CN115872949A - 近红外刚度响应荧光探针、其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了近红外刚度响应荧光探针、其制备方法和应用，属于光学分子影像探针技术领域。本发明提供的了式I或II所示的化合物或其药学上可接受的盐。本发明提供了上述化合物或其药学上可接受的盐在制备近红外荧光探针中的应用；该探针为生学力学刚度响应的近红外荧光探针，能用于活细胞或/和活体成像。本发明创造性地通过调节母体荧光分子的π‑共轭体系，分子结构中位引入转子取代基，分子杂环N引入水溶性基团，从而实现在生理环境中高灵敏度刚度响应型。本发明的近红外刚度响应荧光探针，能在活细胞、3D培养细胞球和活体肿瘤上实现刚度近红外成像。本发明的制备方法简单，操作简便，产物易于纯化，产率高。

Description

近红外刚度响应荧光探针、其制备方法和应用

技术领域

本发明属于光学分子影像探针技术领域，具体涉及近红外刚度响应荧光探针、其制备方法和应用。

背景技术

近期研究发现，肿瘤具有生物学和物理学(固体应力升高、间质流体压力升高、刚度增加和组织微结构改变)的双重异常。肿瘤物理学性质异常与肿瘤生物学特征密切相关，为揭示肿瘤恶性本质带来突破性认知，有望成为肿瘤的治疗策略并为药物研究提供新机遇。肿瘤刚度增加是实体瘤微环境最显著的物理学性质特征，其与肿瘤发生发展、侵袭及转移、治疗等密切相关。因此，利用影像学技术方法无创可视化肿瘤刚度对肿瘤的检查和诊断有着重要的临床意义，肿瘤刚度与肿瘤恶性关系需进一步探索。

目前，原子力显微镜(AFM)可实现细胞水平的刚度成像；超声或CT可初步实现在体刚度成像，但分辨率有限。为了进一步实现肿瘤刚度的在体高分辨成像，研究者们对肿瘤ECM刚度组成(纤维蛋白等)或对刚度生物标志物标记同位素或磁共振造影剂等，进行PET/SPECT或MRI成像。然而，依然存在灵敏度低、辐射性、成像耗时和设备庞大等缺点。

众多成像技术中近红外荧光成像技术具有灵敏度高、分辨率高、非侵入实时成像的优点。然而目前可实现活体水平的刚度响应型近红外探针尚未见报道，可见设计生理条件下高灵敏刚度响应近红外光学探针一项具有挑战性的工作。在众多近红外探针中，近红外花菁染料因其优异的生物相容性被广泛应用于临床及预临床阶段中，例如吲哚菁绿ICG、IRDye800CW等。因此，设计开发波长位于近红外区域的高灵敏刚度响应新型花菁荧光探针对生物医学光学成像尤为重要。

发明内容

本发明的目的之一在于，提供式I或式II所示的化合物或其药学上可接受的盐，其可作为近红外刚度响应荧光探针，能实现单细胞水平、3D细胞球及活体水平的刚度响应成像。

本发明的目的之二在于，提供上述化合物的制备方法。

本发明的目的之三在于，提供上述化合物在制备近红外刚度响应荧光探针中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供的一种式I或II所示的化合物或其药学上可接受的盐，

/>

其中，Z为C(CH₃)₂、S或CH＝CH；

Y为

其中R₃为氢、羟基、卤素、甲氧基或硝基；

R₁为-(C₂H₄O)_mR₄、-(CH₂)_mCOOH、-(CH₂)_m、-SO₃R₇、C_1-6烷基、C_3-8环烷基或-(CH₂)_pC₆H₄R₆，其中m选自1～30的整数，p选自1～30的整数，R₃为氢、羟基、卤素、甲氧基或硝基，R₄为H或C_1-6烷基；R₆为氢、羟基、卤素、甲氧基或硝基；R₇为H、碱金属或碱土金属离子；

R₂为氢、羟基、卤素、硝基、C_6-12芳基、3-12元杂芳基、C_6-12芳基氧基，3-12元杂芳基氧基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基或SO₃R₅；其中R₅为H、碱金属或碱土金属离子；

n为1或2；

X选自无机阴离子。

本发明的部分实施方案中，R₁为C_1-6烷基、-(C₂H₄O)_mR₄，其中R₄为H或C_1-3烷基，m选自1-5的整数；

R₂为氢、羟基、卤素、C_1-3烷氧基、C_1-3烷基、SO₃R₅，其中R₅为H、碱金属离子K或Na；

R₃为氢、羟基、甲氧基、卤素；

X选自卤素离子、PF₆ ^-或TsO^-。

本发明的部分实施方案中，Z为C(CH₃)₂或S；

Y为

R₁为-(C₂H₄O)_mR₄，m选自1-5的整数；R₄为H或C_1-3烷基；

R₂为氢、甲基或SO₃ ^-K⁺；

R₃为H、甲基或甲氧基；

n为1；

X选自卤素离子、PF₆ ^-或TsO^-。

4.根据权利要求3所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，Z为C(CH₃)₂或S；

Y为

R₁为乙基或-[(CH₂)₂O]₃CH₃；

R₂为氢、甲基或SO₃ ^-K⁺；

R₃为H、甲基或甲氧基；

n为1；

X选自卤素离子、PF₆ ^-或TsO^-。

本发明的部分实施方案中，式I化合物选自如下化合物CyThPT：

其中，X选自卤素离子、PF₆ ^-或TsO^-。

本发明的部分实施方案中，式II化合物选自如下化合物CyInPT：

其中，X选自卤素离子、PF₆ ^-或TsO^-。

本发明提供的化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，该制备方法中，化合物I-1与化合物3反应得到式I化合物，

其中R₁、R₂、R₃、X、Y、Z、n的定义同权利要求1。

本发明提供的化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，化合物II-1与化合物3反应得到式II化合物，

其中R₁、R₂、R₃、X、Y、Z、n的定义同权利要求1。

本发明的部分实施方案中，在惰性气体气氛或氮气气氛下反应；

优选地，反应溶剂为DMF和水的混合溶剂，更优选为体积比DMF:H₂O＝9:1的混合溶剂；

优选地，反应温度为65～85℃。

本发明提供的上述化合物或其药学上可接受的盐在制备近红外荧光探针中的应用；

优选地，所述探针为生学力学刚度响应的近红外荧光探针，

优选地，所述探针用于活细胞或/和活体成像。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明创造性地通过调节母体荧光分子的π-共轭体系，分子结构中位引入转子取代基，分子杂环N引入水溶性基团，从而实现在生理环境中高灵敏度刚度响应型。

(2)本发明通过刚度关键演进分子的表达水平调节活细胞和活体肿瘤的刚度变化，本发明提供的新型近红外刚度响应荧光探针，在活细胞、3D培养细胞球和活体肿瘤上成功实现了刚度近红外成像，克服了现有技术中在活细胞和活体刚度成像中没有近红外类荧光探针的问题。

(3)本发明的制备方法简单，操作简便，产物易于纯化，产率高。

术语解释和说明

除非另有说明，本申请说明书和权利要求书中记载的基团和术语定义，包括其作为实例的定义、优选地定义、实施例中具体化合物的定义等，可以彼此之间任意组合和结合。这样的组合和结合后的基团定义及化合物结构，应当属于本申请记载的范围。

除非另有说明，本申请中基团的下标一般指该基团的个数。

本申请说明书和权利要求书记载的数值范围，当该数值范围被定义为“整数”时，应当理解为记载了该范围的两个端点以及该范围内的每一个整数。例如，“0～6的整数”应当理解为记载了0、1、2、3、4、5和6的每一个整数。当该数值范围被定义为“数”时，应当理解为记载了该范围的两个端点、该范围内的每一个整数以及该范围内的每一个小数。

术语“卤素”指F、Cl、Br和I。换言之，F、Cl、Br和I在本说明书中可描述为“卤素”。

本发明单独使用或用作后缀或前缀的“C_1-6烷基”意指支链和直链饱和脂族烃基，其具有1至6个碳原子(或若提供了碳原子的具体数目，则指该具体数目)的支链和直链饱和脂族烃基。C_1-6烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2-乙基己基、3-乙基己基、2-己基癸基等，以及上述基团的全部异构形式。

术语“C_1-6烷氧基”指C_1-6烷基-O-，其中C_1-6烷基具有如上所述的定义。

本发明使用的术语“C_3-8环烷基”意指饱和的烃环，其可包括稠合或桥接的多环系统。环烷基在其环结构中优选具有3至8个碳原子。优选地，环烷基在其环结构中具有3、4、5或6个碳原子。例如，“C_3-6环烷基”表示例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基的基团。

本发明使用的术语“3-8元杂环基”指包含3至8个原子的饱和、不饱和或部分饱和的单环、二环或三环(除非另有说明)，其中1、2、3、4或5个环原子选自氮、硫或氧，除非另有说明，其可通过碳或氮来连接，其中-CH₂-基团任选被-C(O)-代替；及其中除非另有相反说明，环氮原子或环硫原子任选被氧化以形成N-氧化物或S-氧化物或环氮原子任选被季铵化；其中环中的-NH任选被乙酰基、甲酰基、甲基或甲磺酰基取代；及环任选被一个或多个卤素取代。应该理解的是，当杂环基中S原子和O原子的总数超过1时，这些杂原子不彼此相邻。若所述杂环基为二环或三环。

术语“C_6-12芳基”应理解为表示具有6～12个碳原子的一价芳香性或部分芳香性的单环、双环或三环烃环。特别是具有6个碳原子的环(“C₆芳基”)，例如苯基；或联苯基，或者是具有9个碳原子的环(“C₉芳基”)，例如茚满基或茚基，或者是具有10个碳原子的环(“C₁₀芳基”)，例如四氢化萘基、二氢萘基或萘基。

C_6-12芳基氧基，3-12元杂芳基氧基中C_6-12芳基和3-12元杂芳基具有如上所述的定义。

附图说明

附图1是本发明的刚度响应探针ThPT的质谱图。

附图2是本发明的是本发明的刚度响应探针InPT的质谱图。

附图3是本发明的刚度响应探针ThPT在水和甘油-水中的荧光发射图谱；

附图4是本发明的刚度响应探针InPT在水和甘油-水中的荧光发射图谱；

附图5是本发明的刚度响应探针ThPT和InPT在不同刚蛋白仿体中的荧光强度。其中显著性分析：*:p<0.05、****:p<0.0001。

附图6本发明的探针ThPT应用于BGC-823肿瘤细胞系上的刚度成像示意图。其中RA为TG2酶促进剂；MDC为TG2酶抑制剂。

附图7是本发明的探针ThPT用于3D和2D培养细胞成像的示意图。

附图8是本发明的探针ThPT经静脉给予胃癌荷瘤小鼠在24小时内全身近红外成像在体成像示意图。图中MDC为TG2酶抑制剂。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

实施例1

本实施例公开了本发明的刚度探针CyThPT的合成，具体为：

在无氧条件下，将1eq的ThP和2eq的1-(4-苯硼酸频哪醇酯)-1,2,2-三苯乙烯溶于DMF和H₂O的混合溶剂中，混合溶剂中DMF:H₂O＝9:1(v/v)，加入到25mL圆底烧瓶中，在3eq的K₃PO₄和0.05eq的催化剂(二氯二叔丁基-(4-二甲基氨基苯基)膦钯(II))作用下，65～85℃氩气保护反应12h。反应完成除去溶剂，柱层析分离纯化产物，分离比例为甲醇：二氯甲烷＝1：100(v/v)，得到蓝绿色染料CyThPT。产品结构经高分辨鉴定。计算值：957.3971，测试值：957.3966。

质谱表征结果如图1所示。

实施例2

本实施例公开了本发明的刚度探针CyInPT的合成：

将1eq的母体染料InP和1.5eq的1-(4-苯硼酸频哪醇酯)-1,2,2-三苯乙烯加入到25mL圆底烧瓶中，在氩气环境保护下，加入2.5eq的K₃PO₄和0.05eq的催化剂二氯二叔丁基-(4-二甲基氨基苯基)膦钯(II)，最后加入DMF和H₂O的混合溶剂10mL中，DMF:H₂O＝9，氩气环境下65～85℃反应12h，反应完成后旋蒸除去溶剂DMF和水，柱层析分离纯化，洗脱体系比例为二氯甲烷:甲醇＝20:1，最终得到蓝色粉末状固体染料。计算值：1077.5776，测试值：1077.5778。质谱表征结果如图2所示。

实施例3

本实施例考察了刚度响应探针CyThPT和CyInPT的荧光光谱特性。

用万一之一天平分别准确称量CyThPT和CyInPT探针固体各5mg，分别溶于1mL去离子水中配置母液；用水和90％甘油-水溶液配制为工作浓度为5μM。利用爱丁堡1000荧光光谱仪测定荧光发射强度。

测试结果为CyThPT和CyInPT在水相体系中最大发射波长分别为686nm和710nm。通过比对探针在水和90％甘油-水体系中的荧光强度可知，CyThPT在90％甘油-水中荧光强度增强了90倍(如附图3所示)，CyInPT增强了25倍(如附图4所示)。传统转子型荧光染料，在甘油-水体系中染料会析出，无法实现生理环境中的荧光响应。本发明实施例提供的探针CyThPT和CyInPT均可以在水及甘油-水混合溶剂中稳定溶解分散，并且在水相中表现出良好的转子抑制响应性能。

实施例4

本实施例考察了刚度响应探针CyThPT和CyInPT对胶原蛋白仿体的刚度响应：

将海藻酸钠溶解在蒸馏水中并搅拌过夜，制备海藻酸钠储备溶液。在去离子水中以5％、2.5％、1.25％和0％的比例重新组合的海藻酸盐用于控制刚度。将葡萄糖酸内酯和CaCl₂加入海藻酸钠溶液中，使得葡萄糖酸内酯的浓度为40mM，CaCl₂浓度为20mM，并充分混合均匀。1型胶原蛋白溶液用10×磷酸盐缓冲盐水和NaOH进行中和。然后将1型胶原蛋白溶液与以上配置的海藻酸钠溶液以体积比3:1的比例混合，再向每个管中加入1μM的CyThPT和CyInPT，同时将其置于冰中，以防止胶原蛋白预凝胶。在温度为37℃下搅拌交联1h，再加入100mM的CaCl₂，37℃下再搅拌交联1h。然后再使用IVIS对96孔板进行荧光成像，观察获取成像信息。荧光成像使用Ex＝660nm，Em＝710nm波段进行信号采集。最后使用IVIS软件对荧光信号进行后续荧光强度的定量分析。

结果如附图5所示，CyInPT从胶原仿体1.6kPa到6.8kPa有明显的荧光增强，CyThPT从胶原仿体0.5kPa到6.8kPa的刚度变化中都能有明显的荧光增强，这证明了CyInPT和CyThPT都具有刚度响应性，CyThPT刚度响应性能更为优异，可实现生理环境下的刚度响应。

实施例5

本实施例考察了刚度响应探针CyThPT在BGC-82细胞系水平的细胞成像性能。：

乏氧和转谷氨酰胺酶2(TG2)可增强肿瘤微环境刚度。为验证探针的刚度响应性，将细胞在常氧、乏氧、TG2促进剂RA、TG2抑制剂MDC来调节细胞刚度。细胞系选用BGC-823细胞系，以含10％胎牛血清的RPMI1640培养基于37℃，5％CO₂条件下培养。取对数生长期的细胞，消化离心后接种在共聚焦培养皿中，培养过夜。将BGC-823细胞用RPMI-1640培养基稀释至5x10⁴个/mL的密度接种于共聚焦小室中。乏氧组用含有200μM乏氧促进剂CoCl₂的RPMI-1640培养基孵育细胞24h模拟细胞乏氧环境。促进TG2组用含有20μMRA的RPMI-1640培养基孵育细胞6h。抑制TG2组在结束孵育CoCl₂或RA后用含有50μM MDC的RPMI-1640培养基孵育细胞24h。之后，弃去培养基，用PBS清洗2-3次，再加入含有5μM的ThPT探针的培养基孵育1h，孵育结束后弃去培养基，用PBS清洗细胞2-3次后，用4％多聚甲醛固定液对细胞进行20min固定、再用PBS清洗细胞2次后用DAPI进行5min核染色、然后封片、对细胞进行共聚焦成像。

检测结果如图6所示，由图6可以看出乏氧和促进剂RA条件下，可引起TG2表达量的提高，细胞刚度增加，发现荧光明显增强。然而细胞经过TG2抑制剂MDC处理后，细胞荧光强度都会明显降低。结果表明，本发明提供的新型近红外刚度响应探针CyThPT可在单细胞水平上取得较好的细胞刚度成像效果。

实施例6

本实施例考察了刚度响应探针CyThPT在3D细胞球刚度成像性能：

将150mg琼脂糖溶于10mL的无血清培养基中，并在15mL离心管中充分混合后灭菌处理，于96孔板中每个孔加入50μL的琼脂糖溶液，放入4℃冰箱进行储存。将BGC-823细胞按照每个孔5000个细胞的密度接种于琼脂板中，每个孔加入100μL含血清的1640培养基，放入培养箱中培养，每日每孔再加入100μL培养基换液。大约14天左右之后3D细胞球制备完毕，每孔加入含有5μMThPT探针的培养基，孵育1h，孵育结束后将染料吸出，加入Hoechst活细胞细胞核染色剂3D细胞球，最后将细胞球转移至共聚焦小皿中用共聚焦成像仪进行成像。同时与BGC-823的2D细胞做对比(步骤通实施例5)。众所周知，3D培养系统可以保留癌细胞和基质的形状、极化、遗传特征和异质性，更接近实体肿瘤生存环境。因此3D细胞球的刚度比2D细胞较大。

研究结果如图7所示，从图7成像结果中可以看出，探针CyThPT在3D细胞球成像时明显要比2D平面成像时荧光强度高。这也验证了说明CyThPT在细胞水平具有良好的刚度响应性。

实施例7

本实施例考察了刚度响应探针CyThPT在小鼠活体成像性能。

首先建立BGC-823荷瘤小鼠模型：细胞选用BGC-823，待其生长在对数生长期后，用胰蛋白酶消化，新鲜培养基终止消化，然后将细胞悬液加入15mL离心管中，用离心机对细胞悬液进行离心，时间为5min，转速为800rpm，离心结束后弃去上清，并向离心管中加入适量PBS对细胞进行缓慢吹打，使细胞在PBS中分散均匀，按照每只小鼠5×10⁶个细胞接种于小鼠右下肢皮下位置，约7天后完成小鼠肿瘤模型的建立。将小鼠随机分成两组(n＝3)。用5％的异氟烷对小鼠进行麻醉，将MDC用DMSO为溶剂配置成10mg/mL的母液，从当中取出12nmol将其加入25μL的PBS中，提前3h对其中一组小鼠瘤内注射MDC。然后再两组同时瘤内注射由PBS缓冲液稀释的ThPT，注射量均为0.2nmol。选取不同的观测时间，使用IVIS对0min、5min、1h、2h、4h、8h、12h和24h等时间点进行小鼠肿瘤荧光成像观察获取成像信息，对比两组小鼠肿瘤亮度。

结果如附图8所示，对比+MDC和-MDC两组小鼠实验组，+MDC组肿瘤刚度降低，ThPT的肿瘤荧光信号明显降低。这表明刚度响应性探针CyThPT可以通过荧光成像实现在体区分不同刚度的肿瘤。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种式I或II所示的化合物或其药学上可接受的盐，

其中，Z为C(CH₃)₂、S或CH＝CH；

Y为

其中R₃为氢、羟基、卤素、甲氧基或硝基；

R₁为-(C₂H₄O)_mR₄、-(CH₂)_mCOOH、-(CH₂)_m、-SO₃R₇、C_1-6烷基、C_3-8环烷基或-(CH₂)_pC₆H₄R₆，其中m选自1～30的整数，p选自1～30的整数，R₄为H或C_1-6烷基；R₆为氢、羟基、卤素、甲氧基或硝基；R₇为H、碱金属或碱土金属离子；

R₂为氢、羟基、卤素、硝基、C_6-12芳基、3-12元杂芳基、C_6-12芳基氧基，3-12元杂芳基氧基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基或SO₃R₅；其中R₅为H、碱金属或碱土金属离子；

n为1或2；

X选自无机阴离子。

2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，R₁为C_1-6烷基、-(C₂H₄O)_mR₄，其中R₄为H或C_1-3烷基，m选自1-5的整数；

R₂为氢、羟基、卤素、C_1-3烷氧基、C_1-3烷基、SO₃R₅，其中R₅为H、碱金属离子K或Na；

R₃为氢、羟基、甲氧基、卤素；

X选自卤素离子、PF₆ ^-或TsO^-。

3.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，Z为C(CH₃)₂或S；

Y为

R₁为-(C₂H₄O)_mR₄，m选自1-5的整数；R₄为H或C_1-3烷基；

R₂为氢、甲基或SO₃ ^-K⁺；

R₃为H、甲基或甲氧基；

n为1；

X选自卤素离子、PF₆ ^-或TsO^-。

4.根据权利要求3所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，Z为C(CH₃)₂或S；

Y为

R₁为乙基或-[(CH₂)₂O]₃CH₃；

R₂为氢、甲基或SO₃ ^-K⁺；

R₃为H、甲基或甲氧基；

n为1；

X选自卤素离子、PF₆ ^-或TsO^-。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，式I化合物选自如下化合物CyThPT：

其中，X选自卤素离子、PF₆ ^-或TsO^-。

6.根据权利要求1-4任意一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，式II化合物选自如下化合物CyInPT：

其中，X选自卤素离子、PF₆ ^-或TsO^-。

7.根据权利要求1-5任意一项所述的化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，化合物I-1与化合物3反应得到式I化合物，

其中R₁、R₂、R₃、X、Y、Z、n的定义同权利要求1。

8.根据权利要求1-4或权利要求6任意一项所述的化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，化合物II-1与化合物3反应得到式II化合物，

其中R₁、R₂、R₃、X、Y、Z、n的定义同权利要求1。

9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，在惰性气体气氛或氮气气氛下反应；

优选地，反应溶剂为DMF和水的混合溶剂，更优选为体积比DMF:H₂O＝9:1的混合溶剂；

优选地，反应温度为65～85℃。

10.根据权利要求1-6任意一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备近红外荧光探针中的应用；

优选地，所述探针为生学力学刚度响应的近红外荧光探针，

优选地，所述探针用于活细胞或/和活体成像。

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