CN111068051B - 基于酞菁铜分子的诊疗一体化纳米探针及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于酞菁铜分子集检测,成像,治疗于一体的纳米探针,所述纳米探针包括六方氮化硼纳米片,酞菁铜分子以及两组寡核苷酸结合序列。本发明所设计的两组寡核苷酸序列一端为用于检测和循环放大microRNA‑21的碱基对,另一端均为AS1411序列。AS1411序列既可以识别肿瘤细胞表面高表达的核仁素起靶向定位作用,又可以基于其特定条件下形成的G四连体来搭载水溶性较差的酞菁铜分子。继而,装载好酞菁铜的核苷酸序列通过π‑π堆积作用吸附在六方氮化硼纳米片表面进入肿瘤细胞中。本发明还公开了上述的诊疗一体化纳米探针在肿瘤细胞以及活体中的诊断与治疗中的应用。本发明的诊疗一体化纳米探针能够对肿瘤细胞进行原位拉曼诊断,灵敏度高,特异性强,且能够同时实现光动力治疗,在生物医药和临床诊疗上具有一定的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域,尤其涉及一种基于酞菁铜分子的诊疗一体化纳米探针及其应用。
背景技术
诊疗一体化是医学领域的新兴智能手段,是一种兼具诊断与治疗能力的协同系统,已成为癌症研究中被高度关注的关键词。理想情况下,智能有效的诊疗一体化探针应符合以下标准:(i)监测和治疗方式在疾病部位特异性激活,以避免背景干扰和副作用;特别是,用内源性癌症标志物激活探针是理想的,以提供精确的控制;(ii)探针应具有高检测灵敏度和治疗效力;(iii)监测和治疗方式需要在每个探针中相关联,以提供具有高可预测性和可控性的治疗能力。然而,到目前为止,将所有这些特征集成于单个探针仍然具有挑战性。
目前普遍使用的诊断治疗主要依赖于荧光,磁共振成像或正电子发射断层扫描与化疗,基因治疗或放射治疗的组合诊疗。然而,这些检测方法存在选择性差和灵敏度低等一些缺点,导致诊断延迟,准确性差。同时,化疗和放疗会引起多药耐药和放射毒性,引起严重的副作用甚至肿瘤转移。此外,基因治疗引起的免疫反应和非预期的诱变限制了它们在临床中的实际应用。作为一种非侵入性技术,光动力疗法最近已被广泛探索为一种用于精确定位和治疗的有前景的方法。在基于光动力的治疗中,通过在特定区域激光照射光敏剂上,诱导活性氧 (主要是细胞毒性单线态氧)的产生来破坏肿瘤细胞。因此,理想的光敏剂应具有高吸收系数,三重态的高量子产率和生理条件下的低细胞毒性。
金属酞菁是一种具有18-π电子芳香族大环的二维分子,在中心腔处具有金属配位。酞菁化合物具有独特的性质,因其在光谱的红色部分(600-760nm)具有高摩尔吸光系数ε(约 105M-1cm-1),可允许激光穿透组织。此外,酞菁的低毒性使其有望成为光动力治疗的有效试剂。然而,传统光敏分子存在溶解性差和分子选择性低等缺陷,使其作为检测和治疗方式受到限制。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明的目的在于提供一种基于酞菁铜分子的诊疗一体化纳米探针及其应用,所述纳米探针包括六方氮化硼纳米片,酞菁铜分子以及两组寡核苷酸结合序列。 microRNA-21作为肿瘤细胞内高表达的标志物,已被广泛用于乳腺癌,胰腺癌,肠癌等术前诊断中。本发明所设计的两组寡核苷酸序列一端为用于检测和循环放大microRNA-21的碱基对,另一端均为AS1411序列。AS1411序列既可以识别肿瘤细胞表面高表达的核仁素起靶向定位作用,又可以基于其在特定条件(即退火)下形成的G四连体二级结构来搭载水溶性较差的酞菁铜分子。继而,装载好酞菁铜的核苷酸序列通过π-π堆积作用吸附在六方氮化硼纳米片表面进入肿瘤细胞中。本发明的纳米探针能够实现对肿瘤细胞内microRNA-21进行高灵敏度高选择性检测的同时,进行有效的光动力治疗。所述两组寡核苷酸结合序列之间可通过碱基互补结合,并可与microRNA-21部分互补连接;所述六方氮化硼纳米片与装载酞菁铜的 AS1411修饰的寡核苷酸结合序列通过π-π堆积作用结合。
本发明中,所述两组寡核苷酸结合序列分别为:
5’-TCAGACTGATGTTCGTAGCTTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATTTTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’(SEQ ID NO.1)和
5’-TTCGTAGCTTATCAGACTGATGTTTGATAAGCTACGAACATCAGTTTTTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’(SEQ ID NO.2)。
本发明中,所述AS1411序列为:5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’(SEQ IDNO.3)。
本发明中,所述六方氮化硼纳米片的粒径为80~100nm,优选地,粒径为90nm;厚度为 14-16nm,优选地,厚度为15nm。
本发明还提供了一种基于酞菁铜分子的诊疗一体化纳米探针的制备方法,利用化学合成以及物理吸附等方法制备得到;本发明首先通过化学合成和机械剥离合成六方氮化硼纳米片,通过退火作用(即,先在高温水浴锅中加热,然后缓慢冷却至室温)使两组寡核苷酸结合序列分别形成G四连体二级结构,继而搭载酞菁铜分子构建酞菁铜-核苷酸复合物;然后通过π-π堆积作用吸附在六方氮化硼纳米片共同孵育,得到所述基于酞菁铜分子的诊疗一体化探针。
具体包括以下步骤:
(1)六方氮化硼纳米片的制备
在浓硫酸中,六方氮化硼粉末,高锰酸钾(KMnO4)和过氧化氢(H2O2)进行水热反应,然后再通过超声处理,得到所述的六方氮化硼纳米片。
(2)酞菁铜-核苷酸序列复合物的制备
(2-1)将两组寡核苷酸结合序列溶于缓冲液中,然后在水浴锅中加热一定时间,缓慢冷却至室温,形成二级结构(HG1和HG2)。
(2-2)将得到的二级结构(HG1和HG2)与酞菁铜分子震荡孵育,得到酞菁铜-核苷酸序列复合物(CuPc@HG)。
(3)诊疗一体化探针的制备
将上述步骤(2)制备的酞菁铜-核苷酸序列复合物与步骤(1)制备的六方氮化硼纳米片震荡孵育,采用缓冲液洗涤三次,得到所述基于酞菁铜分子的诊疗一体化探针 (CuPc@HG@BN);其中,所述酞菁铜-核苷酸序列的复合物与六方氮化硼纳米片通过物理吸附π-π堆积结合。
步骤(1)中,所述水热反应的温度优选为冰浴,0℃。
步骤(1)中,所述水热反应的时间为10~14h;优选地,为12h。
步骤(1)中,所述超声的条件为85-110kW;优选地,为100kW。
步骤(1)中,所述超声的时间为0.5~2h;优选地,为1h。
步骤(1)中,所述超声的作用是机械剥离。
步骤(1)中,所述六方氮化硼粉末,高锰酸钾和过氧化氢的质量比为(1-2):(0.5-1.5): (8-11);优选地,为2:1:10。
本发明通过采用水热反应和机械剥离(超声处理)的方法相结合,获得了粒径为80~100nm (小于150nm),且形状趋于圆形的六方氮化硼纳米片,相较于现有其他方法,获得的六方氮化硼纳米片粒径更小,形状趋于圆形,因而更适于用于细胞及活体中的分析检测。
在一具体实施方式中,所述六方氮化硼纳米片的制备包括:在磁力搅拌下,在0℃条件下,将六方氮化硼粉末分散在一定量的浓硫酸中。将KMnO4缓慢加入混合体系中,并继续搅拌反应12h。然后向反应体系中加入H2O2反应1h。将所得悬浮液超声处理1小时,然后以10000rpm离心10分钟以除去大的氮化硼粉末。用超纯水洗涤上层液体直至滤液的pH值为中性。最后,将产物置于真空烘箱中,在60℃下干燥24小时,得到六方氮化硼纳米片。
其中,六方氮化硼粉末为1g,高锰酸钾为0.5g,过氧化氢为10ml。
步骤(2-1)中,所述两组寡核苷酸结合序列分别为
5’-TCAGACTGATGTTCGTAGCTTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATTTTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’(SEQ ID NO.1)和
5’-TTCGTAGCTTATCAGACTGATGTTTGATAAGCTACGAACATCAGTTTTTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’(SEQ ID NO.2)。
步骤(2-1)中,所述的缓冲液配方是25~30mM Tris-HCl,175~225mM KCl,2~5mMMgCl2, pH=7.2~7.5。
优选地,所述的缓冲液的配方是28mM Tris-HCl,200mM KCl,4mM MgCl2,pH=7.4。
步骤(2-1)中,溶于缓冲液后,所述两组寡核苷酸结合序列的终浓度分别为5-20μM,其中,所述两组寡核苷酸结合序列的终浓度一样;优选地,为10μM。
步骤(2-1)中,所述加热的温度为90-98℃;优选地,为95℃。
步骤(2-1)中,所述加热的时间为3-10min;优选地,为5min。
步骤(2-1)中,所述室温优选为25℃。
步骤(2-1)中,所述二级结构(HG1和HG2)是指两组寡核苷酸结合序列(如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的)在退火作用后形成的。
其中,所述二级结构(HG1和HG2)指G四连体二级结构。
步骤(2-2)中,所述酞菁铜分子为拉曼信号分子、光敏剂,可用于光动力治疗。
步骤(2-2)中,所述二级结构与酞菁铜分子的摩尔比为(0.5:2)~(2:1);优选地,为1:1。
步骤(2-2)中,所述孵育的时间为1~3h;优选地,为2h。
步骤(2-2)中,所述孵育的温度为35~40℃;优选地,为37℃。
在一具体实施方式中,所述(2)酞菁铜-核苷酸序列复合物的制备过程包括:将所述寡核苷酸结合序列置于95℃水浴锅中加热5分钟,再梯度退火,使其形成特定的二级结构,然后将所述寡核苷酸结合序列与所述酞菁铜分子按一定比例混合,得到酞菁铜-寡核苷酸结合序列复合物。
步骤(3)中,所述酞菁铜-核苷酸序列复合物的终浓度为15~25μM;优选地,为20μM。
步骤(3)中,所述六方氮化硼纳米片的终浓度为90~120μg/ml;优选地,为100μg/ml。
步骤(3)中,所述孵育的温度为35~40℃;优选地,为37℃。
步骤(3)中,所述孵育的时间为10-30min;优选地,为20min。
本发明中,所述纳米探针是一种基于酞菁铜分子的microRNA-21拉曼检测与光动力治疗的诊疗一体化纳米探针。
本发明还提供了如上所述方法制备得到的诊疗一体化探针在表面增强拉曼光谱检测 microRNA-21中的应用。
本发明还提供了如上所述方法制备得到的诊疗一体化探针用于细胞内检测microRNA-21 中的应用;所述细胞包括乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、胰腺癌细胞;优选地,为MCF-7、 MDA-MB-231、SK-BR-3三种乳腺癌细胞。
本发明还提供了如上所述方法制备得到的诊疗一体化探针用于细胞内microRNA-21拉曼成像及生物传感的产品中的应用。
本发明还提供了如上所述方法制备得到的诊疗一体化探针检测microRNA-21的方法,所述方法包括:在缓冲液中,诊疗一体化探针与microRNA-21反应,进行碱基互补配对及循环放大,通过拉曼光谱来测定溶液的拉曼强度。
其中,所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液等;优选地,为磷酸盐缓冲液。
其中,所述激光拉曼光谱的波长为532nm、633nm、780nm;优选地,为780nm。
其中,所述microRNA-21检测反应的最低检测限为0.06fM。
其中,所述microRNA-21检测反应的检测范围为0.1fM~20pM。
其中,所述反应的温度为20~37℃;优选地,为25℃。
其中,所述反应的时间为0.5~2h;优选地,为1h。
本发明还提供了一种利用如上所述方法制备得到的诊疗一体化探针对细胞内microRNA-21拉曼成像的方法,将所述诊疗一体化探针与细胞共孵育,然后用缓冲液清洗,用于细胞的拉曼成像。如,将所述诊疗一体化纳米探针与不同的肿瘤细胞(如乳腺癌细胞)共孵育,通过拉曼仪器观察不同肿瘤细胞中microRNA-21的拉曼成像情况。
其中,所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液;优选地,为磷酸盐缓冲液。
其中,所述诊疗一体化探针与细胞的用量关系为100-250μg/104cells;优选地,为200 μg/104cells。
其中,所述孵育的温度为20~37℃;优选地,为37℃。
其中,所述孵育的时间为6-36h;优选地,为12h。
在本发明一个具体实施方式中,所述诊疗一体化探针检测microRNA-21的方法包括:将诊疗一体化探针与不同浓度的microRNA-21共孵育,然后以激发波长为780nm测量溶液的拉曼强度。随着microRNA-21浓度增大,酞菁铜(1530cm-1)拉曼强度逐渐减弱,而h-BNNS(1367cm-1)的拉曼强度保持不变,因此可以通过比率型I1530/I1367来定量,且microRNA-21浓度和I1530/I1367在0.1fM~20pM范围内呈现良好线性,检测限为0.06fM,可用于microRNA-21 的精确监测。
本发明还提供了如上所述方法制备得到的诊疗一体化探针在制备光动力治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明还提供了如上所述方法制备得到的诊疗一体化探针在体外光动力治疗肿瘤细胞中的应用,在体外,将所述诊疗一体化纳米探针与肿瘤细胞共孵育,通过一定时间和强度的激光照射,由于光敏剂诱发单线态氧产生,发挥诊疗一体化纳米探针对于肿瘤细胞的治疗作用。
其中,光动力治疗中采用的激光的波长为600~700nm;优选地,为655nm。
其中,所述激光的功率为0.1~0.4W/cm2;优选地,为0.2W/cm2。
其中,所述激光的照射时间为3~10min;优选地,为5min。
其中,光动力治疗中采用的光敏剂为酞菁铜分子。
其中,所述肿瘤细胞包括乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、胰腺癌;优选地,为MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3三种乳腺癌细胞。
其中,所述光动力治疗的效果为,能够大大提高肿瘤细胞的致死率,相对于空白对照,采用本发明诊疗一体化纳米探针作用后,肿瘤细胞致死率提高78%。
在一个具体实施方式中,所述诊疗一体化探针治疗肿瘤细胞的方法包括:将所述诊疗一体化探针分别与三种乳腺癌细胞(MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3)共孵育,然后以激发波长为655nm的激光照射细胞5min再孵育。通过细胞毒性实验,细胞流式实验得到78%的肿瘤细胞存活率抑制效果。
本发明的有益效果在于:本发明首先通过化学反应和机械剥离合成六方氮化硼纳米片,通过退火作用使寡核苷酸结合序列形成二级结构,通过π-π堆积作用构建酞菁铜-核苷酸复合物,然后进一步得到诊疗一体化探针。本发明的方法合成简单,方便。所述诊疗一体化纳米探针具备新型多功能集成的特点,使酞菁铜分子在光动力治疗和原位检测与成像中同时发挥着双重关键作用,简化了传统诊疗探针的复杂性,为光敏剂作为检测分子提供了新的可能性。所述诊疗一体化纳米探针结合表面增强拉曼和microRNA循环放大的优势,提高了 microRNA-21检测的灵敏度与选择性。所述诊疗一体化纳米探针具备良好的单线态氧产生能力,使其在拉曼诊断的同时实现对肿瘤细胞有效的光动力治疗。此外,本发明所述诊疗一体化纳米探针不仅能够应用于microRNA-21的检测中,对于细胞内其他的一些生物标识物(如 microRNA、小分子,蛋白)的检测也具有借鉴作用。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的六方氮化硼纳米片(h-BNNS)的透射电镜图(图a)和原子力图(图b)。
图2为本发明实施例1制备的诊疗一体化探针(CuPc@HG@BN)对不同浓度microRNA-21响应的拉曼光谱(图a),以及诊疗一体化探针(CuPc@HG@BN)对对不同种核苷酸序列响应的拉曼光谱及柱状图(图b)。
图3为本发明实施例1制备的诊疗一体化探针(CuPc@HG@BN)对不同浓度抑制剂作用下细胞内microRNA-21响应的拉曼成像。
图4为本发明实施例2中,不同治疗方式下MCF-7肿瘤细胞的细胞存活率,且每一组柱状图从左至右依次为control、HG@BN+Light、CuPc@HG@BN、CuPc@HG@BN+Light。
图5为本发明实施例2中,不同治疗方式下MCF-7肿瘤细胞凋亡情况的流式结果。
图6为本发明实施例2中,不同治疗方式下MCF-7肿瘤裸鼠治疗15天后的裸鼠图和肿瘤图,其中,图6a是i~x组裸鼠体内miR-21浓度随治疗时间变化的图,其中至上而下分别为vii组、viii组、ix组、x组、iv组、v组、vi组、ii组、iii组、i组;图6b是xi~xiv组裸鼠体内miR-21浓度随治疗时间变化的图,其中至上而下分别为xiii组、xiv组、xi组、xii组;图6c和图6d是i,ii,vi,x,xii和xiii组治疗15天后的小鼠与肿瘤图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例,对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1基于酞菁铜分子的诊疗一体化探针的制备
(1)在磁力搅拌下,将1g原始六方氮化硼粉末分散在一定量的浓硫酸中。将0.5g高锰酸钾(KMnO4)缓慢加入混合体系中,并持续搅拌反应12小时。然后向反应体系中加入10mL分析纯过氧化氢(H2O2)。将所得悬浮液超声处理1小时,然后以10000rpm转速离心10分钟以除去大的h-BN粉末。用超纯水洗涤上层液体直至滤液的pH值为中性。最后,将产物置于真空烘箱中,在60℃下干燥24小时,得到六方氮化硼纳米片(h-BNNS)。
所述六方氮化硼纳米片(h-BNNS)的粒径范围为80~100nm,厚度为15nm左右。图1a是实施例1得到的h-BNNS的透射电镜图,从图1a中可看到六方氮化硼纳米片分散较好,形状均一。图1b是实施例1得到的h-BNNS的原子力图,从图1b中可看到纳米片厚度大小较为均一。
(2)配制缓冲液(28mM Tris-HCl,200mM KCl,4mM MgCl2,pH=7.4)备用。将两组寡核苷酸结合序列 5’-TCAGACTGATGTTCGTAGCTTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATTTTTTTTGGTGGTGGT GGTTGTGGTGGTGGTGG-3’(SEQ ID NO.1)和 5’-TTCGTAGCTTATCAGACTGATGTTTGATAAGCTACGAACATCAGTTTTTTTTTGGTGGT GGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’(SEQ ID NO.2)。分别溶于所配缓冲液中,使最终浓度均为10μM,将配好的核苷酸序列在95℃水浴锅中加热5min,然后缓慢降至室温,得到形成二级结构的核苷酸序列(由两组寡核苷酸结合序列分别退火作用后形成的二级结构为HG1和 HG2)。
将酞菁铜分子(CuPc)与核苷酸序列(HG)均按照摩尔比1:1的浓度混合,在室温下震荡2h,在将该复合物与h-BNNS混合,使复合物的最终浓度为20μM,h-BNNS的最终浓度为100μg/ml。在室温下震荡1h,将产物离心洗涤三次,得到诊疗一体化探针 (CuPc@HG@BN)。
实施例2
将实施例1制备的纳米探针用于肿瘤中的诊断与治疗,具体方法如下:
(1)将纳米探针(CuPc@HG@BN)分散于磷酸盐缓冲液中,使探针最终浓度为100μg/ml。再将探针分别与0.1fM~20pM microRNA-21反应1h,然后以激发波长为780nm测定溶液的拉曼强度。图2是纳米探针(CuPc@HG@BN)对不同浓度microRNA-21响应的拉曼光谱及校准曲线,从图2a中可以看出,随着microRNA-21浓度增大,CuPc分子的特征峰1530cm-1处的拉曼强度逐渐降低,h-BNNS的特征峰1367cm-1处的拉曼强度保持不变,通过I1530/I1367与microRNA-21浓度的对数的线性关系,得到检测限为0.06fM,体现了本发明的高灵敏度和高准确性。
(2)将100μg/ml纳米探针(CuPc@HG@BN)分散于磷酸盐缓冲液中,分别与20pM 靶向microRNA-21(T)、1个碱基错配核苷酸序列(1-MT)、3个碱基错配核苷酸序列(3-MT)、非靶向核苷酸序列(NT)反应1h,然后以激发波长为780nm测定溶液的拉曼强度。图2b是纳米探针(CuPc@HG@BN)对不同种核苷酸序列响应的拉曼光谱及柱状图,从图中可看到本发明的探针对靶向microRNA-21(T)有良好的选择性。
(3)将不同浓度(0、12、24、36、48、60μM)的microRNA-21抑制剂与肿瘤细胞(MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3)共同孵育9h,再加入100μg/ml纳米探针(CuPc@HG@BN)孵育 6h,然后以激发波长为780nm对肿瘤细胞进行拉曼成像。图3是抑制剂作用于三种乳腺癌细胞后microRNA-21的拉曼成像,从图3中可看出,随着抑制剂的浓度增大,拉曼强度逐渐增强,说明本发明的探针可以进行良好的细胞内成像。
(4)将不同浓度(0、12、25、50、100、200μg/ml)的control(i)、HG@BN+Light(ii)、CuPc@HG@BN(iii)、CuPc@HG@BN+Light(iv)与MCF-7肿瘤细胞共孵育12h,其中(i) 组加入磷酸盐缓冲液,(ii)和(iv)组用激光照射5min再培养12h。向每个孔中加入20μL MTT 溶液(5mg/mL),然后再孵育4小时,最后加入80μL DMSO混合均匀,采用酶标仪测定。图4是不同治疗方式下MCF-7肿瘤细胞的细胞存活率,从图4中可看出仅当纳米探针 (CuPc@HG@BN)与激光照射共同作用下才能起到良好的治疗效果。
(5)将MCF-7细胞接种到裸鼠中,静脉注射100μL Cy3标记的CuPc@HG@BN (100μg/mL),用512nm波长激发,在不同时间点对裸鼠进行荧光成像。图5是随时间变化药物分布的荧光成像图,从图5中可以看出6h时在肿瘤部位即看到强的荧光,到12h时达到比正常组织强的荧光,并能维持到48h依然能看到高的荧光强度。
(6)将MCF-7细胞接种到裸鼠中,第i组为肿瘤生长2天的裸鼠,第ii、iii组为肿瘤生长4天的裸鼠,第iv、v、vi组为肿瘤生长6天的裸鼠,第vii、viii、ix、x组为肿瘤生长9 天的裸鼠,第xi、xii组为肿瘤生长16天的裸鼠,第xiii、xiv组为肿瘤生长25天的裸鼠。之后,第i、ii、iv、vii组通过尾静脉分别注射100μL CuPc@HG@BN(25μg/mL),第iii、v、 viii组静脉注射100μL CuPc@HG@BN(50μg/mL),第vi、ix组静脉注射100μL CuPc@HG@BN (65μg/mL),第x、xi、xiii组静脉注射100μL CuPc@HG@BN(100μg/mL),第xii、xiv组静脉注射100μLCuPc@HG@BN(200μg/mL)。然后进行NIR照射(0.2W/cm2)5分钟。每隔一天提取一定裸鼠的外周血进行拉曼检测。15天后,对裸鼠进行拍照,用CO2窒息处死裸鼠并解剖,对肿瘤进行拍照。
图6a是i~x组裸鼠体内miR-21浓度随治疗时间变化的图,可以看到只需要25μg/mL剂量的药就能使第i组裸鼠体内miR-21量恢复到正常水平。随着肿瘤生长天数增大所需药物的剂量和治疗天数也随之增加。图6b是xi~xiv组裸鼠体内miR-21浓度随治疗时间变化的图,可以看到当肿瘤生长到晚期再给予治疗,虽然能一定程度上抑制miR-21的快速增加,但无法使其恢复到正常水平。图6c和图6d是i,ii,vi,x,xii和xiii组治疗15天后的小鼠与肿瘤图,可以看到在早期时少量的药物,较短的治疗天数就可以达到彻底清除肿瘤,而晚期时大剂量的药物治疗较长时间仍旧不能根除肿瘤。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中,并且以所附的权利要求书为保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东师范大学
<120> 基于酞菁铜分子的诊疗一体化纳米探针及其制备和应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcagactgat gttcgtagct tatcaacatc agtctgataa gctatttttt ttggtggtgg 60
tggttgtggt ggtggtgg 78
<210> 2
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttcgtagctt atcagactga tgtttgataa gctacgaaca tcagtttttt tttggtggtg 60
gtggttgtgg tggtggtgg 79
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtgg 26
Claims (12)
1.一种基于酞菁铜分子的诊疗一体化纳米探针,其特征在于,所述诊疗一体化纳米探针包括六方氮化硼纳米片,酞菁铜分子以及两组寡核苷酸结合序列,所述六方氮化硼纳米片与装载酞菁铜分子的寡核苷酸结合序列通过π-π堆积作用结合;其中,所述两组寡核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1~2所示。
2.根据权利要求1所述的基于酞菁铜分子的诊疗一体化纳米探针,其特征在于,所述寡核苷酸序列为AS1411修饰。
3.根据权利要求1所述的基于酞菁铜分子的诊疗一体化纳米探针,其特征在于,所述六方氮化硼纳米片的粒径为80~100nm,厚度为14-16nm。
4.一种基于酞菁铜分子的诊疗一体化纳米探针的制备方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)六方氮化硼纳米片的制备
在浓硫酸中,六方氮化硼粉末,高锰酸钾和过氧化氢进行水热反应,然后再通过超声处理,得到所述的六方氮化硼纳米片;
(2)酞菁铜-核苷酸序列复合物的制备
(2-1)将两组寡核苷酸结合序列溶于缓冲液中,分别在水浴锅中加热,然后缓慢冷却至室温,形成二级结构HG1和HG2;所述两组寡核苷酸结合序列分别为如SEQ ID NO.1~2所示;
(2-2)将得到的二级结构HG1和HG2与酞菁铜分子孵育,得到酞菁铜-核苷酸序列复合物CuPc@HG;
(3)诊疗一体化探针的制备
将步骤(2)制备的酞菁铜-核苷酸序列复合物与步骤(1)制备的六方氮化硼纳米片混合孵育,得到所述基于酞菁铜分子的诊疗一体化探针CuPc@HG@BN。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述水热反应的温度为0℃;和/或,所述水热反应的时间为10~14h;和/或,所述六方氮化硼粉末,高锰酸钾和过氧化氢的质量比为(1-2):(0.5-1.5):(8-11);和/或,所述超声的条件为85-110kW;和/或,所述超声的时间为0.5~2h。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤(2-1)中,所述缓冲液的配方是25~30mM Tris-HCl,175~225mM KCl,2~5mM MgCl2,pH=7.2~7.5;和/或,溶于缓冲液中后,所述两组寡核苷酸结合序列的终浓度分别为5-20µM;和/或,所述加热的温度为90-98℃;和/或,所述加热的时间为3-10min。
7.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤(2-2)中,所述二级结构与酞菁铜分子的摩尔比为(0.5:2)~(2:1);和/或,所述孵育的温度为35~40℃;和/或,所述孵育的时间为1~3h。
8.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤(3)中,混合后,所述酞菁铜-核苷酸序列复合物的终浓度为15~25µM;和/或,混合后,所述六方氮化硼纳米片的终浓度为90~120µg/ml;和/或,所述孵育的温度为35~40℃;和/或,所述孵育的时间为10-30min。
9.一种根据权利要求4所述方法制备得到的基于酞菁铜分子的诊疗一体化纳米探针。
10.根据权利要求1或9所述的诊疗一体化探针在制备体内检测microRNA-21的试剂中的应用。
11.根据权利要求1或9所述的诊疗一体化探针在制备用于细胞内microRNA-21成像及生物传感的产品中的应用。
12.根据权利要求1或9所述的诊疗一体化探针在制备光动力治疗肿瘤的药物中的应用。
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