CN102093884A

CN102093884A - 一种用于检测水相中铜离子的近红外荧光探针及其制备方法

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Publication number: CN102093884A
Application number: CN201110024244XA
Authority: CN
Inventors: 路建美; 杨学波; 葛健锋
Original assignee: SUZHOU TIANLILAN ENVIRONMENTAL PROTECTION TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SUZHOU TIANLILAN ENVIRONMENTAL PROTECTION TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2011-01-21
Filing date: 2011-01-21
Publication date: 2011-06-15

Abstract

本发明属于小分子荧光探针领域，特别涉及一种用于检测水相中铜离子的近红外荧光探针及其制备方法，所述近红外荧光探针的结构式如下所示：

。上述近红外荧光探针可以用于生物体系中的铜离子的检测，生物活细胞和生物活组织内的铜离子的分析检测和荧光成像检测，以及临床医学上病变组织中铜离子的检测。

Description

一种用于检测水相中铜离子的近红外荧光探针及其制备方法

技术领域

本发明属于小分子荧光探针领域，特别涉及一种用于检测水相中铜离子的近红外荧光探针及其制备方法。

背景技术

铜是人体及动植物必需的微量元素之一，对机体的新陈代谢有重要的调节作用。但过量摄入铜会引起组织中铜蓄积，比如在肝脏、脑部，可引起组织病变。已知铜在细胞中的平衡改变会导致抑制神经性疾病，如缅克斯（Menkes）综合症、肝豆状核变性病（Wilson病）、家族遗传性脊侧索硬化、阿尔茨海默病（Alzheimmers病）和Prion病等。正是由于铜对于生命的重要性，铜在人体中受到严格的控制。采用荧光分子探针的方法检测生物系统中铜离子就变的尤为重要了。

测定痕量铜常采用的方法有：原子吸收光谱法，属于常规元素分析法，但对于痕量的元素的测定灵敏度低，操作复杂，塞曼效应石墨原子吸收光谱法，是一种准确可靠的方法，但同样操作复杂，而且费用高昂，难以大规模应用。此外还有利用络合剂和铜离子络合形成有色络合物进行比色测定的方法，但其灵敏度低，重现性差，现在一般很少采用。更重要的是这些方法无法在不损伤生物体系的活细胞和活组织的前提下，在其中应用。更无法实时检测生物体系的活细胞和活组织中的铜离子浓度的变化。荧光分子探针技术应用于离子的检测，可实现原位检测，由于普通的荧光分子探针在水溶液中溶解性差，或者选择性差，因此目前许多铜离子探针在有机溶剂中表现出良好的性能（参见：(a) Mashraqui, S. H.; Poonia, K.; Betkar, R.; Chandiramani, M. Tetrahedron Lett. 2010, 51, 4336; (b) Li, N.; Xiang, Y.; Tong, A. Chem. Comm. 2010, 46, 3363; (c) Xiang, Y.; Tong, A. J.; Jin, P. Y.; Ju, Y. Org Lett. 2006, 8, 2863）。但实际上只有能够在水溶液中表现出良好的性能的荧光分子探针才具有使用价值。同时大部分对铜离子识别的荧光探针分子处于短波长区，激发时会对细胞产生损伤，并且生物体中自发荧光对检测也产生了严重的干扰，使其在应用中受到了一定的限制。因此设计合成能在水相中检测铜离子的近红外的荧光探针在实际应用中具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能检测水相中铜离子的近红外荧光探针，从而准确、灵敏地检测出水相中、细胞中、生物体中的铜离子的浓度。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种检测水相中铜离子的近红外荧光探针，其结构式如下所示：

Figure 201110024244X100002DEST_PATH_IMAGE001

。

上述近红外荧光探针的制备方法包括以下步骤：

1）混合2-氯甲基吡啶盐酸盐水溶液、氢氧化钠水溶液、间甲氧基苯胺、相转移催化剂，在惰性气体气氛中，室温下搅拌10～12天；其中，2-氯甲基吡啶盐酸盐水溶液的浓度为0.01～0.04mol/L；氢氧化钠水溶液的浓度为5～7 mol/L；所述相转移催化剂为十六烷基三甲基溴化铵；2-氯甲基吡啶盐酸盐、氢氧化钠、间甲氧基苯胺的摩尔比为1∶4～6∶0.4～0.6；制得中间产物3-甲氧基-N,N-二（2-氯甲基吡啶）苯胺；所述中间产物3-甲氧基-N,N-二（2-氯甲基吡啶）苯胺的结构式为：

Figure 201110024244X100002DEST_PATH_IMAGE002

；

2）将3-甲氧基-N,N-二（2-氯甲基吡啶）苯胺溶解于浓盐酸中，将反应体系至于冰水浴环境中，边搅拌边滴加亚硝酸钠水溶液，滴加完成后继续搅拌反应1.5～3h，将溶液体系调节到9-12，得到中间产物3-甲氧基-4亚硝基-N,N-二（2-氯乙基吡啶）苯胺；其中，3-甲氧基-N,N-二（2-氯甲基吡啶）苯胺、亚硝酸钠的摩尔比1∶0.8～1.2；所述浓盐酸的浓度为5～7 mol/L，所述3-甲氧基-4亚硝基-N,N-二（2-氯乙基吡啶）苯胺的结构式为：

Figure 201110024244X100002DEST_PATH_IMAGE003

；

3）惰性气体氛围中，将3-(二乙基氨基)苯酚加入体积分数80%～90%的异丙醇水溶液，搅拌、加热，得溶液A；将3-甲氧基-4亚硝基-N,N-二（2-氯乙基吡啶）苯胺、浓盐酸溶解在体积分数80%～90%的异丙醇水溶液中，得溶液B；搅拌、回流的条件下，将溶液B在1小时内分3～5批加入到溶液A液中，反应3-8小时，得到近红外荧光探针；其中，3-(二乙基氨基)苯酚、3-甲氧基-4亚硝基-N,N-二（2-氯乙基吡啶）苯胺的摩尔比为1∶0.8～1.2。

上述近红外荧光探针对水相中的铜离子（Cu²⁺）有很专一的识别效果，而且产生的荧光强度与浓度在5×10^-6M到100×10^-6M范围内的铜离子的浓度成线性关系；同时，该近红外荧光探针能够很好的穿透细胞膜进入细胞中，并且能够在细胞中检测铜离子和进行荧光成像。

因此，上述近红外荧光探针可以用于生物体系中的铜离子的检测，生物活细胞和生物活组织内的铜离子的分析检测和荧光成像检测，以及临床医学上病变组织中铜离子的检测。

因此，本发明同时要求保护上述近红外荧光探针检测水相中铜离子的应用，例如：检测废水中铜离子浓度的应用；本发明同时要求保护上述近红外荧光探针检测生物体系中铜离子的应用，所述生物体系包括生物细胞、生物组织；本发明同时要求保护上述近红外荧光探针检测病变组织中铜离子的应用；本发明同时要求保护上述近红外荧光探针在活细胞或者活组织中检测铜离子的应用。

由于上述技术方案的应用，本发明与现有技术相比，具有以下优点;

由于本发明合成了以吩噁嗪为荧光团以N,N-二(2-甲基吡啶)为识别基团的化合物作为在水相中检测铜离子的近红外荧光探针，与前人的工作（(a) Goswami, S.; Sen, D.; Das, N. K. Org Lett. 2010, 12, 856; (b) Esteves, C. I. C.; Raposo, M. M. M.; Costa, S. P. G. Tetrahedron. 2010, 66, 7479; (c) Zhou, Y.; Wang, F.; Kim, Y.; Kim, S.-J.; Yoon, J. Org Lett. 2009, 11, 4442; (d) Xiang, Y.; Tong, A. J.; Jin, P. Y.; Ju, Y. Org Lett. 2006, 8, 2863.）相比，本发明的荧光探针除了具有高选择性、高灵敏度外同时还具有以下优点：荧光光谱的发射峰在近红外区；低细胞毒性；良好的细胞膜透性；以及良好的水溶性；本发明所述荧光探针已经具备了在细胞内检测铜离子及荧光成像的能力，可以为临床医学中相关疾病的诊断研究提供参考。

附图说明

图1：实施例一的合成荧光探针的路线图；

图2：实施例一中荧光探针对铜离子的选择性识别；

图3：实施例一中荧光探针在不同浓度铜离子的水溶液中的荧光图；

图4：实施例一中荧光探针在不同浓度铜离子的水溶液中的荧光强度与铜离子浓度的关系图；

图5：(a) 本发明实施例一的荧光探针1细胞实验中的KB细胞明场图；(b,c,d) 本发明实施例一的荧光探针1细胞实验中KB细胞中的荧光探针1在不同时间的荧光图（分别为b: 2.5 min; c:10 min; d:18 min);(e) 本发明实施例一的荧光探针1细胞实验中所选择的区域的平均荧光强度(1,细胞外；2,3细胞内)。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：

如图1所示，将3.78g 2-氯甲基吡啶盐酸盐(2)（0.023mol,M=164.03g/mol）溶解在1mL水中，然后向上述溶液中加入5.8 mL 5当量氢氧化钠水溶液，得到红色溶液。在充分的搅拌下，再加入1.42g间甲氧基苯胺（0.0115mol,M=123.16g/mol），40 mg相转移催化剂。氩气保护在室温下反应11天。二氯甲烷萃取，干燥，蒸除溶剂后得粗产品。经过硅胶柱分离得到中间产物3-甲氧基-N,N-二（2-氯甲基吡啶）苯胺(3)，为黄色油状物。

将1.9g 3-甲氧基-N,N-二（2-氯甲基吡啶）苯胺(3)（0.006mol,M=303g/mol）溶解在25mL 6 mol·L^-1浓盐酸中，置于冰水浴中。在充分的搅拌下，缓慢地向溶液中滴加含有472 mg(0.0068mol,M=69g/mol)亚硝酸钠的水溶液。滴加完后再在冰水浴中反应1小时。然后用氢氧化钠溶液将反应液调成碱性（pH=10），再用二氯甲烷萃取，干燥蒸除溶剂后得粗产品。经过硅胶柱分离得到中间产物3-甲氧基-4亚硝基-N,N-二（2-氯乙基吡啶）苯胺(4)，为绿色固体。

氮气保护下，将400mg 3-(二乙基氨基)苯酚(0.0024mol,M=165.23g/mol)溶解在30mL 90%异丙醇中加热。然后将800mg 3-甲氧基-4亚硝基-N,N-二（2-氯乙基吡啶）苯胺(4)（0.0024mol,M=333g/mol）、2.54mL浓盐酸溶解在30mL 90%异丙醇中，并将其在1小时内分4批加入到上述反应液中，回流6小时。反应完后蒸除溶剂后得粗产品，经过硅胶柱分离得到产物(1)荧光探针，为带有金属光泽的绿色固体。

将荧光探针(1)分别加入到各种金属离子的水溶液中，探针浓度为20×10^-6M，使用常规方法探测相应的荧光发射强度，得图2，由图2可以看出荧光探针对铜离子（Cu²⁺）有很专一的识别效果，对其他离子几乎没有识别，并可知所述的荧光探针分子的最大发射峰在650nm左右。

将荧光探针(1)分别加入到不同浓度铜离子的水溶液中，探针浓度为20×10^-6M，使用常规方法探测相应的荧光发射强度，得图3、4，由图3、图4可以看出荧光探针的荧光强度与浓度在5×10^-6M到100×10^-6M范围内的铜离子的浓度成线性关系，这个范围已经可以满足实际测试要求。

将100μL荧光探针(1)加入浓度为20×10^-6M的PBS溶液与KB细胞共同培养10分钟，用PBS洗去细胞外未进细胞的荧光探针(1)，立即用荧光共聚焦显微镜实时观察细胞。在第3分钟的时候加入100μL浓度为200×10^-6M的CuCl₂的生理盐水溶液。在第10.5分钟时加入100μL浓度为500×10^-6M的DPEN的PBS溶液，观察其荧光发射强度，得图5，由图5可以看出，荧光探针1能够很好的穿透细胞膜进入细胞中，并且能够在细胞中检测铜离子和进行荧光成像。

所以本发明的荧光探针可以用于生物体系中的同离子的检测，生物活细胞和生物活组织内的铜离子的分析检测和荧光成像检测，以及临床医学上病变组织中铜离子的检测。

Claims

1. 一种检测水相中铜离子的近红外荧光探针，其结构式如下所示：

。

2.权利要求1所述近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）混合2-氯甲基吡啶盐酸盐水溶液、氢氧化钠水溶液、间甲氧基苯胺、相转移催化剂，在惰性气体气氛中，室温下搅拌10～12天；制得中间产物3-甲氧基-N,N-二（2-氯甲基吡啶）苯胺；所述中间产物3-甲氧基-N,N-二（2-氯甲基吡啶）苯胺的结构式为：

；

其中，2-氯甲基吡啶盐酸盐水溶液的浓度为0.01～0.04mol/L；氢氧化钠水溶液的5～7 mol/L；2-氯甲基吡啶盐酸盐、氢氧化钠、间甲氧基苯胺的摩尔比为1∶4～6∶0.4～0.6；所述相转移催化剂为十六烷基三甲基溴化铵；

2）将3-甲氧基-N,N-二（2-氯甲基吡啶）苯胺溶解于浓盐酸中，将反应体系至于冰水浴环境中，边搅拌边滴加亚硝酸钠水溶液，滴加完成后继续搅拌反应2小时1.5～3h，将溶液体系pH值调节到9～12，得到中间产物3-甲氧基-4亚硝基-N,N-二（2-氯乙基吡啶）苯胺；所述3-甲氧基-4亚硝基-N,N-二（2-氯乙基吡啶）苯胺的结构式为：

；

其中，3-甲氧基-N,N-二（2-氯甲基吡啶）苯胺、亚硝酸钠的摩尔比1∶0.8～1.2；所述浓盐酸的浓度为5～7 mol/L；

3）惰性气体氛围中，将3-(二乙基氨基)苯酚加入体积分数80%～90%的异丙醇水溶液，搅拌、加热，得溶液A；将3-甲氧基-4亚硝基-N,N-二（2-氯乙基吡啶）苯胺、浓盐酸溶解在体积分数80%～90%的异丙醇水溶液中，得溶液B；搅拌、回流的条件下，将溶液B在1小时内分3～5批加入到溶液A液中，反应3～8小时，得到近红外荧光探针；其中，3-(二乙基氨基)苯酚、3-甲氧基-4亚硝基-N,N-二（2-氯乙基吡啶）苯胺的摩尔比为1∶0.8～1.2。

3.权利要求1所述近红外荧光探针检测水相中铜离子的应用。

4.权利要求1所述近红外荧光探针检测生物体系中铜离子的应用，所述生物体系包括生物细胞、生物组织。

5.权利要求1所述近红外荧光探针在活细胞或者活组织中检测铜离子的应用。