WO2013021536A1 - Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成を検出する方法 - Google Patents

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target dna
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大輔 三好
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    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a higher order structure of DNA.
  • the human telomeric DNA is a double-stranded DNA consisting of 5'-TTAGGG-3 '(SEQ ID NO: 1) and 5'-CCCTAA-3' (SEQ ID NO: 2, complementary to SEQ ID NO: 1). It contains a single-stranded DNA in which only the sequence and 5′-TTAGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 1) are repeated at the very end.
  • a sequence in which this 5'-TTAGGG-3 '(SEQ ID NO: 1) is repeated can form a quadruplex DNA structure called G-quadruplex.
  • G-quadruplex is a structure in which four guanines form a structure called G-quartet that is stacked by ⁇ - ⁇ stacking interactions (FIG. 1). Since this G-quadruplex is considered to be related to canceration and longevity of cells, it has been energetically studied in recent years.
  • G-quadruplex probe a compound that emits much stronger fluorescence when reacted with G-quadruplex than single-stranded DNA or double-stranded DNA
  • Non-Patent Document 1 reports a G-quadruplex detection technique using Cyan40 (Chemical Formula 1) and Cyan2 (Chemical Formula 2). This report shows that when Cyan2 and G-quadruplex are reacted under conditions where potassium ions are not present, fluorescence is significantly stronger than when double-stranded DNA is reacted.
  • Non-Patent Document 2 reports a G-quadruplex detection technique using thiazole orange (Chemical Formula 3) (hereinafter referred to as TO). In this report, it is shown that TO emits strong fluorescence when reacted with G-quadruplex in the presence of 100 mM potassium ions. However, it has also been shown that when TO is reacted with double-stranded DNA under the same conditions, TO emits more intense fluorescence than when reacted with G-quadruplex. Therefore, G-quadruplex cannot be specifically detected using TO in the presence of 100 mM potassium ions.
  • the present invention for solving the above problems
  • a method for determining whether or not a target DNA forms G-quadruplex in the presence of potassium ions comprising the following steps: Maintaining a first sample solution containing potassium ions, thioflavin T, and the target DNA under G-quadruplex formation reaction conditions; Measuring a first fluorescence intensity value A at a wavelength of lambda 1, wherein the first fluorescence intensity value A is derived from thioflavin T contained in the first sample solution; Lambda 1 is not less than 465 nm and not more than 505 nm, Maintaining a second sample solution containing thioflavin T and the target DNA under conditions that destabilize the structure of the G-quadruplex; Measuring the second fluorescence intensity value B at the wavelength of the lambda 1, wherein the second fluorescence intensity value B is derived from the thioflavin T contained in the second sample solution, and the following inequality is satisfied: Then, it is determined that the target DNA forms the G-quadru
  • the target DNA does not form the G-quadruplex in the presence of potassium ions. It is preferable.
  • the condition for destabilizing the structure of the G-quadruplex is preferably a condition in the presence of lithium.
  • the lambda 1 is preferably 485 nanometers.
  • the present invention provides a method for specifically and quantitatively detecting G-quadruplex in the presence of potassium ions, and a method for specifically and quantitatively detecting DNA capable of forming G-quadruplex.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining the structure of a G-quadruplex.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining a method for examining whether or not a target DNA forms a G-quadruplex in the presence of potassium ions in the present embodiment.
  • FIG. 3 shows a graph plotting the results of fluorescence spectrum in the presence of 0 mM-KCl and the relationship between each DNA concentration and fluorescence intensity at 530 nm in Comparative Example 1.
  • FIG. 4 shows a graph plotting the relationship between each DNA concentration in the presence of 50 mM KCl and the fluorescence intensity at 530 nm in Comparative Example 1.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining the structure of a G-quadruplex.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining a method for examining whether or not a target DNA forms a G-quadruplex in the presence of potassium ions in the present embodiment.
  • FIG. 3 shows a graph plotting the results of fluorescence spectrum in the presence of 0 m
  • FIG. 5 is a graph plotting the relationship between each DNA concentration in the presence of 100 mM KCl and the fluorescence intensity at 530 nm in Comparative Example 1.
  • FIG. 6 is a graph plotting the relationship between each DNA concentration in the presence of 150 mM-KCl and the fluorescence intensity at 530 nm in Comparative Example 1.
  • FIG. 7 is a graph plotting the relationship between each DNA concentration in the presence of 500 mM KCl and the fluorescence intensity at 530 nm in Comparative Example 1.
  • FIG. 8 shows the result of fluorescence spectrum in the presence of 0 mM-KCl and a graph plotting the relationship between each DNA concentration and fluorescence intensity at 450 nm in Example 1.
  • FIG. 9 shows a graph in which the relationship between each DNA concentration in the presence of 50 mM-KCl and the fluorescence intensity at 450 nm in Example 1 is plotted.
  • FIG. 10 shows a graph in which the relationship between each DNA concentration in the presence of 100 mM KCl and the fluorescence intensity at 450 nm in Example 1 is plotted.
  • FIG. 11 is a graph plotting the relationship between each DNA concentration in the presence of 150 mM-KCl and the fluorescence intensity at 450 nm in Example 1.
  • FIG. 12 shows a graph in which the relationship between each DNA concentration in the presence of 500 mM KCl and the fluorescence intensity at 450 nm in Example 1 is plotted.
  • FIG. 13 shows a graph plotting the fluorescence spectrum results and the relationship between the concentration of G-DNA2 and the fluorescence intensity at 450 nm in Example 2.
  • FIG. 14 is a graph plotting the fluorescence spectrum results and the relationship between the concentration of G-DNA 3 and the fluorescence intensity at 450 nm in Example 3.
  • FIG. 15 is a diagram showing the presence of G-DNA2 and Duplex-C in Example 4.
  • FIG. 16 is a graph showing the difference in fluorescence intensity value at 485 nm in Example 4.
  • FIG. 17 is a graph showing the difference in fluorescence intensity value at 485 nm in Example 5.
  • Step 1 A sample solution 1 containing potassium ions, target DNA, and thioflavin T is prepared.
  • the order of mixing potassium ions, target DNA, and thioflavin T is not limited.
  • Step 2 After step 1, the sample solution 1 is placed under G-quadruplex formation conditions.
  • Step 3 After step 2, the fluorescence intensity value (A) derived from thioflavin T in the sample solution 1 is measured.
  • Step 4) The sample solution 2 containing the target DNA and thioflavin T is placed under conditions that destabilize the structure of G-quadruplex.
  • Step 5) After step 4, the fluorescence intensity value (B) derived from thioflavin T in the sample solution 2 is measured.
  • the fluorescence intensity values A and B are fluorescence intensity values of the same wavelength.
  • Step 6 When AB> 0, it is determined that the target DNA forms G-quadruplex in the presence of potassium ions.
  • thioflavin T is added to the sample solution 1 in step 1. However, it is not always necessary to add thioflavin T to the sample solution 1 in step 1. By step 3, thioflavin T may be added to the sample solution 1. In the above procedure, thioflavin T is added to the sample solution 2 in step 4. However, it is not always necessary to add thioflavin T to the sample solution 2 in step 4. By step 5, thioflavin T may be added to the sample solution 2.
  • the present inventor has discovered that when thioflavin T is reacted with G-quadruplex, strong fluorescence having a maximum fluorescence wavelength is observed at around 485 nm. On the other hand, when thioflavin T was reacted with single-stranded DNA or double-stranded DNA, it was also found that no fluorescence was observed at all or very small even when observed. In other words, the inventor has discovered that thioflavin T is a G-quadruplex-specific fluorescent probe. Therefore, when the target DNA forms G-quadruplex in the presence of potassium ions and when it does not form, it is as follows.
  • Step 4 When the target DNA forms G-quadruplex in the presence of potassium ions Since the target DNA forms G-quadruplex after the above steps 1 and 2, strong fluorescence derived from thioflavin T is emitted in step 3 above. It is confirmed. However, after Step 4 above, part or all of the target DNA forms single-stranded DNA or double-stranded DNA. Therefore, in Step 5 above, no fluorescence derived from thioflavin T is observed or recognized. Even so, the fluorescence intensity value is clearly smaller than the value obtained in step 3 above. Therefore, the value obtained in step 6 is greater than zero.
  • step 6 When the target DNA does not form a G-quadruplex in the presence of potassium ions The target DNA does not form a G-quadruplex either after the above steps 1 and 2 or after the above step 4, The fluorescence intensity derived from thioflavin T measured in step 3 and step 5 is substantially the same. Therefore, the value obtained in step 6 is substantially zero.
  • the condition for destabilizing the structure of G-quadruplex in the above step 4 is, for example, a condition where lithium ions are present. It is known that the structure of G-quadruplex is destabilized in the presence of lithium ions. Further, the conditions for destabilizing the structure of other G-quadruplexes are high temperature conditions. It is known that the structure of G-quadruplex becomes unstable under high temperature conditions ( ⁇ 100 ° C.).
  • the conditions for destabilizing the structure of G-quadruplex in the above step 4 are not limited to the examples given here. Any condition that destabilizes the structure of the G-quadruplex may be used.
  • the wavelength of the excitation light used in Step 3 and Step 5 may be any wavelength as long as it is within the absorption band of thioflavin T. However, since the maximum excitation wavelength of thioflavin T is around 450 nm, the wavelength of the excitation light used in Step 3 and Step 5 is preferably around 450 nm.
  • Comparative Example 1 G-quadruplex and double-stranded DNA were detected using thiazole orange, which is a typical benzothiazole derivative.
  • the G-quadruplex used in this comparative example is composed of 5′-GGGTTAGGGTTTAGGGTTTAGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 3) human telomeric DNA (hereinafter, this DNA is referred to as G-DNA1).
  • the sequence of the double-stranded DNA used in this comparative example was 5′-AGTTCAAGGCCGCCTTGAACT-3 ′ (SEQ ID NO: 4) (hereinafter, the DNA of this sequence is referred to as Duplex 1).
  • reaction solutions shown in Table 1 were prepared.
  • FIG 3B is a graph showing the relationship between each DNA concentration and the fluorescence intensity at 530 nm based on this fluorescence spectrum result.
  • FIGS. 4 to 7 are graphs showing the relationship between each DNA concentration and the fluorescence intensity at 530 nm in the presence of 50, 100, 150, and 500 mM-KCl, respectively. From the above results, it can be seen that thiazole orange emits fluorescence when it reacts with G-DNA1, but also when it reacts with Duplex1, it emits the same or more fluorescence. That is, these results indicate that thiazole orange has no specificity for G-quadruplex. Therefore, thiazole orange cannot be used to analyze whether the target DNA can form G-quadruplex.
  • Example 1 In Example 1, G-DNA1 and Duplex1 were detected as in Comparative Example 1. However, Thioflavin T (concentration is 1 ⁇ M) was used instead of TO. In addition, 5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
  • FIG. 8A shows the fluorescence spectrum result when the KCl concentration is 0 mM.
  • FIG. 8B shows a graph plotting the relationship between each DNA concentration and the fluorescence intensity at 485 nm based on this spectrum result.
  • FIGS. 9 to 12 show graphs plotting the relationship between each DNA concentration and fluorescence intensity at 485 nm in the presence of 50, 100, 150, and 500 mM-KCl, respectively. From the above results, it can be seen that when thioflavin T is reacted with G-DNA1 in any concentration of KCl, fluorescence is emitted.
  • Example 2 In Example 1, G-quadruplex consisting of G-DNA1 was detected using thioflavin T. G-DNA1 is known to form a (3 + 1) -type G-quadruplex structure (Non-patent Documents 3 and 4). In Example 2, G-quadruplexes having different structures were detected using thioflavin T. In this Example 2, G-quadruplex formed by DNA having the sequence of 5′-GGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 6) was used as the DNA to be measured (hereinafter, the DNA comprising this sequence is referred to as G-DNA2). . The concentration of KCl was only 100 mM. Otherwise, the same experiment as in Example 1 was performed. Under these experimental conditions, G-DNA2 is known to form an antiparallel G-quadruplex.
  • FIG. 13A shows the fluorescence spectrum result.
  • FIG. 13B shows a graph plotting the relationship between the concentration of G-DNA2 and the fluorescence intensity at 485 nm based on this result. From the above results, it can be seen that when thioflavin T is reacted with G-DNA2, fluorescence is emitted. Therefore, it was shown that anti-parallel G-quadruplex can be detected using thioflavin T.
  • Example 3 In each of Examples 1 and 2, (3 + 1) -type G-quadruplex and anti-parallel G-quadruplex were detected using thioflavin T. Therefore, in this example 3, thioflavin T was used to detect a parallel type G-quadruplex different from those in examples 1 and 2.
  • G-quadruplex formed by DNA having the sequence of 5′-GGGGTGGGGGTGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 7) was used as the DNA to be measured (hereinafter, the DNA comprising this sequence is referred to as G-DNA3).
  • the concentration of KCl was only 100 mM. Otherwise, the same experiment as in Example 1 was performed. Under these experimental conditions, G-DNA3 is known to form a parallel G-quadruplex.
  • FIG. 14A shows the fluorescence spectrum result.
  • FIG. 14B shows a graph plotting the relationship between the concentration of G-DNA3 and the fluorescence intensity at 485 nm based on this result. From the above results, it can be seen that when thioflavin T is reacted with G-DNA3, fluorescence is emitted. Therefore, it was shown that parallel G-quadruplex can be detected using thioflavin T.
  • G-DNA2 and 5′-CCCCAAAAACCCCAAAAACCCCCAAAACCCC- ′ (SEQ ID NO: 8, complementary strand of G-DNA2) (hereinafter, this DNA is referred to as Duplex-C) has a G-quadruplex structure in the presence of lithium ions. Under destabilizing conditions, they bind complementary to each other to form double stranded DNA. However, in the presence of potassium ions, G-DNA2 forms a G-quadruplex structure, and Duplex-C exists in a single-stranded DNA state (FIG. 15). In this Example 4, a DNA sample in which G-DNA2 and Duplex-C are mixed can form G-quadruplex in the presence of potassium ions. The fluorescence intensity derived from thioflavin T in the presence of potassium ions and the presence of lithium ions. It was examined whether it could be discriminated by the difference in fluorescence intensity derived from thioflavin T below.
  • reaction solution 2 was prepared.
  • the composition of the reaction solution 2 is the same as that of the reaction solution 1 except that the KCl of the reaction solution 1 is changed to LiCl.
  • These reaction solutions were kept at 90 ° C. for 2 minutes and then lowered to 25 ° C. at a rate of 0.5 ° C./min.
  • most of G-DNA 1 in reaction solution 1 forms G-quadruplex, and Duplex-C is already known to exist in a single-stranded DNA state.
  • the reaction solution 2 because of the presence of lithium ions, the structure of G-quadruplex becomes unstable, and most of G-DNA2 and Duplex-C bind to each other complementarily to form double-stranded DNA. It is known to do.
  • a fluorescence intensity analysis at 485 nm was performed on these reaction solutions. The excitation light wavelength was 450 nm.
  • Duplex-AGA 5′-AGAAGAGAAAGA-3 ′
  • Duplex-TCTTCT-3 5′-TCTTTCTCTTCT-3 ′
  • '(SEQ ID NO: 10 complementary strand of SEQ ID NO: 9) this DNA is referred to as Duplex-TCT
  • Duplex-AGA and Duplex-TCT are complementary to each other. Neither can form a G-quadruplex. Therefore, in the presence of lithium ions and potassium ions, these DNAs bind complementarily to each other to form double-stranded DNA.
  • Results are shown in FIG.
  • the right bar in FIG. 16 shows the value obtained by subtracting the fluorescence intensity value derived from the reaction solution 2 from the fluorescence intensity value derived from the reaction solution 1 when G-DNA2 and Duplex-C are used. Its value was approximately 30 and was greater than 0.
  • the left bar shows a value obtained by subtracting the fluorescence intensity value derived from the reaction solution 2 from the fluorescence intensity value derived from the reaction solution 1 when Duplex-AGA and Duplex-TCT are used. Its value was approximately zero.
  • the above results indicate that thioflavin T can be used to determine whether the target DNA can form G-quadruplex in the presence of potassium ions.
  • Example 5 It is known that most of G-DNA1 forms G-quadruplex in the presence of potassium ions. On the other hand, G-DNA1 is destabilized in the presence of lithium ions, so that part of G-DNA1 exists in a single-stranded DNA state. In this Example 5, whether or not G-quadruplex formed from G-DNA2 can be detected using thioflavin T in the presence of potassium ions in a sample solution containing G-DNA1. In Example 5, G-DNA1 can form G-quadruplex in the presence of potassium ions. The fluorescence intensity derived from thioflavin T in the presence of potassium ions and the fluorescence intensity derived from thioflavin T in the presence of lithium ions. We examined whether it was possible to discriminate by the difference.
  • the experimental procedure was exactly the same as Example 4 except that G-DNA1 was used instead of G-DNA2 and Duplex-C.
  • G-DNA1 was used instead of G-DNA2 and Duplex-C.
  • T21 exists in a single-stranded DNA state in the presence of lithium ions and potassium ions.
  • Results are shown in FIG.
  • the bar on the right side in FIG. 17 shows the value obtained by subtracting the fluorescence intensity value derived from the reaction solution 2 from the fluorescence intensity value derived from the reaction solution 1 when G-DNA1 is used. Its value was approximately 6, which was greater than 0.
  • the left bar indicates a value obtained by subtracting the fluorescence intensity value derived from the reaction solution 2 from the fluorescence intensity value derived from the reaction solution 1 when T21 is used. Its value was approximately zero.
  • the above results indicate that thioflavin T can be used to determine whether the target DNA can form G-quadruplex in the presence of potassium ions.
  • the present inventors have found for the first time in the world that specific detection of G-quadruplex that could not be achieved by conventional benzothiazole derivatives can be achieved by using thioflavin T, and have completed the present invention.
  • the G-quadruplex specific detection method is useful as an analysis method in the biotechnology field.

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Abstract

　本発明の方法は、カリウムイオン存在下においてもＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出することを目的とする。　本発明の方法は、カリウムイオン存在下において、チオフラビンＴが、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと反応させたときに強い蛍光を発する現象を利用し、標的ＤＮＡがＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているかどうかを判定する。本発明の方法においては、カリウムイオンおよび標的ＤＮＡを含有する第１試料溶液をＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが形成される条件に維持した後、チオフラビンＴを添加して第１蛍光強度値を測定する。標的ＤＮＡを含有する第２試料溶液をＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが不安定化される条件に維持し、チオフラビンＴを添加して第２蛍光強度値を測定し、これらの値の差が０以上であれば、標的ＤＮＡはＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できると判定される。

Description

Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成を検出する方法
　本発明はＤＮＡの高次構造の検出方法に関する。
　ヒトのテロメアＤＮＡは、５’－ＴＴＡＧＧＧ－３’（配列番号：１）と５’－ＣＣＣＴＡＡ－３’ （配列番号：２、配列番号１の相補鎖）からなる二本鎖ＤＮＡが繰り返された配列と、その最末端に５’－ＴＴＡＧＧＧ－３’（配列番号：１）のみが繰り返された一本鎖ＤＮＡを含む。この５’－ＴＴＡＧＧＧ－３’（配列番号：１）が繰り返された配列は、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと呼ばれる四重鎖ＤＮＡ構造を形成できる。Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘは、４つのグアニンがＧ－ｑｕａｒｔｅｔと呼ばれる構造を形成し、それがπ－πスタッキング相互作用により積み重なった構造である（図１）。このＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘは細胞の癌化や寿命に関連していると考えられているため、近年精力的に研究されている。
　また最近行われたコンピュータによるゲノムワイド解析は、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できると考えられる配列が、ゲノムＤＮＡ中にテロメアＤＮＡ以外にも多数存在することを示した。それらの多くは、ｃ－ｋｉｔ、ｃ－ｍｙｃ、Ｈ－ｒａｓ、Ｋ－ｒａｓ遺伝子を含む癌原因遺伝子のプロモーター領域に存在する。したがって、これらＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できると考えられる配列についても研究が行われている。以上の事実は、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが細胞の活動において重要な役割を果たしている可能性を示唆している。
　以上の背景のもと、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できると考えられるＤＮＡが、本当にＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できるか否かを簡便に解析する技術が必要とされている。特に、細胞内のカリウムイオン濃度はおよそ１００－１５０ｍＭであるため、このカリウムイオン濃度条件下でＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの形成を解析できる技術が必要である。そのために、一本鎖ＤＮＡや二本鎖ＤＮＡと比べて、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと反応した際に格段に強い蛍光を発する化合物（以下、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘプローブと呼ぶ）の探索が行われてきた。言い換えれば、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘプローブは、一本鎖ＤＮＡや二本鎖ＤＮＡと反応してもほとんど蛍光を発しないが、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと反応すると強い蛍光を発する性質を持っていなければいけない。
　近年、最も精力的に研究されているＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘプローブの一つは、ベンゾチアゾール誘導体である。ベンゾチアゾール誘導体の研究が盛んな理由は、ベンゾチアゾール誘導体は水溶性が高く、蛍光強度変化が非常に大きいためである。たとえば、非特許文献１ではＣｙａｎ４０（化１）およびＣｙａｎ２（化２）を用いたＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出技術が報告されている。この報告では、カリウムイオンが存在しない条件下で、Ｃｙａｎ２とＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを反応させた場合、二本鎖ＤＮＡ反応させた場合と比べて、優位に強い蛍光が発せられることが示されている。しかし、１００ｍＭカリウムイオン存在下では、Ｃｙａｎ２とＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを反応させてもほとんど蛍光が検出されないことも示されている。したがって、Ｃｙａｎ２は、カリウムイオン存在下におけるＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの検出には使えない。また非特許文献２では、チアゾールオレンジ（化３）（以下、ＴＯと呼ぶ）を用いたＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出技術が報告されている。この報告の中で、ＴＯは、１００ｍＭカリウムイオン存在下で、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと反応させると強い蛍光を発することが示されている。しかし、同じ条件下でＴＯを二本鎖ＤＮＡと反応させた場合、ＴＯは、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと反応させた場合よりも、より強い蛍光を発することも示されている。したがって、１００ｍＭカリウムイオン存在下で、ＴＯを用いてＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出することはできない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　以上のように、近年、ベンゾチアゾール誘導体をＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘプローブとして用い、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出する技術の開発行われている。しかし、細胞内条件と同様にカリウムイオンが存在する条件下で特異的にＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出できる技術は知られていなかった。
J.Flucresc.,2011,21(1),223-230 J.Am.Chem.Soc.,2006,128(36),11890-11893. J.Am.Chem.Soc.,2006,128(30),9963-9970. Nucleic Acids Res.,2006,34(19),5715-5719.
　カリウムイオン存在下で、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できると考えられるＤＮＡが、本当にＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できるか否かを簡便に解析する技術は非常に有用である。そのため、ベンゾチアゾール誘導体を用いたＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出技術の研究が精力的になされているが、カリウムイオン存在下で特異的にＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出できる技術は開発されていなかった。そこで本発明者は鋭意検討した結果、カリウムイオン存在下において、チオフラビンＴ（化４）が、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと反応させたときに強い蛍光を発することを見出した。この蛍光強度は、チオフラビンＴを二本鎖ＤＮＡや一本鎖ＤＮＡと反応させた場合と比べ、優位に大きい。したがって、本発明によりカリウムイオン存在下においてもＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的に検出できることを見出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　上記課題を解決する本発明は、
　標的ＤＮＡがＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘをカリウムイオン存在下で形成しているかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備する方法である：
　カリウムイオン、チオフラビンＴ、および前記標的ＤＮＡを含有する第１試料溶液をＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応条件下で維持する工程、
　ラムダ１の波長における第１蛍光強度値Ａを測定する工程、ここで
　　前記第１蛍光強度値Ａは、前記第１試料溶液に含有されるチオフラビンＴに由来し、
　　ラムダ１は、４６５ナノメートル以上５０５ナノメートル以下であり、
　チオフラビンＴおよび前記標的ＤＮＡを含有する第２試料溶液を、前記Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造が不安定化する条件下に維持する工程、
　前記ラムダ１の波長における第２蛍光強度値Ｂを測定する工程、ここで
　　前記第２蛍光強度値Ｂは、前記第２試料溶液に含有されるチオフラビンＴに由来し、および
　以下の不等式が充足されれば、前記標的ＤＮＡがカリウムイオン存在下で前記Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成していると判定される工程：
　前記第１蛍光強度値Ａ－前記第２蛍光強度値Ｂ＞０。
　本発明の方法では、前記第１蛍光強度値－前記第２蛍光強度値≦０の不等式が充足されれば、前記標的ＤＮＡがカリウムイオン存在下で前記Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成していないと判定されることが好ましい。
　　本発明の方法では、前記Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造が不安定化する条件は、リチウム存在下の条件であることが好ましい。
　　本発明の方法では、前記ラムダ１が４８５ナノメートルであることが好ましい。
　本発明の上記目的、他の目的、特徴および利点は、添付図面参照の下、以下の好適な実施態様の詳細な説明から明らかにされる。
　本発明により、カリウムイオン存在下において、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを特異的かつ定量的に検出する方法、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できるＤＮＡを特異的かつ定量的に検出する方法が提供される。
図１は、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を説明するための図を示す。 図２は、本実施の形態における、カリウムイオン存在下で標的ＤＮＡがＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するか否かについて調べる方法を説明するための図を示す。 図３は、比較例１における、０ｍＭ－ＫＣｌ存在下での蛍光スペクトル結果と、各ＤＮＡ濃度と５３０ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。 図４は、比較例１における、５０ｍＭ－ＫＣｌ存在下での各ＤＮＡ濃度と５３０ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。 図５は、比較例１における、１００ｍＭ－ＫＣｌ存在下での各ＤＮＡ濃度と５３０ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。 図６は、比較例１における、１５０ｍＭ－ＫＣｌ存在下での各ＤＮＡ濃度と５３０ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。 図７は、比較例１における、５００ｍＭ－ＫＣｌ存在下での各ＤＮＡ濃度と５３０ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。 図８は、実施例１における、０ｍＭ－ＫＣｌ存在下での蛍光スペクトル結果と、各ＤＮＡ濃度と４５０ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。 図９は、実施例１における、５０ｍＭ－ＫＣｌ存在下での各ＤＮＡ濃度と４５０ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。 図１０は、実施例１における、１００ｍＭ－ＫＣｌ存在下での各ＤＮＡ濃度と４５０ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。 図１１は、実施例１における、１５０ｍＭ－ＫＣｌ存在下での各ＤＮＡ濃度と４５０ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。 図１２は、実施例１における、５００ｍＭ－ＫＣｌ存在下での各ＤＮＡ濃度と４５０ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。 図１３は、実施例２における、蛍光スペクトル結果と、Ｇ－ＤＮＡ２の濃度と４５０ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。 図１４は、実施例３における、蛍光スペクトル結果と、Ｇ－ＤＮＡ３の濃度と４５０ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。 図１５は、実施例４における、Ｇ－ＤＮＡ２とＤｕｐｌｅｘ－Ｃの存在状態を示す図を示す。 図１６は、実施例４における、４８５ｎｍにおける蛍光強度値の差を示すグラフを示す。 図１７は、実施例５における、４８５ｎｍにおける蛍光強度値の差を示すグラフを示す。
　以下本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
　本実施の形態では、カリウムイオン存在下で標的ＤＮＡがＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するか否かについて調べる方法について、図２を用いて説明する。
　本実施の形態では、以下の工程が実施される。
（工程１）カリウムイオンと標的ＤＮＡとチオフラビンＴを含む試料溶液１を調製する。カリウムイオンと標的ＤＮＡとチオフラビンＴを混合する順番は問わない。
（工程２）工程１の後、この試料溶液１をＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成条件下に置く。
（工程３）工程２の後、この試料溶液１中のチオフラビンＴ由来の蛍光強度値（Ａ）を測定する。
（工程４）標的ＤＮＡとチオフラビンＴを含む試料溶液２を、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を不安定化する条件下に置く。
（工程５）工程４の後、試料溶液２中のチオフラビンＴ由来の蛍光強度値（Ｂ）を測定する。蛍光強度値ＡとＢは、同じ波長の蛍光強度値である。
（工程６）Ａ－Ｂ＞０の場合、標的ＤＮＡがカリウムイオン存在下でＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成すると判断する。
　上記手順では、工程１において、試料溶液１中にチオフラビンＴが加えられる。しかし、必ずしも工程１において、試料溶液１中にチオフラビンＴが加えられる必要はない。工程３までに、試料溶液１中にチオフラビンＴが加えられればよい。また、上記手順では、工程４において、試料溶液２中にチオフラビンＴが加えられる。しかし、必ずしも工程４において、試料溶液２中にチオフラビンＴが加えられる必要はない。工程５までに、試料溶液２中にチオフラビンＴが加えられればよい。
　本発明者は、チオフラビンＴをＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと反応させた場合、４８５ｎｍ付近に極大蛍光波長を有する強い蛍光が観察されることを発見した。また一方で、チオフラビンＴを一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡと反応させた場合には、蛍光はまったく観察されないか、観察されても極めて小さいことも発見した。言い換えれば、本発明者はチオフラビンＴがＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ特異的な蛍光プローブであることを発見した。したがって、カリウムイオン存在下で標的ＤＮＡがＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する場合と形成しない場合では、それぞれ次のとおりになる。
　（１）カリウムイオン存在下で標的ＤＮＡがＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成する場合
　上記工程１～２の後に、標的ＤＮＡはＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しているため、上記工程３ではチオフラビンＴ由来の強い蛍光が確認される。しかし、上記工程４の後では、標的ＤＮＡの一部または全部が、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡを形成するため、上記工程５ではチオフラビンＴ由来の蛍光はまったく認められないか、認められたとしても、その蛍光強度値は、上記工程３で得られた値よりは明らかに小さい。したがって、上記工程６で得られる値は０より大きい。
　（２）カリウムイオン存在下で標的ＤＮＡがＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成しない場合
　上記工程１～２の後においても、上記工程４の後においても、標的ＤＮＡはＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成していないため、上記工程３と上記工程５で測定されるチオフラビンＴ由来の蛍光強度は実質同じである。したがって、上記工程６で得られる値は実質０である。
　上記工程４における、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を不安定化する条件とは、例えばリチウムイオンが存在する条件である。リチウムイオン存在下では、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造は不安定化することが知られている。また他のＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を不安定化する条件は、高温条件である。高温条件下（～１００℃）では、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造は不安定化することが知られている。上記工程４における、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を不安定化する条件は、ここに挙げた例に限られない。Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を不安定化する条件であればよい。
　また、上記工程３と上記工程５で用いられる励起光の波長は、チオフラビンＴの吸収帯の範囲内であればいずれの波長でもよい。しかし、チオフラビンＴの極大励起波長が４５０ｎｍ付近であるため、上記工程３と上記工程５で用いられる励起光の波長は、４５０ｎｍ付近が望ましい。
　［実施例］
　以下に記載する実施例および比較例で用いられるＤＮＡは、全て北海道システム・サイエンス株式会社より購入された。またチオフラビンＴはシグマ・アルドリッチ（株）より購入した。またチアゾールオレンジは和光純薬工業（株）より購入された。また蛍光強度解析には、サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製Ｖａｒｉｏｓｋａｎ　ｆｌａｓｈを用いた。
　（比較例１）
　本比較例１では、代表的なベンゾチアゾール誘導体であるチアゾールオレンジを用いて、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと二本鎖ＤＮＡの検出を行った。本比較例で用いられたＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘは、５’－ＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ－３’（配列番号：３）のヒトテロメア配列のＤＮＡからなる（以降、この配列のＤＮＡをＧ－ＤＮＡ１と呼ぶ）。また本比較例で用いられた二本鎖ＤＮＡの配列は、５’－ＡＧＴＴＣＡＡＧＧＣＧＣＣＴＴＧＡＡＣＴ－３’ （配列番号：４）であった（以降、この配列のＤＮＡをＤｕｐｌｅｘ１と呼ぶ）。これら二種類のＤＮＡを用いて、以下のとおり実験を行った。まず表１に示す反応溶液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　Ｘは０、５０、１００、１５０、または５００であった。また、Ｙは０、１０、または５０であった。次に、この反応溶液を９０℃で２分間保温した後、０．５℃／分の降温速度で２５℃まで降温させた。以上の工程後、Ｇ－ＤＮＡ１はＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成することがすでに知られている。同様にＤｕｐｌｅｘ１は分子内二本鎖構造を形成することが知られている。その後、この反応溶液について蛍光強度解析を行った。励起光波長は５０１ｎｍであった。結果を図３に示す。図３（Ａ）はＫＣｌ濃度が０ｍＭの際の蛍光スペクトル結果である。図３（Ｂ）は、この蛍光スペクトル結果をもとに、各ＤＮＡ濃度と５３０ｎｍにおける蛍光強度の関係をグラフ化したものである。同様に、図４～７はそれぞれ、５０、１００、１５０、および５００ｍＭ－ＫＣｌ存在下における、各ＤＮＡ濃度と５３０ｎｍにおける蛍光強度の関係をグラフ化したものである。以上の結果より、チアゾールオレンジはＧ－ＤＮＡ１と反応させると蛍光を発するが、Ｄｕｐｌｅｘ１と反応させた場合も同程度かあるいはそれ以上に蛍光を発することが分かる。すなわち、これらの結果はチアゾールオレンジのＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異性が全くないことを示している。したがって、標的ＤＮＡがＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できるか否かの解析にはチアゾールオレンジを用いることはできない。
　（実施例１）
　本実施例１では、比較例１と同様に、Ｇ－ＤＮＡ１とＤｕｐｌｅｘ１の検出を行った。ただし、ＴＯの代わりにチオフラビンＴ（濃度は１μＭ）を用いた。また、１００ｍＭ－ＫＣｌの条件下においてのみ、測定対象ＤＮＡとして、５’－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号：５）（以降、この配列からなるＤＮＡをＴ２１と呼ぶ）を用いた。Ｔ２１は一本鎖ＤＮＡとして溶液中で存在することが分かっている。また、励起光波長は５０１ｎｍではなく、４５０ｎｍであった。それ以外については、比較例１と同じ実験を行った。
　結果を図８に示す。図８（Ａ）はＫＣｌ濃度が０ｍＭの際の蛍光スペクトル結果を示す。図８（Ｂ）はこのスペクトル結果をもとに、各ＤＮＡ濃度と４８５ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。同様に、図９～１２はそれぞれ、５０、１００、１５０、および５００ｍＭ－ＫＣｌ存在下における、各ＤＮＡ濃度と４８５ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。以上の結果より、いずれの濃度のＫＣｌ存在下においても、チオフラビンＴをＧ－ＤＮＡ１と反応させると蛍光を発することが分かる。しかし、チオフラビンＴをＤｕｐｌｅｘ１やＴ２１と反応させた場合は、ほとんど蛍光を発しないことが分かる。すなわち、これらの結果はチオフラビンＴのＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへの特異性が極めて高いことを示している。したがって、チオフラビンＴを用いることで、カリウムイオン存在下で標的ＤＮＡがＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成でるか否かを判断できることが示された。
　（実施例２）
　実施例１では、チオフラビンＴを用いて、Ｇ－ＤＮＡ１からなるＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの検出を行った。Ｇ－ＤＮＡ１は（３＋１）型のＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を形成することが知られている（非特許文献３、非特許文献４）。本実施例２では、チオフラビンＴを用いて、異なる構造のＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの検出を行った。本実施例２では、５’－ＧＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧ－３’（配列番号：６）の配列のＤＮＡが形成するＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを測定対象ＤＮＡとした（以降、この配列からなるＤＮＡをＧ－ＤＮＡ２と呼ぶ）。また、ＫＣｌの濃度は１００ｍＭのみであった。それ以外は、実施例１と同じ実験を行った。この実験条件では、Ｇ－ＤＮＡ２はアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成することが知られている。
　結果を図１３に示す。図１３（Ａ）は蛍光スペクトル結果を示す。図１３（Ｂ）はこの結果をもとに、Ｇ－ＤＮＡ２の濃度と４８５ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。以上の結果より、チオフラビンＴをＧ－ＤＮＡ２と反応させると蛍光を発することが分かる。したがって、チオフラビンＴを用いて、アンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出できることが示された。
　（実施例３）
　実施例１および２ではそれぞれ、チオフラビンＴを用いて、（３＋１）形のＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘとアンチパラレル型のＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの検出を行った。そこで本実施例３ではチオフラビンＴを用いて、実施例１、２と異なる、パラレル型のＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの検出を行った。本実施例３では、５’－ＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧ－３’（配列番号：７）の配列のＤＮＡが形成するＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを測定対象ＤＮＡとした（以降、この配列からなるＤＮＡをＧ－ＤＮＡ３と呼ぶ）。また、ＫＣｌの濃度は１００ｍＭのみであった。それ以外は、実施例１と同じ実験を行った。この実験条件では、Ｇ－ＤＮＡ３はパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成することが知られている。
　結果を図１４に示す。図１４（Ａ）は蛍光スペクトル結果を示す。図１４（Ｂ）はこの結果をもとに、Ｇ－ＤＮＡ３の濃度と４８５ｎｍにおける蛍光強度の関係をプロットしたグラフを示す。以上の結果より、チオフラビンＴをＧ－ＤＮＡ３と反応させると蛍光を発することが分かる。したがって、チオフラビンＴを用いて、パラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出できることが示された。
　（実施例４）
　Ｇ－ＤＮＡ２と５’－ＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＣ－’（配列番号：８、Ｇ－ＤＮＡ２の相補鎖）（以降、このＤＮＡをＤｕｐｌｅｘ－Ｃと呼ぶ）は、リチウムイオン存在下のようなＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造を不安定化する条件下では、互いに相補的に結合して二本鎖ＤＮＡを形成する。しかし、カリウムイオン存在下では、Ｇ－ＤＮＡ２はＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を形成し、Ｄｕｐｌｅｘ－Ｃは一本鎖ＤＮＡの状態で存在する（図１５）。本実施例４では、Ｇ－ＤＮＡ２とＤｕｐｌｅｘ－Ｃを混合したＤＮＡ試料が、カリウムイオン存在下ではＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できることを、カリウムイオン存在下でのチオフラビンＴ由来の蛍光強度と、リチウムイオン存在下でのチオフラビンＴ由来の蛍光強度の差によって判別できるか否かについて検討した。
　実験手順は以下のとおりであった。まず表２に示す反応溶液１を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　同様に、反応溶液２を調製した。反応溶液２の組成は、反応溶液１のＫＣｌをＬｉＣｌに変えた以外は、反応溶液１と同じ組成である。これらの反応溶液を９０℃で２分間保温した後、０．５℃／分の降温速度で２５℃まで降温させた。以上の工程後、反応溶液１中のＧ－ＤＮＡ１の大半はＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成し、Ｄｕｐｌｅｘ－Ｃは一本鎖ＤＮＡ状態で存在することがすでに知られている。一方、反応溶液２中では、リチウムイオンが存在しているため、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造は不安定化し、Ｇ－ＤＮＡ２とＤｕｐｌｅｘ－Ｃの大半が互いに相補的に結合し、二本鎖ＤＮＡを形成することが知られている。その後、これらの反応溶液について４８５ｎｍにおける蛍光強度解析を行った。励起光波長は４５０ｎｍであった。
　また同様に比較実験として、Ｇ－ＤＮＡ２とＤｕｐｌｅｘ－Ｃの代わりに、５’－ＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡ－３’（配列番号：９）（以降、このＤＮＡをＤｕｐｌｅｘ－ＡＧＡと呼ぶ）と５’－ＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴ－３’（配列番号：１０、配列番号９の相補鎖）（以降、このＤＮＡをＤｕｐｌｅｘ－ＴＣＴと呼ぶ）を用いた以外は、全く同じ実験を行った。Ｄｕｐｌｅｘ－ＡＧＡとＤｕｐｌｅｘ－ＴＣＴは互いに相補的である。またいずれもＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できない。したがって、リチウムイオン存在下でもカリウムイオン存在下でも、これらＤＮＡは互いに相補的に結合して、二本鎖ＤＮＡを形成する。
　結果を図１６に示す。図１６中の右側のバーは、Ｇ－ＤＮＡ２とＤｕｐｌｅｘ－Ｃを用いた場合の、反応溶液１由来の蛍光強度値から反応溶液２由来の蛍光強度値を引いた値を示している。その値はおよそ３０であり、０より大きかった。一方、左側のバーは、Ｄｕｐｌｅｘ－ＡＧＡとＤｕｐｌｅｘ－ＴＣＴを用いた場合の、反応溶液１由来の蛍光強度値から反応溶液２由来の蛍光強度値を引いた値を示している。その値はおよそ０であった。以上の結果は、チオフラビンＴを用いて、標的ＤＮＡがカリウムイオン存在下でＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できるか否かを判断できることを示している。
　（実施例５）
　Ｇ－ＤＮＡ１は、カリウムイオン存在下では、そのほとんどがＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成することが知られている。一方、Ｇ－ＤＮＡ１は、リチウムイオン存在下では、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造が不安定化されるため、その一部は一本鎖ＤＮＡ状態で存在する。本実施例５では、Ｇ－ＤＮＡ１を含む試料溶液中において、チオフラビンＴを用いて、カリウムイオン存在下でＧ－ＤＮＡ２から形成されるＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを検出できるか否かについて検討した。本実施例５では、Ｇ－ＤＮＡ１が、カリウムイオン存在下ではＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できることを、カリウムイオン存在下でのチオフラビンＴ由来の蛍光強度と、リチウムイオン存在下でのチオフラビンＴ由来の蛍光強度の差によって判別できるか否かについて検討した。
　実験手順は、Ｇ－ＤＮＡ２とＤｕｐｌｅｘ－Ｃの代わりにＧ－ＤＮＡ１を用いた以外は実施例４と全く同じであった。また、比較実験としては、Ｇ－ＤＮＡ２とＤｕｐｌｅｘ－Ｃの代わりにＴ２１を用いた実験を行った。Ｔ２１は、リチウムイオン存在下でもカリウムイオン存在下でも、一本鎖ＤＮＡの状態で存在する。
　結果を図１７に示す。図１７中の右側のバーは、Ｇ－ＤＮＡ１を用いた場合の、反応溶液１由来の蛍光強度値から反応溶液２由来の蛍光強度値を引いた値を示している。その値はおよそ６であり、０より大きかった。一方、左側のバーは、Ｔ２１を用いた場合の、反応溶液１由来の蛍光強度値から反応溶液２由来の蛍光強度値を引いた値を示している。その値はおよそ０であった。以上の結果は、チオフラビンＴを用いて、標的ＤＮＡがカリウムイオン存在下でＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成できるか否かを判断できることを示している。
　以上まとめると、本発明者は、従来のベンゾチアゾール誘導体では達成できなかったＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの特異的検出を、チオフラビンＴを用いれば達成できることを世界で初めて見出し、本発明を完成するに至った。
　上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施の形態が明らかである。したがって、上記説明は例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する最良の態様を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神を逸脱することなく、その構造および／または機能の詳細を実質的に変更できる。
　本発明により、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの特異的検出方法は、バイオテクノロジー分野における分析方法として有用である。
　１　Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ
　２　Ｇカルテット面
　３　金属イオン
　４　Ｇカルテット面の化学構造
　５　容器
　６　カリウムイオンと標的ＤＮＡとチオフラビンＴを含む試料溶液１
　７　標的ＤＮＡとチオフラビンＴを含む試料溶液２
　８　二本鎖ＤＮＡ中のＤｕｐｌｅｘ－Ｃ
　９　二本鎖ＤＮＡ中のＧ－ＤＮＡ２
　１０　一本鎖ＤＮＡ状態のＤｕｐｌｅｘ－Ｃ
　１２　Ｇ－ＤＮＡ２により形成されたＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ

Claims (4)

  1. 　標的ＤＮＡがＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘをカリウムイオン存在下で形成しているかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備する方法：
    　カリウムイオン、チオフラビンＴ、および前記標的ＤＮＡを含有する第１試料溶液をＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成反応条件下で維持する工程、
    　ラムダ１の波長における第１蛍光強度値Ａを測定する工程、ここで
    　　前記第１蛍光強度値Ａは、前記第１試料溶液に含有されるチオフラビンＴに由来し、
    　　ラムダ１は、４６５ナノメートル以上５０５ナノメートル以下であり、
    　チオフラビンＴおよび前記標的ＤＮＡを含有する第２試料溶液を、前記Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造が不安定化する条件下に維持する工程、
    　前記ラムダ１の波長における第２蛍光強度値Ｂを測定する工程、ここで
    　　前記第２蛍光強度値Ｂは、前記第２試料溶液に含有されるチオフラビンＴに由来し、および
    　以下の不等式が充足されれば、前記標的ＤＮＡがカリウムイオン存在下で前記Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成していると判定される工程：
    　前記第１蛍光強度値Ａ－前記第２蛍光強度値Ｂ＞０。
  2. 　請求項１に記載の方法であって、
    　前記第１蛍光強度値－前記第２蛍光強度値≦０の不等式が充足されれば、前記標的ＤＮＡがカリウムイオン存在下で前記Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成していないと判定される、方法。
  3. 　請求項１に記載の方法であって、
    　前記Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの構造が不安定化する条件は、リチウム存在下の条件である、方法。
  4. 　請求項１に記載の方法であって、
    　前記ラムダ１が４８５ナノメートルである、方法。
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