CN102818790A - 含脂双层有机/无机复合荧光纳米粒子检测铜离子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明旨在提供一种由有机/无机复合脂质和磷脂制备的含脂质双层的荧光纳米粒子用于检测水相中铜离子的方法及应用。本发明应用荧光共振能量转移的原理，选择疏水性荧光染料尼罗红作为能量供体，将其包埋在疏水的脂质双层内，待检样品中的铜离子作为能量受体，并将含有氨基的磷脂与有机/无机复合脂质按一定比例混合制备荧光纳米粒子，其中氨基提供铜离子与荧光纳米粒子的结合位点，根据荧光纳米粒子溶液的荧光变化情况实现对铜离子的检测。该发明的方法操作简便，选择性好，灵敏度高，可应用于环境科学及食品科学等多个领域。
Description
技术领域
本发明属于环境科学与生物材料科学的交叉领域，涉及了使用含脂质双层的有机/无机复合荧光纳米粒子检测铜离子的方法。
背景技术
金属离子在环境科学与生物领域中起着重要的作用，其中铜离子对人体的健康是必要的，它促进血红蛋白的合成，是新陈代谢中许多酶的组成成分，还与人体的生长发育及免疫系统息息相关。但是，短时间接触过量的铜，会引起肠胃功能紊乱，长时间接触过量的铜，会引起肝肾损伤。水中含铜时可腐蚀镀锌管及铁、铝制品，高于5mg/L时使水产生颜色和苦味；高于1.0mg/L时，可使洗过的衣服带色。因此，开发灵敏度高、选择性好的铜离子检测方法具有重要的实用意义。
自从1965年英国人Banghan在电镜下发现由脂质双分子层组成，内部为水相的闭合的脂质体(Liposome)以来，这种特殊的结构已经引起了各国学者的广泛关注。脂质体作为药物载体已经被应用于生物医学领域，但是不稳定性的缺点极大地限制了其实际应用。硅质体是近年发展起来的一类新型的有机/无机复合纳米粒子，可由人工合成的复合脂质制备。形成硅质体的脂质是由一个链接分子链接两个疏水性的碳链和一个亲水性的无机硅烷分子组成。硅氧烷部分可以水解缩合，在硅质体的表面形成一层单分子厚度的Si-O-Si网络结构，从而使硅质体的形态学稳定性大为提高，应用硅质体包埋药物或者染料，可以有效克服传统脂质体不稳定、容易溶合、泄漏的缺点。
本发明以新型的有机/无机复合脂质和传统的磷脂为原料，对疏水性荧光染料尼罗红进行有效包埋，应用荧光共振能量转移的原理(尼罗红作为能量供体，待检样品中的铜离子作为能量受体)，实现了对铜离子的灵敏、选择性测定。因此本发明构建的有机/无机复合荧光纳米粒子分散体系对于铜离子的检测具有重要的实用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种使用含脂质双层的有机/无机复合荧光纳米粒子分散体系检测铜离子的方法，本发明的方法操作简单，选择性好，灵敏度高，具有较好的通用性，可以选择一系列的有机/无机复合脂质和磷脂作为原料，为检测铜离子传感器的制备奠定了基础。
本发明所使用的含脂质双层的有机/无机复合荧光纳米粒子检测水相中铜离子的方法是按如下步骤实现的：
一、有机/无机复合脂质和DMPE最佳摩尔比例的确定。将有机/无机复合脂质和磷脂以1.5∶1～5∶1的摩尔比例混合，尼罗红荧光染料溶液与以上二者以1∶10～1∶30的摩尔比例混合，加入氯仿将混合物溶解，利用旋转蒸发仪将有机溶剂蒸干，瓶底会形成一层薄膜，向瓶中加入1～4ml去离子水，水化30min，再对其进行水浴超声，直至形成分散均匀的悬液，最后进行探头超声(“on”3s，“off”3s)。制备好的分散液中含有未包埋的游离的尼罗红，由于尼罗红不溶于水且在水中会沉在底部，因此采用离心的方法将有利的尼罗红除去，制备好的荧光纳米颗粒在室温下避光保存24h后，粒径在120nm左右，4℃避光保存待用。
二、实验最佳pH值的确定。将制备好的纳米颗粒分散液的pH值分别调到4、5、6、7、8、8.5、9，然后对铜离子进行检测，最终确定铜离子检测效果最好的pH值为检测的最佳pH值。
三、荧光纳米颗粒分散液对铜离子检测效果测定。向荧光纳米粒子分散液中加入梯度浓度的铜离子溶液，利用荧光光谱仪对体系的荧光强度进行检测。
四、阴离子对检测效果的影响测定。选择硝酸铜，醋酸铜，硫酸铜和氯化铜四种铜盐配制成1mM的铜离子水溶液，取120μl加入到荧光纳米颗粒分散液中，对它们的荧光强度进行测定。
五、共存阳离子对检测效果的影响测定。配置浓度为4mM的各种离子的水溶液，取50μl加入到荧光纳米粒子分散液体系中，以S0μL 1mM的铜离子水溶液作为对照，并对它们的荧光强度进行测定。
步骤一中所述的有机/无机复合脂质是一种能够形成含脂质双层的纳米粒子的硅氧烷脂质结构，由可水解的头部(R1O)3Si头部、连接基团和两条疏水的尾部组成；其硅氧烷脂质单体结构式如下所示：
式中R1，可选用CH3、CH3CH2、CH3CH2CH2、CH3CH2CH2CH2、(CH3)2CH等所有小于5个碳的短链烃基及所有能够水解形成硅醇的基团。结构式中R2和R3，可选用辛基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、二十烷基等所有小于26个碳的疏水长链烃基及其衍生物。结构式中R4可选用：-NHCO-，-NHCOCH2CH2CO-，
步骤一中所述的有机/无机复合脂质是一种能形成含有脂质双层的纳米粒子的硅氧烷脂质，其特征在于步骤一中所述的硅氧烷脂质也可以是如下基于季戊四醇的硅氧烷脂质的一种或者几种之间的任意组合，其结构通式如下：
其中，R1为C6～C18烷基；R2为C6～C18烷基；R3和R8为-CO(CH2)2CONH(CH2)3Si(X0)3、-CO(CH2)3CONH(CH2)3Si(X0)3或-CONH(CH2)3Si(X0)3，R4为C6～C18烷基，R5为
-CO(CH2)2CONH(CH2)3Si(X0)3、-CO(CH2)3CONH(CH2)3Si(X0)3或-CONH(CH2)3Si(X0)3，R9为-CO(CH2)2COOH或-CO(CH2)3COOH，其中X0为乙氧基或甲氧基，Y0为卤代基；a为2或3；X1为-H，-CH3，CH3O-，卤代基或-NO2；Y1为-H，-CH3，CH3O-或卤代基。X2为-H，-CH3，CH3O-或卤代基；M为与卟啉环配位的金属离子。
步骤一中所述的有机/无机复合脂质是一种能形成含有脂质双层的纳米粒子的硅氧烷脂质，其特征在于步骤一中所述的硅氧烷脂质也可以是如下一种基于胆固醇的硅氧烷脂质，其结构通式如下：
步骤一中所述的磷脂，可以是如下几种：1，2-二甘油脂-3-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)，其结构式如下：
本发明方法的原理是荧光共振能量转移。铜离子与磷脂提供的氨基可以形成铜氨络离子，从而使铜离子链接在纳米粒子表面，被包埋在脂质双层中的疏水性荧光染料尼罗红作为能量供体，纳米粒子表面的铜离子作为能量受体，从而发生荧光共振能量转移，使尼罗红的荧光发生变化，根据荧光变化的情况可实现对铜离子的检测。该发明使用含脂质双层的有机/无机复合脂质荧光纳米粒子检测铜离子的方法，制备工艺简单，反应条件温和，操作简便，具有广阔的应用前景。
附图说明
图-1含脂质双层的有机/无机复合荧光纳米粒子的制备过程示意图。
图-2含脂质双层的有机/无机复合荧光纳米粒子的粒度测定图和透射电镜图。
图-3含脂质双层的有机/无机复合荧光纳米粒子对铜离子的吸附能力分析图。
图-4含脂质双层的有机/无机复合荧光纳米粒子成功包埋尼罗红的验证图。
图-5含脂质双层的有机/无机复合荧光纳米粒子检测铜离子最佳pH值选择。
图-6含脂质双层的有机/无机复合荧光纳米粒子检测铜离子的效果图。
图-7阴离子对含脂质双层的有机/无机复合荧光纳米粒子检测铜离子的影响。
图-8阳离子对含脂质双层的有机/无机复合荧光纳米粒子检测铜离子的影响。
具体实施方式
通过以下具体实施方式将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。
具体实施方式一
本实施方式是有机/无机复合脂质与1，2-二甘油脂-3-磷脂酰乙醇胺(DMPE)以不同摩尔比混合制备荧光纳米粒子及最稳定配比的选择，荧光纳米粒子的制备过程如图-1，具体方法如下：
1、薄膜水化法制备纳米颗粒
有机/无机复合脂质与磷脂(DMPE)分别以六种摩尔比进行混合(1.5∶1，2∶1，2.5∶1，3∶1，4∶1，5∶1)，盛装于梨形瓶中，用氯仿将其溶解，加入合适量的尼罗红甲醇溶液，然后用旋转蒸发仪蒸发除去有机溶剂，在瓶底形成一层薄膜，加入去离子水，51℃水浴中水化30min，然后水浴超声5min，最后探头超声3min，即制备成粒径在120nm左右的纳米颗粒。
本实施方式所采用的有机/无机复合脂质是一种能形成含脂质双层纳米粒子的硅氧烷脂质，由可水解的头部(R1O)3Si头部、连接基团和两条疏水的尾构成；其单体结构式如下所示：
式中R1，可选用CH3、CH3CH2、CH3CH2CH2、CH3CH2CH2CH2、(CH3)2CH等所有小于5个碳的短链烃基及所有能够水解形成硅醇的基团。结构式中R2和R3，可选用辛基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、二十烷基等所有小于26个碳的疏水长链烃基及其衍生物。结构式中R4可选用：-NHCO-，-NHCOCH2CH2CO-，
本实施方式中所使用的有机/无机复合脂质和磷脂混合的摩尔比例范围是1.5∶1～5∶1，药质比范围是1∶10～1∶30，加入的梯度铜离子浓度范围是0～100μM。
2、硅质体和磷脂最佳配比的选择
对用以上方法制备好的荧光纳米颗粒进行荧光强度测定，记录荧光强度值，相同样品在4℃下避光放置3天后，用同样的方法对其荧光强度进行测定，结果证明，当硅质体形成有机/无机复合脂质与磷脂的摩尔比大于2.5∶1时，用二者制备的纳米颗粒都具有良好的稳定性，且摩尔比例越大，稳定性越好。
2、有机/无机复合脂质与磷脂以不同摩尔比例制备的荧光纳米粒子检测铜离子的效果测定。
取2mL制备好的荧光纳米颗粒分散液盛装于长方形的石英皿中，首先测定未加入铜离子时的荧光强度，即初始荧光强度(Io)，加入以上四种浓度的铜离子溶液15min后，再测定每个样品的荧光强度值(I)。每个样品制备三个平行样进行测定。最后计算出每个样品的相对荧光强度(I/Io)，根据测定结果，得出以下结论，当有机/无机复合脂质与DMPE的摩尔比为2.5∶1时，对铜离子的检测效果最好。
本实施方式中使用有机/无机复合脂质与磷脂混合制备荧光纳米粒子，其中有机/无机复合脂质提供的Si-O-Si网格结构起到稳定纳米粒子的作用，DMPE则为铜离子提供结合位点，当有机/无机复合脂质的含量增加时，有利于纳米粒子的稳定，当磷脂含量增加时可以提供更多的铜离子结合位点。
本实施方式的结果表明，当有机/无机复合脂质与磷脂的摩尔比例小于2.5∶1时，粒子不稳定，而当有机/无机复合脂质与磷脂的摩尔比例大于2.5∶1时，粒子稳定氮检测效果欠佳，因此在以后的试验中选择2.5∶1的摩尔比例制备荧光纳米颗粒。
具体实施方式二
有机/无机复合脂质与磷脂以2.5∶1混合制备的荧光纳米颗粒的粒度测定及表征。用动态光散射仪测定纳米颗粒的粒度。将2ml纳米颗粒分散液加入到测量所用的塑料比色杯中，选用氩离子激光器，测定角度90°，温度为25℃检测粒径大小和粒径分布范围。采用透射电镜对纳米粒子进行表征，取适量的纳米颗粒分散液滴在铜网上，室温自然干燥，使粒子在铜网上浓缩沉积，再用染色剂对其进行染色18min，干燥后，进行透射电镜观察，结果如图-2。
本实施方式中的结果均证明制备好的荧光纳米颗粒的粒径在120nm左右。
具体实施方式三
纳米颗粒对铜离子的吸附能力测定及尼罗红被纳米颗粒成功包埋的验证。
1、纳米颗粒对吸附铜离子的能力测定。
由于NH2中的氮原子有一对孤对电子，而铜离子又有空的电子轨道(4s，4p)，所以他们可以形成配位键，也就形成了铜氨络离子。具体方法如下：在0～6μM之间，配置10种浓度的铜离子溶液，利用前面提到的薄膜水化法制备未包埋尼罗红的纳米颗粒，分别加入不同浓度的铜离子溶液并对其进行紫外吸收测定，同时一纳米颗粒分散液和6μM铜离子溶液作为对照，图-3A是加入6μM铜离子的紫外吸收光谱图，从图中可以看出，在780nm附近出现一个吸收峰，由于铜氨络离子的形成是一个发色反应，所以这个吸收峰是铜氨络离子溶液的紫外吸收峰。从图-3B中可以看出，随着加入的铜离子溶液浓度的增大，紫外吸收值也随着增大，到铜离子浓度为6μM时趋于稳定，说明纳米颗粒对铜离子具有良好的吸附能力。
2、尼罗红被成功包埋的验证实验。
称取适量尼罗红溶于去离子水中，然后进行超声，离心出去未溶解的尼罗红粉末，即得到尼罗红饱和溶液。利用前面提到的薄膜水化法制备空纳米颗粒(未包埋尼罗红)和荧光纳米颗粒分散液，测定以上三种溶液的紫外吸收值，如图-4A，可以看到荧光纳米颗粒在600nm左右有一个吸收峰，且明显高于尼罗红水溶液的吸收峰。再对尼罗红水溶液和荧光纳米颗粒进行荧光强度的测定，如图-4B，可以看出，荧光纳米颗粒在600nm处也有一个强的吸收峰。综合以上两图说明，尼罗红被成功包埋到纳米颗粒中。
具体实施方式四
含脂质双层的有机/无机荧光纳米粒子分散体系检测铜离子的最佳pH值选择。本实施方式中制备七个荧光纳米粒子样品200μL，用不同pH值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、8.5、9.0)的磷酸盐缓冲液稀释至2mL，540nm激发波长下激发，测定602nm处的相对荧光强度，结果如图-5，当pH值为8时荧光纳米粒子检测铜离子的效果最好。
本实施方式中所使用的磷脂提供了大量的NH4 +，当pH 8.0时，这种弱碱性的环境将NH4 +转变为NH2，可以与铜离子结合形成铜氨络离子，从而为铜离子与荧光纳米粒子的结合提供了结合位点。
具体实施方式五
含脂质双层的有机/无机复合脂质荧光纳米粒子检测铜离子的效果测定。配置在0～100μM之间的10种浓度的铜离子溶液，利用以上提到的薄膜水化法制备荧光纳米颗粒分散液，取2mL分散液装入石英皿里，先测定其初始荧光强度值，加入梯度浓度的铜离子溶液15min后，再对其荧光强度值进行测定，最后计算出加入梯度浓度的铜离子溶液后的相对荧光强度值，以相对荧光强度为纵坐标，铜离子浓度为横坐标作图，即得到图-6中的插图，以荧光强度为纵坐标，以铜离子浓度为横坐标作图即得到图-6。从图中可以看出，加入的铜离子浓度越大，荧光强度越低，说明荧光淬灭的程度越大。从图中计算得到最低检测限为0.1μM，因此，这种生物传感器具有良好的敏感性。
本实施方式在测定过程中，每加入一次铜离子溶液都要等待15min，再对其荧光强度的变化进行测定，因为铜离子结合在纳米粒子表面需要一段反应时间，本发明中测得实验所需的反应时间为15min。
具体实施方式六
含脂质双层的有机/无机复合脂质荧光纳米粒子对铜离子的选择性验证，具体方法如下：
1、阴离子对检测效果的影响。分别配置浓度为1mM的氯化铜、硝酸铜，醋酸铜、硝酸铜溶液，取用pH 8.0磷酸盐缓冲液稀释的荧光纳米粒子分散液2mL，在540nm的激发波长下激发，测定其初始荧光强度Io，向纳米粒子分散液中加入120μL以上配置好的盐溶液，反应15min后，测定分散液的荧光强度，以不同的盐溶液和相对荧光强度作图，考察阴离子对铜离子检测的影响结果如图-7。
本实施方式中的结果表明，当向荧光纳米分散液体系中加入相同浓度的不同铜盐溶液后，体系的荧光强度淬灭程度几乎相同，因此可以得出结论，阴离子对荧光纳米粒子检测铜离子的影响可以忽略。
2、共存阳离子对检测效果的影响。分别配置三种不同浓度的铜离子(5μM，20μM，100μM)，二价铁离子，汞离子，钙离子，钴离子，镁离子，锰离子，镍离子，铅离子，锌离子的水溶液待用。取2ml纳米粒子分散液装入石英皿中，首先测定初始荧光强度，再分别加入不同浓度的各种离子10min后，测定荧光强度，计算出相对荧光强度，结果如图-8。
本实施方式检测铜离子的原理是荧光共振能量转移(FRET)，这个过程的完成需要两个基本因素，第一个因素是能量供体和能量受体，二者进行能量传递；本实验中的能量供体是尼罗红，能量受体是铜离子，尼罗红分子将能量传递给铜离子，从而使尼罗红分子的荧光淬灭。而能量供体与能量受体之间要想发生能量传递，必须要满足第二个因素，即能量受体与能量供体之间存在合适的距离。只有同时满足以上两个因素，才能发生荧光共振能量转移。由于本实验制备的荧光纳米粒子体系的最终目的是应用于环境尤其是水环境样品的铜离子检测，而环境样品中常常是多种金属离子共存，因此我们采用荧光纳米粒子体系对环境中存在比较多的二价阳离子进行检测，来考察体系对铜离子的选择性。
本实施方式中的检测结果表明，在四个金属离子浓度下，只有加入铜离子后，体系的荧光强度呈现出梯度下降的趋势，而加入其他的二价金属离子后，体系的荧光强度变化微弱，甚至可以忽略，这种微弱的变化可能是由于金属离子水溶液对体系的轻微稀释作用。因此可以得出结论，在所有经过测试的二价金属离子中，我们制备的这种荧光纳米粒子只对铜离子具有检测效果。
本实施方式的结果表明，其他离子的存在对传感器检测铜离子的效果所产生的影响很微弱，可忽略，本发明制备的荧光纳米粒子分散体系对铜离子具有很好的选择性。总体上含脂质双层的有机/无机复合脂质制备的荧光纳米粒子应用于铜离子的检测，克服了传统的原子吸收/发射光谱法及电感耦合等离子体质谱
(ICP-MS)法等传统方法需要昂贵而复杂的仪器，有的需要非常复杂的样品制备过程等缺点，为灵敏度高，选择型好的检测铜离子传感器的开发奠定了基础，本发明在环境科学，食品科学以及生物科学有很好的应用前景和很大的实际应用价值。
Claims (10)
1.使用有机/无机复合脂质制备的含脂质双层的荧光纳米粒子检测水相中的铜离子的方法，其特征在于：以有机/无机复合脂质、磷脂作为成膜材料，应用薄膜水化法，将疏水荧光染料尼罗红包埋到纳米颗粒的疏水双层中，从而形成具有荧光的纳米粒子分散液，然后对待检样品进行检测，根据荧光变化的现象及程度达到检测和定量水相中铜离子的目的。
2.如权力要求1所述的检测铜离子的荧光纳米粒子，其制备方法如下所述：将有机/无机复合脂质和磷脂以1∶1～8∶1的摩尔比例混合，尼罗红荧光染料溶液与以上二者以1∶5～1∶50的摩尔比例混合，加入有机溶剂将上述混合物溶解，后蒸干形成一层薄膜，向瓶中加入1～4mL各种不同pH值的去离子水，水化30min，再进行水浴超声，最后进行探头超声，直至形成分散均匀的混悬液。
3.如权利要求1和2所述的使用含脂质双层的有机/无机复合荧光纳米粒子检测水相中铜离子的方法，其特征在于硅氧烷脂质的结构，其结构为：
(硅氧烷脂质)。结构式中R1，可选用CH3、CH3CH2、CH3CH2CH2、CH3CH2CH2CH2、(CH3)2CH等所有小于5个碳的短链烃基及所有能够水解形成硅醇的基团。结构式中R2和R3，可选用辛基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、二十烷基等所有小于26个碳的疏水长链烃基及其衍生物。结构式中R4可选用：-NHCO-，-NHCOCH2CH2CO-，
4.如权力要求3所述的用于形成含脂质双层的有机/无机复合荧光纳米粒子的硅氧烷脂质
可以是硅氧烷脂质的一种或者几种之间的任意组合。
5.如权利要求1和2所述的使用含脂质双层的有机/无机荧光纳米粒子检测水相中的铜离子的方法，其特征在于所述的有机/无机复合脂质还可以是如下基于季戊四醇的复合脂质的一种或者几种之间的任意组合，其结构通式如下：
其中，R1为C6～C18烷基；R2为C6～C18烷基；R3和R8为-CO(CH2)2CONH(CH2)3Si(X0)3、-CO(CH2)3CONH(CH2)3Si(X0)3或-CONH(CH2)3Si(X0)3，R4为C6～C18烷基，R5为-CO(CH2)2CONH(CH2)3Si(X0)3、-CO(CH2)3CONH(CH2)3Si(X0)3或-CONH(CH2)3Si(X0)3，R9为-CO(CH2)2COOH或-CO(CH2)3COOH，其中X0为乙氧基或甲氧基，Y0为卤代基；a为2或3；X1为-H，-CH3，CH3O-，卤代基或-NO2；Y1为-H，-CH3，CH3O-或卤代基。X2为-H，-CH3，CH3O-或卤代基；M为与卟啉环配位的金属离子。
6.如权利要求1和2所述的使用含脂质双层的有机/无机复合脂质荧光纳米粒子检测水相中的铜离子的方法，其特征在于所述的有机/无机复合脂质也可以是一种含有胆固醇的复合脂质，其结构式如下：
7.如权利要求1和2所述的使用含脂质双层的有机/无机复合脂质荧光纳米粒子检测水相中的铜离子的方法，其特征在于所述的磷脂是含有氨基的磷脂，可以是如下磷脂的一种或者几种之间的任意组合：1，2-二甘油脂-3-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)，其结构式如下：
8.如权利要求1和2所述的使用含脂质双层的有机/无机复合脂质荧光纳米粒子检测水相中的铜离子的方法，其特征在于所述的有机/无机复合脂质和磷脂混合的摩尔比例范围优选1.5∶1～5∶1。
9.如权利要求1和2所述的使用含脂质双层的有机/无机复合脂质荧光纳米粒子检测水相中的铜离子的方法，其特征在于所述的有机/无机复合脂质和磷脂与疏水荧光染料尼罗红的比范围优选10∶1～30∶1。
10.如权利要求1和2所述的使用含脂质双层的有机/无机复合脂质荧光纳米粒子检测水相中的铜离子的方法，其特征在于所检测铜离子的浓度范围是0～100μM。
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2011
- 2011-06-09 CN CN2011101530514A patent/CN102818790A/zh active Pending
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