
特に、例えば、細菌類、真菌類、ウィルス類、酵母、植
物または動物のような生物に由来する分子の存在を測定
できる。かくして、患者またはその他の生物中の核酸含
有病因物質を決定できる。本発明に従って選択された、
式■の化合物のプローブ配列ｔは一本鎖または二本鎖Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ配列である。このような配列において
は、複合体形成工程（２）は、少なくとも一種類の核酸
プローブをサンプル中の相補核酸配列ヘハイプリダイゼ
ーションさせる工程である。相補核酸配列は適当な固体
支持体に結合させることもできる。この固体支持体とし
て硝酸セルロースのシートを使用できる。別法として、
ガラスピーズまたはポリスチレンビーズを固体支持体と
して使用することもできる。反応性アミノ基が付加され
たガラスピーズも使用できる。ポリスチレンビーズ（こ
れも反応性アミノ基を有する）はＰｉｅｒｃｅＯｈθｍ
１ｃａ１社（米国）から市販されている。

検出工程（３）は選択された。ハプテンまたは配位子に
左右される。ビオチン配位子が使用される場合、検出工
程（３）は、 （ａ）工程（２）の生成物を過剰量のアビジン−、スト
レゾトアビジンーまたは抗ビオチン抗体−酵素複合体と
反応させ；そして、 （ｂ）その生成物を抽出する；ことからなる。前記の検
出方法は周知の酵素−結合免疫吸着効力検定（ＥＬＩＳ
Ａ）試験法に類似している。検出工程（３）で使用でき
る適当な酵素は例えば、アルカリ性ホスファターゼおよ
び西洋ワサビペルオキシダーゼなどである。

本発明は添付の実施例を参照することにより更に詳しく
記述されるだろう。以下の記述は単に例示するためのも
のであって、先に述べた本発明の普遍性を何ら制限する
ものでないことを理解すべきである。

物質および方法 物質 アビジン、ｄ−ビオチン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド、５−ブロム−４−クロル−３−インドリルホスフェ
ート、ニトロズルーテトラゾリウムおよびアビジン−ウ
シ腸アルカリ性ホスファターセ複合体（１モルのアビジ
ン当たり２，１モルのアルカリ性ホスファターゼ）はＳ
ｉｇｍａ社から入手した。Ｎ、　Ｎ／−ジシクロへキシ
ルカルボジイミド９（ＤＣＣ）はＭａ、ｎｎ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ研究所から入手した。

４−フルオル−３−ニトロナニリンオヨヒＮ−（３−ア
ミノプロピル）−Ｎ−メチル−１，３−プロパンジアミ
ンＣＮ、Ｎ−ビス（３−アミノプロピル）メチルアミン
〕はＴｏｋｙｏ　Ｋａｅｅｉ社から入手した。キーゼル
ゲ＃　（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ）　６０　Ｆ　２５４およ
びアルミニウムオキシ）ｓ（ａｌｕｍｉｎｉｕｍｏｘｉ
ｄ）　６０　Ｆ　２５４のＴＬＣプレートはＭＢｒｃｋ
社から入手した。ビオチン標識ＤＮＡを検出するための
キットはＥｎｚ。

Ｂｌｏｃｈｅｍ社（Ｄｅｔｅｋ　１−ＡＣＰ、　４ｐ　
ＥＢＰ　−８２１）およびＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ研究所（ＢＲＬ、　　す８２３９ＳＡ）から入
手した。ピリジンはニンヒトゞリンから２回およびＣａ
　Ｈ２から１回蒸留した。−水銀Ｍ１３ｍｐ　９３　Ｄ
ＮＡベクター内に全長挿入物を含むアボカド・サンプロ
ツチ・バイロイ）ｌ’　（ＡＳ　ＢＶ　）　（１）　２
４７残基からなる一本鎖ＲＮＡのプラスおよびマイナス
組み換えＤＮＡクローンはＢａｒｋｅｒらのＪｏｕｒｎ
ａｘｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏ３ｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏａｓ　
ｌ　Ｑ　（１９８５）に記載の方法により作製されかつ
精製された。

アリールアジドの生成および使用を伴う全ての反応は暗
所１で実施した。４−フルオル−３−二トロア　ｘ　二
＃　７ジド（ＩＶ）はＦｌｅｅｔらのＢｉｏｃｈｅｍ、
　Ｊ。

１２８４４９〜５０８　（１９７２）に記載の方法によ
り合成した。但し、１１の４−フルオル−３−ニトロア
ニリン当たり３２ｄの濃ＨＧｔ−水混合溶媒（５：　３
゜容量／容量）ｔ−使用し、また最初の２画分は必要で
なかった。乾燥エーテル１０コ中の４−フルオル−３−
二トロフェニルア：）ド０，９１　？　（５，０ミリモ
ル）の溶液を、乾燥エーテル２０ｍ／中のＮ−（３−ア
ミノプロピル）−Ｎ−メチル−１，３−プロパンシフ　
ミ７　（Ｖ）　３．２ｍ　（２０ミリモルンの溶液に攪
拌しながら加え、この混合物ｔ３０分攪拌した。メタノ
ールを用いたアルミナでのＴＬＣは反応が完了したこと
を示した。溶媒を除去し、赤色油状物を水２５−中に溶
解した。Ｉ　Ｍ　ＮａＯＨ２５ｍ１ｔ−加え、生成物は
酢酸エチル５ｏ−ずつで２回抽出した。

水相はまだ暗赤色であったが、残存する生成物は５％よ
り少なかった。酢酸−水の混合溶媒（１：９゜容量／容
量）を用いたシリガゲルでのＴＬＣによる抽出物の分析
は、アミン検出用のエンヒト９リンを使うことによりそ
の生成物が化合物（Ｖ）　ｔ−含まないことを示した。

プールした酢酸エチル抽出物はＮａ　２　Ｓ　０４で乾
燥し、溶媒を除去して粗生成物を得、これは更に精製す
ることなく使用した。

■）の合成 ｄ−ビオチニ／Ｉ／　−Ｎ−ヒトゝロキシスクシンイミ
トゝエステル（ＩＩＩ）はＢａｙ６　ｒおよびＷｉ、１
ｃｈｅｃｋの”　Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓ工８”並＋１〜４５に記載のＤ
ＣＣ法によりｄ−ビオチン（１）から合成した。但しこ
のエステルはエーテルからの沈殿により単離し、これ以
上精製することなく使用した。Ｎ−（３−アミノプロピ
ル）−Ｎ’−（４−アジド９−２−二トロンエニル）−
Ｎ−メチル−１，３−フロパンジアミン（■；約５ミリ
モル）をピリジン−水の混合溶媒５゜ｒｎｔ（７：３．
容量／容量）中のｄ−ビオチニル−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル１．７ｒ（５，０ミリモル）含有溶
液に溶解し、この溶液を３７℃で２時間インキュベート
した。テトラヒトゞロフランー水の混合溶媒（１９：１
．容量／容量）を用いたアルミナでのＴＬＯは反応が完
了したことを示した。溶媒を除去し、残留物ｆ　０．５
　Ｍ　ＮａＨＣＯ３１００−と２−ブタノール１００−
との混合物に溶解した。

２つの相の間の界面を肉眼で見えるようにするのに大容
量が必要であった。２−ブタノール相を取り出して順次
水１００ｍ／！および飽和ＮａＣｔ１００−で洗い、そ
の後エーテル９００ｔｎｔに徐々に添加した。

この懸濁液を攪拌し、赤色析出物を沈殿させ、上清はデ
カントした。この析出物をエーテル１０〇−で洗い、真
空乾燥して生成物１．３．１’を得た（４−フルオ／ｌ
／　−３−ニトロフェニルアジドからの収率５０チ）。

融点１１４．５〜１１５℃（補正値）。元素分析（％）
；Ｃ２３Ｈ３５Ｎ９０４Ｓとしての計算値：Ｃ５１，８
゜Ｈ６，６，Ｎ２３．６実測値：　Ｃ５０，６，Ｈ６，
８，Ｎ２３．４（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ　Ｍｉｎｅｒａ
ＩＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ研究所）。メタノールを用い
たアルミナでのＴＬＧはこの生成物がＲｆＯ９７５の単
一スボッ１であることを示した（化合物■および■から
生成された対称的なジ置換生成物はＲｆ０６であった）
。アセトニトリル−水の混合溶媒（１９：　１．容量／
容量）を用いたシリカでのＴＬＣは、ビオチン誘導体シ
υ検出用の　−、＞メチルアミノシンナムアルデヒドの
スプレーｆｆ１ｆｆｌ用することによりこの生成物が化
合物１．　ＩＩおよび■を含まないことを示した。フォ
トビオチンは水に貧溶解性である。

１Ｍ酢酸０．３０ｍ／中のフォトビオチン０．１１４（
０，２１ミＩＪモル）の溶液を凍結乾燥して過剰の酢酸
を除いた。得られた吸湿性の赤色固体は非常に水溶性で
あった。λｍａｘ（水）＝２６１および４７３ｍｍ（Ｍ
＝　１９２００および３９００Ｍ　　ｃｍ　　、第３図
参照）。

フォトビオチン酢酸塩の水溶液は一１５℃の暗所で少な
くとも５ケ月間安定である。

ＤＮＰ）の合成 粗Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ’−（４−アジド−
２−二トロフェニル）−Ｎ−メチル−１，３−プロノξ
ンジアミン３００１ｎｇ（約１ミリモル）を室温で攪拌
しながら７０％ピリジン−水の混合溶媒５−に溶解した
。７０％ピリジン−水の混合溶媒５−中の１−フルオル
−２，４−）ニトロベンゼン１１０■（１ミリモ／Ｉ／
）の溶液を攪拌しながら少量ずつ加えた。橙赤色析出物
がすぐに生成し始め、この反応混合物を室温で一晩攪拌
した。次にこの混合物全回転蒸発器で濃縮して油状物を
得、これは０Ｈ２Ｃ１□２０−に溶解し、Ｉ　Ｍ　Ｎａ
、ＯＨ２０ｍｌで洗い、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、回転蒸
発器で再び濃縮して油状固体を得た。最後の微量の溶媒
を油ポンプを使った排気によって室温で除き、橙赤色粉
末のフオ）−ＤＮＰ’ｌｉ７得た。収量は２９４■であ
り、融点は９０〜９５℃であった。ジクロルエタンを用
いたアルミナでのＴＬＣはこの生成物がＲｏｏ、６の単
一スポットであることを示し、これらの条件下で出発ア
ミンは開始点に残った。

フォト−ＤＮＰギ酸塩の製造 フオ）−ＤＮＰ９■は１Ｍギ酸２００μｔで処理した。

全部の固体が溶解したとき、この橙赤色溶液を回転蒸発
器で、次に油ポンプを使って蒸発させた。フオ）　−Ｄ
ＮＰギ酸塩の残留物を水９献に溶解して一１５℃で保存
した。水中のλｍａＸ−２６１および３５８ｎｍ０ ＤＮＡ反応 ０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ中の一本鎖Ｍ１３　ＤＮＡ　１μ
ｆ／ｒｓｔおよび７オ）−ＤＮＰ　Ｏ，５μｆ１ｍｌを
ガラス毛細管に密封し、これに０℃で１５分間可視光線
を照射した。この溶液を最終濃度が０．１Ｍ　Ｎａ、、
ＣＯ８または０、１　Ｍ　、ＮａＯＨとなるように希釈
し、等容量の酢酸エチルで３回抽出した。水相は５Ｍ緩
衝液を用いて１Ｍ酢酸Ｎａ　（ｐＨ５，２）となし、２
．５容量の冷エタノールを添加しかつ一２０℃で２時間
冷蔵することＫよりＤＮＡ’ｉ沈殿させた。ＤＮＰ−Ｄ
ＮＡの赤色沈殿物は遠心分離により得た。対照実験は未
反応の光分解したフオ）　−ＤＮＰがこの精製法によっ
て除かれたことを示した。

抗ＤＮＰ抗体（ポリクローナル）の製造これらは標準方
法によってつくられた。ＤＮＰ基をウシ血清アルブミン
へ１−フルオル−２，４−ジニトロベンゼンを経てカッ
プリングさせ、このＤＮＰ−蛋白質をウサギに注射した
。集めた血清は３０％飽和硫酸アンモニウムを用いて分
画化し、脱塩後の沈殿物を抗体源として使用した。

フォトビオチン酢酸塩での核酸の標識化非常に弱い光線
のもとで、水１〜２５μを中のフォトビオチン酢酸塩１
μｆ／１１１の溶液を水または中性０．１　ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ中の核酸１μ２／μｔの溶液等容量に加えた。この
溶液をシリコン処理したガラス毛細管（Ｂｒａｎｄミク
ロピはット、５〜５０１１ｔ）内に密封し、サンランプ
（Ｐｈｉｌｉｐｓ　Ｕｌｔｒａｐｈｉｌ　ＭＬＵ３００
Ｗ）から１０ｃＩｎ下の氷−水浴中で冷却し、１５分間
照射した（第３図参照）。２μ２またはそれ以上の７オ
トビオチン酢酸塩を使用した場合には、窒素の気泡が発
生した。その後この溶液を０，１Ｍトリス−ＨＧＩ　（
ｐＨ９）　５０μｔに加え、水を加えて容量ｅ１００μ
ｔに増し、こめ溶液は２−ブタノール１００μｔずつで
２回抽出して濃縮した。水相の容量は水を加えて３５μ
ｔに増し、次に１Ｍ酢酸ナトリウム１５μｔおよび冷エ
タノール１２５μｔｆ加え、固体ＣＯ２中で１５分間冷
却することによってビオチン標識核酸を沈殿させた。遠
心分離（Ｅｐｐθｎａｏｒｆミクロ遠心分離器、４℃、
１５分）にかけて、肉眼で見たとき赤色のはレットを得
た。このベレットは７０容量／容量チ冷エタノールで洗
い、真空乾燥し、０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡに溶解シタ。

光分解に適することが見出された他のランプはＰｈ１ｌ
ｉｐｅ　ＨＰＬ−Ｎ　４００ＷおよびＯｓｒａｍ　ＭＢ
／Ｕ４００Ｗであった。

ドツト−プロット（Ｄｏｔ−Ｂ１０ｔ）ハイブリダイゼ
ーションニトロセルロース１ｃＩｎ当たり溶液約０．１
ｍｇ’ｉ含むヒートシール可能なポリテンバックが全て
のインキュベーション工程のために使われた。ニトロセ
／ｌ／　ｌ：Ｉ−スフイルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、
孔寸法０．４５μｍ）を水にひたし、続いて２ｏ　ｘ　
８８０（ＳＳＣ：　０．１５ＭＮａＣ２，０，０１５Ｍ
クエン酸ナトリウム）にひたした。

乾いたフィルターにＱ、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ　１〜２　
μＬ中の核酸全点在させ、乾燥し、真空下に８０℃で２
時間ベーキングした。その後フィルターはプレハイブリ
ダイゼーション用緩衝液（５０容量／容量チの脱イオン
ホルムアミド、５ｘＳＳＣ，５ＱｍＭ燐酸ナトリウムｐ
Ｈ６，５０，２５■／−の超音波処理して変性したサケ
精子ＤＮＡ、０．２％ＳＤＳ、　５ｍＭＥＤＴＡおよび
０．２　Ｗ／−ずつのウシ血清アルブミン、フィコール
４００およびポリビニルピロリドンＭｒ　４００００　
）中で少な（とも４時間４２℃においてプレハイブリッ
ド化させた。ハイブリダイゼーションはプレハイブリダ
イゼーション用緩衝液４容量、０．５ｆ／ｒｎｔナトリ
ウムデキストランサルフエート１容量および２Ｑｎｙ、
、７ｍｇビオチン標識Ｍ１３ＤＮＡプローブを含む緩衝
液中５５℃で２０時間振とう水浴を用いて実施した。そ
の後フィルターはたびたび攪拌しなから２ｘＳＳＣ，０
，１％５ＤＳ（３Ｘ１５分、室温）およびｏ、１ｘＳＳ
Ｃ，Ｏ，ｔチＳＤＳ　（３×３０分、５５℃）で洗った
。

乾いたフィルターはウシ血清アルブミン３０　ｑ／ｍＡ
を含むＳＴＭＴ緩衝液（ＩＭ　ＮａＣ４，０，１Ｍ　）
リス−ＨＧＬ　ｐＨ７，５，２ｍＭ　ＭｇＣｚ２０．０
５容量／容量チトライトンＸ−１００）中４２℃で３０
分インキュベートした。乾かした後、このフィルターは
Ｓｉｇｍａ社製アビジン−アルカリ性ホスファターゼ１
μ２／−を含むＳＴＭＴ緩衝液中室温で１０分インキュ
ベートし、その後たびたび攪拌しなからＳＴＭＴ緩衝液
（３Ｘ１０分）およびＳＴＭ緩衝液（ＩＭ　ＮａＣｔ、
０．１Ｍトリス−ＨＣｔｌ）Ｈ９，５，５ｍＭ　ＭｒＣ
ｔ２；　２Ｘ５分）で洗った。赤色のために、フィルタ
ーは基質溶液（０，３３１Ｆ／ｍ二）０ブルーテトラゾ
リウム、０．１７岬／ゴ５−ブロム−４−タ日々−３−
インドリルホスフェートおよび０．３３容量／容量４　
Ｎ、　Ｎ−ジメチルホルムアミドを含むＳＴＭ緩衝液、
但しＮａｃｔは０．１Ｍのみを含む）と共に暗所におい
て室温でインキュベートした。この反応はフィルター１
１０ｍＭ　）リス−ＨＣ４ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴ
Ａで洗うことＫより停止させた。

２、　　ＢＲＬ製キット ストレプトアビジン、ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ
のビオチニル化重合物、５−ブロム−４−クロル−３−
インド９リルホスフエートおよびニトロブルーテトラゾ
リウムが本質的に製造者の使用説明書に従って用いられ
た。但し検出法の工程１〜１０における緩衝液１〜３中
の０．１　Ｍ　ｋＪａＧＬの代りＫ　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１
ｔが使われた。

３、　　Ｅｎｚｏ　Ｂｉｏｃｈｅｍ製キットストレプト
アビジン−ビオチニル化酸性ホスファターゼ複合体、ナ
フトールＡＳ−ＭＸホスフェートおよびファストバイオ
レットＢベースが本質的に製造者の使用説明書に従って
用いられた。

ニトロセルロースフィルターへ結合したＤＮＰ−ＤＮＡ
の検出 ファージＭ１３−水銀ＤＮＰ−ＤＮＡおよびＤＮＰ−ウ
シ血清アルブミンをニトロセルロースフィルター上へ点
在させ、このフィルターを真空下に８０℃で１時間ベー
キングした。ＤＮＰ基を含まない対照のＤＮＡおよび蛋
白質も点在させた。緩衝塩溶液中の３％Ｂ５Ａ１用いて
４２℃で２０分平衡化した後、このフィルターは燐酸緩
衝食塩水（ＰＢＳ）−０，０５％ツイーン２０で２回洗
い、その後適当に希釈した抗ＤＮＰ抗血清とともに室温
で１時間インキュベートした。このフィルターはＰＢＳ
−０，０５チツイーン２０で２０分ずつ２回洗い、次に
西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅ　ｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダ
ーゼに結合したヤギー抗ウサギ抗体の市販品と共にイン
キュベートシた。室温で３０分後、フィルターは再びＰ
ＢＳ−０，０５チツイーン２０で２回洗い、トリス−Ｈ
Ｃｔ　（ｐＨ７，５）中の０．５　ｔ＋ｖ／ａｔジアミ
ノ（ンジジン、０．０４％ＣｏＣ１ｔｚ　　Ｏ，１チＨ
２０□の基質混合物を加えた。陽性の発色反応が１０分
でおこり、フィルター上に点在させたＤＮＰ−ＤＮＡお
よびＤＮＰ−蛋白質のみが発色した。こうして、ＤＮＰ
−蛋白質に対してつくられたＤＮＰ−抗体はフォト−Ｄ
ＮＰ　５用いてつ（られたＤＮＰ−ＤＮＡとも反応する
。

以下の記述は第３図〜第６図について説明する。

第３図　光分解前および光分解後のフォトビオチン酢酸
塩の吸収スペクトル。７オトビオチン酢酸塩の水溶液（
０，５μ２／μｔｒ　２０Ｐｔ）は光分解前（実線）お
よび光分解後（破線）のスペクトル分析のために水を用
いて１．２１ｎｌの容量に希釈した。

第４図　ニトロセルロースへ結合したビオチン標識ＤＮ
Ａの３種の市販酵素複合体を用いた比色定量検出。（Ａ
）検出感度を決定するためのスポット当たりのＤＮＡ量
の変化。一本領Ｍ１３ＤＮＡはフォトビオチン酢酸塩で
標識し、ニトロセルロース上へ点在させ、ベーキングし
て検出した。ＣｏｎはＭ１３　ＤＮＡ　１２８　ｐｆの
対照である。検出系および反応時間は次の通りであった
。レーンｌ　：　Ｅｎｚ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ製ストレプトアビジン−ビオチニル化酸
性ホスファターゼ、−晩；レーン２　：　ＢＲＬ製スト
レゾトアビジンおよびビオチニル化アルカリ性ホスファ
ターゼ重合物、５時間；レーン３　：　Ｓｉｇｍａ社製
アビジン−アルカリ性ホスファターゼ、５時間。（Ｂ）
検出の相対感度に対するＤＮＡのビオチン標識化の程度
の影響。Ｍ１３ＤＮＡは所定最終濃度のフォトビオチン
酢酸塩で標識した。各ＤＮＡのサンプル（２０ｐ？）は
ニトロセルロース上へ点在させてイーキングしくＡ）の
゛如く検出した。ただしレーン２での反応時間は一晩で
あった。

第５図　ニトロセルロースへ結合した標的核酸ヘハイズ
リダイズした後のビオチン標識Ｄ　Ｎ’Ａゾローゾの３
種の市販酵素複合体を用いた比色定量検出。（Ａ）検出
感度を決定するためのスポット当たりのクローン化ＡＳ
ＢＶ　　ＤＮＡ量の変化。所定量の標的ＤＮＡ挿入物ヲ
含むＡＳＢｖの一本領Ｍｘ３ＤＮＡフラスクローンのサ
ンプルをニトロセルロース上へ点在させてベーキングし
た。ＣｏｎはＭ　１３　ＤＮＡ１ｎｊの対照である。プ
ローグは所定最終濃度のフォトビオチン酢酸塩でＡＳＢ
ＶのＭ１３マイナスクローンを標識することによりつく
った。プレノーイブリダイゼーション、ハイブリダイゼ
ーションおよび検出は上述の通りであった。検出系およ
び反応時間は次の通りであった。レーンｌ　：　Ｅｎｚ
。

Ｂｉｏｃｈｅｍ製酵素複合体、−晩；　Ｌ／−ｙ２：　
ＢＲＬ製酵素複合体、５時間；レーン３〜５　：　Ｓｉ
ｇｍａ社製酵素複合体、５時間。ＣＢ）検出感度全決定
するためのスポット当たりのＡＳＢＶ　ＲＮＡ量の変化
。

精製ＡＳＢＶのサンプル（所定量）はニトロセルロース
上へ点在させてベーキングした。Ｃｏｎは酵母菌の低分
子量ＲＮＡ５１２ｐｒの対照である。検出は（Ａ）のレ
ーン１〜３と同じであった。

第６図　感染したアボカド葉の部分精製核酸抽出物中の
プラスＡＳＢＶ配列のＮＯｒｔｈθｒｎハイブリダイゼ
ーション分析。抽出物（レーン１，５μｉ）はグリオキ
サル化し、１．９％アガロースゲルによる電気泳動にか
け、ニトロセルロースへ移した。ノ１イブリダイゼーシ
ョンのためにＡＳ、ＢＶのビオチン標識Ｍ１３ＤＮＡマ
イナスクローンを使用し、また比色定量による検出（２
時間反応）のためにＳｉ　ｇｍａ社製酵素複合体を使用
した。顕著なバンドおよびマーカー色素の位置は標識さ
れる。

フォトビオチン酢酸塩での核酸の標識化通常、核酸は光
分解の間の紫外線による損傷の可能性を最小限に抑える
ためにガラス毛細管内に密封した。フォトビオチンでの
核酸の標識度を測定するために、１４Ｇ−フォトビオチ
ン酢酸塩をＭａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄ
ｓに記載の調製方法の微小規模での変法によりａ−（＊
ルボニルー　Ｃ）ビオチン（５８ｍＯｉ／ミリモル；　
Ａｍｅｒｓｈａｍ　）から合成した。１４Ｃ−フォトビ
オチン酢酸塩０．５μ２／μｔ２ｏ、ｏ５ｍＭＥＤＴＡ
５μを中の一本領７７−ジＭ１３ＤＮＡ０．５μ２／μ
ｔとともに光分解しかつこのビオチン標識Ｄ　Ｎ　Ａ　
ｆ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓに記
載の如く精製した場合、１０００個の残基当たり約７個
のビオチンが結合した。１４（Ｈ−フォトビオチン酢酸
基金ＤＮＡとの混合以前に光分解する対照実験は、この
精製方法がＤＮＡに結合せずに光分解された全てのフォ
トビオチンを除去することを示した。

アビジンに容易に結合しやすいＤＮＡ上のビオチンの数
は過剰のアビジンをビオチン標識Ｍ　１３　ＤＮＡ（ビ
オ−Ｍ１３ＤＮＡ）に加え、アビジン−ビオ−Ｍ　１３
　ＤＮＡ複合体を過剰のアビジンからゲルｆ過（Ｉ　Ｍ
　Ｎａ０４５０　ｍＭ燐酸ナトリウムｐＨ７で緩衝化し
たＴＳＤＫ　３０００　ＳＷカラムによるＨＰＬＣ）に
より分離し、そしてビオ−Ｍ１３ＤＮＡおよびアビジン
画分の２１５ｎｍでの吸光度の変化を測定することによ
って決定した。Ｍ　１３　ＤＮＡ　０．５μ２／μｔ’
ｆｃ　Ｏ，０５ｍＭ　ＥＤＴＡ中０．１２５．０．５お
よび１μＶ／μｔの濃度の７オトビオチン酢酸塩で標識
した場合、１０００個の残基当たり約２．５．４．７お
よび１０個のアビジンが結合した。これらの概算値はカ
ラムからの成分の不完全な回収のために近似すると考え
られた。ビオチン結合部位を４つ有する各アビジンがた
だ１個のビオチンに結合しかつ全てのビオチンが結合さ
れたと仮定すると、これらの概算値はＤＮＡの１０００
個の残基当たりに結合したビオチンの数に相当する。こ
の結果はエタノール沈殿後の赤色ビオ−Ｍ１３　ＤＮＡ
ペレットの相対的な色の濃さと一致し、また　Ｃ−７オ
トビオチンで標識することＫより得られた概算値と一致
した。

フォトビオチン酢酸塩の２μ２／μｚ（ＤＮＡ残基、Ｊ
：す１．２モル過剰）またはそれ以上の最終濃度はフォ
トビオチンのＤＮＡ塩の沈殿を引き起こすので、フォト
ビオチン酢酸塩および核酸は双方ともプローブの慣例的
製造に対して０．５μ？、／１−１１の濃度で用いられ
た。

この標識方法は１〜２５μ２の一本鎖ＲＮＡ　ＤＮＡを
使用したが、更に大きな規模でのビオチン標識ゾロープ
の製造に適している。１５μｍまたはそれ以上のＤＮＡ
’ｉ標識した場合、赤色Ｒレットはエタノール沈殿後、
明らかに肉眼で見ることができた。二本鎖ＤＮＡおよび
一本鎖ＲＮＡもまた赤色核酸啄レットの場合に示した方
法と同じ方法およびニトロセルロースフィルター上での
比色定量検出（下記参照）により効果的に標識された。

フォトビオチンでの一本領環状Ｍ１３　ＤＮＡの標識化
は、電子顕微鏡写真によるＤＮＡの本来の形態に殆んど
影響を及ぼさ−なかった。こうして、１００チの環状分
子を含むＤＮＡは７０％の環状分子、２５％の全長線状
分子および５％の全長より短い線状分子をもつビオチン
標識生成物を与えた。

Ｍ１３　ＤＮＡとビオチンとの共有結合はニトロセルロ
ースへの固定化およびト９ットープロツ訃ハイブリダイ
ゼーション実験で示したハイブリダイゼーション反応の
ための普通の条件に対して安定であった。ビオ−Ｍ１３
　ＤＮＡのサンプルはニトロセルロース上へ点在させ、
真空下８０℃で０．５〜４時間ベーキングした。更に、
他のサンプルは２時間ベーキングした後にプレハイブリ
ダイゼーション用緩衝液中５５℃で４時間、続いてハイ
ブリダイゼーション用緩衝液中６５℃で２０時時間イン
キュベートシ。これらのサンプルは全てＳｉｇｍａ社製
アビジン−アルカリ〕生ホスファターゼ宅同じ着色応答
を与え（下記参照）、用いたどの条件下でもＤＮＡ結合
ビオチンの損失がなかったことを示した。ハイブリダイ
ゼーション実験（下記参照）は０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ中
リビオすＭ１３　ＤＮＡプローブの溶液が一１５℃で少
なくとも５ケ月間安定であることを示した。

ファー：）Ｍ　１３一本領ＤＮＡに結合したビオチンの
安定性 標準方法によりつくられたビオチン標識Ｍ１３ＤＮＡは
１０ｍＭ　）　リス−ＨＣｔ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ（
ｐＨ８）中１００℃で６０分までの種々の時間の間加熱
するか、或いは０．５Ｎ　ＮａＯＨ中２５℃で３０分ま
での種々の時間インキュベートした。サンプル’ｋＯ，
ＩＭ酢酸ナトリウムで希釈し、種々のＤＮＡ濃度のサン
プル３μｔはニトロセルムース上へ点在させた。

真空下８０℃でベーキングしてＤＮＡを固定した後Ｓｉ
ｇｍａ社製アビジンーアルカリ性ホスファターゼを使っ
てフォトビオチン環ＲＤＮＡの比色定量による検出を実
施した。スポット当たり５μ？以上のサンプル中のＤＮ
Ａを検出する能力に差は全くなかった。それ故、ＤＮＡ
へのビオチン結合は用いた条件下で安定であった。

ニトロセルロースへ点在させた７オトビオチン標識＃醋
θ）Ｌ＋＋糸ｃｂ　ＪＬ　ｌ／レフ込山ニトロセルロー
スフィルターヘビオーＭ１３　ＤＮＡ全点在させてベー
キングし、その後プレハイズリダイゼーションおよびハ
イブリダイゼーションを経ることな（Ｍａｔｅｒｉａｌ
ｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓに記載の３種の比色定量検
出法金行った。Ｓｉｇｍａ社製アビジン−アルカリ性ホ
スファターゼ複合体；　ＢＲＬ製ストレプトアビジン、
アビジン様蛋白質、およびビオチニル化アルカリ性ホス
ファターゼ重合物；ならびにＥｎｚｏ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
製ストレプトアビジン−ビオチニル化酸性ホスファター
ゼ複合体は全て約４ｐ？（２ｘｌＯモル）のビオ−Ｍ１
３　ＤＮＡのより低い検出感度を与えた。アルカリ性ホ
スファターゼ複合体は酸性ホスファターゼ複合体（−晩
）よりも速く（５時間）最大感度に達した。

第４Ａ図のレーン３の予期せぬ結果は、アビレフ１モル
当たりアルカリ性ホスファターゼ２．１モルを含みかつ
デオキシリボヌクレアーゼ活性（結果は示されない）を
有するＳｉｇｍａ社製複合体がＢＲＬ製重合性酵素複合
体（第４Ａ図、レーン２）と同じ感度であるということ
であった。しかしながら、３種の酵素複合体によるビオ
−Ｍ１３　ＤＮＡの相対的検出感度はビオチンでのＭ１
３　ＤＮＡの標識化の程度に関係していた（第４Ｂ図）
。Ｅｙ）ｚ。

Ｂｉｒｃｈｅｍ製およびＳｉｇｍａ　ａ製の複合体（第
４Ｂ図、レーン１およびレーン３）にとって、色の濃さ
はビオ−Ｍ１３　ＤＮＡｆｔつ（るのに用いられたフォ
トビオチン酢酸塩の濃度に大よそ比例し、それ故ビオチ
ンでのＤＮＡの標識化の程度に比例していた（上記参照
）。こうして、これらの２種の複合体を使用する場合、
ｒットープロット法はフォトビオチンでの核酸の標識度
を相対的に見積るのに有用であるだろう。対照的に、Ｂ
ＲＬ製重合性酵素複合体を使用した場合には、ＤＮＡの
ビオチン標識度にともなう色の濃さの変化が殆んど見ら
れなカッタ（第４Ｂ図、レーン２）。こうして、この酵
素複合体はビオチン標識化の程度が低いＤＮＡの検出に
対して最高の感度をもつと思われる。

アビジンは非常に塩基性の蛋白質であるので、静電的に
核酸に引き寄せられる。それ故、イオンの相互作用全解
離することにより非特異性の基底色（ｂａｃｋｇｒｏｕ
ｎｄ　ｃｏｌｏｕｒ）を減するために比色定量用緩衝液
中には１ＭＮａｃｔが必要とされた。Ｅｎｚ。

ＢｉｏｃｈθｍおよびＢＲＬからのキットはアビジンの
代りにビオチン結合蛋白質のストレットアビジンを使用
しており、このことはストレプトアビジンが酸性の等電
点をもつために静電的に核酸に引き寄せられないからで
ある。

Ｅｎｚｏ　Ｂｉｏｃｈｅｍ製ストレプトアビジン−セイ
ヨウワサビベルオキシダーゼ複合体（Ｄｅｔｅｋ　１−
　ｈｒｐ。

４ＥＢＰ−８２０）は、本質的に製造者の使用説明書に
従って過酸化水素およびジアミノベンジジン基質を用い
たとき、３０ｐｔ　Ｉ）　ヒ＃−Ｍ　１３　ＤＮＡ　ノ
より低い検出限度を有していた（結果は示されない）。

Ｓｉｇｍａ社製アビジン−被ルオキシダーゼ複合体（す
Ａ３１５１）は、同じ条件下で用いたとき、更に低い感
度であったが検出限度は測定されなかった。これらの結
果はＬｅａｒｙらのものと合わせてアルカリ性ホスファ
ターゼ複合体が西洋ワサビイルオキシダーゼ複合体より
感度がよいということを示している。

固定した核酸へハイブリッド化した後の７オトビオニト
ロセルロースフィルターへＡＳＢＶのＭ１３ＤＮＡプラ
スクローンを点在させ、イーキングし、プレハイプリツ
ビ化させ、次にＡＳＢＶのビオ−Ｍ１３　ＤＮＡマイナ
スク目−ンとハイノリダイズさせた。３種の比色定量検
出法は全て標的ＡＳＢＶ配列約０．５　ｐｒ　（６Ｘ　
１０−１８モル）の同様により低い検出感度を与えた（
第５Ａ図、レーン１〜３）。アルカリ性ホスファタ〜ゼ
複合体（レーン２および３）は酸性ホスファターゼ複合
体（レーン１、−晩）よりも速く（５時間）最大感度に
達した。

０．１２５〜ｌμｙ／ＩＩｔの濃度の７オトビオチン酢
酸塩で標識したビオーＭ１３ＤＮＡプローブは、Ｓｉｇ
ｍａ社製アビジン−アルカリ性ホスファターゼでもって
同様により低い検出レイル全厚えた（第５Ａ図、レヘン
３・−６）。この結果はニトロセルロースへ直接点在さ
せたビオ−Ｍ１３　ＤＮＡサンプルの検出に対して得ら
れた結果（第４Ｂ図、レーン３）からすると予期されな
いことであり、ビオチンでの標識度がより高いプローブ
を用いても感度の増加は得られないだろうということを
示唆している。

ビオ−Ｍ１３　ＤＮＡマイナスプローブはまたニトロセ
ルロース上へ点在させたＡＳＢＶのＲＮＡサンプルにも
ハイブリダイズした（第５Ｂ図）。約４ｐ？のＡＳＢＶ
のより低い検出感度は３２ｐで標識した一本ｔ［Ｍ１３
　ＤＮＡプローブを用いて得た感度に等しい。アボカド
のＡＳＢＶの診断にビオーＭ１３ＤＮＡプローズを用い
る予備的試みは今までのところ成功していない。種々の
正常なアボカド葉の部分精製核酸抽出物を調製してＢａ
ｒｋｅｒら（１９８５）の方法でニトロセルロースへ点
在させた場合、いくつかのサンプルはハイブリダイゼー
ション中にビオ−Ｍ１３　ＤＮＡプローブと結合して偽
陽性へと導いた。このプローブは精製したココナツト・
カダング・カダング・バイロイ）’　（１００ｎｆ　Ｒ
ＮＡ／スポット）、タノζコモザイクウィルスＲＮＡ（
５μり／スポット）、ヒヨコ胚ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ　（
２，ｓ　／ｊｒ／スポット）またはせん断したサケ精子
ＤＮＡＫ結合しなかったので（結果は示されない）、偽
陽性は部分精製抽出物中の非核酸物質へのプローブの結
合によると推定された。

ビオ−Ｍ１３　ＤＮＡプローブはＮＯｒｔｈｅｒｎ　ハ
イブリダイゼーション分析による特異的なＲＮＡ配列の
検出に上首尾で用いられた（第６図）。ＡＳＢＶに感染
したアボカド葉の部分精製核酸抽出物はグリオキサル化
し、アガｐ−スゲルの電気泳動にかケ、ニトロセルロー
スへ移し、ＡＳＢＶのビオ−Ｍ１３　ＤＮＡマイナスク
ローン金使って試験した。

Ｓｉｇｍａ社製酵素複合体での比色定量検出はモノマー
性の２４７個の残基からんるＡＳＢＶのほかにオリゴマ
ー形（ダイマーからペンタマーまで）のパターンと、２
つの小さなバント９の標識されたＸ２およびＸ３ヲ示し
た。検出／モターンおよび検出感度は３２ｐで標識した
一重鎖ＤＮＡプローブを用いて得たものに等しかった。

基底色の程度はハイブリダイゼーション混合物中の用い
られたビオ−Ｍ１３　ＤＮＡプローブの濃度に依存して
いた。１００〜１０００ｎｆ／ｄのプローブ濃度は許容
し得ない基底色金示したが、プローブ濃度ｆ２０Ｑｆ／
ｍｌ／Ｃ低下させることによって有意に差のない基底色
が得られた。これらの基底色はビオチンで標識した二本
鎖ＤＮＡおよび一本＠ＲＮＡプローゾが有意な基底色な
しに１００ｎＰＡの濃度で用いられたのでＭ１３　ＤＮ
Ａの性質でありうる。

フォトビオチン酢酸塩での蛋白質の標識化アリールニト
レンは蛋白質の基を含む広範囲の官能基と反応すること
ができるので、フォトビオチンはビオチンでの蛋白質の
迅速な標識化のための有力な新しい試薬であると考えら
れた。５ｍＭＮａＣ４ｏ、ｏｓ　ｍＭ　Ｚｎ０ｔｚ　５
０μを中の７オトビオチン酢酸塩１０μ２／μｔおよび
ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（全蛋白質の８５〜９
０％）とラフ血清７Ａ／プミｙ　（Ｓｉｇｍａ、すＰＯ
６５５）１μ２／μｔの混合物の溶液全ガラス毛細管の
中に密封し、核酸のところで述べた如（３０分照射した
。２−メタノール５０μｔ、続いて０．１Ｍ）リス−Ｈ
０Ｉ　（ｐＨ９）　１００μｔｆ加え、水相は２−メタ
ノールで３回抽出した。先に述べたものと同様のゲルｆ
過検定は、アルカリ性ホスファターゼ（Ｍｒ　１０００
００　）　１分子当たりアビジンに容易に結合するビオ
チンが約５個存在することを示した。酵素活性はこの処
理により本質的に変わらなかった。トリス−クエン酸緩
衝塩は光生成したアリールニトレンのスキャベンジャ−
として作用すると思われたので、光分解に先だって透析
により市販の酵素からこれらｔ除（必要があった。

安定な非放射性ハイブリダイゼーションプローブの製造
に関してここで述べた方法は、従来技術の標識方法の欠
点の少なくともある面を克服する。

この方法は、迅速で、確実′でしかも安全であり、そし
て一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡのビオチンで
の小規模もしくは大規模の安価な標識化を可能にする。

標識された核酸は結合しなかった試薬から簡単に精製さ
れ、そして標識化はフォトビオチン標識核酸が赤色であ
るので肉眼で監視することができる。一本鎖ＤＮＡはこ
の標識方法によって減成されずまた架橋されない。１０
０〜４００個の残基当たり１個のビオチンという程度の
核酸の推挙された標識度は、プローブによる相補的配列
の認識を妨害しないと思われる。ビオチン標識ＤＮＡプ
ローブは標準的なノ・イゾリダイゼーション条件下に安
定であり、少なくとも５ケ月間にわたってハイブリダイ
ゼーション反応で再現性のある結果をもたらす。

１００〜４００個の残基当たり１個のビオチンで標識さ
れた一本領Ｍ１３　ＤＮＡプローブは、Ｓｉｇｍａ社、
ＢＲＬまたはＥｎｚｏ　Ｂｉｏｃｈｅｍから入手したア
ルカリ性または酸性ホスファターゼを使って、ニトロセ
ルロース上でのト９ットーブロットハイプリダイゼーシ
ョン反応において０．５ｐ？（６Ｘ１０　　モル）とい
う少量の標的ＤＮＡを検出した（第５Ａ図）。

ドツト−プロット法（第５Ｂ図）およびＮＯｒｔｈｅｒ
ｎプロット法（第６図）での標的ＲＮＡの検出は放射性
同位元素を用いた方法と感度が同じであった。

Ｌｅａｒｙらの結果とは相違して、単純なアビジン−ア
ルカリ性ホスファターゼ複合体は重合性酵素複合体と同
程度の感度であることが見出された。

フォトビオチン標識プローブは植物や動物の病気の日常
的な診断、現場でのノ・イブリダイゼーシヨン、ハイブ
リッド選択による混合物からの特異な核酸の純化、およ
び特異な核酸結合蛋白質の純化に応用できる。この標識
方法は大量のプローブを必要とするハイブリッド選択反
応に％に適している。

フォトビオチン酢酸塩もまた蛋白質の標識試薬として使
用できる。これは水性有機溶媒中で使用される蛋白質の
ビオチン標識用の他の試薬の代りとなる。更に、Ｈ−ま
たは　Ｃ−フォトビオチンはビオチン結合蛋白質の７オ
トアフイニテイーラベリングに使用しうる。

【図面の簡単な説明】

第１図はフォトビオチンの合成経路を示す。 第２図はハイブリダイズしたプローブの７・イゾリツド
構造の模式図を示す。 第３図は光分解前および光分解後のフォトビオチン酢酸
塩の吸収スはクトルを示す。 第４図はニトロセルロースに固定したビオチン標識ＤＮ
Ａの３種の市販酵素複合体を用いた比色定量による検出
結果を示す。 第５図はニトロセルロースに固定した標的核酸ヘハイブ
リダイズした後のビオチン標ｆｉＤＮＡプローブの３槌
の市販酵素複合体を用いた比色定量による検出結果を示
す。 第６図は感染したアボカド葉の部分精製核酸抽出物中の
プラスＡＳＢＶ配列のＮＯｒｔｈｅｒｎハイズリダイゼ
ーション分析結果を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｂは基Ｃとベンゼン環とをつなぐ−ＮＨ−基で
   あつて、アジド基に対してパラ位にあつてもパラ位にな
   くてもよく； Ｃは少なくとも５個の炭素原子を含むヒドロカルビルア
   ミン部分であり； Ｄはリガンドまたはハプテンであり； Ｒ＿１〜Ｒ＿４は同一かまたは異なつて、水素原子、炭
   素原子数１〜５のアルキル基、ニトロ基、ハライド基、
   カルボン酸基またはアミノ基から選択される） で表わされる化合物またはその酸付加塩。 （２）Ｂはアジド基に対してパラ位の−ＮＨ−基である
   、特許請求の範囲第１項記載の化合物。 （３）ヒドロカルビルアミン部分Ｃは次式の基：▲数式
   、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿８は▲数式、化学式、表等があります▼ま
   たは▲数式、化学式、表等があります▼ であり； Ｒ＿５、Ｒ＿６、Ｒ＿７、Ｒ＿９、Ｒ＿１＿０は同一か
   または異なつて、水素原子、炭素原子数１〜５のアルキ
   ル基またはハライド基から選択され； ｎは０〜５の整数であり； ｍは１〜１０の整数であり； ｐは０または１である） から選択される特許請求の範囲第２項記載の化合物。 （４）Ｃは次式の基： ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ −（ＣＨ＿２）＿３−ＮＨ（ＣＨ＿２）＿４−ＮＨ−−
   （ＣＨ＿２）＿３−ＮＨ（ＣＨ＿２）＿４−ＮＨ−（Ｃ
   Ｈ＿２）＿３−ＮＨ−から選択される特許請求の範囲第
   ３項記載の化合物。 （５）Ｄは核酸に結合したときペプチド蛋白質または他
   の分子と検出可能な複合体を形成しうるか、または標識
   ポリヌクレオチドを未標識ポリヌクレオチドから選択的
   に抽出できるようにする部分である、特許請求の範囲第
   ４項記載の化合物。 （６）Ｄはビオチン、イミノビオチンまたはジニトロフ
   ェニル（ＤＮＰ）基もしくはその誘導体から選択される
   特許請求の範囲第５項記載の化合物。 （７）Ｒ＿１〜Ｒ＿４は各々水素原子である特許請求の
   範囲第６項記載の化合物。 （８）Ｒ＿１、Ｒ＿２およびＲ＿４は水素原子であり、
   Ｒ＿３は−ＮＯ＿２である特許請求の範囲第７項記載の
   化合物。 （９）次式の化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ から選択される特許請求の範囲第１項記載の化合物。 （１０）特許請求の範囲第１項記載の化合物の酢酸塩ま
   たはギ酸塩。 （１１）式VII： ▲数式、化学式、表等があります▼（VII） （式中、Ｂ、ＣおよびＲ＿１〜Ｒ＿４は下記定義通りの
   意味を有する） で表わされる化合物を式VIII： ▲数式、化学式、表等があります▼（VIII） （式中、Ｄはリガンドまたはハプテンであり、Ｒ＿９は
   水素原子、炭素原子数１〜５のアルキル基またはハライ
   ド基から選択され、ｎは０〜５の整数である） で表わされる化合物と反応させることからなる式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｂは基Ｃとベンゼン環とをつなぐ−ＮＨ−基で
   あつて、アジド基に対してパラ位にあつてもパラ位にな
   くてもよく； Ｃは少なくとも５個の炭素原子を含むヒドロカルビルア
   ミン部分であり； Ｄはリガンドまたはハプテンであるがジニトロフェニル
   基ではなく； Ｒ＿１〜Ｒ＿４は同一かまたは異なつて、水素原子、炭
   素原子数１〜５のアルキル基、ニトロ基、ハライド基、
   カルボン酸基またはアミノ基から選択される） で表わされる化合物またはその酸付加塩の製造方法。 （１２）式VIIの化合物は式IX： ▲数式、化学式、表等があります▼（IX） で表わされ、式Ｘ： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｌは離脱基である） の化合物を式Ｘ I ： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿５、Ｒ＿６、Ｒ＿７は同一かまたは異なつ
   て、水素原子、炭素原子数１〜５のアルキル基またはハ
   ライド基から選択され、ｎは０〜５の整数であり、ｍは
   １〜１０の整数である） の化合物と反応させることにより製造される、特許請求
   の範囲第１１項記載の方法。 （１３）式Ｘの化合物は４−フルオル−３−ニトロフェ
   ニルアジドおよびＮ−〔（４−アジドベンジル）オキシ
   〕スクシンイミドから選択される、特許請求の範囲第１
   ２項記載の方法。 （１４）式VIIIの化合物は次式の化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ から選択される特許請求の範囲第１１項記載の方法。 （１５）式VII： ▲数式、化学式、表等があります▼（VII） （式中、Ｂ、ＣおよびＲ＿１〜Ｒ＿４は下記定義通りの
   意味を有する） で表わされる化合物を式ＸIII： ▲数式、化学式、表等があります▼ＸIII （式中、Ｘはハライド基であり、Ｒ＿９は水素原子、炭
   素原子数１〜５のアルキル基またはハライド基から選択
   され、ｎは０または１である） で表わされる化合物と反応させることからなる次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｂは基Ｃとベンゼン環とをつなぐ−ＮＨ−基で
   あつて、アジド基に対してパラ位にあつてもパラ位にな
   くてもよく； Ｃは少なくとも５個の炭素原子を含むヒドロカルビルア
   ミン部分であり； Ｒ＿１〜Ｒ＿４は同一かまたは異なつて、水素原子、炭
   素原子数１〜５のアルキル基、ニトロ基、ハライド基、
   カルボン酸基またはアミノ基から選択される） で表わされる化合物またはその酸付加塩の製造方法。 （１６）式VIIの化合物は式IX： ▲数式、化学式、表等があります▼（IX） で表わされ、式Ｘ： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｌは離脱基である） の化合物を式Ｘ I ： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿５、Ｒ＿６、Ｒ＿７は同一かまたは異なつ
   て、水素原子、炭素原子数１〜５のアルキル基またはハ
   ライド基から選択され、ｎは０〜５の整数であり、ｍは
   １〜１０の整数であり、ｐは０または１である） の化合物と反応させることにより製造される、特許請求
   の範囲第１５項記載の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる特許請求の範囲第１６項記載の方法。 （１８）式ＸII： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＸII） （式中、Ｐはポリヌクレオチド鎖、蛋白質または炭水化
   物の残基であり； Ｂは基Ｃとベンゼン環とをつなぐ−ＮＨ−基であつて、
   アジド基に対してパラ位にあつてもパラ位になくてもよ
   く； Ｃは少なくとも５個の炭素原子を含むヒドロカルビルア
   ミン部分であり； Ｄはリガンドまたはハプテンであり；そしてＲ＿１〜Ｒ
   ＿４は同一かまたは異なつて、水素原子、炭素原子数１
   〜５のアルキル基、ニトロ基、ハライド基、カルボン酸
   基またはアミノ基から選択される） で表わされる化合物またはその酸付加塩。 （１９）Ｂはアジド基に対してパラ位の−ＮＨ−基であ
   る、特許請求の範囲第１８項記載の化合物。 （２０）Ｃは次式の基： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿８は▲数式、化学式、表等があります▼ま
   たは▲数式、化学式、表等があります▼ であり； Ｒ＿５、Ｒ＿６、Ｒ＿７、Ｒ＿９およびＲ＿１＿０は同
   一かまたは異なつて、水素原子、炭素原子数１〜５のア
   ルキル基またはハライド基から選択され； ｎは０〜５の整数であり； ｍは１〜１０の整数である） から選択される特許請求の範囲第１９項記載の化合物。 （２１）Ｄは核酸に結合したときペプチド、蛋白質また
   は他の分子と検出可能な複合体を形成しうるか、または
   標識ポリヌクレオチドを未標識ポリヌクレオチドから選
   択的に抽出できるようにする部分である、特許請求の範
   囲第２０項記載の化合物。 （２２）Ｐは一本鎖または二本鎖のデオキシリボ核酸（
   ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）の残基である、特
   許請求の範囲第２１項記載の化合物。 （２３）（ｉ）（ａ）式 I の化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＲ＿１〜Ｒ＿４は下記定義通
   りである）、および （ｂ）核酸、炭水化物または蛋白質配列から選択される
   プローブ、 を準備し； （ｉｉ）（ａ）および（ｂ）を接触させ；そして（ｉｉ
   ｉ）これらの間に反応を起こさせるのに十分な時間工程
   （ｉｉ）の混合物を電磁線源にさらす；ことからなる式
   ＸII： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＸII） （式中、Ｐ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＲ＿１〜Ｒ＿４は特許請
   求の範囲第１８項に定義した通りである） で表わされる化合物の製造方法。 （２４）工程（ｉｉ）は、おおよそ中性のｐＨをもつ溶
   液中で（ａ）と（ｂ）とを混合し、こうして生成した混
   合物を密封容器内に密封し、そしてこの混合物を低温で
   可視光線源にさらすことからなる、特許請求の範囲第２
   ３項記載の方法。 （２５）（ｉ）（ａ）試験用サンプル、および（ｂ）少
   なくとも１種の式ＸIIの化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＸII） （式中、Ｐ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＲ＿１〜Ｒ＿４は特許請
   求の範囲第１８項に定義した通りである） を準備し； （ｉｉ）（ａ）と（ｂ）との複合体を形成するのに適す
   る条件下で（ａ）と（ｂ）とを接触させ；そして（ｉｉ
   ｉ）工程（ｉｉ）の生成物をハプテンまたはリガンドＤ
   についての検出法および／または同定法にかける； ことからなる核酸、蛋白質または炭水化物配列の検出お
   よび／または同定方法。 （２６）検出および／または同定しようとする配列は核
   酸配列である、特許請求の範囲第２５項記載の方法。 （２７）工程（ｉｉ）は少なくとも１種の核酸プローブ
   とサンプル中の相補的核酸配列とのハイブリダイゼーシ
   ョンを含む、特許請求の範囲第２６項記載の方法。 （２８）少なくとも２種の式ＸIIの化合物（ここで各化
   合物のハプテンまたはリガンドＤは異なつている）を準
   備し、工程（ｉｉｉ）が （ａ）ハイブリダイゼーション生成物を一方のハプテン
   またはリガンドについての第一抽出にかけ；そして （ｂ）（ａ）の抽出生成物を他方のハプテンまたはリガ
   ンドに特異的な検出法にかける； ことを包含する特許請求の範囲第２７項記載の方法。 （２９）式ＸII： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＸII） （式中、Ｐはポリヌクレオチド鎖、蛋白質または炭水化
   物の残基であり； Ｂは基Ｃとベンゼン環とをつなぐ−ＮＨ−基であつて、
   アジド基に対してパラ位にあつてもパラ位になくてもよ
   く； Ｃは少なくとも５個の炭素原子を含むヒドロカルビルア
   ミン部分であり； Ｄはリガンドまたはハプテンであり；そしてＲ＿１〜Ｒ
   ＿４は同一かまたは異なつて、水素原子、炭素原子数１
   〜５のアルキル基、ニトロ基、ハライド基、カルボン酸
   基またはアミノ基から選択される） で表わされる化合物またはその酸付加塩を含む、サンプ
   ル中の核酸、蛋白質または炭水化物配列を検定および／
   または同定するための診断用キット。 （３０）キットは更にアビジン−、ストレプトアビジン
   −または抗体−酵素複合体および比色定量用試薬を含む
   、特許請求の範囲第２９項記載のキット。