CN108752512A - 温度响应型aie荧光聚合物纳米粒子及其合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种温度响应型AIE荧光聚合物纳米粒子及其合成方法和应用，1)TPE‑OH的合成；2)TPE‑BPM的合成；3)TPE‑PNIPAM的合成:将N‑异丙基丙烯酰胺溶解在混合溶剂中并搅拌，然后在氩气保护条件下依次加入三(2‑二甲氨基乙基)胺、CuBr、TPE‑BMP，在室温下搅拌后，将反应原液用超纯水透析，最后将透析液冷冻干燥，得到淡黄色固体粉末即为TPE‑PNIPAM。通过原子转移自由基聚合(ATRP)引发合成具有温敏性的荧光高分子。该聚合物在水溶液中自组装成纳米粒子，展现出了优异的水溶性和荧光特性。

Description

温度响应型AIE荧光聚合物纳米粒子及其合成方法和应用
技术领域
本发明属于荧光成像领域，涉及一种温度响应型AIE荧光聚合物纳米粒子及其合成方法和应用。
背景技术
刺激响应型聚合物是指其某些行为或性质可随外界给定的温度、CO2、pH、离子的强度、光、热以及其它的外界环境的改变而发生响应性的智能型材料。由于这些响应性的存在，在生物应用、医药、化学等相关的领域有潜在的应用价值。聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)是一种非常典型的温度刺激响应性聚合物，该聚合物既具有疏水的异丙基基团又有亲水的酰胺基基团，结构如下所示。
聚合物PNIPAM在32℃的时候会发生相转变行为，即聚合物PNIPAM的最低临界的溶解温度(LCST)是32℃。当给定的温度低于最低临界溶解温度时，PNIPAM分子链上的酰胺基和水分子中的羟基会形成比较稳定的氢键，而此时氢键间的作用力成为主要作用力，使聚合物PNIPAM溶于水；当温度高于LCST时，聚合物PNIPAM与水的相互作用的参数会发生变化，进而使得酰胺基团和水分子间的氢键相互作用发生改变，进而表现出聚合物PNIPAM的疏水性。长期以来，基于聚N-异丙基丙烯酰胺为基础的聚合物的研究已经成为智能敏感性聚合物研究领域的热点。
荧光检测具有操作简便、灵敏度高、易调节等优点，进而被广泛的应用在化学以及生物检测领域。但是，由于传统荧光探针分子存在ACQ效应，使荧光分子很难在浓度比较高的情况下进行检测，限制其应用。而聚集诱导发光(AIE)分子在聚集的状态下发光会增强，克服了ACQ现象。AIE分子和被检测物之间往往通过物理相互作用，例如：亲疏水的相互作用，静电的相互作用以及配位间的相互作用及氢键作用等发生聚集，从而诱导该类分子聚集发光，实现优良的荧光检测效果。此外，还可以利用检测物和被检测物发生某些化学反应后，反应产物的溶解性变化导致聚集程度不同而实现荧光检测。聚集诱导发光荧光探针分子的荧光检测具有背景信号弱，灵敏度高等优点。自从聚集诱导发光现象被唐本忠院士课题组发现以来，多种AIE荧光探针分子被被开发出来，它们均展示了良好的聚集发光性能。通过对TPE，silole等AIE有机小分子进行聚合物修饰，例如引入具有优异生物相容性的两亲性聚合物，诱导其自组装成聚合物量子点，并将其应用于生物成像，从而提高生物显影效果已经成为目前的研究热点之一。荧光高分子可以自组装成荧光聚合物量子点，在生物应用中有良好的生物相容性，好的发光稳定性，强的光学性质而被广泛关注。最近，壳聚糖(CS)与四苯乙烯(TPE)共价相连可得具有生物相容性的发光聚合物，其能自发地聚集到细胞内，能作为一种细胞示踪剂。使用不同种类聚合物，通过简单合成方法开发新型的AIE型有机纳米颗粒无疑为寻找新的长期细胞示踪剂提供机会。但是，相关的报道较少。聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)为温度敏感聚合物，有较低的临界溶液温度和良好的生物相容性，PNIPAM已被广泛应用在生物技术，尤其是在药物输送系统、低温靶向治疗材料、组织工程材料等。
发明内容
本发明提供了一种温度响应型AIE荧光聚合物纳米粒子及其合成方法和应用，是一种TPE衍生物为引发剂，通过原子转移自由基聚合(ATRP)引发合成具有温敏性的荧光高分子。该聚合物在水溶液中自组装成纳米粒子，展现出了优异的水溶性和荧光特性。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
一种温度响应型AIE荧光聚合物纳米粒子，其化学结构式如下：
其中，n正整数。
一种温度响应型AIE荧光聚合物纳米粒子的合成方法，包括以下步骤：
1)TPE-OH的合成
将4-羟基四乙烯、12-溴-1-十二烷醇和K2CO3溶解在无水乙腈中，在氩气保护条件下回流反应，反应结束后，将反应液冷却至室温，然后将反应液过滤，将有机层蒸发，最后采用柱层析分离法对产物进行分离提纯，最终得到淡黄色固体4-(12-羟基十二烷基)四苯乙烯；
2)TPE-BPM的合成
TPE-OH、三乙胺和2-溴-2-甲基丙酰溴加入无水THF中，在室温下搅拌，反应结束后，反应液过滤，滤液浓缩，粗产品最后采用柱层析分离法对产物进行分离提纯，最终得到淡黄色TPE-BPM；
3)TPE-PNIPAM的合成
将N-异丙基丙烯酰胺溶解在混合溶剂中并搅拌，然后在氩气保护条件下依次加入三(2-二甲氨基乙基)胺、CuBr、TPE-BMP，在室温下搅拌后，将反应原液用超纯水透析，最后将透析液冷冻干燥，得到淡黄色固体粉末即为TPE-PNIPAM。
步骤1)中，4-羟基四乙烯、6-溴-1-己烷醇和K2CO3的摩尔比为1：(1～1.2)：(1～1.2)。
步骤2)中，4-(6-羟基己烷基)四苯乙烯、三乙胺和2-溴-2-甲基丙酰溴的摩尔比为1：(1～1.25)：(1～1.25)。
步骤4)中，N-异丙基丙烯酰胺与TPE-BMP的摩尔比为800:1。
步骤4)中，混合溶剂为水和甲醇的混合物，其中V水:V甲醇＝2:1。
一种温度响应型AIE荧光聚合物纳米粒子的合成方法，分离提纯采用的淋洗剂为乙酸乙酯与石油醚的混合物。
优选地，作为荧光生物探针使用。
相对于现有技术，本发明具有以下技术效果：
本发明的温度响应型AIE荧光聚合物纳米粒子TPE-PNIPAM具有十分良好的水溶性、优异的AIE性能、生物相容性、以及较低的相转变温度以及良好的稳定性。毒性低、AIE发光特征明显及对温度变化做出快速响应；Hela细胞用制备好的聚合物量子点TPE-PNIPAM对其染色，采用荧光显微镜、显微镜、酶标仪等相关仪器对聚合物量子点TPE-PNIPAM的细胞毒性以及细胞成像进行了探究。
本发明以TPE衍生物为引发剂，通过原子转移自由基聚合(ATRP)引发合成具有温敏性的荧光高分子。该聚合物在水溶液中自组装成纳米粒子，展现出了优异的水溶性和荧光特性。通过1H NMR、IR和GPC对聚合物分子进行了结构表征，通过扫描电镜(SEM)对聚合物分子的自组装进行研究。通过荧光光谱研究了聚合物的发光特性，以及相转变温度。实验结果表明，聚合物分子的合成简单，细胞毒性低，而且生物相容性好，是细胞显影的优良材料。
将具有AIE特性的TPE荧光团成功的和温敏性的NIPAM通过共价键结合在一起，合成出荧光强度强的蓝色荧光纳米粒子。经过一系列的检测证明聚合物量子点TPE-PNIPAM具有AIE性质。Hela细胞内能观测到很强的深蓝色的荧光。表明该聚合物TPE-PNIPAM有望作为生物探针。
附图说明
图1为聚合物TPE-PNIPAM的合成路线以及自组装示意图；
图2为TPE-BPM的核磁氢谱图(600MHz,CDCl3)；
图3为TPE-PNIPAM的核磁氢谱图(600MHz,CDCl3)；
图4为不同浓度的TPE-PNIPAM的荧光测试图，(a)为不同浓度的TPE-PNIPAM水溶液的荧光光谱(激发波长为332nm)；(b)为不同浓度的TPE-PNIPAM水溶液的荧光强度的变化及在紫外灯下(365nm)0.005mg mL-1和5mg mL-1TPE-PNIPAM水溶液的数码相片；
图5为TPE-PNIPAM的荧光光谱测试图，(a)为不同H2O体积分数的1mg.mL-1的TPE-PNIPAM在水和THF混合溶剂中的荧光光谱(激发波长为332nm)；(b)为相对应的的荧光强度的变化及其在紫外灯下(365nm)的数码相片；
图6为TPE-PNIPAM对温度的荧光测试图，(a)为TPE-PNIPAM在温度从25℃升高到80℃的水溶液中的荧光光谱；[TPE-PNIPAM]＝5.0g L-1，λex＝332nm；插图：不同温度下TPE-PNIPAM在水溶液中的相对荧光强度(I/I0)的变化；(b)为TPE-PNIPAM溶液在(左)25℃和(右)65℃下在可见光和紫外线下的照片；
图7为用不同浓度的TPE-PNIPAM处理48小时后HeLa细胞毒性测试；
图8为TPE-PNIPAM细胞成像应用对比图，HeLa细胞共聚焦显微镜图像，比例尺是25微米；(a)为荧光显示，(b)无荧光显示。
图9为TPE-PNIPAM纳米粒子表征参数图，(a)为TPE-PNIPAM纳米颗粒的SEM图像，(b)为浓度为1mg/mL的流体动力学尺寸，(c)为在激光照射下在THF或水中的TPE-PNIPAM溶液的照片。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明：
本发明采用的试剂如下：
4-羟基二苯甲酮(98％)，二苯甲酮(BP，98％)，四氯化钛(TiCl4，99％)，四氢呋喃(THF，AR)，锌粉(Zn，AR)，12-溴-1-十二醇(99％)，N,N-二乙基乙二胺(N,N-Diethylethylenediamine，98％)，溴化亚铜(CuBr，99％)，乙酸乙酯(ethyl acetate，AR)，三(2-二甲氨基乙基)胺(Tris(2-dimethylaminoethy)amine，99％)，N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM,98％)，石油醚(petroleun，AR)，碳酸钾(K2CO3,99.5％),2-溴-2-甲基丙酰溴(BIBB，98％),乙醇(EtOH，AR)，以上试剂都购买于安耐吉。通过蒸馏的方法对THF进行了纯化，CuBr在醋酸中回流除去杂质。本发明采用的仪器如下：
所有红外光谱(IR)由Nicolet AVATAR 360FT-IR红外光谱仪测定，(采用压片法测得)。
所需核磁(1H NMR、13C NMR)由MERCURY色谱仪测定。
粒径由动态光散射(DLS)方法测得，测试仪器为美国Zetasizer Nano ZS。
质谱数据由美国质谱联用仪(HP5989B)测得。
凝胶渗透色谱(GPC)数据由GPCV2000凝胶渗透色谱仪测得。
F97Pro荧光分光光度计测得荧光光谱(PL)，单色的Xe灯为激发源。
日本岛津紫外仪(Shimadzu Model 3100UV-vis)测得紫外数据。
ZEISS ULTRA PLUS扫描电子显微镜测得扫描电镜(SEM)图片。
通过RT-6100ELISA分析仪测定细胞毒性。
通过荧光显微镜(日本Olympus IX71)拍摄细胞成像。
实施例1
1)4-(12-羟基十二烷基)四苯乙烯(TPE-OH)的合成：
利用4-羟基四乙烯、6-溴-1-己烷醇和K2CO3的摩尔比为1：1.2：1.2的比例进行投料，将4-羟基四乙烯(3.48g，0.01mol)、12-溴-1-十二烷醇(0.28mL，0.012mol)和K2CO3(1.66g，0.012mol)溶解在100mL无水乙腈中，在氩气保护条件下回流24h。反应结束后，将反应液冷却至室温，然后将反应液过滤，将有机层蒸发，最后采用柱层析分离法对产物进行分离提纯(淋洗剂：V乙酸乙酯:V石油醚＝1:5)，最终得到2.6g淡黄色固体4-(12-羟基十二烷基)四苯乙烯，产率约为49％。
利用4-羟基四乙烯、6-溴-1-己烷醇和K2CO3的摩尔比为1：1：1的比例进行投料，将4-羟基四乙烯(3.48g,0.01mol)、12-溴-1-十二烷醇(0.24mL，0.01mol)和K2CO3(1.38g，0.01mol)溶解在100mL无水乙腈中，在氩气保护条件下回流24h。反应结束后，将反应液冷却至室温，然后将反应液过滤，将有机层蒸发，最后采用柱层析分离法对产物进行分离提纯(淋洗剂：V乙酸乙酯:V石油醚＝1:5)，最终得到2.4g淡黄色固体4-(12-羟基十二烷基)四苯乙烯，产率约为45％。
利用4-羟基四乙烯、6-溴-1-己烷醇和K2CO3的摩尔比为1：1.1：1.1的比例进行投料，将4-羟基四乙烯(3.48g,0.01mol)、12-溴-1-十二烷醇(0.26mL，0.011mol)和K2CO3(1.52g，0.011mol)溶解在100mL无水乙腈中，在氩气保护条件下回流24h。反应结束后，将反应液冷却至室温，然后将反应液过滤，将有机层蒸发，最后采用柱层析分离法对产物进行分离提纯(淋洗剂：V乙酸乙酯:V石油醚＝1:5)，最终得到2.5g淡黄色固体4-(12-羟基十二烷基)四苯乙烯，产率约为47％。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.16–7.05(m,15H),6.98(d,J＝8.8Hz,2H),6.67(d,J＝8.8Hz,2H),3.92–3.85(m,2H),3.65(t,J＝6.7Hz,2H),3.45–3.37(m,1H),2.03–1.82(m,2H),1.81–1.75(m,2H),1.67–1.54(m,4H),1.47(dd,J＝14.2,9.0Hz,4H),1.35(s,8H).
13C NMR(151MHz,CDCl3)δ153.96(s),144.28–143.62(m),140.29(d,J＝33.3Hz),136.37(s),132.71(s),131.52–131.16(m),127.63(d,J＝15.1Hz),126.24(s),114.57(s)
2)TPE-BPM的合成：
利用4-(6-羟基己烷基)四苯乙烯、三乙胺和2-溴-2-甲基丙酰溴的摩尔比为1：1.25：1.25的比例进行投料，TPE-BMP的合成所示图1，TPE-OH(5.33g，0.01mol)、三乙胺(1.75mL，0.0125mol)和2-溴-2-甲基丙酰溴(1.5mL，0.0125mol)加入无水THF 150ml的250mL的三口烧瓶中。该混合物在室温下搅拌24小时，反应结束后，反应液过滤。滤液浓缩，粗产品最后采用柱层析分离法对产物进行分离提纯(淋洗剂：V乙酸乙酯:V石油醚＝1:10)，最终得到4.7g淡黄色产率约为69％。
利用4-(6-羟基己烷基)四苯乙烯、三乙胺和2-溴-2-甲基丙酰溴的摩尔比为1：1：1的比例进行投料，TPE-BMP的合成所示图1，TPE-OH(5.33g，0.01mol)、三乙胺(1.23mL，0.01mol)和2-溴-2-甲基丙酰溴(1.24mL，0.01mol)加入无水THF 150ml的250mL的三口烧瓶中。该混合物在室温下搅拌24小时，反应结束后，反应液过滤。滤液浓缩，粗产品最后采用柱层析分离法对产物进行分离提纯(淋洗剂：V乙酸乙酯:V石油醚＝1:10)，最终得到4.4g淡黄色产率约为65％。
利用4-(6-羟基己烷基)四苯乙烯、三乙胺和2-溴-2-甲基丙酰溴的摩尔比为1：1.2：1.2的比例进行投料，TPE-BMP的合成所示图1，TPE-OH(5.33g，0.01mol)、三乙胺(1.66mL，0.012mol)和2-溴-2-甲基丙酰溴(1.48mL，0.012mol)加入无水THF 150ml的250mL的三口烧瓶中。该混合物在室温下搅拌24小时，反应结束后，反应液过滤。滤液浓缩，粗产品最后采用柱层析分离法对产物进行分离提纯(淋洗剂：V乙酸乙酯:V石油醚＝1:10)，最终得到4.5g淡黄色产率约为66％。
TPE-BMP的核磁氢谱如图2所示
3)TPE-PNIPAM的合成：
将N-异丙基丙烯酰胺(nipam)(4.52g,0.04mol)溶解在10mL水和5mL甲醇(V水:V甲醇＝2:1)混合溶剂中并搅拌15min，然后在氩气保护条件下依次加入三(2-二甲氨基乙基)胺Me6TREN(240μL)、CuBr(0.0282g 0.1960mmol)、TPE-BMP(0.05g,0.05mmol)，在室温下搅拌24h后,将反应原液用超纯水透析72小时，最后将透析液冷冻干燥24小时，得到淡黄色固体粉末即为TPE-PNIPAM2.1g。TPE-PNIPAM的核磁氢谱如图3所示。
TPE-PNIPAM MTT法研究细胞毒性。
将HeLa细胞以10000个细胞/孔的密度接种在96孔培养板中。培养箱培养24小时后，将细胞用不同浓度的TPE-PNIPAM处理。用配好的PBS洗涤Hela细胞，然后将MTT溶液(5mg/mL，10μL)和Hela细胞培养基(90μL)加入到每个孔中的细胞中去。将96孔培养板在37℃的(含CO2 5％)培养箱中温育4小时。除去含有MTT的培养基，加入二甲亚砜(DMSO，100μL)溶解由活细胞形成的甲瓒晶体。使用RT-6100酶标仪在492nm处测量吸光度。
TPE-PNIPAM的细胞成像应用：
首先，将Hela细胞预先接种12孔培养板细胞片上。培养基是含有1％链霉素和10％胎牛血清的1640溶液。然后将12孔板置于5％浓度的CO2和37℃温度的潮湿培养箱中24小时。用100μgmL-1TPE-PNIPAM处理Hela细胞，24小时后，取出细胞片，用磷酸盐缓冲溶液将平板冲洗三次。在共焦荧光显微镜下拍摄细胞成像图片。使用Olympus FV1000共聚焦显微镜(Olympus Tokyo Japan)在332nm激发并且在460-490nm发射。
TPE-PNIPAM结构表征
由于原子转移的自由基聚合的方法在可控合成聚合物方面的优势，本发明采用该方法成功的合成了AIE型聚合物TPE-PNIPAM，核磁氢谱(图2)很好的证明了其聚合物的分子结构。化学位移在7.15ppm左右处出现了芳环质子氢的信号峰，1.05ppm处出现了甲基氢的信号峰，1.5ppm和2.0ppm处分别为PNIPAM上面的亚甲基信号峰，3.75ppm出现了PNIPAM上的亚氨基的氢峰。这表明TPE分子和PNIPAM成功的共价结合在了一起。此外，通过GPC测试进一步证明了TPE-PNIPAM的结构，数均分子量(Mn)和重均分子量分别为2.5×104和2.8×104(如表1所示)。
表1 TPE-PNIPAM的GPC数据。
TPE-PNIPAM的AIE特性
TPE-PNIPAM在一定的温度范围在水中能全部溶解形成透明的溶液，但是其聚合物TPE-PNIPAM的水溶液在紫外灯(365nm)下仍然是发光的，而其聚合物TPE-PNIPAM在纯THF溶液中是几乎肉眼看不见光。这现象和TPE小分子的AIE(聚集发光)性质非常的相似。
THF和H2O两种溶剂都能够很好的溶解PNIPAM聚合物链段。而对于小分子TPE来说，四氢呋喃是TPE-PNIPAM的良溶剂，所以在四氢呋喃溶液中小分子TPE几乎没有什么荧光，而水则是小分子TPE的不良溶剂。选用TPE-PNIPAM来研究该聚合物的AIE性质。
基于上面的发现，对于荧光聚合物TPE-PNIPAM的AIE性质，本实验从两个方面对聚合物TPE-PNIPAM进行了证实。一方面考察了浓度变化对聚合物荧光的影响，如图4所示，当其聚合物TPE-PNIPAM浓度由0.005mg.mL-1增大到5mg.mL-1时，则会表现出随着聚合物浓度的增大荧光随之增强，激发和发射波长分别为332nm和450nm。随着浓度的增大，TPE-PNIPAM分子必定会发生一定的聚集，而荧光显著增强展示了其AIE特性。
另一个方面观察了TPE-PNIPAM在不同比例的水/四氢呋喃混合溶剂中的荧光变化，进一步证明了该聚合物的AIE特性。如图5所示，随着H2O体积分数的增加，TPE-PNIPAM的荧光强度以非线性的方式减弱。H2O的体积分数超过90％后，其荧光强度急剧减弱，这与文献中的报道的聚集诱导荧光增强(aggregation-induced enhanced emission，AIEE)现象一致。其主要的原因是随着H2O体积分数的增加，聚合物链发生了扩张，使得TPE-PNIPAM微球的尺寸增大，TPE分子聚集的更小使得发射荧光减弱。
温度对TPE-PNIPAM荧光强度的影响
此外，为了研究温度对TPE-PNIPAM荧光性质的影响，研究了TPE-PNIPAM在20～60℃不同温度水溶液中的荧光变化。TPE-PNIPAM在溶剂为水中随温度变化的荧光行为如图6中(a)所示。当TPE-PNIPAM的水溶液从25℃加热到50℃的区间内，荧光强度会发生下降。从50℃加热到60℃时，溶液的荧光强度变化缓慢，在此之后继续加热，荧光强度几乎不变。
此外，图6中(b)显示，当温度高于LCST(50℃)时，TPE-PNIPAM从透明溶液变为浊度溶液。原因是因为NIPAM是很典型的温度敏感性材料，而四苯乙烯类化合物则是荧光性材料，因此TPE-PNIPAM的PNIPAM和聚集发光的的特征，能够更好地应用在各领域。
TPE-PNIPAM的细胞毒性评估
将Hela细胞以毎孔10000个的密度接种入96孔扳中，毎孔加100μL培养基，四周用配好的PBS溶液封边，然后放入二氧化碳含量为5％、温度为37℃的恒温培养箱中，需要培养24小时后。当Hela细胞完全贴壁后，再取出96孔板，倒掉原有的培养基，用PBS冲洗3遍后，根据本实验所需的设计加入不同浓度的聚合物样品(分别加入浓度为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL的TPE-PNIPAM)，然后再加入90mL的培养基，最后放在37℃的恒温培养箱中培养24小时，为了确保实验结果的准确度，实验对照组与实验组都需要设置3个平行样。取出96孔板，小心倒掉原有的培养基，用配置好的PBS溶液(切记灭菌)冲洗3遍后，再在每孔加入MTT溶液(10mL)和1640培养基(90Ml)，再继续放入培养箱中培养4小时后，再小心倒掉原有的培养液，再加入DMSO(100mL)振荡，使生成的甲瓒晶体完全溶解。再打开电脑和酶标仪，使其连接。在酶标检测仪上选取490nm的波长光源，测96孔培养板的每孔的吸光度，然后记录结果，使浓度为其横坐标，用计算出来的细胞的存活率(Viability)为纵坐标绘制细胞存活柱状图。
Viability(％)＝(OD试验组-OD调零组)/(OD空白组-OD调零组)×100％
对于聚合物TPE-PNIPAM的毒性问题，对于生物医学领域、细胞显影的应用非常重要，本实验采用比较简单的MTT法测了TPE-PNIPAM聚合物对Hela宫颈癌细胞的细胞毒性，细胞毒性实验的结果如图3所示，即使浓度达到400mg/m L时，该聚合物TPE-PNIPAM对细胞也只表现出极小的毒性。综上所述，聚合物TPE-PNIPAM对Hela细胞的生物相容性及其好，可将该聚合物TPE-PNIPAM其进一步应用于Hela细胞成像。
TPE-PNIPAM细胞成像应用：
由于聚合物TPE-PNIPAM聚合物具有优良的生物相容性及聚集发光的性能，本实验探究了聚合物TPE-PNIPAM的Hela细胞成像能力。传统的一些荧光的显影剂，尤其是小分子的各种荧光剂，很难进入Hela细胞的细胞内部，因此，很难将其化合物应用于与细胞探针。实验结果如图8所示。再Hela细胞内能观测到很强的深蓝色的荧光。表明该聚合物TPE-PNIPAM有望作为生物探针。
TPE-PNIPAM纳米粒子。
图6中(a)展示了聚合物TPE-PNIPAM的形貌。扫描电镜(SEM)照片证明聚合物纳米粒子是形状相对规整的球形，并且纳米粒子的大小相对均一，TPE-PNIPAM的粒径大约190nm。如图9中(b)所示。聚合物粒子的粒径在一定程度上比通过SEM照片获得的粒稍微偏大，这是因为聚合物TPE-PNIPAM分散在水溶液中时会发生稍微的膨胀动态光散射显示这些纳米粒子的流体力学大小是保持在200nm(图9中(b))。TPE-PNIPAM聚合物在不同的溶液中，TPE-PNIPAM可以在溶液中组装成纳米颗粒，由于其聚合物的两亲性质的影响，在其中疏水性TPE聚集在核心和亲水性PNIPAM延伸到水中(图9中(a))浓度为1mg/mL时。
总之，本实发明通过简单的方法成功的合成了含有聚集发光基团的四苯乙烯衍生物(TPE-BPM)，再进一步通过简单的自由基引发聚合的简单反应合成了聚合物TPE-PNIPAM量子点。然后通过1HNMR、GPC证明了聚合物TPE-PNIPAM量子点的结构。接下来通过紫外光谱、荧光光谱、扫描电镜(SEM)、荧光拍摄照片等测试结果证明了聚合物量子点TPE-PNIPAM具有十分良好的水溶性、优异的AIE性能、生物相容性、以及较低的相转变温度以及良好的稳定性。Hela细胞用制备好的聚合物量子点TPE-PNIPAM对其染色，采用荧光显微镜、显微镜、酶标仪等相关仪器对聚合物量子点TPE-PNIPAM的细胞毒性以及细胞成像进行了探究。具体有以下优点：
1.将具有AIE特性的TPE荧光团成功的和温敏性的NIPAM通过共价键结合在一起，合成出荧光强度强的蓝色荧光纳米粒子。经过一系列的检测聚合物量子点TPE-PNIPAM具有AIE性质。
2.由于扫描电镜可知，聚合物量子点TPE-PNIPAM可以自组装成纳米圆球。聚合物量子点尺寸较小(粒径大约190nm)，粒径分布相对均一。
3.研究了聚合物量子点TPE-PNIPAM的温敏性。纳米粒子的相转变温度较低为50℃。
4.聚合物量子点TPE-PNIPAM对宫颈癌细胞有良好的识别作用。而聚合物纳米粒子对宫颈癌细胞几乎没有细胞毒性，可用于宫颈癌细胞的靶向成像。因为所合成的聚合物纳米粒子具有良好的介孔结构，因此有望应用于搭载抗癌药进行靶向治疗。
本发明的保护范围并不限于上述的实施例，对于本领域的普通技术人员来说，倘若对本发明进行的各种改动和变形属于本发明权利要求及等同技术范围内，则本发明的意图也包含这些改动和变形在内。

Claims (8)

1.一种温度响应型AIE荧光聚合物纳米粒子，其特征在于，其化学结构式如下：
其中，n正整数。
2.一种温度响应型AIE荧光聚合物纳米粒子的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)TPE-OH的合成
将4-羟基四乙烯、12-溴-1-十二烷醇和K2CO3溶解在无水乙腈中，在氩气保护条件下回流反应，反应结束后，将反应液冷却至室温，然后将反应液过滤，将有机层蒸发，最后采用柱层析分离法对产物进行分离提纯，最终得到淡黄色固体4-(12-羟基十二烷基)四苯乙烯；
2)TPE-BPM的合成
TPE-OH、三乙胺和2-溴-2-甲基丙酰溴加入无水THF中，在室温下搅拌，反应结束后，反应液过滤，滤液浓缩，粗产品最后采用柱层析分离法对产物进行分离提纯，最终得到淡黄色TPE-BPM；
3)TPE-PNIPAM的合成
将N-异丙基丙烯酰胺溶解在混合溶剂中并搅拌，然后在氩气保护条件下依次加入三(2-二甲氨基乙基)胺、CuBr、TPE-BMP，在室温下搅拌后，将反应原液用超纯水透析，最后将透析液冷冻干燥，得到淡黄色固体粉末即为TPE-PNIPAM。
3.根据权利要求1所述的温度响应型AIE荧光聚合物纳米粒子的合成方法，其特征在于：步骤1)中，4-羟基四乙烯、6-溴-1-己烷醇和K2CO3的摩尔比为1：(1～1.2)：(1～1.2)。
4.根据权利要求1所述的温度响应型AIE荧光聚合物纳米粒子的合成方法，其特征在于：步骤2)中，4-(6-羟基己烷基)四苯乙烯、三乙胺和2-溴-2-甲基丙酰溴的摩尔比为1：(1～1.25)：(1～1.25)。
5.根据权利要求1所述的温度响应型AIE荧光聚合物纳米粒子的合成方法，其特征在于：步骤4)中，N-异丙基丙烯酰胺与TPE-BMP的摩尔比为800:1。
6.根据权利要求1所述的温度响应型AIE荧光聚合物纳米粒子的合成方法，其特征在于：步骤4)中，混合溶剂为水和甲醇的混合物，其中V水:V甲醇＝2:1。
7.根据权利要求2至6中任意一项所述的温度响应型AIE荧光聚合物纳米粒子的合成方法，其特征在于：分离提纯采用的淋洗剂为乙酸乙酯与石油醚的混合物。
8.权利要求1所述的温度响应型AIE荧光聚合物纳米粒子在细胞显影中的应用，其特征在于，作为荧光生物探针使用。
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