CN113105459A - 一种三唑并嘧啶衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种三唑并嘧啶衍生物及其制备方法和应用。本发明的5‑(3,4,5‑三甲氧基苯基)‑[1,2,4]三唑并[1,5‑c]嘧啶衍生物，具有较好的抗肿瘤活性，对多种肿瘤细胞株有显著的抑制水平，且毒性较小，具有开发前景。本发明的5‑(3,4,5‑三甲氧基苯基)‑[1,2,4]三唑并[1,5‑c]嘧啶衍生物，可以通过电化学方法制备，为氧化还原转化的常规化学方法提供了有效的替代方案，通过阳极氧化和阴极还原，电化学合成避免了在构造复杂分子中大量使用化学氧化剂和还原剂，简化了操作步骤，同时，避免了昂贵的催化剂的使用，节约了生产制造成本。
Description
技术领域
本发明属于制药技术领域，具体涉及一种三唑并嘧啶衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤是危害人类健康的第二大“杀手”，其死亡率高，发病率仅次于心脑血管疾病。因此，开发有效治疗肿瘤的新药是当前面临的重大课题。微管是主要由α、β两种微管蛋白亚基形成的蛋白二聚体，是细胞骨架主要组成部分，在维持肿瘤细胞的形态、增殖和转移及信号转导过程中起着非常关键的作用，是有效的抗肿瘤药物靶点之一。
微管蛋白抑制剂(TPIs)可通过干扰微管的解聚-聚集的动态平衡过程，使细胞分裂停滞于G2/M期，诱导细胞凋亡，从而抑制肿瘤生长。目前临床上使用的微管蛋白抑制剂主要有紫杉烷类、爱博霉素类、喜树碱、长春碱类，以及近期获批上市的艾日布林(Eribulin)。但这些抑制剂存在如下问题：水溶性较差，有严重毒副作用以及获得性耐药，来源珍贵、分子结构复杂且难以大规模合成等缺点，限制了其进一步使用。因而，亟需发现新型、高效、低毒性的微管蛋白抑制剂，尤其是结构简单的小分子抑制剂。根据结合位置的不同，可将微管蛋白抑制剂分为三类：作用于秋水仙碱结合位点的微管蛋白抑制剂、作用于长春碱位点的微管蛋白抑制剂以及作用于紫杉醇位点的微管蛋白抑制剂。
秋水仙碱结合位点的自身结合腔体积较小，适合小分子抗肿瘤药物开发，目前尚未有秋水仙碱结合位点的微管蛋白抑制剂上市。南非矮生柳树中发现的顺式二苯乙烯CA-4是一类作用于秋水仙碱结合位点的强效微管蛋白抑制剂，然而CA-4存在水溶性差、稳定性差以及生物利用度不高，且容易转化为结构稳定但无抗肿瘤活性的反式CA-4。基于此，仍需开发一种可以作用于秋水仙碱结合位点的微管蛋白抑制剂。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明提供了一种5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物，该衍生物可以用作微管蛋白抑制剂，作用于秋水仙碱结合位点。
本发明还提供了上述衍生物的制备方法。
本发明还提供了上述衍生物的应用。
本发明的第一方面提供了一种5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物，包括式A所示结构的化合物及其药学上可接受的盐，所述式A为：
根据本发明的一些实施方式，所述Ar选自如式B或C所示的取代基，
所述式B为：
所述式C为：
其中，n为1～5的整数，R1，R2及R3分别独立地选自H、C1-C3烷基、卤素取代的C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、卤素取代的C1-C3烷氧基、3，4-亚甲二氧基、苯基、-NR4R5；
R4、R5分别独立地选自H、C1-C3烷基；
X选自C或N。
根据本发明的一些实施方式，X为C时，R2选自C1-C3烷基；X为N时，R2选自H或C1-C3烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述Ar为3-吲哚基、4-吲哚基、5-吲哚基、6-吲哚基、7-吲哚基、4-甲基苯基、4-甲氧基苯基、4-异丙基苯基、4-甲氧基苯乙烯基、3,4-二甲氧基苯基、3-(1-Boc吲哚基)、3-(5-甲氧基吲哚基)、4-(1-甲基吲哚基)、5-(1-甲基吲哚基)、6-(1-甲基吲哚基)、3-(1-Boc-5-甲氧基吲哚基)、3-(5-乙氧基吲哚基)、3-(1-Boc-5-乙氧基吲哚基)、3-(6-甲氧基吲哚基)、3-(1-Boc-6-甲氧基吲哚基)、3-羟基-4-甲氧基苯基、3,4-二甲基苯基、3-氟-4-甲氧基苯基、3-氯-4-甲氧基苯基、3-溴-4-甲氧基苯基和3-氨基-4-甲氧基苯基中的一种。
根据本发明的一些实施方式，Ar为4-甲氧基苯基时，5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的化学结构为：
根据本发明的一些实施方式，Ar为4-甲基苯基时，所述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的化学结构为：
根据本发明的一些实施方式，Ar为4-吲哚基时，所述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的化学结构为：
根据本发明的一些实施方式，Ar为3-(N-Boc吲哚基)时，所述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的化学结构为：
根据本发明的一些实施方式，Ar为3-吲哚基时，所述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的化学结构为：
根据本发明的一些实施方式，Ar为5-吲哚基时，所述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的化学结构为：
根据本发明的一些实施方式，Ar为6-吲哚基时，所述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的化学结构为：
根据本发明的一些实施方式，Ar为7-吲哚基时，所述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的化学结构为：
根据本发明的一些实施方式，Ar为3-(5-甲氧基吲哚基)时，所述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的化学结构为：
根据本发明的一些实施方式，Ar为3-(1-Boc-5-甲氧基吲哚基)时，所述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的化学结构为：
根据本发明的一些实施方式，Ar为3-(6-甲氧基吲哚基)时，所述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的化学结构为：
根据本发明的一些实施方式，Ar为3-(1-Boc-6-甲氧基吲哚基)时，所述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的化学结构为：
根据本发明的一些实施方式，Ar为3-羟基-4-甲氧基苯基时，所述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的化学结构为：
根据本发明的一些实施方式，Ar为3,4-二甲基苯基时，所述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的化学结构为：
根据本发明的一些实施方式，Ar为异丙基苯基时，所述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的化学结构为：
根据本发明的一些实施方式，Ar为3,4-二甲氧基苯基时，所述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的化学结构为：
根据本发明的一些实施方式，Ar为4-甲氧基苯乙烯基时，所述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的化学结构为：
根据本发明的一些实施方式，Ar为3-氟-4-甲氧基苯基时，所述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的化学结构为：
根据本发明的一些实施方式，Ar为3-氯-4-甲氧基苯基时，所述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的化学结构为：
根据本发明的一些实施方式，Ar为3-溴-4-甲氧基苯基时，所述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的化学结构为：
本发明的第二方面提供了制备上述5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的方法，包括以下步骤：
S1：以2-氯-4-肼基嘧啶和芳基甲醛ArCHO为原料，通过电化学阳极氧化反应得到式II所示化合物；
S2：式II所示化合物与3,4,5-三甲氧基苯硼酸发生Suzuki反应并同时发生Dimroth重排反应，即得；
式II所示化合物为：
根据本发明的一些实施方式，5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的制备方法为：
根据本发明的一些实施方式，步骤S1中，以2-氯-4-肼基嘧啶和ArCHO芳基甲醛为原料，原位生成苯腙中间体，同时通过电化学阳极氧化反应，以四正丁基氟硼酸铵为电解质，在恒压条件下(V可以为10V)，在装有石墨棒(阳极)以及铂片(阴极)的电解池中进行环化反应，反应结束后用乙酸乙酯萃取，干燥，浓缩，通过柱层析纯化得到式II所示中间体。
根据本发明的一些实施方式，步骤S1中，电化学阳极氧化反应，以铂片为阴极，碳棒为阳极，电化学阳极氧化反应过程中，反应体系使用的直流电压为5～20V。
根据本发明的一些实施方式，所述直流电压为10～15V。
根据本发明的一些实施方式，电化学阳极氧化反应过程中，反应体系的温度为25～40℃。
根据本发明的一些实施方式，电化学阳极氧化反应过程中，反应的时间为5～24小时。
根据本发明的一些实施方式，电化学阳极氧化反应过程中，反应的时间为5～12小时。
根据本发明的一些实施方式，步骤S1中，2-氯-4-肼基嘧啶的结构为：
根据本发明的一些实施方式，步骤S1中，2-氯-4-肼基嘧啶和芳基甲醛ArCHO的摩尔比为1：(0.2～1.2)。
根据本发明的一些实施方式，步骤S1中，2-氯-4-肼基嘧啶和芳基甲醛ArCHO的摩尔比为1：(0.4～1.0)。
根据本发明的一些实施方式，步骤S1中，2-氯-4-肼基嘧啶和芳基甲醛ArCHO的摩尔比为1：(0.4～0.6)。
根据本发明的一些实施方式，步骤S1中，电化学阳极氧化反应的电解质为四正丁基四氟硼酸铵、四正丁基醋酸铵、四正丁基硫酸氢铵和四正丁基六氟磷酸铵中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，步骤S1中，电化学阳极氧化反应的电解质为四正丁基四氟硼酸铵、四正丁基醋酸铵、四正丁基硫酸氢铵和四正丁基六氟磷酸铵中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，步骤S1中，反应溶剂为四氢呋喃、1,4-二氧六环、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜或甲醇四氢呋喃。
根据本发明的一些实施方式，步骤S1中，反应溶剂为四氢呋喃。
根据本发明的一些实施方式，步骤S2中，Suzuki反应及Dimroth重排反应：以式II所示的中间体和3，4，5-三甲氧基苯硼酸为原料，以四三苯基膦为催化剂，碳酸钾作为碱，1，4-二氧六环为反应溶剂，氮气保护下100℃加入反应10h，反应结束后用乙酸乙酯萃取，干燥，浓缩，通过柱层析纯化得到式A所示5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物。
根据本发明的一些实施方式，步骤S2中，式II所示的中间体、3,4,5-三甲氧基苯硼酸、钯催化剂、碱的摩尔比为1:(1～1.5):(0.01～0.1):(1.5～3)。
根据本发明的一些实施方式，步骤S2中，式II所示的中间体、3,4,5-三甲氧基苯硼酸、钯催化剂、碱的摩尔比为1:1.2:0.1:2。
根据本发明的一些实施方式，还包括在步骤S2之后，对产物进行提纯处理。
根据本发明的一些实施方式，所述提纯处理的方法为：向产物中加入乙酸乙酯淬灭反应，再加入饱和氯化钠溶液洗涤，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取3～5次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂，经柱层析即得。
根据本发明的一些实施方式，淬灭反应过程中，乙酸乙酯的体积用量以[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶类衍生物的物质的量计为5～55mL/mmol，饱和氯化钠溶液的体积用量以[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶类衍生物的物质的量计为4～30mL/mmol，每次萃取过程中，乙酸乙酯的体积用量以[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶类衍生物的物质的量计为4～30mL/mmol。
本发明的第三方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有上述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物。
根据本发明的一些实施方式，药物组合物中，还包括活性成分或辅助治疗成分。
根据本发明的一些实施方式，活性成分包括烷化剂、氮芥类、塞替派类、亚硝尿类和甲基磺酸酯类活性成分，铂类化合物及丝裂霉素，二氢叶酸还原酶抑制剂、胸腺核苷合成酶抑制剂、嘌呤核苷酸合成酶抑制剂、核苷酸还原酶抑制剂及DNA多聚酶抑制剂，核酸转录抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白抑制剂，其他细胞毒药；激素类药物、生物反应调节剂、单克隆抗体，以及其他被证明对肿瘤具有抑制作用的药物。
根据本发明的一些实施方式，辅助治疗成分包括升血药、止呕药、肺动脉高压、镇痛药、抑制破骨细胞药。
本发明的第四方面提供了一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物含有上述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物或药物组合物。
根据本发明的一些实施方式，所述抗肿瘤药物的剂型包括口服制剂、注射剂、气雾剂及外用制剂。
根据本发明的一些实施方式，所述注射剂包括冻干粉针剂、乳剂、乳浊液及混悬液。
根据本发明的一些实施方式，所述抗肿瘤药物的剂型包括片剂、胶囊剂、口服液体剂型、口服丸剂、口服颗粒剂、口服散剂中的一种。
本发明的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物，至少具有以下有益效果：
本发明的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物，具有较好的抗肿瘤活性，对人正常细胞水平均弱于对癌细胞的毒性，其中化合物A-2、A-3、A-5、A-6以及A-7等对多种肿瘤细胞株有显著的抑制水平，且毒性较小，具有开发前景。
本发明的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物，原料便宜易得，所用试剂低毒，制备方法反应条件温和，后处理方便，绿色环境友好。
本发明的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物，可以通过电化学方法制备，为氧化还原转化的常规化学方法提供了有效的替代方案，通过阳极氧化和阴极还原，电化学合成避免了在构造复杂分子中大量使用化学氧化剂和还原剂，简化了操作步骤，同时，避免了昂贵的催化剂的使用，节约了生产制造成本。
附图说明
图1是化合物A-1的分子结构图。
图2是流式细胞仪检测A-5对HeLa细胞凋亡的影响，其中A为空白对照；B为5nM；C为10nM；D为25nM。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，并结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
本领域技术人员可以理解，根据本领域中使用的惯例，本申请描述基团的结构式中所使用的
指相应的基团通过该位点与化合物中的其它片段、基团进行连接。
实施例1
本实施例制备了2-(4-甲氧基苯基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶，编号为A-1，结构式为：
步骤S1：5-氯-3-(4-甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[4,3-c]嘧啶的制备：
取三口圆底烧瓶，以碳棒(φ6mm)作为阳极，铂片(10mm×10mm×0.1mm)作为阴极，分别加入2-氯-4-肼基嘧啶I(0.5mmol),4-甲氧基苯甲醛(0.55mmol)，四正丁基氟硼酸铵(0.5mmol)，四氢呋喃(8mL)。室温条件下在恒定电压(10V)下电解5-6h。反应结束后加入乙酸乙酯10mL淬灭反应，加入5mL饱和食盐水洗涤，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为5mL，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)，得到中间体II-1。白色固体，产率81％。
取上述中间体进行NMR和MS表征，表征数据如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.84(d,J＝6.5Hz,1H),7.71(d,J＝6.5Hz,1H),7.52(d,J＝7.9Hz,2H),7.35(d,J＝7.9Hz,2H),3.50(s,3H)以及ESI-MS m/z:260.7([M+H]+)。
步骤S2：化合物2-(4-甲氧基苯基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶的制备。
取三口圆底烧瓶，分别加入中间体II-1(0.4mmol),3,4,5-三甲氧基苯硼酸(0.48mmol)，四三苯基膦钯(0.04mmol)，碳酸钾(0.6mmol)以及1,4-二氧六环(4mL)，氮气保护下100℃反应12h。反应结束后加入乙酸乙酯10mL淬灭反应，加入5mL饱和食盐水洗涤，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为5mL，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝4:1)，得到产物A-1，产率66％。白色固体，熔点：184.2-184.7℃。
取上述产物进行NMR和MS表征，表征数据如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.34(d,J＝6.0Hz,1H),8.32-8.27(d,J＝8.7Hz,2H),8.19(s,2H),7.61(d,J＝6.1Hz,1H),7.06(d,J＝8.7Hz,2H),4.06(s,6H),4.01(s,3H),3.91(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ164.8,161.8,154.6,152.9,148.8,144.0,141.3,129.2,126.4,122.6,114.3,109.1,108.0,61.1,56.3,55.4.HRMS(ESI)(m/z):calcd forC21H20N4O4[M+H]+:393.1557,found:393.1552。
图1为化合物A-1的分子结构图，可确证其核心结构为[1,2,4]三唑[1,5-c]，该杂环是由Suzuki反应以及Dimroth重排反应生成得到的。
实施例2
本实施例制备了2-(4-甲基苯基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶，编号为A-2，结构为：
步骤S1：5-氯-3-(4-甲基苯基)-[1,2,4]三唑并[4,3-c]嘧啶的制备：
取三口圆底烧瓶，以碳棒(φ6mm)作为阳极，铂片(10mm×10mm×0.1mm)作为阴极，分别加入2-氯-4-肼基嘧啶I(0.5mmol),4-甲基苯甲醛(0.55mmol)，四正丁基氟硼酸铵(0.5mmol)，四氢呋喃(8mL)。室温条件下在恒定电压(10V)下电解5-6h。反应结束后加入乙酸乙酯10mL淬灭反应，加入5mL饱和食盐水洗涤，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为5mL，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)，得到中间体II-2。浅黄色固体，产率85％。
取上述中间体进行NMR和MS表征，表征数据如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.74(d,J＝6.5Hz,1H),7.88(d,J＝6.5Hz,2H),7.30(d,J＝7.5Hz,2H),7.28(d,J＝7.5Hz,1H),.2.48(s,3H)以及ESI-MS m/z:244.1([M+H]+)。
步骤S2：2-(4-甲基苯基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶的制备。
取三口圆底烧瓶，分别加入中间体II-2(0.4mmol),3,4,5-三甲氧基苯硼酸(0.48mmol)，四三苯基膦钯(0.04mmol)，碳酸钾(0.6mmol)以及1,4-二氧六环(4mL)，氮气保护下100℃反应12h。反应结束后加入乙酸乙酯10mL淬灭反应，加入5mL饱和食盐水洗涤，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为5mL，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)，得到产物A-2，产率72％。白色固体，熔点：172.1-172.7℃。
取上述产物进行NMR和MS表征，表征数据如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.35(d,J＝6.1Hz,1H),8.25(d,J＝7.9Hz,2H),8.20(s,2H),7.64-7.63(m,1H),7.41-7.37(m,2H),4.06(s,6H),4.02(s,3H),2.46(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ165.0,154.6,153.0,148.9,144.0,141.3,141.2,129.6,127.6,127.3,126.4,109.3,108.0,61.1,56.3,21.6以及HRMS(ESI)(m/z):calcd for C21H20N4O3([M+H]+):377.1608,found:377.1602。
实施例3
本实施例制备了2-(1H-4-吲哚基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶，编号为A-3，结构为：
步骤S1：5-氯-3-(1H-4-吲哚基)-[1,2,4]三唑并[4,3-c]嘧啶的制备：
取三口圆底烧瓶，以碳棒(φ6mm)作为阳极，铂片(10mm×10mm×0.1mm)作为阴极，分别加入2-氯-4-肼基嘧啶I(0.5mmol),4-吲哚甲醛(0.55mmol)，四正丁基氟硼酸铵(0.5mmol)，四氢呋喃(8mL)。室温条件下在恒定电压(10V)下电解5-6h。反应结束后加入乙酸乙酯10mL淬灭反应，加入5mL饱和食盐水洗涤，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为5mL，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)，得到中间体II-3。浅黄色固体，产率74％。
取上述中间体进行NMR和MS表征，表征数据如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.55(brs,1H),7.86(d,J＝6.5Hz,1H),7.74(d,J＝6.5Hz,1H),7.65-7.63(m,1H),7.36(s,1H),7.35(d,J＝2.4Hz,1H),7.33-7.32(m,1H),6.30-6.29(m,1H)以及ESI-MS m/z:269.1([M+H]+)。
步骤S2：2-(1H-4-吲哚基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶的制备。
取三口圆底烧瓶，分别加入中间体II-3(0.4mmol),3,4,5-三甲氧基苯硼酸(0.48mmol)，四三苯基膦钯(0.04mmol)，碳酸钾(0.6mmol)以及1,4-二氧六环(4mL)，氮气保护下100℃反应12h。反应结束后加入乙酸乙酯10mL淬灭反应，加入5mL饱和食盐水洗涤，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为5mL，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)，得到产物A-3，产率62％。白色固体，熔点：214.6-215.5℃。
取上述产物进行NMR和MS表征，表征数据如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.54(brs,1H),8.37(d,J＝6.1Hz,1H),8.27(d,J＝7.4Hz,1H),8.21(s,2H),7.68(d,J＝6.1Hz,1H),7.67-7.62(m,1H),7.61(d,J＝8.1Hz,1H),7.45-7.35(m,2H),4.06(s,6H),4.04(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ165.6,154.0,152.9,149.0,143.9,141.2,136.6,126.8,126.1,125.5,122.0,121.7,121.3,113.9,109.3,108.0,104.2,61.1,56.4以及HRMS(ESI)(m/z):calcd for C22H19N5O3([M+H]+):402.1561,found:402.1560。
实施例4
本实施例制备了3-(5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]-2-嘧啶基)-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯，编号A-4以及2-(1H-3-吲哚基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶，编号为A-5，结构如下：
S1：3-(5-氯-3-[1,2,4]三唑并[4,3-c]嘧啶基)-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯的制备：
取三口圆底烧瓶，以碳棒(φ6mm)作为阳极，铂片(10mm×10mm×0.1mm)作为阴极，分别加入2-氯-4-肼基嘧啶I(0.5mmol),N-Boc-3-吲哚甲醛(0.55mmol)，四正丁基氟硼酸铵(0.5mmol)，四氢呋喃(8mL)。室温条件下在恒定电压(10V)下电解5-6h。反应结束后加入乙酸乙酯10mL淬灭反应，加入5mL饱和食盐水洗涤，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为5mL，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)，得到中间体II-4。白色固体，产率75％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.56(d,J＝7.0Hz,1H),8.49(s,1H),8.28(d,J＝8.4Hz,2H),8.05(s,1H),7.89(d,J＝6.5Hz,1H),7.76(d,J＝6.5Hz,1H)1.71(s,9H)以及ESI-MS m/z:369.1([M+H]+)。
步骤S2：3-(5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑[1,5-c]-2-嘧啶基)-1H-吲哚-1-甲酸叔丁基酯的制备。
取三口圆底烧瓶，分别加入中间体II-4(0.4mmol),3,4,5-三甲氧基苯硼酸(0.48mmol)，四三苯基膦钯(0.04mmol)，碳酸钾(0.6mmol)以及1,4-二氧六环(4mL)，氮气保护下100℃反应12h。反应结束后加入乙酸乙酯10mL淬灭反应，加入5mL饱和食盐水洗涤，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为5mL，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)，得到产物A-4，产率63％。白色固体。
取上述产物进行NMR和MS表征，表征数据如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.59(d,J＝7.8Hz,1H),8.53(s,1H),8.36(d,J＝6.1Hz,1H),8.30(d,J＝8.2Hz,1H),8.20(s,2H),7.62(d,J＝6.1Hz,1H),7.44(t,J＝7.8Hz,1H),7.36(t,J＝7.8Hz,1H),4.07(s,6H),4.02(s,3H),1.71(s,9H)13C NMR(125MHz,CDCl3)δ162.2,160.8,152.9,149.8,147.2,147.1,138.7,134.8,129.5,129.5,125.5,124.7,121.8,119.9,115.0,111.4,110.3,98.2,83.6,60.7,56.3,27.9.HRMS(ESI)(m/z):calcdfor C27H27N5O5([M+H]+):501.2012,found:501.2008.
步骤S3：2-(1H-3-吲哚基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶的制备。
取单口圆底烧瓶，分别加入化合物A-4(0.3mmol)以及二氯甲烷(3mL),0℃下滴加三氟乙酸(1mL)，室温搅拌1小时。反应结束后，经减压蒸馏得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)，得到产物A-5，产率68％。白色固体，熔点：194.4-195.3℃。
取上述产物进行NMR和MS表征，表征数据如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.74(brs,1H),8.62(d,J＝7.6Hz,1H),8.35(d,J＝6.0Hz,1H),8.26(s,2H),8.21(d,J＝2.6Hz,1H),7.60(d,J＝6.0Hz,1H),7.52(d,J＝8.0Hz,1H),7.35(t,J＝7.5Hz,1H),7.31(t,J＝7.5Hz,1H),4.10(s,6H),4.04(s,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ162.4,153.9,152.9,148.7,144.1,141.2,136.5,127.3,126.8,125.4,123.2,121.7,121.2,111.7,108.5,108.1,108.0,61.1,56.4.HRMS(ESI)(m/z):calcd forC22H19N5O3([M+H]+):402.1560,found:402.1555。
实施例5
本实施例制备了2-(1H-5-吲哚基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶，编号为A-6，结构为：
步骤S1：5-氯-3-(1H-5-吲哚基)-[1,2,4]三唑并[4,3-c]嘧啶的制备：
取三口圆底烧瓶，以碳棒(6mm)作为阳极，铂片(10mm×10mm×0.1mm)作为阴极，分别加入2-氯-4-肼基嘧啶I(0.5mmol),5-吲哚甲醛(0.55mmol)，四正丁基氟硼酸铵(0.5mmol)，四氢呋喃(8mL)。室温条件下在恒定电压(10V)下电解5-6h。反应结束后加入乙酸乙酯10mL淬灭反应，加入5mL饱和食盐水洗涤，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为5mL，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)，得到中间体II-5。浅黄色固体，产率74％。
取上述中间体进行NMR和MS表征，表征数据如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.48(brs,1H),7.93(d,J＝8.8Hz,1H),7.84(dd,J＝8.8,6.5Hz,1H),7.73-7.70(m,1H),7.55-7.51(m,1H),7.49-7.45(m,1H),7.36-7.34(m,1H),6.69(d,J＝2.9Hz,1H)以及ESI-MS m/z:269.1([M+H]+)。
以及ESI-MS m/z:269.1([M+H]+)。
步骤S2：2-(1H-5-吲哚基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶的制备。
取三口圆底烧瓶，分别加入中间体II-5(0.4mmol),3,4,5-三甲氧基苯硼酸(0.48mmol)，四三苯基膦钯(0.04mmol)，碳酸钾(0.6mmol)以及1,4-二氧六环(4mL)，氮气保护下100℃反应12h。反应结束后加入乙酸乙酯10mL淬灭反应，加入5mL饱和食盐水洗涤，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为5mL，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)，得到产物A-6，产率51％。白色固体，熔点：207.5-208.4℃。
取上述产物进行NMR和MS表征，表征数据如下：
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.44(brs,1H),8.54(s,1H),8.44(d,J＝6.1Hz,1H),8.18(s,2H),8.12–8.02(m,1H),7.86(d,J＝6.1Hz,1H),7.58(d,J＝8.5Hz,1H),7.50–7.40(m,1H),6.61(s,1H),3.97(s,6H),3.84(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ165.9,154.6,152.9,148.2,144.7,141.0,137.9,128.3,127.2,126.8,121.0,120.8,120.4,112.5,109.8,108.3,102.7,60.8,56.5以及HRMS(ESI)(m/z):calcd for C22H19N5O3([M+H]+):402.1560,found:402.1554。
实施例6
本实施例制备了2-(1H-6-吲哚基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶，编号为A-7，结构为：
步骤S1：5-氯-3-(1H-6-吲哚基)-[1,2,4]三唑并[4,3-c]嘧啶的制备：
取三口圆底烧瓶，以碳棒(φ6mm)作为阳极，铂片(10mm×10mm×0.1mm)作为阴极，分别加入2-氯-4-肼基嘧啶I(0.5mmol),5-吲哚甲醛(0.55mmol)，四正丁基氟硼酸铵(0.5mmol)，四氢呋喃(8mL)。室温条件下在恒定电压(10V)下电解5-6h。反应结束后加入乙酸乙酯10mL淬灭反应，加入5mL饱和食盐水洗涤，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为5mL，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)，得到中间体II-6。浅黄色固体，产率74％。
取上述中间体进行NMR和MS表征，表征数据如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.48(brs,1H),7.95(d,J＝8.2Hz,1H),7.87(d,J＝8.8,6.5Hz,1H),7.70–7.68(m,1H),7.50-7.49(m,1H),7.42-7.40(m,1H),7.32-7.30(m,1H),6.70(d,J＝3.0Hz,1H)以及ESI-MS m/z:269.1([M+H]+)。
步骤S2：2-(1H-6-吲哚基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶的制备。
取三口圆底烧瓶，分别加入中间体II-6(0.4mmol),3,4,5-三甲氧基苯硼酸(0.48mmol)，四三苯基膦钯(0.04mmol)，碳酸钾(0.6mmol)以及1,4-二氧六环(4mL)，氮气保护下100℃反应12h。反应结束后加入乙酸乙酯10mL淬灭反应，加入5mL饱和食盐水洗涤，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为5mL，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)，得到产物A-7，产率61％。白色固体，熔点：197.4-198.2℃。
取上述产物进行NMR和MS表征，表征数据如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.52(brs,1H),8.47(s,1H),8.35(d,J＝6.1Hz,1H),8.21(s,2H),8.15(d,J＝8.3Hz,1H),7.79(d,J＝8.3Hz,1H),7.63(d,J＝6.1Hz,1H),7.39-7.34(m,1H),6.66(s,1H),4.08(s,6H),4.03(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ166.0,154.6,152.9,148.8,144.0,141.2,135.8,130.1,126.5,126.5,123.7,121.1,119.3,111.1,109.0,108.1,103.1,61.1,56.4以及HRMS(ESI)(m/z):calcd for C22H19N5O3[M+H]+:402.1560,found:402.1559。
实施例7
本实施例制备了2-(1H-7-吲哚基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶，编号为A-8，结构为：
步骤S1：5-氯-3-(1H-7-吲哚基)-[1,2,4]三唑并[4,3-c]嘧啶的制备：
取三口圆底烧瓶，以碳棒(φ6mm)作为阳极，铂片(10mm×10mm×0.1mm)作为阴极，分别加入2-氯-4-肼基嘧啶I(0.5mmol),5-吲哚甲醛(0.55mmol)，四正丁基氟硼酸铵(0.5mmol)，四氢呋喃(8mL)。室温条件下在恒定电压(10V)下电解5-6h。反应结束后加入乙酸乙酯10mL淬灭反应，加入5mL饱和食盐水洗涤，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为5mL，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)，得到中间体II-7。浅黄色固体，产率78％。
取上述中间体进行NMR和MS表征，表征数据如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.39(brs,1H),7.88-7.81(m,3H),7.63(d,J＝6.5Hz,1H),7.38(d,J＝6.5Hz,1H),7.33-7.31(m,1H),6.69-6.68(m,1H)以及ESI-MS m/z:269.1([M+H]+)。
步骤S2：2-(1H-7-吲哚基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶的制备。
取三口圆底烧瓶，分别加入中间体II-7(0.4mmol),3,4,5-三甲氧基苯硼酸(0.48mmol)，四三苯基膦钯(0.04mmol)，碳酸钾(0.6mmol)以及1,4-二氧六环(4mL)，氮气保护下100℃反应12h。反应结束后加入乙酸乙酯10mL淬灭反应，加入5mL饱和食盐水洗涤，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为5mL，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)，得到产物A-8，产率68％。白色固体，熔点：194.3-195.1℃。
取上述产物进行NMR和MS表征，表征数据如下：
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.05(s,1H),8.52(d,J＝6.1Hz,1H),8.16(s,2H),8.12(d,J＝7.6Hz,1H),7.93(d,J＝6.1Hz,1H),7.81(d,J＝7.8Hz,1H),7.54(t,J＝2.5Hz,1H),7.25(t,J＝7.6Hz,1H),6.62(t,J＝2.5Hz,1H),3.96(s,6H),3.84(s,3H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ164.0,154.3,153.0,148.5,145.1,141.1,133.9,129.6,127.3,126.7,123.9,121.3,119.8,113.2,109.9,108.3,102.3,60.7,56.5以及HRMS(ESI)(m/z):calcd forC22H19N5O3([M+H]+):402.1560,found:402.1553。
实施例8
本实施例制备了3-(5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]-2-嘧啶基)-5-甲氧基-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯(编号为A-9)以及2-(1H-5-甲氧基-3-吲哚基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶(编号为A-10)，结构如下：
S1：3-(5-氯-3-[1,2,4]三唑并[4,3-c]嘧啶基)-5-甲氧基-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯的制备：
取三口圆底烧瓶，以碳棒(φ6mm)作为阳极，铂片(10mm×10mm×0.1mm)作为阴极，分别加入2-氯-4-肼基嘧啶I(0.5mmol),N-Boc-6-甲氧基-3-吲哚甲醛(0.55mmol)，四正丁基氟硼酸铵(0.5mmol)，四氢呋喃(8mL)。室温条件下在恒定电压(10V)下电解5-6h。反应结束后加入乙酸乙酯10mL淬灭反应，加入5mL饱和食盐水洗涤，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为5mL，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝4:1)，得到中间体II-8。白色固体，产率68％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.51(s,1H),8.38(dd,J＝6.0,1.5Hz,1H),8.20(d,J＝6.7Hz,1H),8.16(s,2H),8.10(s,1H),7.76(d,J＝8.6Hz,1H),7.06(d,J＝9.0Hz,1H),4.07(s,6H),4.02(s,3H),3.91(s,3H),1.72(s,9H)以及ESI-MS m/z:400.1([M+H]+)。
步骤S2：3-(5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-甲氧基-[1,2,4]三唑[1,5-c]-2-嘧啶基)-1H-吲哚-1-甲酸叔丁基酯的制备。
取三口圆底烧瓶，分别加入中间体II-8(0.4mmol),3,4,5-三甲氧基苯硼酸(0.48mmol)，四三苯基膦钯(0.04mmol)，碳酸钾(0.6mmol)以及1,4-二氧六环(4mL)，氮气保护下100℃反应12h。反应结束后加入乙酸乙酯10mL淬灭反应，加入5mL饱和食盐水洗涤，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为5mL，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝4:1)，得到产物A-9，产率68％。白色固体。
取上述产物进行NMR和MS表征，表征数据如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.51(s,1H),8.38(dd,J＝6.0,1.5Hz,1H),8.20(d,J＝6.7Hz,1H),8.16(s,2H),8.10(s,1H),7.76(d,J＝8.6Hz,1H),7.06(d,J＝9.0Hz,1H),4.07(s,6H),4.02(s,3H),3.91(s,3H),1.72(s,9H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ162.2,160.8,152.9,149.8,147.2,147.1,138.7,134.8,129.5,129.5,125.5,124.7,121.8,119.9,115.0,111.4,110.3,98.2,83.6,60.7,56.3,27.9以及HRMS(ESI)(m/z):calcd forC28H29N5O6([M+H]+):532.2112,found:532.2119。
步骤S3：2-(1H-5-甲氧基-3-吲哚基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶的制备。
取单口圆底烧瓶，分别加入化合物A-9(0.3mmol)以及二氯甲烷(3mL),0℃下滴加三氟乙酸(1mL)，室温搅拌1小时。反应结束后，经减压蒸馏得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)，得到产物A-10，产率63％。白色固体，熔点：190.2-191.1℃。
取上述产物进行NMR和MS表征，表征数据如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.97(brs,1H),8.32(d,J＝6.1Hz,1H),8.17(s,2H),8.14(s,1H),8.07(s,1H),7.57(d,J＝6.1Hz,1H),7.37(d,J＝8.8Hz,1H),6.97(d,J＝8.8Hz,1H),4.06(s,6H),4.02(s,3H),3.90(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ162.5,155.5,153.8,152.9,148.8,144.1,141.4,131.7,127.8,126.8,126.2,112.5,112.2,108.5,108.3,107.6,104.7,61.1,56.6,56.1以及HRMS(ESI)(m/z):calcd for C23H21N5O4([M+H]+):432.1666,found:432.1662。
实施例9
本实施例制备了3-(5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]-2-嘧啶基)-6-甲氧基-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯(编号为A-11)以及2-(1H-6-甲氧基-3-吲哚基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶(编号为A-12)，结构如下：
S1：3-(5-氯-3-[1,2,4]三唑并[4,3-c]嘧啶基)-6-甲氧基-1H-吲哚-1-甲酸叔丁酯的制备：
取三口圆底烧瓶，以碳棒(φ6mm)作为阳极，铂片(10mm×10mm×0.1mm)作为阴极，分别加入2-氯-4-肼基嘧啶I(0.5mmol),N-Boc-6-甲氧基-3-吲哚甲醛(0.55mmol)，四正丁基氟硼酸铵(0.5mmol)，四氢呋喃(8mL)。室温条件下在恒定电压(10V)下电解5-6h。反应结束后加入乙酸乙酯10mL淬灭反应，加入5mL饱和食盐水洗涤，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为5mL，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝4:1)，得到中间体II-9。白色固体，产率68％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.93(s,1H),7.87(d,J＝6.5Hz,2H),7.74(d,J＝6.5Hz,1H),7.34(d,J＝8.0Hz,1H),6.95(d,J＝8.0,1H),3.93(s,3H),1.72(s,9H)以及ESI-MS m/z:400.1([M+H]+)。
步骤S2：6-甲氧基-3-(5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑[1,5-c]-2-嘧啶基)-1H-吲哚-1-甲酸叔丁基酯的制备。
取三口圆底烧瓶，分别加入中间体II-9(0.4mmol),3,4,5-三甲氧基苯硼酸(0.48mmol)，四三苯基膦钯(0.04mmol)，碳酸钾(0.6mmol)以及1,4-二氧六环(4mL)，氮气保护下100℃反应12h。反应结束后加入乙酸乙酯10mL淬灭反应，加入5mL饱和食盐水洗涤，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为5mL，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝4:1)，得到产物A-11，产率68％。白色固体。
取上述产物进行NMR和MS表征，表征数据如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.45(d,J＝8.7Hz,1H),8.42(s,1H),8.38(d,J＝6.1Hz,1H),8.20(s,2H),7.82(d,J＝8.2Hz,1H),7.63(d,J＝7.0Hz,1H),7.59(t,J＝7.0Hz,1H),4.08(s,6H),4.04(s,3H),3.95(s,3H),1.72(s,9H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ161.2,160.8,160.2,152.8,149.8,147.2,147.1,138.7,135.2,129.6,126.8,125.5,120.4,111.7,111.4,110.3,98.2,97.6,83.6,60.7,56.3,55.6,27.9以及HRMS(ESI)(m/z):calcdfor C28H29N5O6([M+H]+):532.2112,found:532.2115。
步骤S3：2-(1H-6-甲氧基-3-吲哚基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶的制备。
取单口圆底烧瓶，分别加入化合物A-11(0.3mmol)以及二氯甲烷(3mL),0℃下滴加三氟乙酸(1mL)，室温搅拌1小时。反应结束后，经减压蒸馏得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)，得到产物A-12，产率72％。白色固体，熔点：247.6-248.1℃。
取上述产物进行NMR和MS表征，表征数据如下：
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.60(brs,1H),8.40(d,J＝6.0Hz,1H),8.27(d,J＝8.6Hz,1H),8.20(s,2H),8.10(s,1H),7.77(d,J＝6.0Hz,1H),7.03(s,1H),6.86(d,J＝8.3Hz,1H),3.98(s,6H),3.84(s,3H),3.82(s,3H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ162.7,156.7,154.0,152.9,147.9,144.6,141.0,138.0,127.7,127.0,121.7,119.6,111.1,109.1,108.2,106.5,95.6,60.8,56.5,55.7.以及HRMS(ESI)(m/z):calcd for C23H21N5O4([M+H]+):432.1666,found:432.1662。
实施例10
本实施例制备了2-甲氧基-5-(5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]-2-嘧啶基)苯酚，编号为A-13，结构为：
步骤S1：5-(5-氯-[1,2,4]三唑并[4,3-c]-3-嘧啶基)-2-甲氧基苯酚：
取三口圆底烧瓶，以碳棒(φ6mm)作为阳极，铂片(10mm×10mm×0.1mm)作为阴极，分别加入2-氯-4-肼基嘧啶I(0.5mmol),3-羟基-4-甲氧基苯甲醛(0.55mmol)，四正丁基氟硼酸铵(0.5mmol)，四氢呋喃(8mL)。室温条件下在恒定电压(10V)下电解5-6h。反应结束后加入乙酸乙酯10mL淬灭反应，加入5mL饱和食盐水洗涤，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为5mL，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)，得到中间体II-10。白色固体，产率75％。
取上述中间体进行NMR和MS表征，表征数据如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.82(d,J＝6.5Hz,1H),7.74(d,J＝6.5Hz,1H),7.17-7.15(m,2H),6.81(d,J＝7.5Hz,1H),5.51(brs,1H)3.71(s,3H)以及ESI-MS m/z:277.0([M+H]+)。
步骤S2：化合物2-(4-甲氧基苯基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶的制备。
取三口圆底烧瓶，分别加入中间体II-10(0.4mmol),3,4,5-三甲氧基苯硼酸(0.48mmol)，四三苯基膦钯(0.04mmol)，碳酸钾(0.6mmol)以及1,4-二氧六环(4mL)，氮气保护下100℃反应12h。反应结束后加入乙酸乙酯10mL淬灭反应，加入5mL饱和食盐水洗涤，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为5mL，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)，得到产物A-13，产率76％。白色固体，熔点：200.8-201.2℃。
取上述产物进行NMR和MS表征，表征数据如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.34(d,J＝6.1Hz,1H),8.19(s,2H),7.93–7.88(m,2H),7.62(d,J＝6.1Hz,1H),7.03–7.00(m,1H),5.79(brs,1H),4.06(s,6H),4.01(s,3H),4.00(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ164.7,154.6,152.8,149.0,148.7,145.9,144.0,141.2,126.3,123.3,120.3,113.8,110.7,109.1,108.0,61.1,56.3,56.0以及HRMS(ESI)(m/z):calcd for C21H20N4O5([M+H]+):409.1506,found:409.1503。
实施例11
本实施例制备了2-(3-氟-4-甲氧基苯基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶，编号为A-14，结构为：
步骤S1：5-氯-3-(3-氟-4-甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[4,3-c]嘧啶：
取三口圆底烧瓶，以碳棒(φ6mm)作为阳极，铂片(10mm×10mm×0.1mm)作为阴极，分别加入2-氯-4-肼基嘧啶I(0.5mmol),3-氟-4-甲氧基苯甲醛(0.55mmol)，四正丁基氟硼酸铵(0.5mmol)，四氢呋喃(8mL)。室温条件下在恒定电压(10V)下电解5-6h。反应结束后加入乙酸乙酯10mL淬灭反应，加入5mL饱和食盐水洗涤，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为5mL，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)，得到中间体II-11。白色固体，产率75％。
取上述中间体进行NMR和MS表征，表征数据如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.84(d,J＝6.5Hz,1H),7.39(d,J＝6.5Hz,1H),7.33-7.30(m,2H),6.84(d,J＝7.5Hz,1H),3.83(s,3H)以及ESI-MS m/z:279.7([M+H]+)。
步骤S2：化合物2-(3-氟-4-甲氧基苯基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶的制备。
取三口圆底烧瓶，分别加入中间体II-11(0.4mmol),3,4,5-三甲氧基苯硼酸(0.48mmol)，四三苯基膦钯(0.04mmol)，碳酸钾(0.6mmol)以及1,4-二氧六环(4mL)，氮气保护下100℃反应12h。反应结束后加入乙酸乙酯10mL淬灭反应，加入5mL饱和食盐水洗涤，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯用量为5mL，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)，得到产物A-14，产率79％。白色固体，熔点：215.4-216.3℃。
取上述产物进行NMR和MS表征，表征数据如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.34(d,J＝6.1Hz,1H),8.16(s,2H),8.11–8.09(m,1H),8.06–8.03(m,1H),7.60(d,J＝6.1Hz,1H),7.10(t,J＝8.5Hz,1H),4.05(s,6H),4.01(s,3H),3.99(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ163.8,154.6,152.9,152.3(C-F,1JC-F＝246.7),149.9(C-F,2JC-F＝10.9),148.8,144.2,141.4,126.2,124.1(C-F,3JC-F＝3.5),123.1(C-F,3JC-F＝7.3),115.3(C-F,2JC-F＝20.3),113.2,109.2,108.0,61.1,56.3,56.3以及HRMS(ESI)(m/z):calcd for C21H19FN4O4([M+H]+):411.1463,found:411.1458。
抗肿瘤细胞增殖活性测试
本发明所用到的细胞株有人宫颈癌细胞株HeLa，人乳腺癌细胞株MCF-7，人结肠癌细胞株HCT-116。
取对数生长期的宫颈癌细胞(HeLa),乳腺癌细胞(MCF-7),结肠癌细胞(HCT116)，胰酶消化，调整细胞数浓度为5×104/mL，按100μL/孔接种到96孔板中。在37℃ 5％CO2细胞培养箱中培养过夜，待细胞贴壁。吸弃旧的培养基加入不同浓度的含药培养基，每个化合物设置六个浓度，每个浓度设置三个复孔。加药培养48h后，向每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL)，培养4h后吸弃培养基，向每孔加入150μL的DMSO后在摇床避光防止10min溶解结晶紫后，用酶标仪读各孔在570nm下的吸光值。根据公式计算肿瘤细胞生长抑制率。
抑制率＝[1-(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％，其中As:加药孔的吸光值，Ab:空白孔的吸光值，Ac:对照孔的吸光值。
结果见下表1。在浓度为0.1μM时，把高于50％抑制细胞生长能力的化合物标记为“+++”；在浓度为1μM时，把高于50％抑制细胞生长能力的化合物标记为“++”；在浓度为10μM时，把高于50％抑制细胞生长能力的化合物标记为“+”；在浓度为10μM时，把不能抑制50％细胞生长能力的化合物标记为“–”。
微管蛋白聚集抑制实验
微管蛋白聚集的测试方法参考Cytoskeleton公司的tubulin polymerizationassay kit试剂盒(BK110P)进行操作，具体操作方法为：在冰上，用PEM缓冲液重悬将微管蛋白(2mg/mL)配置成tubulin工作液，在冰上保存，将待测化合物用DMSO稀释成10×的测试浓度，加入至96孔板中并在37℃下预热1min，向各孔加入tubulin工作液，混匀，用酶标仪在37℃下以1min为间隔记录各孔的荧光值(ex:360nm；em:450nm)，共90min，计算各组的微管蛋白聚集的抑制率。在浓度为10μM时，把高于50％以上抑制微管蛋白聚集的化合物标记为“+”；在浓度为10μM时，未能高于50％以上抑制微管蛋白聚集的化合物标记为“–”；未测定的化合物标记为“NT”。
表1
HeLa细胞流式实验
取对数生长期的HeLa细胞，经胰酶消化制成细胞悬液，调整细胞浓度，以3×105个/孔接种到六孔板上，待HeLa细胞生长24小时后，加入含不同浓度的化合物培养48小时，以不加入化合物的组作为阴性对照，然后弃去培养液，用PBS缓冲液清洗细胞3次，经胰酶消化制成细胞悬液，1000RPM/分钟离心5分钟收集细胞。按照碧云天的Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒的方法检测各组细胞的凋亡情况。随后向各组细胞加入染色结合液(195μL)，轻轻重悬细胞，加入Annexin-V-FITC溶液(5μL)轻轻混匀，在加入PI溶液(10μL)。室温下避光孵育20分钟，用流式细胞仪对各组细胞进行检测，结果如图2所示。与对照组相比，化合物A-5与HeLa细胞作用24h后，可以剂量依赖性的方式提高HeLa细胞的凋亡率。
上面结合实施例对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
Claims (10)
1.一种5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物，其特征在于，包括式A所示结构的化合物及其药学上可接受的盐，所述式A为：
2.根据权利要求1所述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物，其特征在于，所述Ar选自如式B或C所示的取代基，
所述式B为：
所述式C为：
其中，n为1～5的整数，R1，R2及R3分别独立地选自H、C1-C3烷基、卤素取代的C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、卤素取代的C1-C3烷氧基、3，4-亚甲二氧基、苯基、-NR4R5；
R4、R5分别独立地选自H、C1-C3烷基；
X选自C或N。
3.根据权利要求1所述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物，其特征在于，所述Ar为3-吲哚基、4-吲哚基、5-吲哚基、6-吲哚基、7-吲哚基、4-甲基苯基、4-甲氧基苯基、4-异丙基苯基、4-甲氧基苯乙烯基、3,4-二甲氧基苯基、3-(1-Boc吲哚基)、3-(5-甲氧基吲哚基)、4-(1-甲基吲哚基)、5-(1-甲基吲哚基)、6-(1-甲基吲哚基)、3-(1-Boc-5-甲氧基吲哚基)、3-(5-乙氧基吲哚基)、3-(1-Boc-5-乙氧基吲哚基)、3-(6-甲氧基吲哚基)、3-(1-Boc-6-甲氧基吲哚基)、3-羟基-4-甲氧基苯基、3,4-二甲基苯基、3-氟-4-甲氧基苯基、3-氯-4-甲氧基苯基、3-溴-4-甲氧基苯基和3-氨基-4-甲氧基苯基中的一种。
4.一种制备如权利要求1至3任一项所述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：以2-氯-4-肼基嘧啶和芳基甲醛ArCHO为原料，通过电化学阳极氧化反应得到式II所示化合物；
S2：式II所示化合物与3,4,5-三甲氧基苯硼酸发生Suzuki反应并同时发生Dimroth重排反应，即得；
式II所示化合物为：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S1中，2-氯-4-肼基嘧啶和芳基甲醛ArCHO的摩尔比为1：(0.2～1.2)。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S1中，电化学阳极氧化反应的电解质为四正丁基四氟硼酸铵、四正丁基醋酸铵、四正丁基硫酸氢铵和四正丁基六氟磷酸铵中的至少一种。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括在步骤S2之后，对产物进行提纯处理。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述提纯处理的方法为：向产物中加入乙酸乙酯淬灭反应，再加入饱和氯化钠溶液洗涤，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取3～5次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，经减压蒸馏除去溶剂，经柱层析即得。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有如权利要求1至3任一项所述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物。
10.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物包括如权利要求1至3任一项所述的5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物或如权利要求9所述的药物组合物。
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